（应用化学专业论文）仿生型信号分子对烟叶硝态氮、亚硝态氮的抑制作用研究.pdf

摘要 摘要 硝态氮( ( n 0 3 ) 、亚硝态氮( n 0 2 3 是烟草致癌物质烟草特有亚硝胺( t s n a ) 的前体物。减少烟叶中n 0 3 与n 0 2 。的含量是降低t s n a 的途径之一。基于昆虫 取食或机械性损伤( 如打顶) 能激活烟草植株的系统性防卫反应，改变烟草对氮 素的吸收与转化，本研究在烟草与昆虫互作效应的基础上，设计选取由烟草的寡 食性昆虫下唇腺特异性酶产生的与创伤信号相颉抗的仿生型分子信号物质 ( b i o n i c ss i g n a lm o l e c u l eb s m ) ，在烟草打顶后将b s m 涂抹于烟草伤口断面，研 究其对烟草n 0 3 、n 0 2 含量的影响，同时研究b s m 与烟草类型( 烤烟、白肋烟) 、 品种、打顶时期等栽培因素的互作效应。以优化b s m 的应用，从而为烟草n 0 3 。、 n 0 2 的调控提供一条新途径。 主要研究工作与成果如下： 1 分别对烤烟和白肋烟整个生长过程中烟株不同部位的的n 0 3 与n 0 2 - 含量、 硝酸还原酶( n r ) 活性进行检测。结果表明：烤烟中部叶及根部n 0 3 含量在旺 长期达到最大值，打顶后2 5 d 为最小值；中部叶及根部n 0 2 含量打顶期含量最 低，打顶后1 5 d 含量达到最大值；中部叶n r 活性在打顶后2 5 d 为最小值，根部 n r 活性打顶第5 天后逐渐降低，打顶后2 5 d 降至最小值。白肋烟中部叶n 0 3 。 在打顶期为最大值，打顶后2 5 d 降到最低；根部n 0 3 含量在旺长期达到最高值， 打顶后2 5 d 则为最小值；中部叶n 0 2 含量在旺长期达到最大值，打顶后2 5 d 为 最低值，根部n 0 2 含量在旺长期达到最大值，在打顶期含量最低；中部叶与根 部n r 活性移栽期最低，打顶后第5 d 达到最大值。 2 用b s m 在不同时间、对烤烟在打顶后进行涂抹处理。2 0 0 8 年与2 0 0 9 年的 试验表明：烤烟k 3 2 6 和9 7 1 7 打顶后用b s m 处理，叶片中n 0 3 和n 0 2 含量较 对照均有不同程度的下降。2 0 0 8 年试验表明：打顶后用b s m 处理，k 3 2 6 中部 叶n 0 2 。含量降幅最大，降幅为4 3 3 ，9 7 1 7 上部叶的n 0 3 含量降低最多，降幅 达到3 1 5 。2 0 0 9 年实验表明：b s m 对n 0 2 - 的处理效果明显优于n 0 3 。，除中部 叶n 0 3 - 外，b s m 对初花打顶的处理效果好于盛花打项。 3 b s m 对不同打项时间的白肋烟的处理效果。结果表明：在不同的情况下， 打顶后的白肋烟施用b s m ，均会降低n 0 3 。、n 0 2 在其体内的积累。2 0 0 8 年湖北恩 施试验结果是：b s m 在浓度较高时抑制率更高，表现出浓度效应；b s m 对中部叶 的n 0 3 和n 0 2 影响幅度大于上部叶。2 0 0 9 年合肥试验结果为：b s m 对n 0 2 - 处理效 果更好，上部叶n 0 2 。的降低率是n 0 3 - 降低率的近十倍；b s m 对初花打顶组的n 0 3 。 和n 0 2 抑制率高于盛花打顶组，中部叶初花打顶组n 0 3 降低率是盛花打顶组的4 倍。 关键词：烟草 信号分子( b s l v o n 0 3 。n 0 2 。抑制作用 i i a b s t r a c t a b s t r a c t n i t r a t ea n dn i t r i t ea r et h ep r e c u r s o ro fo b a c e oc a r c i n o g e n - t o b a c c o s p e c i f i c n i t r o s a m i n e s ( t s n a ) r e s t r a i n i n gt h ec o n t e n to fn 0 3 ，n 2 i so n eo ft h em e t h o dt o r e s t r a i n i n gt h ec o n t e n to ft s n a i n s e c tf e e d i n go rm e c h a n i c a li n j u r y ( s u c ha st o p p i n g ) c a na c t i v a t et h es y s t e mo ft o b a c c op l a n t so fd e f e n s er e s p o n s e s ，c h a n g i n gt h ea b s o r b a n dt r a n s l a t i o no fnf r o mt o b a c c o b a s e do nt h es t u d yo ft h ei n t e r a c t i o no ft o b a c o o a n di n s e c t , t h eb i o n i c ss i g n a lm o l e c u l e ( b s m ) f r o mt o b a c c of e e d i n go l i g o p h a g o u s p e s t so r a ls e c r e t i o n ，w e r ea p p l i e dt ot h et o po fc a u l i so fd i v e r s et y p e so ft o b a c c oa f t e r t o p p i n g ，s t u d y i n go nt h ei n t e r a c t i o no fb s ma n dn 0 3 。