（生物化学与分子生物学专业论文）整合非编码rna的人类基因调控网络研究.pdf

中山大学硕士学位论文 整合非编码r n a 的人类基因调控网络研究 专业：生物化学与分子生物学 硕士生：陈俊宇 指导教师：屈良鹄教授 摘要 后基因组时代的分子生物学研究需要从整体的角度，系统地阐述基因参与的 生物调控过程。基因调控网络是描述生物体内基因相互作用的方式之一，调控网 络以节点表示生物体的基因，以节点之间的连线表示两个基因的相互作用。目前 已有的研究主要关注蛋白编码基因之间的相互作用。 随着近年来非编码r n a ( n o n c o d i n gr n a ) ，特别是m i r n a 功能研究的深入， 显示生物体内存在着广泛的基因转录后调控。如一个m i r n a 基因可以调控数以 百计的蛋白编码基因的表达；已有实验结果显示m i r n a 基因在胚胎发育、组织 分化、癌症形成等过程中扮演着关键角色。 本研究提出了构建基因调控网络的新观点，通过综合不同来源的数据，首次 构建了包含蛋白编码基因与非编码r n a 基因的人类基因调控网络。 论文在m i r n a 靶目标预测的数据方面采用了综合多种计算机预测方法，以 及结合作用位点保守与不保守两类情况的数据，通过g o ( g e n eo n t o l o g y ) 分析 统计了m i r n a 预测靶基因的功能分布特点。提出现已发表的m i r n a 靶基因分 析因为往往只使用一种计算机预测方法，并且只采用物种间保守的靶基因预测结 果，可能导致所得出的推论与m i r n a 的实际功能不一致。 论文分析得到调控一个蛋白编码基因的m i r n a 数目，与该蛋白基因跟其他 基因的相互作用数目之间存在着相关性。论文根据基因的调控m i r n a 数目与跟 其他基因的相互作用数目两个属性对蛋白编码基因进行分类，发现受m i r n a 调 控数目多的基因较多与转录相关；而与其他蛋白编码基因作用较多的基因，相应 的m i r n a 作用位点数较少，并且与基因的翻译、r n a 剪切等有关。 论文根据所建立的基因调控网络，系统地分析了人类基因组中涉及m i r n a 鳖盒韭绫塑基! 坠鲍厶耋蕉旦塑蕉婴垒塑塞 的三类作用模式：( 1 ) 宿主基因与内含子m i r n a 共同作用于另一个蛋白编码基 因。其中发现了一个宿主基因与其内含子m i r n a 共同负调控靶基因的已验证的 实例，为研究内含子m i r n a 的起源提供了新的材料；( 2 ) m i r n a 簇中的不同 m i r n a 分另q 作用于存在着相互作用的两个蛋白编码基因。其中一个预测的结果 已为最新的实验结果所证实，为研究m i r n a 簇内的不同m i r n a 基因与靶基因 之间的协同进化提供了参考数据；( 3 ) 预测了一个由两个宿主基因与其各自的内 含子m i r n a 形成双向负调控回路的例子。 本研究的结果为进一步认识人类m i r n a 基因的功能特性提供了重要参考， 论文所预测的结果为实验验证提供了基础，为研究模式生物的基因调控机制的进 化提供了参考。 关键词：非编码r n a ，m i r n a ，基因调控网络，蛋白质互作网络 巾出大学硕士学靛论文 c o n s t r u c t i o no fh u m a ng e n er e g u l a t o r yn e t w o r k c o m p r i s i n g p r o t e i n - c o d i n gg e n e sa n dn o u c o d i n gr n a s m a j o r ：b i o c h e m h t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：c h e nj u n y u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rq ul i a n g h a b s t r a c t i nt h e “p o s t - g e n o m i c e r a , t h e r e san e e df o rs y s t e m a t i ca n a l y s i so fg e n ef u n c t i o n s i nt h ec o n t e x to fi n t e g r a t i v eb i o l o g y , t h eg e n er e g u l a t o r yn e t w o r k , w h i c hr e p r e s e n t s g e n eo rp r o t e i na sn o d e , a n dt h e i ri n t e r a c t i o na sl i n kb e t w e e nt w on o d e s ，i saw i d e l y u s e dm e t h o df o r t h er e p r e s e n t a t i o no fa no r g a n i s m sg e n e - g e n ei n t e r a c t i o n s p u b l i s h e d r e s e a r c ho ng e n er e g u l a t o r yn e t w o r k sm a i n l yf o c u s e d0 1 1p r o t e i n - c o d i n gg e n e s r e c e n t l y , t h es t u d yo ft h en o n c o d i n g - r n a s , e s p e c i a l l ym i r n a , r e v e a l sah i d d e n n e t w o r ko f p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n ee x p r e s s i o nr e g u l a t i o n m i r n a , t y p i c a l l y1 9t o2 4 n u c l e o t i d e si nl e n g t h , c a l lt a r g e th u n d r e d so fm r n a sb yi m p e r f e c tc o m p l e m e n t a r i t y l dm r n a3 u t r s 。m i r n a sh a v eb e e ni m p l i c a t e di ne m b r y o n g e n e s i s , o r g a n o g e n e s b a n de v e nt u m o r i g e n e s i s t h i sp a p e ri m p l e m e n t san e wi d e ao ng e n er e g u l a t o r yn e t w o r kr e s e a r e l lt h r o u g h ad a t a - i n t e r g m t i o nm e t h o d , ac o m p r e h e n s i v eh u m a ng e n er e g u l a t o r yn e t w o r ki s c o n s t r u c t e d , c o m p r i s 堍b o t hp r o t e i n - c o d i n gg e n e sa n dm i r n ag e n e s , f o rt h ef i r s t t i m e t h i sw o r ka d o p t ss e v e r a lc o m p u t a t i o n a lm e t h o d sf o rt h ep r e d i c t e dt a r g e ts e to f m i r n a s , i n c l u d i n gb o t hc o n s e r