（控制科学与工程专业论文）离子阱串联质谱数据de+novo分析方法与实现.pdf

国随科茎篮丕太堂亟兰焦论塞 摘要 蛋白质的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少地一步。近些年来，由于串联质 谱技术可以高通量地进行蛋白质鉴定以及其它很多优势，使得质谱技术成为蛋白 质组学领域的主流技术。串联质谱实验产生大量的质谱数据，这些质谱数据中蕴 含着丰富的多肽和蛋白质一级结构信息，但这些信息必须经过处理才能得到多肽 和蛋白质的鉴定结果。串联质谱数据d en o v o 分析方法研究”来源于人类肝脏 蛋白质组计划表达谱数据分析平台建设。本课题的焦点主要集中在图谱的预处理 和图谱的从头解析( d en o v o ) 算法。 本文首先介绍了课题的相关背景、意义以及从头解析( d en o v o ) 算法的研究 现状，并对从头解析( d en o v o ) 算法的发展趋势发表了自己的一些想法。由于质 谱仪是一个很复杂的系统，由不同部分组成；而每个部分都可以有很多选择，这 样组成地不同系统有不同的特性，而这些特性对于图谱预处理方法以及从头解析 ( d en o v o ) 算法有很大的影响。质谱中存在大量的噪声，这会使得鉴定时间增加、 精度下降，质谱数据的预处理就变成一个不可忽略的翘题。在第三章介绍了图谱 预处理的基本原理、方法，并进行了一些融合。图谱解释九步法是所有从头解析 ( d en o v o ) 算法的基础和出发点，在第四章探讨了图谱解释九步法的基本原理、 具体示例，并基于图谱解释九步法设计开发了图谱解释程序。这个程序可以作为 人工读图的辅助工具，并且已经被应用于实验人员的判图实践，加快了工程进度。 在第五章讨论了p e p n o v o 这种d ei i o v o 算法，并用标准质谱数据对其进行检验和 评价，结果表明这种从头解析算法的预测准确率比较优异，但并不是十分可靠。 同时由于p e p n o v o 只给出了最后结果，无法进行蛋自质修饰的鉴定。这些原因导 致它并不适合于工程应用 关键词串联质谱蛋自质鉴定质谱数据预处理d en o v o 图谱解释九步法概率两络模型 第页 国陵登兰蕴垄盍雯亟堂篮j 幺塞 i nr e c e n ty e a r s ，m a s ss p e c t r o m e t r y ( m s ) h a sb e e no n eo ft h em o s t s u c c e s s f u lt e c h n i q u e si np r o t e o m i c sr e s e a r c h e s p e c i a l l y ，t h et a n d e mm a s s s p e c t r o m e t r y ( 蟋璐) h a sb e e nw i d e l yu s e df o rh i g h t h r o u g h o u tp r o t e i n i d e n t i f i c a t i o n m a s ss p e c t r o m e t r yc a np r o d u c ea l a r g ea m o u n to fd a t a t h e d a t ai n c l u d ea b u n d a n ti n f o r m a t i o no fp r o t e i ns t r u c t u r e 。b u tt h i s i n f o r m a t i o nn e e dp r o c e e dt og e tt h ei d e n t i f i c a t i o nr e s u l to fp e p t i d ea n d p r o t e i n 。r e s e a r c h i n g o fd en o v o s e q u e n c i n gu s i n gt a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y ”c o m e sf r o mt h eb u i l d i n go fp r o t e i ne x p r e s s i o na n a l y z i n g s y s t e mo fh u m a nl i v e rp r o t e o m ep r o j e c t ( h l p p ) i nc h a p t e r1 ，t h ea r t i c l ei n t r o d u c e sb a c k g r o u n d 、s i g n i f i c a n c eo ft h e r e s e a r c h i n ga n dt h er e c e n ts t a t u so fd en o v os e q u e n c i n g i nt h el a s t ，t h e a r t i c l ee x p a t i a t e ss o m et h o u g h t so ft h et e n d e n c yo fd en o v os e q u e n c i n g m a s ss p e c t r o m e t r yi sac o m p l e xs y s t e m ，i n c l u d i n go fs o m ep a r t d i f f e r e n t p a r th a sm a n yc h o i c e s 。