，n 0 2 。a n di n t e r a c t i o ne f f e c t so f b i o n i c ss i g n a lm o l e c u l ea n dt h ec u l t i v a t i o nf a c t o r s ，s u c ha sv a r i e t i e s ，a n dt o p p i n gt i m e t h i ss t u d yb a s e do nt h eb e s tw a yt ou s eb s m ，w h i c hp r o v i d ean e ww a yt or e g u l a t e t o b a c c oa l k a l o i d s 乃e s i sw o r ka r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 d e t e r m i n e da n da n a l y z e dt h ec o n t e n to fn 0 3 ，n 0 2 。c o n t e n ta n dn ra c t i v i t y o nf l u e c u r e dt o b a c c oa n db u r l e yt o b a c c oi nt h ew h o l eg r o w t hp r o c e s so f p l a n t si n v a r i o u sp a r t s a n a l y z e dt h ee f f e c to fb s mo nt h ec o n t e n to f n 0 3 。，n 0 2 。a n dn r a c t i v i t ya f t e rt o p p i n g t h er e s u l t ss h o wt h a t ；t h ec e n t r a lt o b a c c ol e a fa n dr o o tn 0 3 c o n t e n tr e a c hm a x i m u mi n t h ef a s tg r o w i n gp e r i o d ，r e a c h e sam i n i m u ma f t e rt o p p i n g 2 5 d ；t o b a c c oc e n t r a ll e a fa n dr o o tg e tl o w e s tl e v e l so f n 0 2 。i nt o p p i n gp e r i o da n d r e a c ht h em a x i m u mi nt h e15 da f t e rt o p p i n g 。；t h en r a c t i v i t yi nt o b a c c oc e n t r a ls r e a c h e dt h em i n i m u mi n t h e2 5 da f t e rt o p p i n g r o o tn r a c t i v i t yw i t h i nd e c r e a s i n g g r a d u a l l yi nt h ef i r s tf i v ed a y sa f t e rt o p p i n g ，r e a c h e dm i n i m u ma f t e rt o p p i n g2 5 d m i d d l el e a v e so fb u r l e yt o b a c c oi nd i f f e r e n tp e r i o d so fn 0 3 c o n t e n tg e tt h em a x i m u m i nt o p p i n gp e r i o d ，r e a c ht h em i n i m u ma t2 5 da f t e rt o p p i n g 1 1 1 ec o n t e n to f n o s 。