血清总补体溶活性测定.ppt

血清总补体溶血活性测定（CH50试验）,补体,(Complement),JulesBodet(1870-1961),Discovererofcomplement,补体-是一组存在于人和脊椎动物血清及组织液中具有酶样活性、不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件。,概念,正常情况下，补体在体内以无活性酶原形式存在，须经激活后才能发挥其功能,补体系统按其性质与功能分三类,1补体系统固有成分，共九种，C1-C9.2调节和控制补体系统活化的成分3补体受体(CR),一、补体的组成和命名,CR1（CD35）、CR2（CD21）CR3（CD11b/CD18）CR4（CD11c/CD18）等,固有成份,调控成分,补体受体,C1C9（C1qC1rC1s）B因子，D因子，P因子,CT抑制物（CTINH）C4结合蛋白（C4bp）I因子（C3bINA）H因子（C3bINA促进因子）（1H）S蛋白,激活物质抗原抗体复合物（Ag-Ab）、聚合IgG、SPA、dDNA,经典途径激活(classicalpathway),膜攻击单位：C5C9,识别阶段,活化阶段,膜攻击阶段,识别单位：C1q、C1r、C1s,活化单位：C4、C2、C3,参与成分十一种,IgMCH3区，IgGCH2区,Whoareyou?,C1,补体攻膜单位细胞膜表面的C3b5b与C6、C7、C8依次结合形成C5b678复合物。该复和物诱发C9在细胞膜表面共聚，形成膜表面的通道结构MACs，造成胞膜的穿孔损伤。,C5b+C6+C7+C8+C9=MACs,补体参与的溶血反应溶血反应是指补体参与的抗体致敏红细胞的溶解反应.参与反应的成分有（1）红细胞；（2）抗红细胞抗体，也称溶血素；（3）补体,补体参与的溶血试验溶血试验是将抗红细胞的抗体(通常称为溶血素)与相应的红细胞混合，当补体存在时，红细胞即被溶解。此种特异性溶血现象肉眼可见，广泛用于血清总补体活性测定。此外，溶血试验常用于补体结合试验中作为指示系统。,溶血反应的用途,1、测定总补体活性2、补体结合试验，即利用溶血系统作为指示剂，检测另一个反应系统的抗原或抗体。,血清总补体溶血活性测定试验原理：血清补体的主要活性是溶细胞作用。红细胞与特异性抗体结合后可激活补体,导致红细胞溶解。补体的活性与溶血程度相关，但不是直线关系。,血清总补体溶血活性测定以溶血百分率为纵坐标，相应补体血清量为横坐标，在一个稳定的体系中，溶血程度与补体剂量呈一种特殊的“S”形曲线。曲线在30%-70%之间最陡几乎呈直线，补体剂量的少许变化，溶血程度会发生很大改变，曲线此阶段对补体量的变化非常敏感，所以试验常以50%溶血作为终点指标，该试验即为50%补体溶血试验。,补体介导的溶解技术,血清补体总活性测定（CH50试验）,试验方法1、绵羊红细胞抽绵羊全血去纤维用NS洗涤三次用缓冲液配制成2%备用。,绵羊红细胞的制备法,2、溶血素即抗绵羊红细胞抗体，是以SRBC免疫家兔而得到的兔血清。但试验前应进行加热5630min以灭活补体。（1）溶血素稀释根据需要对其进行稀释。补体活性测定一般使用2U(1：2000),效价滴定,管号,溶血素稀释度,溶血素,1：60的补体,缓冲液,2%SRBC,结果,123456789,1：10001：20001：30001：40001：50001：60001：80001：10000（对照）,0.10.10.10.10.10.10.10.1-,0.20.20.20.20.20.20.20.2-,0.20.20.20.20.20.20.20.20.5,0.10.10.10.10.10.10.10.10.1,全溶全溶全溶全溶大部分溶微溶不溶不溶不溶,溶血素的滴定,溶血素效价和单位的确定：以产生完全溶血的最高稀释管为最大有效反应管，以该管中所含溶血素的量为1U/ml,以该管的溶血素稀释倍数为溶血素的效价。如上表中溶血素的效价应为1：4000。,3、稀释缓冲液：PH7.2-7.4磷酸盐缓冲液或巴比妥缓冲液加NaCl以保持等渗，加适量活化补体不可少的Ca2+和Mg2+4、补体：取新鲜血清标本，1：20稀释血清。,5、50%溶血标准管取2%SRBC悬液0.25ml加蒸馏水1ml，SRBC全部溶解，为100%全溶血。再加1.8%NaCL1mL,最后加2%SRBC悬液0.25ml混匀，即为50%溶血标准管。,试验方法,1、配制2%绵羊红细胞(1)1ml绵羊红细胞+5ml生理盐水2000rpm*5分钟重复洗涤三次(2)用缓冲液配制成2%(200ulRBC+10ml缓冲液),2、1：20稀释血清：300ul血清+6mlBB液(已稀释),3、稀释巴比妥缓冲液：4mlBB原液+20ml水，1：5稀释(已稀释),4、2u/ml溶血素:用溶血素1ml+2000mlBB液稀释(已稀释),50%溶血标准管,5、取2%SRBC悬液0.25ml加1ml蒸馏水使SRBC完全溶解，为100%溶血。再加入1.8%NaCL溶液1ml校正为等渗溶液，最后加入2%SRBC悬液0.25ml，即为50%溶血悬液,取试管10支，分别编号1、2、310，按下表加入物质：CH50测定操作表管号123456789101：20血清ml0.10.150.20.250.30.350.40.450.5-BB液ml1.41.351.31.251.21.151.11.051.01.5溶血素ml（2U/ml）每管加入0.52%SRBCml每管加入0.5摇匀、37水浴30min，取出离心2500r/min5min,6、比色肉眼观察：初步目视比较，找出与标准管相近的两管比色：在分光光度计上读取OD541值,测定与50%溶血标准管最近的一管为最高有效反应管。,按下列公式求50%溶血的总补体值CH50（U/ml）,血清用量,1,X,稀释倍数,总补体活性参考范围：50100U/ml,方法学评价CH50试验测定经典途径总补体溶血活性，所反应的是补体9种成分的综合水平。本法敏感性较低，补体的溶血活性除与试验中反应体积有关外，还与反应所用缓冲液的PH、离子强度、钙镁浓度、SRBC数量和反应温度有一定关系故实验时对反应的各个环节应严格控制，统一步骤。,正常人血清中的补体活性及含量相对稳定，在疾病情况下补体水平可能出现波动。因此对补体活性及含量的检测有助于某些疾病的诊断、疗效观察和发病机制研究。,临床意义,1、增高：急性炎症，组织损伤，恶性肿瘤2、降低：主要见于消耗增加：急性肾小球肾炎、SLE活动期、类