s od i f f e r e n ts y s t e mh a sd i f f e r e n tp e c u l i a r i t ya n d t h i s i si m p o r t a n tf o rt h ed e s i g no fm a s sd a t ap r o c e s s i n ga n dd en o y o s e q u e n c i n g m a s sd a t ah a sal o to fn o i s e ，t h i s , i l li n c r e a s et h et i m eo f p e p t i d ei d e n t i f i c a t i o na n dl o wd o w nt h ea c c u r a c yo fi d e n t i f i c a t i o n t h e p r o c e s s i n go fm a s sd a t ai sap r o b l e mc a nn o tb ei g n o r e d i nc h a p t e r3 ， t h ea r t i c l ei n t r o d u c e ss o m em e t h o d sa n dc o m b i n e st h e lt h e s em e t h o d sa r e u s e f u lf o ra d v a n c i n gt h es p e e da n da c c u r a c yo fd en o v os e q u e n c i n g n i n e s t e p sm e t h o do fm a s si n t e r p r e t a t i o ni sb a s eo fd en o v os e q u e n c i n g i n c h a p t e r4 ，t h ea r t i c l ei n t r o d u c e st h eb a s i ct h e o r yo ft h i sk i n d o fm e t h o d a n dg i v e ss o m ee x a m p l e f i n a l l y ，t h ea r t i c l ei n t r o d u c e san e wp r o g r a m b a s i n go nn i n es t e p sm e t h o do fm a s si n t e r p r e t a t i o n t h i sp r o g r a mc a nb e a na i dt o o la n dh a sb e e nu s e di nt h ep r o j e c t t h ec h a p t e r5d i s c u s s e s p e p n o v o ，t e s t sa n de v a l u a t e st h ep r o g r a mu s i n gs t a n d a r dm a s sd a t a t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h ea c c u r a c yi sg o o d ，b u tb e c a u s ep e p n o v oj u s t sg i v e t h ef i n a lr e s u l t ，s oi tc a nn o ti d e n t i f yt h ep r o t e i nm o d i f i c a t i o na n dd o n o tf i tt h en e e do ft h ep r o j e c t 。 k e y t o r d s ：t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ，p r o t e i ni d e n t i f i c a t i o n 。 t h ep r o c e s s i n go fm a s sd a t a 。d en o v os e q u e n c i n g ， n i n es t e p sm e t h o do fm a s si n t e r p r e t a t i o n ， p r o b a b i l i s t i cn e t w o r km o d e l 第页 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得国防科学技术大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料与我一同工作的同志对本研究所敛的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意 学位论文题目： 宣王瑗生垒珐厘道教量g ! q ! q 金盘左洼盏塞超 学位论文作者签名：i 整整日期：口6 年j f 月z 7 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解国防科学技术大学有关保留使用学位论文的规定本人授权国防科学技 术大学可以保留并向国家育关部门或机构送交论文的复印件和电子文档。