i n r o o ts r e a c ht h em a x i m u mi nt h ef a s tg r o w i n gp e r i o da n dr e a c h e dt h em i n i m u mi nt h e 2 5 da f t e rt o p p i n g ；n l en 0 2 c o n t e n to fm i d d l el e a v e si nb u r l e yt o b a c c or e a c ht h e m a x i m u mi nt h ef a s tg r o w i n gp e r i o dr e a c h e dt h el o w e si nt h e2 5 da f t e rt o p p i n g n o c o n t e n to fr o o tr e a c ht h em a x i m u mi nt h ef a s tg r o w i n gp e r i o dr e a c h e dt h el o w e si n t h ei nt h et o p p i n gp e r i o d ；n ra c t i v i t yo ft h ec e n t r a ll e a v e sa n dr o o ti nb u r l e y t o b a c c o r e a c ht h el o w e si np l a n tp e r i o dr e a c ht h em a x i m u mt h e5 da f t e rt o p p i n g ， 2 n l ee f f e c to f u s i n gb s m o nf l u e - c u r e dt o b a c c oa f t e rt o p p i n go fd i f f e r e n t t o p p i n gt i m e 砀ee x p r r i m e n tf r o mt h ey e a r2 0 0 8a n d2 0 0 9 w e r es h o wt h a t ：k 3 2 6a n d i i i a b s t r a c t 9 717v a r i e t i e so ft o b a c c of l u e - c u r e dt o b a c c o ，t r e a t e dw i t hb s ma f t e rt o p p i n g ，t h e c o n t e n to fn 0 3 一a n dn 0 2 i nl e a v e sw e r ei nd e c r e a s e dd e g r e e s ，c o m p a r e dw i t ht h e m a t c h e dg r o u p 2 0 0 8r e s u l t ss h o wt h a t ：k 3 2 6a n d9 717v a r i e t i e so ft o b a c c of l u e - c u r e d t o b a c c od e a l e dw i t hb s ma f t e rt o p p i n g ，k 3 2 6m i d d l el e a v e sd e c r e a s e dn 0 2 m o r e ， f e l lt o4 3 3 ，t h ec o n t e n to f n 0 3 。i nt h eu p p e rl e a f o f 9 7 1 7d e c r e a s e dt h em o s t ，u p 31 5 2 0 0 9r e s u l t ss h o wt h a t ：t h et r e a t m e n to fb s m ao nn 0 2 w e r em o r ee f f e c t i v e t h a nn 0 3 。；b e s i d e st h ec o n t e n to f n 0 3 i nt h em i d d l e1 e a v e s ，t h eu s eo fb s m am a d e b e t t e re f f e c to nt h ee a r l yb l o s s o m i n gt o p p i n gg r o u pt h a nf u l lb l o o mt o p p i n gg r o u p 3 t h ee f f e c to ft h eu s eo fb s mo fb u r l e yt o b a c c o t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h e u s eo fb s ma f t e rc o u l dr e d u c et h ec o n t e n to fn 0 3 。a n dn 0 2 i nt h el e a v e so fb u r l e y t o b a c c o 埘md i f f e r e n e tc o n d i t i o n s ，n l ee x p e r i m e n to fh u b e ii n2 0 0 8s h o wt h a tt h e h i g h e rc o n t e n to f b s mg o tb e t t e rr e s u l t t h a ti st os a y , t h er e s u l tp u tu p c o n c e n t r a t i o ne f f e c t t h eu s eo fb s m g o tb e t t e rr e s u l ti n t h ec o n t e n to fn 0 3 a n dn 0 2 。 