允许论文被查阅和 借阅；可以将学位论文的全部或部分内容辕入有关数据库进彳亍检索，可以采用影印缩印或 扫描等复制手段保存汇编学位论文 ( 保密学位论文在解密后适用本授权) 学位论文题目： ：矗胜皇l i 压谨熬握4 12 q ! q 佥堑友洼当去强 学位论文作者签名， 作者指导老师签名： 日期； 口f 年 7 月日 日期： 椤多年( j 月占日 国防科学技术大学硕士学位论文 1 1 课题的背景及意义 第一章绪论 在人类基因组计划完成之后，生命科学的研究开始进入到后基因组时代。研 究的重点开始从序列的测定转移到功能的分析。蛋白质组研究的目标是直接大规 模地从整体上解读生命的功能分子：蛋白质而这也是后基因组时代生命科学研 究的一个熟点 人类肝脏蛋白质组计划是由贺福初院士倡导和推动地一个蛋白质组研究的 国际计划，计划中关于表达谱的研究是为了全面鉴定肝脏中表达的蛋白质，其中 主要的技术手段就是质谱技术，特别是串联质谱技术表达谱数据已经可以大规 模地产出，数据地存储、管理和分析任务需要生物信息学提供相应的平台。 在蛋白质组研究中，质谱技术是蛋白质鉴定的主要手段质谱数据的分析主 要有3 种方法：数据库搜索方法，从头解析测序( d en o v o ) 算法和肽序列标签 ( p e p t i d es e q u e n c et a g ，p s t ) 方法。其中d en o v o 测序方法不依赖于数据库， 能够对图谱进行明确地解释，这对于新蛋白质的鉴定，提高图谱的利用率具有重 要的作用本课题是人类肝脏蛋白质组计划表达谱数据分析平台建设的一部分， 对于整个平台地建设具有重要意义。 本课题来源于人类肝脏蛋白质组计划，而肝脏蛋白质组计划的意义是不言自 明的，如对于疾病的预防、治疗，以及进一步地科研研究都有重大的理论和实际 意义人类肝脏蛋白质组计划的目标之一就是建设一个肝脏蛋白质数据管理和服 务平台，这就要求在对各种已有的方法进行比较全面和调研的基础上，博取众家 之长实现数据处理算法；同时考虑现有的关于质谱仪器原理，肽段碎裂的物理化 学原理，质谱专家的实际图谱解释经验等知识，构建自己的基于数据管理系统的 高效的从头解析( d en o v o ) 算法；这对于整个计划数据分析质量的提高，后续的生 物学研究具有重要的意义。同时。这也有利于系统总结实验原理在数据处理中的 应用方法，也具有重要的学术价值 1 2 研究现状及发展趋势 蛋白质组是由澳大利亚学者w i l k i n s 和w i l l i a m s 于1 9 9 4 年首次提出的， 第l 页 国防科学技术大学硕士学位论文 指的是某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质。随着人类基因组计 划的基本完成，蛋自质组的研究日益受到重视一般研究过程主要包含三个步骤； 分离与实验目的相关的蛋白质；蛋白质的鉴定；蛋白质功能的细致研究“其中 蛋白质的鉴定是非常重要的一步早期蛋白质鉴定一般使用e d m a n 降解法。这种 方法鉴定蛋白质非常准确，但测序速度慢，费用高，灵敏度低，而且不能对n 端 封闭的肽进行测序质谱技术就刚好弥补了e d m a n 降解法的这些缺点，质谱仪能 够准确地测量肽段和蛋白质的相对分子量、氨基酸序列及翻译后修饰等结构信 息，甚至可以对蛋白质进行相对或者绝对定量目前串联质谱技术是唯一能够迅 速对n 端封闭和共价修饰驮段进行测序的方法( 3 ) 。质谱技术很灵活，能与多种 蛋白分离、捕获技术联用质谱技术能快速地鉴定大量的蛋白质，并且质谱技术 的灵敏度也非常高( 4 ) 质谱技术的这些优点使其成为蛋白质组学领域的主流技 术。 蛋白质鉴定的技术路线如图1 1 所示首先，对感兴趣的样品进行样品制备 得到细胞；经过超速离心就可以得到蛋白质混合物，用双向电泳技术就可以分离 蛋白质混合物，得到比较纯净的蛋白质；对蛋白质进行酶解就可以得到肽段混合 物，这时就需要对肽段混合物进行质谱分析对肽段混合物进行质谱分析得到质 谱数据，最后分析质谱数据就可以得到蛋白质列表 图1 1 蛋白质鉴定技术路线 2 0 0 4 年以前，质谱数据分析方法的研究集中于搜库算法的研究，例如： 第2 页 国防科学技术大学硕士学位论文 最早的s e q u e s t ( ”，m o w s e ( “。m a s c o t ( ”，后来的p r o f o u n d ( ”，p r o b l d o ) ，s c o p e ( ， s o n a r ( “，0 1 a v 0 2 ) 等。r o v s h a n 等( ”对这些研究工作进行了分类总结，分析了 这些算法的原理。对于通量和灵敏度比较高的搜库结果的评估目前也有很多的研 究结果( 1 。) 