i nt h ei d d l el e a v e st h e nt h eu p p e r n l ee x p e r i m e n to fh e f e ii n2 0 0 8s h o wt h a tt h eu s e o fb s m g o tb e t t e rr e s u l ti nt h ec o n t e n to fn 0 2 t h e nn 0 3 。，a n dm a d eb e t t e re f f e c to i l t h ee a r l yb l o s s o m i n gt o p p i n gg r o u pt h a nf u l lb l o o mt o p p i n gg r o u p k e yw o r d s ：t o b a c c o ， b i o n i c s i g n a l i n gm o l e c u l e s ( b s m ) ， n o s ，n 0 2 ， r e a t r a i n i v 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的成 果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或撰写 过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了明确 的说明。 作者签名：堡垒签字日期： 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学拥 有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人 提交的电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 鬯么开口保密( 年) 作者签名缉遣 签字日期：兰! 生：鱼! ! 导师签名：二刍咝 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 1 1引言 人类吸烟已有将近千年的历史，全世界目前的吸烟人口约有1 3 亿。吸烟对人 类健康的副作用也已日益引起人们的普遍关注。早在2 0 世纪5 0 年代初英国皇家医 学会就公开提出吸烟有害身体健康，5 0 年代末，英国皇家医学会和美国卫生署都 发表公告，认为过量吸烟是产生肺癌的病因之一( w y n d e re l ，1 9 6 7 ) 。从此以后， 小规模的反吸烟运动，开始演变为世界范围内的禁烟浪潮。 烟草控制框架公约于2 0 0 5 年8 月正式在我国生效，烟草行业面临的“吸 烟与健康”问题的压力又有所加强，公约中“烟草成分管制与披露”准则要求， 将使得各国政府制订出对应的管制法规，更加严格地限制卷烟制品中有害成分的 释放量( 张颖璞，2 0 0 9 ) 。进人2 0 世纪9 0 年代，世界各地的禁烟呼声日益高涨，烟 草业的发展已到了生死存亡的关键时期。为了对人类的健康负责和自身的生存发 展，各国烟草业都积极开展卷烟降害方法的研究。 一般认为，烟草中的致肺癌物主要是多环芳香族碳水化合物( p o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h ) 、a s z - 芳烃、亚硝胺类、各种有机化合物和无机 化合物( h e c h t s s ，1 9 9 8 ) 。经过大量的研究和积累，烟草行业最后统一把烟碱来 源的亚硝胺称为烟草特有亚硝胺( t o b a c c o s p e c i f i cn n i t r o s a m i n e s ，t s n a ) 。 p a h 和t s n a 在烟草所致肺癌中起着非常重要的作用( b r u n n e m a n nkd ，1 9 8 3 ) 。 烟草制品中的n 一亚硝胺是由仲胺与亚硝酸或氮氧化物作用而生成( 汪安云， 2 0 0 4 ) 。这些n 亚硝胺可以分3 种：( 1 ) 挥发性亚硝胺；( 2 ) 非挥发性亚硝胺；( 3 ) 烟草 特有亚硝胺。研究表明：烟草特有亚硝胺( t s n a ) 具有较强的致癌性，烟草特有 的n 亚硝胺( t s n a ) 主要有4 种，分别为n 亚硝基降烟碱( n n n ) 、4 ( 甲基亚硝 胺) 1 ( 3 吡啶基) 1 丁酮( n n k ) 、4 ( n 甲基埘亚硝基氨基) 4 ( 3 吡啶基) 丁醛 ( n n a ) 、n 亚硝基新烟碱( n a b ) 和n 亚硝基新烟草碱( n a t ) ( 汪安云，2 0 0 6 、杨焕 文，1 9 9 8 ) 。 t s n a 的致癌性已经在相关动物实验中得到证实，而t s n a 与人体癌症之间 的关联性，通过不吸烟而长期使用鼻烟者口腔癌的高发率的调查研究中得以证实 ( h o f f m a n ，19 9 5 ) 。 s a n d r i n e 等( s a n d r i n e2 0 0 3 ) 对原型卷烟烟丝和其产生的主流烟气中t s n a s 的关系进行研究，该原型卷烟除了配方不同，其他参数完全相同。结果发现，烤 烟和混合型卷烟烟丝t s n a s 的含量，和卷烟主流烟气中的t s n a s 的输送量有着 明显的相关性。卷烟烟气中t s n a s 的量大部分来自于卷烟烟丝中t s n a s 的直接 转移。从烟制品、烟草及烟气中吸收的t s n a s 是人体吸收亚硝基化合物的主要 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 来源之一，分别为烈酒的5 7 0 倍、啤酒中吸收量的5 0 倍、腌制品的1 0 0 倍、化 妆品的4 1 倍( h o f f m a n ，1 9 9 5 ) 。 1 2 t s n a 的形成及调控 1 2 1t s n a 的形成 目前普遍认为，t s n a 在烟草鲜叶中很少产生或几乎不产生，其形成与积累 是在采收之后发生的，且大部分是在调制期间形成( w e i ) ( 1 9 9 6 ) 。t s n a 的形成 过程如下：t s n a 以硝酸盐、亚硝酸盐和烟草生物碱作为前体物质，相互作用反 应生成( dm p e e l ee ta l ，1 9 9 9 ) 。t s n a 的形成途径有两条：其一是烟草生物碱 在微生物的作用下发生亚硝化作用生成t 阶认；另一条是硝酸盐在微生物作用下 生成亚硝酸盐，这些亚硝酸盐或其它氮氧化物再与烟草生物碱反应生成t s n a 。 在调制过程中，烟草中的硝酸盐被微生物还原为亚硝酸盐以及氮氧化物 ( n o x ) ，然后与烟草生物碱作用形成t s n a ( b b i d e s v , 1 9 8 7 ；c h o r t y k o t ，1 9 9 1 ； b r u n n e m a n n k d ，1 9 8 3 ；f l i s c h e r s ，1 9 8 9 ) 具体过程如下： 1 2 2t s n a 的毒性 2 微生物作用 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 目前有关t s n a 的致病机制在国内外已有大量报道，但都是在动物试验中 得到证实，在人体中是否有同样作用也有初步研究。n n n 尤其是n n k 是强烈 的动物致癌剂，它会对小鼠、大鼠及叙利亚金田鼠诱发肺癌，仅将l g n n k 一次 注入田鼠中即会造成肺部癌瘤的高发病率( h o f f m a n n d ，1 9 9 4 ) 。h e c h t 等通过大 量实验证实了t s n a 与动物癌症之间的关系，发现不同动物( 小鼠、大鼠、仓鼠、 貂及猿类等) 通过不同的给药途径( 包括灌注、腹腔注射、静脉、皮肤接触及面颊 涂拭等) 均能导致这些实验动物发生癌症，其中癌症的种类以肺腺癌或肺腺鳞癌 为主( h e c h t s s ，1 9 9 8 ；赖百塘，2 0 0 0 ) 。2 0 0 3 年z h o u 等报道，用1 0 0 m g m l 和 4 0 0 m g m l 两种浓度的n n k 处理永生化人类支气管上皮细胞，7 天后检测，此类 细胞均发生了恶性转化，这个实验充分证明了n n k 能诱导支气管上皮细胞的癌 变。 生化研究表明( ke 1 。b a y o u n y ，1 9 9 9 ) ：在新陈代谢活动中n n k 能使动物活 体和离体的人体组织中的d n a 甲基化，这已从各种人体组织中分离出7 甲基鸟 嘌呤及0 6 甲基鸟嘌呤实验中得到证明。分子生物学家认为遗传密码中带有0 6 甲基鸟嘌呤的d n a 是一种化学损害，有可能会引发肿瘤。另外有实验证明( k e 1 b a y o u n y ，1 9 9 9 ) ，给小鼠喂饲高脂肪食物时，n n k 能导致环加氧酶2 活性 增强，而环加氧酶2 活性在动物体内的过强表达，意味着会发生许多疾病，其中 包括癌变。 1 2 3t s n a 的降低途径 近年来，国际烟草界就如何降低t s n a 开展了广泛且深入的研究，一些减害 技术已进行了实际应用，如具有特殊减害作用的特种滤嘴、生物减害技术( 血红 蛋白等) 等等。降低t s n a 的途径也分为农艺措施、调制技术、生物控制、物 理控制几方面。 1 2 3 1 降低t s n a 的农业技术 降低t s n a 的农业技术，主要有： 控制施肥水平：n 素的供应能直接影响t s n a s 的前体物质n 0 3 。、n 0 2 。在烟 株内的积累，在保证质量和产量的前提下，降低施n 水平对减少t s n a s 的形成 和积累有很大效果。低水平的施肥量，同时还能够相对降低烟草生物碱含量，可 以抑制调制过程中t s n a s 的积累。 改变采收方式：杨焕文等( 1 9 9 7 ) 研究得出，与正常的整株采收晾制相比，逐 叶采收、整株采收叶片划主脉、逐叶采收划主脉、逐叶采收叶肉主脉分离晾制均 能显著降低叶肉及主脉中t s n a 的含量， 3 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 1 2 3 2 降i 氏t s n a 的调制技术 由于t s n a 主要是在调制期间，在微生物的作用下反应生成，改进调制工 艺也可以相应地减少烟叶t s n a 的含量。 