为了解决翻译后修饰，突变和蛋白质序列数据库的不完整等问题， 研究人员们也提出了很多搜库策略以及将从头解析( d en o v o ) 算法和搜库结合的 算法幽) 。噪声问题研究人员也给于了很大的关注拉”，关于c l d 碎裂原理的 研究也有了一些进展( 3 7 州 2 0 0 5 年关于从头解析( d en o v o ) 算法的研究比较多“”，很多试图面向实用 的工具也被开发出来，例如：l u t e f i s k ，a u d e n s ，也有商业化软件，例如p e a k s 但 是这些工具缺乏与数据管理平台的合适接口，不适合大规模的数据处理任务。其 中一些关键问题的处理方法还有待于改进对多肽在串联质谱中碎裂规律的最新 研究结果及时进行总结和利用，利用统计方法对已有的可靠鉴定结果进行分析， 再基于知识推理和机器学习对串联质谱图谱进行分析，是解决质谱数据分析中图 谱利用率低，结果的假阳性高等问题的未来发展方向。从头解析( d en o y o ) 算法是 一种对图谱直接解释的方法，经验和启发式的规则对于提高算法的性能具有重要 的意义，所以，对于从头解析( d en o y o ) 算法的改进也遵循着上述思路 蛋白质组为了发现新的蛋白质，处理修饰等问题，需要新的技术出现，软 件地发展应该能够跟上技术地发展，但是大型软件地开发往往需要很长的周期， 这给数据分析带来了很多困难所以有必要对软件平台的架构进行革新，独立数 据分析的各个部分，支持局部算法地改进和加入。 i 3 课题研究内容及本人工作 本人通过调研、查阅大量相关资料，了解了实验原理，获取了背景知识。人 类肝脏蛋白质组计划产生大量的串联质谱数据，这就需要稳定而可靠的数据处理 平台，而建立数据处理平台也是人类肝脏蛋白质组计划的目标之一图谱解释九 步法是从头解析( d en o v o ) 分析算法的基础，所以本文对它进行了细致的研究， 掌握了图谱解释九步法的思路和各方面的细节，并用c 语言实现了这种算法我 们设计的程序是基于对人工读图规则的经验总结，可以作为人工判图的辅助工具 软件图谱解释九步法虽然比较简单，但是和人工判图结合在一起，就可以给出 比较可靠的鉴定结果，同时大大减轻研究人员的劳动强度。目前，这个软件已经投 第3 页 国防科学技术大学硕士学位论文 入了使用，效果很好。本文还用标准数据集，对其进行了数据实验，给出了实验结 果，并结合搜索数据库软件对蛋白质修饰的鉴定进行了一些探索，并列举了两个 示例。p e p n o v o 是最近出现的一种新的从头解析( d en o v o ) 算法，这种算法提出了 一种新的打分算法，应用了概率网络模型和假设检验。第五章讨论了这种从头解 析算法，并用标准质谱数据对其进行了检验和评价实验结果表明这种新的从头 解析算法预测准确率比较优异，但完全依靠p e p n o v o 进行肽段测序并不可行。同 时，由于p e p n o v o 只给出最后结果，不涉及蛋白质修饰的鉴定。这些原因导致它 不符合人类肝脏蛋白质组计划当前的迫切需求，这也是我们开发图谱解释程序的 直接原因。 第4 页 国防科学技术大学硕士学位论文 2 。1 概述 第二章质谱技术 生物质谱技术是近些年来发展较为迅速的分析技术之一，尤其是在生物分析 中越来越显示出其优点。质谱技术在测定生物大分子时以其快速、准确，灵敏等 优点而备受关注在质谱技术中，随着快原子轰击( f a b ) 、基质辅助激光解析 ( h i a l d i ) 、电喷雾技术( e s i ) 等电离技术的出现使得生物大分子可以电离产生气相 离子，将这些技术同碰撞诱导分离技术( c i d ) 等技术结合，可以获得蛋自质分子 的共价结构信息，同时，基质辅助激光解析、电喷雾技术等软电离技术在一定的 电离下，可以不破坏生物大分子的非共价作用，对生物大分子的非共价结构的研 究也很有益处。 近些年来，生物质谱无论是在仪器构造上，还是图谱数据分析上都取得了 显著的进展基于生物质谱的特性，m c l a f f e r t y ( 4 9 归纳出生物质谱的“5 s ”特 点：灵敏( s e n s i t i v i t y ) 、快速( s p e e d ) 、专- - ( s p e c i f i c i t y ) 、样品量小( s m a l l ) ， 同时，质谱提供的质量信息也可以提供样品分子的化学计量信息这些特点决定 了生物质谱技术在生物领域的重要性。生物质谱作为一个灵敏的通用型检钡i 器， 已逐濒成为生物大分子鉴定、肽序列质谱分析以及蛋白质高级结构测定的重要工 具，尤其是随着后基因组时代及蛋白质组学的开始，生物质谱结合其他分离、分 析工具及方法已逐渐引起广大研究工作者的兴趣，成为探测生物大分子的又一重 要工具 质谱仪一般由进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统组成 ( 如图2 1 所示) ，其中离子源、质量分析器和检测器需要在真空状态下工作， 以保证较高的灵敏度与分辨率和较少的干扰信号”。 第5 页 国防科学技术大学硕士学位论文 图2 1 质谱仪器框图 质谱数据通常用图的形式来表现，称为质谱图，即以质荷比作为横坐标，强 度( i n d e n s i t y ) 为纵坐标构成，而每一个数据对应图上的一个峰从质谱图上可 以直观的观察分子的质谱全貌。