调制工艺改革：近年来，在降低调制过程中t s n a s 的生成实验上，微波技 术得到了应用。在烟叶处于变黄期，尚未褐变时，细胞还保持其完整性，此时采 用微波辐射，可杀除会产生亚硝胺的有害细胞，抑制在烟叶调制过程中t s n a s 的形成和累积，使其含量有效地降至新鲜烟叶水平，同时还保留其香气和吸昧。 d a v i d m p e e l e 等( 2 0 0 3 ) 人研究烤烟调制方法时发现，改变烘烤形式，用热交换 式烘烤代替直接烘烤，可以将t s n a 总量及n n k 含量分别降低9 1 和9 3 。 美国r j 雷诺士公司开发出了用热交换器代替烤炉烘烤烟叶的技术，可大大降 低普通烟叶中t s n a 的含量，该公司6 年的研究结果显示，在烤房中改用热交 换器，可使烤烟中t s n a 的平均含量至少下降8 0 。 魏玉玲等人( 2 0 0 2 ) 研究表明：与用其它方法调制的烟叶相比，用微波辐射调 制的烟叶，至少有一种t s n a 的含量有所降低。实验表明，经微波处理烟叶的 t s n a 含量小于0 2 u g g ，最低的小于0 1 u g g ；n n n 含量小于0 1 5 u g g ，最 低的低于0 0 5 u g g ；n n k 含量小于o 0 0 2 u g g ，最低的小于0 0 0 0 5 u g g 。南京 大学( 郑新章，2 0 0 3 ) 发明了利用微波技术对卷烟成品进行处理，从而降低卷烟烟 气中t s n a 的新方法，实验结果表明：主流烟气的t s n a 总量可降低5 2 一7 6 ， 侧流烟气的t s n a 总量可降低2 1 5 - 5 3 。 烘烤时间越短，微生物存活和作用时间就会越短，t s n a 积累相对较少。试 验表明，在棕化反应过程中加热，会导致微生物活性增强，最后导致t s n a 含 量高。在烟叶调制过程中，可溶性多酚、蛋白质、生物碱、过量的硝酸盐、残留 农药等都可以得到有效地去除，也可以在这个过程中添加其它制剂，从而就可最 大限度地消除t s n a 量( 杨焕文，1 9 9 9 ) 。 烘烤温度的影响：高温烘茎过程中，烘干时间较久以及随之而来的高氮氧化 物转化会导致叶片中t s n a 浓度较高，因为在较高温度下亚硝化率会增高。在 叶片烘干中，电加热比直接火焰加热产生的t s n a 浓度较低，但是在叶脉中相反。 烘茎过程中的低温会得到较低浓度的t s n a ( c d er o t o n ，2 0 0 5 ) 。 1 2 3 3 降低t s n a 的生物技术 国外利用生物技术减害研究进行得较早，希腊研制出了加有血红蛋白( 德国 产品) 的活性炭的三元复合生物滤嘴，其主要优点是改进了复合滤嘴生产技术， 将涂有血红蛋白的活性炭几乎完全地充满三元复合滤嘴中段的全部空腔，从而在 吸烟过程中大大提高了卷烟焦油和其它有害物质的去除率( 李卫，2 0 0 9 ) 。 戴亚等人( 2 0 0 1 ) 从动物鲜血中提取血红蛋白，并将血红蛋白作为滤嘴添加剂 4 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 加入到卷烟滤嘴中，研究其对卷烟烟气中亚硝胺含量的抑制。结果表明，以血红蛋 白为添加剂的滤嘴能够显著降低卷烟烟气中n 亚硝胺的含量。血红蛋白可以大 幅度地截留烟气中的t s n a ，降低率基本在5 0 左右，并且对粒相t s n a 也有截 留作用 张玉芹等( 2 0 0 7 ) 研究了反硝化细菌( d c n i t r i f y i n g b a c t e r i a ) 在降低t s n a 的过 程中起的作用。利用反硝化细菌的反硝化作用，将烟丝中硝酸盐和亚硝酸盐还 原为气体，从而达到降低烟丝中t s n a 含量的目的。 祝明亮等( 2 0 0 4 ) 利用内生细菌接种降低t s n a 含量，以粉碎烟叶接种、叶柄 浸泡接种和叶面喷雾接种3 种方式处理调制后，化验分析结果表明：接种内生细 菌能降低白肋烟t s n a 含量，降低率在2 7 5 6 - 9 9 8 8 之间。 1 2 3 4 降低t s n a 的物理技术。 目前利用物理技术控制t s n a 含量的技术，已经比较成熟。主要是在烟叶 中加入一些添加剂，吸收烟叶和烟气中的t s n a 。 恽之瑜等人( 2 0 0 0 ) ，研究在卷烟中加入以沸石作为卷烟添加剂，以去除烟气 中t s n a ，试验结果表明：将n a z s m - 5 和n a y 等类型沸石作为添加剂，均匀 地分散在烟丝中，处理效果较好；当沸石添加剂质量分数小于5 时，主流烟气 中降低3 5 一6 1 ，侧流烟气中的t s n a 可降低约3 0 ，而烟气中t s n a 总量则 分别减少5 0 和5 0 左右。另外还发现，在卷烟烟丝中加入2 、5 载有金属 氧化物( 镁、锌、铁、锰等的氧化物) 的沸石，主流和侧流烟气中的t s n a 总 量可降低5 0 以上 周仕禄等( 2 0 0 3 ) 首次研究了沸石对于分子直径远大于其孔径的n n n 的吸附 和催化裂解作用。实验表明采用程序升温表面反应技术，沸石依然能吸附和催 化裂解n n n 被；沸石表面酸位和其孔径都是影响催化裂解n n n 的重要因素。 n n n 很可能以n - n = o 官能团嵌入沸石孔道的形式进行催化裂解。