肽质量指纹图是对肽段混合物直接进行质谱分析 而得到的，横坐标表示肽段离子的质荷比( m z ) ，纵坐标表示观测到的对应的肽 段离子的数日( 强度，如图2 2 所示) 。从肽段混合物中分离出某一特定的肽段， 然后把该肽段进一步碎裂，按照肤段化学键断裂难易程度的不同，会产生质量不 同，丰度不同的碎片离子，这就产生了串联质谱图。串联质谱图的横坐标表示碎 片离子的质荷比，纵坐标表示碎片离子的强度。一般在串联质谱图中，纵坐标都 用碎片离子的相对强度来表示，即每个碎片离子的强度与图谱中强度最高的碎片 离子的比值( 如图2 3 所示) ，测量获取串联质谱图的技术就是串联质谱技术。 通过质谱图中碎片离子的丰度和质荷比信息，可以反向组合、推理出肽段、甚至 是蛋白质的构成理论上，如果肽段的碎裂是完全的( 即肽段的每个肽键都碎裂 产生碎裂碎片) ，那么我们可以通过计算同一种离子类型中相邻碎片的质荷比差 值而得到整个肽段的序列。串联质谱图的基本判读方法参见本文第四章 第6 页 国防科学技术大学硕士学位论文 2 2 迸样系统 图2 2 肽质量指纹图谱 m z 图2 3 串联质谱图 质谱方法的一个重要特点是对各种物理状态的样品都具有非常高的灵敏度， 而且在一定程度上与待测物分子量的大小无关但由于质谱仪的质量分析器安装 在真空腔里，分析样品只有通过特定的方法和途径才能被引入到离子源，并被离 子化。然后被引入质量分析器进行质量分析通常把所有用于完成这种样品引入 任务的部件统称为样品引入系统；而样品引入方式则可分为直接引入法和间接引 入法，间接引入法又可细分为色谱引入法、膜迸样法等。 直接引入法是将低挥发性样品直接装在探针上，将探针送入真空腔内，然后 给探针通大电流加热，使探针的温度急剧上升( 一般不超过4 0 0 ) ；样品分子受 第7 页 h蕾山2叶 国防科学技术大学硕士学位论文 热后挥发形成蒸气，蒸气受真空腔内的真空梯度作用被直接引入到离子源中离子 化。由于温度对样品的挥发度影响较大，需精确控制温度，但这也使固体选择性进 样成为可能。这种方法主要适合于挥发性较低、热稳定性好的样品。而对于难挥 发和热不稳定样品，主要采用解析电离( d i ) 的方法。 质谱中应用最多得是样品间接引入法，这种进样系统的研究热点之一是质谱 和色谱之间的接口技术。气相色谱( g c ) 的样品可通过毛细管直接导入到质谱 的离子源p d 如果气相色谱的载气流量较大，可在离子源前面加一级真空或者 采用喷射式分离器( 竭( 如图2 4 ) 来分流载气( 如h e 等小分子气体) 和富集待测 物。l c ( 液相色谱) m s 常采用电喷雾技术从色谱流出物中提取样品，并同时进行 样品引入。该方法的优点是不需要对仪器进行复杂的维护和调试，而且具有很高 的灵敏度和极快的响应速度。除了经典的气相色谱，液相色谱( l c ) 被用于质谱 样品引入外，超临界流体色谱( s f c ) 和毛细管电泳婵( c e ) 也可与质谱技术 联用，从而扩大了样品引入的灵活性如果采用解析电离技术，则薄层色谱( ” 纸色谱等都可用到质谱分析中来，在效率允许的情况下，可大大降低成本。 来自气相色谱 _ _ _ _ - 图2 4 喷射式射入器示意图 近年来，随着质谱在环境分析中的普及，膜进样技术逐渐得到重视在常见的 膜进样系统中，大多采用硅聚合物制作半透膜，这种半透膜能够让某些小分子有 机物通过膜壁进入真空系统，而样品中大量的基体和溶剂则不能透过因此，膜进 样技术( m i ) 特别适宜于对低含量待测物的连续在线监测。如m i m s 可望在环境 监测，工业控制等方面获得良好的应用 在质谱仪器地校正和有机物结构鉴定中经常用到炉式或池式进样，很多商品 仪器都配备了这种进样系统该系统能够长时间提供稳定的样品浓度，方便对仪 器进行校正和对待测物进行慢速扫描，从而获得精确的信号但这种方法要求样 品具有较低挥发性和较好的热稳定性；此外，使用该方法对样品的消耗量较大。 第s 页 国防科学技术大学硕士学位论文 2 3 离子化技术 由于生物样品的非挥发性、热不稳定性且分子量大等特性，使得传统的电 子电离等电离技术的应用受到极大限制。随着快原子轰击( f a b ) 、基质辅助激光 解析( m a l d i ) 、电喷雾技术( e s i ) 等电离技术的出现，大大提高了质谱的测定范围， 改善了测量灵敏度，并在一定程度上解决了溶剂分子干扰等问题，使得质谱在生 物分析上的应用得到迸一步发展。 ( 1 ) 快原子轰击( f a b ) 技术 快原子轰击技术利用快原子( 如a t ) 轰击被分散于底物( 液) 中的样品， 使样品离子溅出产生分子离子，其中快原子的产生是通过电离惰性气体a r 、x e 、 h e 等气体产生a r + ，x e + 、h e + 等离子并被电场加速，从而具有较大动能，再通 过a r 气室进行交换反应； * 扛删 ( 1 1 ) 经电荷交换后的低动能a r + 被偏转出快原子流，获得高动能快速的a r 原子对分 散于基质的样品分子进行轰击，导致样品的挥发和离解( 如图2 5 ) 。 图2 5 f a b 电离示意图 这种电离技术非常适于高极性热不稳定化合物分析在快原子轰击质谱实验 中，基质的选择较为重要，常用的基质为甘油、硫代甘油及溶解于甲醇中的三硫 赤鲜醇( d t e ) 和二硫苏糖醇( d t t ) 这些底物的特点是蒸汽压低，在高真空离子 源中能在几分钟甚至更长时间存在。快原子轰击不易获得碎片离子，在样品结构 分析中常和串联质谱( m s m s ) 联用( ( 2 ) 电喷雾技术( e s i ) 自从y a m a s h i t a 、f e n n 创立了电喷雾技术5 7 ) ，使得多肽与蛋白质分析近年 第9 页 国防科学技术大学硕士学位论文 来取得较大成功。e s i 是在高的电场中，当样品溶液以低地流速( 1 2 0 口l m i n ) 经毛细管流出后，在雾化器的辅助作用下，雾化成很细的带电液滴这种液滴在 运动过程中逐渐变小，表面电荷密度增大，当达到一定极限时，液滴爆裂，产生 更小的液滴，并循环下去。当液滴足够小时，由于液滴表面电荷密度很大，足以 从液滴中解析出分子离子而进入质谱分析器中( 如图2 6 ) 。e s i 的显著特点是被 分析离子是多电荷的，大大提高了质量测定范围。e s i 的出现大大拓宽了质谱在 生物领域的应用，使得质谱得以给出生物大分子的精确质量信息。这是生物大分 子测定技术的重要飞跃 电喷雾 c = ) 喷嘴 带 + 带 带电残基 图2 6 电喷雾原理示意图 ( 3 ) 基质辅助激光解析( 姒l d i ) 基质辅助激光解析技术是1 9 8 8 年由m i c h a c lk a r a s 及f r a n zh i l l e n k a 盈p 首次 提出鹅) 其原理同f a b 类似它是利用激光束照射分散于基质中的样品。由于这 些基质能够强烈地吸收激光，从而保护了样品分子当基质吸收一定能量后发生 爆射变为气相，同时由于基质分子与样品分子的能量交换产生分子离子进入质谱 仪m a l d i 的基质种类较多。主要特性如下： ( 1 )基质对激光有较强的吸收力 ( 2 ) 基质与样品能溶于同一种使用的溶剂中 ( 3 )具有真空稳定性 ( 4 ) 对普通存在于生物溶液中的无机盐及缓冲液等污染物具有包容性 ( 5 )可以促进样品离子化 目前常用的基质有芥子酸( s a ) 、2 ，昏一= 羟基苯甲酸、咖啡酸、砒臻酸、 安息香酸、尼古丁酸。由于基质在改善灵敏度、精确度及重现性等方面都有着重 要作用，因此目前对液态基质、固液复合基质都有一定的研究。对基质的选用， 底物也有影响基质辅助激光解析技术较之快原子轰击技术有更大的质量测定范 围，且对样品中无机或有机杂质的包容性也比快原子轰击技术大。遗憾的是基质 第l o 页 国防科学技术大学硕士学位论文 辅助激光解析技术的脉冲性使它的应用受到一定的限制。 2 4 离子阱 离子阱具有存储离子和质量分析的功能。基于这个性质上的串联质谱技术 是一种新型的时间尺度上的串联质谱，其特点是离子的产生、质量选择，离子活 化、质量分析以及多极质谱过程都在同一空间( 阱) 中进行，这与“传统”的串 联质谱的空问上的串联是不同的。 离子阱集离子产生、离子选择、离子活化、质荷比分析以至多极串联等过程 于一体，阱中母离子与子离子共存，减少传输损失，因此离子阱质谱与其他的质 谱技术相比能更有效的检测离子。离子阱质谱仪结构小巧，质量轻，灵敏度比较 高，价格相对比较便宜，而且还有多级质谱功能，可以用于气相色谱质谱 ( g c m s ) ，也可以用于液相色谱质谱( l c m s ) ，因此在各个生物实验室中比较 普及，目前文献报导中的数据比较多，离子阱的一个缺点就是质量的精度比较低 2 5 检测器 质谱仪器的检测器有很多种，此处仅对电子倍增管及其阵列、离子计数器、 感应电荷检测器、法拉第收集器等比较常见的检测器进行简要评述 电子倍增管是质谱仪器中使用比较广泛的检测器之一单个电子倍增管基本 上没有空间分辨能力，难以满足质谱日益发展的需要。于是，人们将电子倍增管微 型化，集成为微型多通道板( 妣p ) 检测器，并在许多实际应用中发挥了重要 作用除了这种形式的阵列检测器外，电荷耦合器件卿( c c d ) 等在光谱学中广 泛使用的检测器也在质谱仪器中获得了日益增多的应用。近些年来，由于 i p d ( i o n - t o - p h o t o n ) 检测器( 6 ”能够在高压下长时间稳定地工作，也引起了人们 的极大重视。 离子计数器是一种非常灵敏的检测器，一般多用来进行离子源的校正或离子 化效率的表征对一般电子倍增管而言，一个离子能够在1 0 一7 s 内弓l 发1 0 5 1 0 8 个电子，对绝大多数工作在有机物检测或生物化学研究领域的质谱仪器来说，其 灵敏度已经足够了；但在某些地球化学或宇宙学研究中，则需要用离子计数器来 进行检测，其检测电流可以低于l o 一1 9 a ( 即相当于每秒一个离子的水平) ，一般 第l l 页 国防科学技术大学硕士学位论文 离子源的信号至少也是离子计数器检出限的1 0 0 倍。 感应电荷检钡4 器也叫成像电流( i m a g i n gc u r r e n t ) 检测器，常与i c r 质量分 析器联用由于测量的是感应电荷( 流) ，感应效率较低，故灵敏度较低。