在他们的试验 中，吸附介孔分子筛被首次用于催化裂解n n n ，其催化活性高于微孔沸石。 戴亚等( 2 0 0 4 ) 从羊齿类植物中提取出多种酮酚类化合物及其衍生物，将这些 物质组合，得到复合的添加剂，将这种添加剂以0 0 0 8 的比例添加于卷烟滤嘴 或烟丝中，检测结果表明：在卷烟中添加该复合添加剂后，其主流烟气中的多种 自由基、稠环芳烃和芳香胺等致癌物的含量得到显著抑制，烟气中的t s n a 也 有一定程度的降低。 1 3 烟叶n o ；、n 0 2 - 的调控 1 3 1 烟叶n o 。一、n 0 。一与t s n a 的关系 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 t s n a 的形成一般认为是n 0 3 - 在微生物的作用下转化为n 0 2 ，这些n 0 2 和 其它氮氧化物再与烟草生物碱经过一系列反应生成t s n a s ( r t j 万峰，2 0 0 2 ) 。早 在1 9 8 3 年就有报道：烟叶和烟烟气中的n o r 与t s n a 含量有明显相关。1 9 8 9 年又报道烟草中的n 0 2 和t s n a 之间有显著相关。有研究表明：t s n a s 在烟 叶中的分布更类似于n 0 2 。而非烟草生物碱，引起t s n a s 积累的主要因素是 n 0 2 。而非烟草生物碱和n 0 3 。( b u r t o n ，1 9 9 2 ) 。如图所示： 微生物调节 硝酸根百亚硝酸根百。弩x _ t s l 收后烟叶) l 调制过程中l 新鲜的烟叶中只含有微量的n 0 2 ，n 0 2 。是在调制过程中，由n 0 3 在硝酸还 原酶及微生物的作用下生成的，目前普遍认为，n 0 2 才是t s n a s 最直接的中间 体( b r u n n e m a n n ，1 9 8 3 ；f i s c h e r ，1 9 8 9 ) ，高浓度的n 0 3 。一高浓度的n 0 2 。一高浓 度的t s n a ，n 0 2 。是生成t s n a 的限制性前体物质，n 0 2 。在n r 的作用下还原为 n 0 2 。是关键性限制阶段( 王瑞新，2 0 0 3 ) 。 1 3 2 烟叶n o r 、n 0 2 - 的调控 t s n a 是在烟草调制过程中产生的，新鲜烟叶中不存在，所以，在农业生 产中，可以通过降低烟叶中t s n a 的前体物质，来降低t s n a 。n 0 3 。、n 0 2 。是 t s n a 的主要前体物质，所以，在烟叶生长的过程中，能够降低n 0 3 、n 0 2 的 含量，对烟叶的质量、安全性的提高有很大的意义。由于新鲜烟叶中n 0 2 的含 量较低，n 0 2 主要在调制过程中生成，所以在培育过程中，主要通过降低烟叶中 的n 0 3 的含量，来达到降低t s n a 的目的。 1 3 2 1 选育优良品种 不同类型的烟株，n 0 3 、n 0 2 含量有所不同。烤烟中n 0 3 。、n 0 2 含量低于 白肋烟( 陈秋会、赵铭钦，2 0 0 8 ) 。烟草植株中的n 0 3 。、n 0 2 。含量主要取决于植株 的基因。选育优良品种，是得到低n 0 3 、n 0 2 含量烟叶的一个最有效的方法。 从生化和遗传基因的角度，可以通过对低n 0 3 。、n 0 2 。品种进行杂交，再从杂交 后代中筛选出n 0 3 、n 0 2 含量低于双亲的优良组合。 利用现在生物学技术，可以从基因水平对烟草品种进行改良。利用分子标记 6 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 技术，例如s s r 、a f l p 等，可使烟草不同的生态型和不同近交系的d n a 产生 多态性，表现出物种特异性，从而构建烟草d n a 图谱，找出控制烟草n 0 3 。、 n 0 2 含量水平的相关基因，进而在基因水平上进行操作，有针对性地改良基因， 培育出n 0 3 。、n 0 2 。含量较低的烟草新品种( 刘万峰，2 0 0 2 ) 。 1 3 2 2 改善光照、温度，合理灌溉 光照强度对烟叶中n 0 3 的积累影响很大，光周期短或者光照弱都会造成叶片 中n 0 3 的积累。光照决定了光合作用的强弱，光合作用的强弱限制了在叶绿体中 糖类的合成速度，进而影响细胞中n a d h + 的生成，积需要n a d h + 为它将n 0 3 还原为n 0 2 的电子供体，所以光照强弱能够调讯的活力，并直接影响植株体 勾n 0 3 的累积，强光照下烟叶的n 0 3 含量较低，弱光照下烟叶的n 0 3 含量较高。 在正常光照条件下，光合作用良好，能够促进n r 的合成，并提高其活性，同时 植株生长量大，吸入的n 0 3 可被稀释而不致积累太多，因此，强光照有利于n 0 3 含量的降低( 倪晋山，1 9 9 0 ；许长蔼，1 9 9 1 ) 。 温度也会影响植物对n 0 3 的吸收，v a a s t ( 1 9 9 8 ) 钡l j 定了不同温度条件下烟草对 n 0 3 - 的吸收，实验结果表明：在一定的温度范围内，随着温度升高，根系对n 0 3 。 的吸收也随之加快。温度与烟叶n 0 3 含量之间呈负相关，即气温越高，n 0 3 含量 越低，气温越低，n 0 3 含量越高。 