但当与 i c r 等联用时，由于i c r 允许离子的非破坏性测量和反复测量，因而仍具有很高 的灵敏度 法拉第盘( 杯) 是一种最为简单的检测器这种检测器是将一个具有特定结 构的金属片接入特定的电路中，收集落入金属片上的电子或离子，然后进行放大 等处理，得到质谱信号一般来说，这种检测器没有增益，其灵敏度很低，限制了它 的用途；但在某些场合，这种古老的检测器仍有不可替代的作用如印地安那 ( i n d i a n n a ) 大学h i e f t j e 等制作的阵列检测器就利用了法拉第杯检测器的上 述特点 在某些特殊场合，还用到低温检测器。，这是一种利用在热力学温度1 m l 【左 右的低温环境中超导体的性质发展起来的检测器，它具有非常高的灵敏度，非常 低的噪音和良好的分辨率，而且对质量没有歧视，不同质量的离子均具有相同的 检测效率。但这种检测器需要在极端低温的环境下工作，限制了其应用范围 2 6 质谱仪器的发展趋势 为鉴定有机物的结构，经常需要对化合物的某种离子进行选择，然后再做碰 撞诱导解离( c i d ) 并对碎片离子进行表征，这时就需要使用串联质谱( t a n d e m m a s ss p e c t r o m e t e r ，m s m s ) ：串联质谱可分为空间串联( t a n d e mi ns p a c e ) 和时间串联( t a n d e mi nt i m e ) 两种 简单地说，串联质谱的基本思想是用一级质谱选出要研究的离子。使其进入 碰撞区与惰性气体碰撞，经过碰撞诱导解离( c o l l i s i o ni n d u c e dd i s s o c i a t i o n 。 c i d ) ，有时也叫碰撞活化解离，( c o l l i s i o na c t i v a t i o nd i s s o c i a t i o n ，c a d ) 产 生的产物由二级质谱进行分析串联质谱可以获得子离子谱、母离子谱、恒定中 性丢失谱，并可作多反应监测这些谱图可提供离子碎裂过程中彼此间的亲缘关 系，对了解化合物的结构特征可提供重要的信息鉴于m s o 的重要性，级联质谱将 成为质谱发展的重要方向 质谱技术灵敏度高，是对化合物有独特鉴定能力的分析手段，但一般的质谱 仪( 除m s m s $ ) 只能对单一组分给出良好的有关分子结构的有价值的信息如果 第1 2 页 国防科学技术大学硕士学位论文 将混合物直接引入质谱仪，它就显得有些无能为力了。将质谱技术与各种分离富 集技术联用，可在很大程度上解决这一问题。色谱与质谱的联用一直是质谱研究 的热点，并且这种研究方向在短期内将不会发生很大的变化；固相微萃取技术和 膜进样技术与质谱技术联用也是一种极富生命力的分析技术 在质谱仪器的研制中，仪器的小型化不但有很好的学术价值，同时也有显著 的经济效益，这一点是显而易见的。质谱仪自问世以来，因其能够方便快捷地提供 被分析样品的大量信息( 尤其是结构信息) 而褥到了广泛应用，为人们认识自然、 改造自然和保护自然提供了一种强有力的工具，日益成为一种不可或缺的精密分 析仪器在生物武器和化学武器的监测与防护、环境质量( 尤其是野外和居室环 境质量) 的现场监测与评价、工业过程控制、药物检测和疾病诊治等诸多领域中， 小型化的质谱仪都是一种非常重要的工具质谱学家c o o k s 教授说，能够应用大 型质谱仪的绝大多数领域都可以让小型化的质谱仪大显身手，而那些不适合使用 大型质谱仪的场合也可以方便地使用小型化的质谱仪。可以预料，小型化的质谱 仪作为大型质谱仪的有力补充将会获得越来越广泛的应用，大大加快人们从必然 王国向自由王国过渡的进程 第1 3 页 国防科学技术大学硕士学位论文 3 1 引言 第三章图谱预处理 全部分析误差可分为三类：粗差、随机误差和系统误差 粗差是由一些明显的因素引起的，因而是可以消除的例如，质谱仪的高真 空没有抽好，或者离子源装配上的偏离致使分辨恶化引进的误差；或者分析完样 品善后处理不妥，分析结果中有残存样品影响的实验数据；或者发现有关电子部 件工作异常引起分析差错，等等 但是，即便一台仔细调正好的仪器，对所解的问题已具有足够的分辨，峰形 良好、轮廓清楚高阻线性及放大器线性都作了检查，屏蔽了杂散磁场对电子倍 增器的影响，等等。但总有一些没有被完全认识和控制的因素影响着最后的测量 结果 这里可分为两大类，一类是随机因素，就是说它们的影响完全是偶然性质的， 如电离中离子发射过程中的涨落，电子倍增器放大系数的起伏，微弱离子流表现 出来的电流非连续性等等这些因素的影响遵从统计规律，致使测定值围绕某个 平均值有一个分布另一类是系统误差，它与设备和方法有关，质量歧视效应， 特别是与样品蒸发电离有关的分馏效应，是产生这种分析误差的主要因素 这些误差就会在最后得到的图谱中形成随机峰，也称为噪声或噪声峰不对 这些噪声进行过滤、预处理，从头解释( d en o v o ) 算法就会得到很多的随机匹配， 产生错误的匹配结果目前，图谱预处理问题并没有得到很好的解决，这是导致 + 最后得到错误的匹配结果的根本原因 当前，利用串联质谱鉴定肽序列主要有三种方法： ( 1 ) 数据库搜索方法，此方法是基于把实验图谱与数据库中的理论图谱进 行相似度比较，并且按照一定的打分算法进行打分，最后给出最佳匹配的多肽序 列或者多肽序列列表 ( 2 ) 从头测序( d el l o v o ) ，这种方法直接分析串联质谱数据而得到多肽序 列，不需要搜索数据库。