水分也会影响植物体内n 0 3 的含量。水分是植物体内重要的部分，n 0 3 的吸 收、转化、运输均与植株内水分的运动密切相关，n 0 3 溶解于水中然后向植物 体内各处迁移，这个过程需要水分的蒸腾作用推动。干旱情况下，植物水分运动 不足，n r 活性会受抑制，n 0 3 的积累显著增加。因此，合理灌水也是调控烟叶 n 0 3 。含量的重要的步骤。 1 。3 2 3 合理施肥 土壤有机质对烟草植株的生长有直接的作用。土壤中有机质，含有植物生长 过程中的必需元素，土壤通过对有机质的吸收和释放来影响土壤中n 、p 、k 、s 和一些微量元素对烟草植物的供应。 陈伟等( 2 0 0 4 ) 通过对4 个烤烟品种3 个等级的2 5 6 个烟叶样品进行研究，分 析烟叶中n 0 3 。、n o z 含量与土壤有机质的关系。结果表明：不同品种、不同等 级烟叶中n 0 3 含量与土壤有机质均呈极显著的正相关；不同品种、不同等级烟 叶中n 0 2 与土壤有机质的正相关也达到1 的极显著水平。烟草的根对n 0 2 - 极 其敏感，土壤缺氧时，n 0 3 会与有机质结合生成n 0 2 ，导致根部积聚大量的n 0 2 ， n 0 2 含量达到毒性浓度时，会妨碍新根的产生，且会使烟草根黑腐病恶化( 文0 t f l 衡，1 9 8 2 ) 。土壤营养元素含量水平是影响烟叶体内n 0 3 含量的关键因素，所以 7 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 施肥时必须考虑土壤中不同营养元素的水平，以免不合理施肥导致烟叶n 0 3 。含 量过高。 n 素是影响烟叶中n 0 3 。、n 0 2 含量高低的主要因素。烟叶的生长过程中， 在一定范围内，随着施n 量的增加，烟叶中的蛋白质含量随之上升，n 0 3 含量 也会较缓慢增加；当施氮量达到或超过一定限度后，烟叶中蛋白质含量会有所下 降，n 0 3 。含量却反而剧增，从而影响烟叶的品质。研究表明：随着施氮量增加， 特别是硝态氮肥的增加，烟草中n 0 3 。、n 0 2 、生物碱、t s n a 的含量也随之呈 上升趋势( c h a m b e r l a n ，19 8 6 ) 。 p 也影响烟叶中n 0 3 、n 0 2 。含量高低。p 是硝酸还原酶( n r ) 、亚硝酸还原 酶( n i r ) 的重要组成部分，参与n 0 3 。、n 0 2 的同化和转化过程，所以，它能够影 响烟叶中n 素的吸收。在n 素充足的条件下，缺p 会导致烟叶组织内n r 、n i r 的活性不足，进而导致n 0 3 的积累。在一定范围内，随着p 素的减少，n 0 3 的 积累不是很明显，但是超过一定的范围，n 0 3 会显著积累。 k 是烟草中重要的一种元素。k 是植株内酶的活化剂，能促进植物体内蛋白 质的合成，介质中钾浓度与叶片n 0 3 含量呈极显著负相关，k 素供应充足时， n r 活性相对也较高，有利于n 0 3 - 的还原，n 0 3 含量较低，当供k 不足时，n r 活性及n i r 活性受到抑制作用，造成n 0 3 的积累。 z n 也是多种酶的组分或活化剂。z n 参与植物体内有机物质的氧化，还原和 水解，能促进蛋白质的生物合成，由于植物吸收的n 0 3 必须还原为氨后，才能 被同化为氨基酸，缺z n 会影响n 0 3 向氨的转化，从而会造成n 0 3 在烟草植株 中的积累( h i t o s h i ，1 9 8 8 ) 。 c l 对烟叶品质影响较大。同时c l 离子对n 0 3 - 离子有拮抗作用和取代效应， 可以抑制植株中硝化细菌的活性，促进n 0 3 - 对氨基酸的转化，合成蛋白质，进 而降低植株n 0 3 的积累，所以c l 供应不足会影响烟株正常的生长发育。( 杨 海，1 9 9 9 ) 。对少数缺c l 土壤应特殊对待，适当施氯肥。 在众多微量元素中，m o 对植物n 0 3 积累的影响最为明显。m o 的主要生理 功能是参与固氮作用和n 0 3 的还原，m o 作为n r 的重要组成部分，能激活植 物体内n r 的活性，提高酶催化效应，缺m o 会使植物体内n r 活性降低，造成 过量的n 0 3 积累。在低钼土壤中，随着加入钼浓度的增加，植物n r 活性逐渐 提，而n 0 3 含量却逐渐下降( 孙映波，1 9 8 8 ) 。在缺m o 土壤中增施钼肥，对降低 烟叶中n 0 3 含量有一定作用。在植烟土壤上，m o 肥的丰缺同样影响烟叶n 0 3 。 的积累。 适宜的土壤肥力、土壤有机质含量会使烟株正常地生长，生理代谢保持正常， 使烟株中n 0 3 含量保持在较低的水平，提高烟叶原料的可用性。 第一章烟叶硝态氮、亚硝态氮调控研究进展 1 3 2 4 适当的调制方式 烟叶在调制过程中，烘烤会造成水分的丧失，细胞膜遭到破坏，细胞内营养 物质流到细胞间。一些影响烟叶中n 0 3 含量的微生物，在烟草生长过程中就附 着在烟叶表面上，由于环境条件的限制，没有大量繁殖，调制过程中较高的湿度、 适宜的温度以及缺氧等条件适宜微生物的生长和繁殖，而微生物和酶的作用可使 烟叶中的n 0 3 还原成n 0 2 ，造成n 0 2 的积累，从而产生t s n a ( 杨焕文，2 0 0 0 ； f l