理论上，如果多肽的碎裂是完全的( 即多肽的每个肽健 都碎裂产生碎裂碎片) ，则可以通过计算同一种离子类型中相邻碎片的质荷比差 值而得到多默序列这类的系统和算法有s h e p 础g a ( 6 3 ) ，p e a k sc “) ，l u t e f i s k ( 6 5 ) 第1 4 页 国防科学技术大学硕士学位论文 等 ( 3 ) 肽序列标签法，这种方法是前两种方法的结合。当使用d en o v o 方法 不能得到全序列，就把从串联质谱中分析得到的候选序列的片段信息作为肽序列 标签，然后利用这些部分序列信息搜索数据库，得到多肽序列这种方法可以提 高搜索的效率和准确性( 卿 无论采用哪种方法进行多肽序列的鉴定，图谱中的噪声都会大大增加计算的 复杂度，并产生假阳性和假阴性问题，这就使得图谱预处理交得非常必要有效 的图谱预处理算法可以消除不利因素的影响，提高测序的效率和准确性 。3 2 基线识别算法 目前，比较流行的各种基于串联质谱的蛋白质鉴定软件所采用的预处理方 法，都是着眼于对谱峰强度进行处理，大多属于阀值类方法，即根据某个阀值， 保留阕值以上的蜂作为信号峰，而阀值以下的被当作噪音峰抛弃。这是由于仪器 等原因，每张图谱都会有一条噪音峰的水平强度基线( 即阀值) 根据基线的设 定方法，可以大致分为三类： ( 1 ) 固定基线算法嘟) ，即根据经验对所有的图谱设定同样的基线，不考 虑图谱的差异比较简单的就是绝对强度基线法，即给定一个绝对强度的基线， 在此基线以下的全部舍弃，这种方法弊端十分明显因为不同机器，不同实验室， 不同的实验人员，不同批次的实验得到的图谱的强度差异非常大，即便是同一批 次的实验数据，在强度上同样有很大差异。简单设定一个固定的值，尽管是经验 性的，效果也是不能令人满意的。这个阀值对于一些平均强度大的图谱会过低， 不能缩减任何的谱峰，而对于一些平均强度小的图谱又会过高，把大部分的谱峰 都判为噪音峰；这两种情况都会严重影响测序的准确性( 如图3 1 所示) 。把图 谱a 和b 的基线都定在绝对强度7 0 处，对于图谱a 比较合适；而在此基线下， 图谱b 在此基线下就只剩下几个谱峰，这就会对后续测序产生不利影响 第1 5 页 国防科学技术大学硕士学位论文 t ”s , s ：a k ；t 3 y l ：l * l q f l g 口j 3 l - lm 旷。i萨 z a ) 图3 1 绝对强度基线法示例 在此基础上修改可以得到相对强度基线法，即将峰强归一化，取定一个百 分比值，在此基线以下认为是噪音。相对强度的方法避免了绝对强度基线法的一 个弊端，但这种方法不能改变谱峰的强度分布关系，比如某些图谱的谱峰分布很 集中，那么相对强度也会集中；某些图谱的谱峰分布很分散，强度高的谱峰特别 高而强度低的谱峰特别低，那么相对强度的分布也就很分散，这些时候也会出现 和绝对强度基线类似的情况( 如图3 2 所示) 。对于图谱a 经该基线过滤，可以 有效地过滤掉一些低强度噪音，而图谱b 经该基线过滤后，仅剩下不到5 个峰， 这就使得后续测序很难进行。 h ，s e s ：蝴 董缝 j， 。t r 1t ! - l f i - ，t 佛) 图3 2 相对强度基线法示例 这种固定基线方法简单易行，但最大的不足就在于没有根据用户当前提供的数据 第1 6 页 国防科学技术大学硕士学位论文 寻找基线，而固定一个基线，无法考虑当前图谱的强度分布。 ( 2 ) 窗口基线法( 6 “，这种方法根据图谱的谱峰分布，在谱峰分布强度不 同的区间给定不同的基线，这些平均强度不同的区间被称为窗口( 如5 0 d a 为一 个窗口，如图3 3 所示) ，计算出每个窗口内谱峰强度的平均值以及标准差，将强 度的平均值加上标准差作为窗口的基线。这种方法相比于固定基线法有改进，设 置基线时考虑了在不同的质量段，会有不同的谱峰强度分布。 窗口 图3 3 窗口基线法示意图 ( 3 ) 、固定峰数法( 卿，这个方法可以看作是有效峰挑选的方法这种方法将谱 峰按照强度高低进行排序，保留固定数日的峰作为信号峰( 如2 0 0 个) ，其他的 都作为噪音舍弃，这个方法比固定基线方法有所改进，不需要考虑图谱的谱峰强 度分布，取强度最高的固定数目的谱峰进行后续的分析。但是有的图谱的谱峰可 能很多，会丢掉太多的信息( 如图3 4a 所示) ；而有的图谱的谱峰可能很少， 甚至不到1 0 0 个，这就会使得预处理产生不了作用，所有的谱峰都被保留( 如图 3 4b 所示) 第1 7 页 国防科学技术大学硕士学位论文 3 3 预处理效果 i 鞠u 泣t zi ：1 1 6 。l。|lj，一。 。1 - 1 a )( 琊 图3 4 固定峰数法示例 无论是人们的日常生活还是科学研究，噪音无处不在，是人们比较头疼的 问题，而噪音消除也成了人们重点研究的问题之一由串联质谱技术产生的大量 数据中，同样不可避免的也存在很多噪音( 在本文与质谱数据中的峰相应，称之 为噪音峰) ，这些噪音峰给后面的蛋白质鉴定带来了很大的困难。因此，串联质 谱数据的预处理虽然不是肽鉴定流程中最重要的一环，但却是快速、精确的鉴定 肽序列不可或缺的一部分如果不进行预处理，不仅会浪费大量计算时间在噪音 峰上，而且还会使由随机匹配导致的假阳性率和假阴性率增高，但是如果预处理 过于复杂，可能就会适得其反。 本文所采用的图谱数据预处理算