v e ds i t e sa n d n o n - c o n s e r v e ds i t e si nm r n a3 u t r s + af u n c t i o n a lc a t e g o r yo fm i r n at a r g e t e dg e n e si sg i v e nt h r o u g hag o ( g e n e o n t o l o g y ) a n a l y s i sa p p r o a c h ac o n c c l a li sr a i s e df o rt h ev i a b u i t ro fp r e v i o u ss t u d i e s ， w h i c ho n l yu s e do n ec o m p u t a t i o n a lm e t h o da n du s e dc o n s e r v a t i o nf i l t e r i n gf o r m i r n at a r g e tp r e d i c t i o n s t h i sp a p e rs h o w saw e a kc o r r e l a t i o nb e t w e e nm i r n at a r g e ts i t e sa n dk n o w n i n t e r a c t i o nn u m b e rf o rp r o t e i n - c o d i n gg e n e s a n dg e n e sc a l lb ec l a s s i f i e di n t ot h r e e g r o u p sb yt h e i rm i r n at a r g e ts i t en u m b e ra n dt h e i rg e n ei n t e r a c t i o nn u m b e r g o a n a l y s i ss h o w st h a tg e n e sw i t hm o r em i r n at a r g e ts i t e st e m p tt ob e 舡：a l l s c r i p t i o n - m 壁盒韭绫塑型盎艘厶耋薹旦烫毽旦终塑基 r e l a t e d ，w h i l eg e n e s i t hm o r ek n o w ni n t e r a c t i o n st e m p tt oh a v el e s sm i r n at a r g e t s i t e sa n da r er e l a t e dt or “a n s l a t i o n , m r n as p l i e i n g , e t c t h r e ek i n d so fr e g u l a t i o np a t t e r ni n v o l v i n gm i r n a st i t l es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d ：( 1 ) h o s tg e n ea n di t si n t r o n i cm i r n at a r g e t i n gt h es a m ep r o t e i n - c o d i n gg e n e ac a s ei s g i v e no f 箨v e r i f i e dm i r n an e g a t i v e l yr e g u l a t e st h ee x p r e s s i o no fap r o t e i n - c o d i n g g e n e , w h i c hi sa l s on e g a t i v e l yr e g u l a t e dt h r o u g hp r o t e i n - b i n d i n gb yt h em i r n ah o s t g e n e i ts h e d sn e wl i g h to nt h er e s e a r c ho fi n t r o n i cm i r n ag e n e sa n dt h e i rf u n c t i o n s ( 2 ) m i r n a sw i t h i nac l u s t e rr e g u a l a t et w oi n t e r a c t i n gp r o t e i n - c o d i n gg e n e s 。a p r e d i c t e dc a s ei sr e c o v e r e df i o mr e c e n t l y - p u b l i s h e dd a t a 。i tp r o v i d e sc l u e sf o rt h e s t u d yo f e o e v o l u t i o no f c l u s t e r i n gm i r n a sw i t ht h e i rt a r g e t e dp r o t e i ng e n e s ( 3 ) t w o h o s tg e n ea n dt h e i ri n d i v i d u a lm i r n af o r mal o o po fd o u b l en e g a t i v er e g u l a t i o n ，i n w h i c he a c hi n t r o n i cm i r n a t a r g e t st h eo t h e rh o s t g e n e 。 t h i sp a p e rp r o v i d e sa l li m p o r t a n tf o u n d a t i o nf o rt h er e s e a r c ho fh u m a nm i r n a g e n ef u n c t i o n s , a n dp r o v i d e sd a t af o rt h es t u d yo ft h ee v o l u t i o no fg e n er e g u l a t o r y n e t w o r ki nm o d e lo r g a n j s m g o k e yw o r d s ：n o n e o d i n gr n a ，m i r n a , g e n er e g u l a t o r yn e t w o r k ，p r o t e i ni n t e r a c t i o n n e t w o r k 1 1 研究背景 第 章前言 1 1 1 基因谲控瓣络静磷究遴装 骺基因组时代的生物科学研究需要从整体的角度，研究细胞内基嘲、蛋白质 虢及生物夸分子之阕翦籀互俸掰珏- 3 1 ，露要获整俸的屡次了解缩蕤靛功施，裁需 要以整个基因组的范围研究基因及其蛋白质产物的相互作用。基因调控网络以节 点袭示基因或蛋囱质，以连接两个节点的边表示基因或卷蛋自之阃的栩互作用， 楚撩述生物体肉笈杂懿基因闰穰互关系静蠢效方法。 基因的表达以及蛋白质产物的特性受列多方面的作用：在转录水平上的调 控，翻译水平的调控，m r n a 以及蛋白质稳定性的调控簿。另一方蕊，在一个 生物体俸内静誉淄缝织不丽细胞，报据不同瓣细稳所在环境、细胞宣鸯的特佳， 基因所受到的调控作用又有区剐，因而形成个巨大的动懑网络。通过构建基因 网络，可以表现激物体内基因豹糨互作用关系。通过基因嗣络的连接特征的分析 霹l ；盂获功能已知鹩基西预测瑟发现基因静功麓等，当前磷究得的吃较深入的是由 蛋臼质编码基因、转录因子组成的调控网络，基因网络中的调控因子通过控制基 因转蒙的开启、关闭或者效率点的细微调整，对备类生物作用通路产擞影响。 邋年来，随麓麓遴量研究技术的发展，如基霞芯片( m i c r o a r r a y ) 、酵母双杂 交技术、免疫共沉淀以及c h i p - c h i p 等，使得丈规模地研究基因、蛋囱质之间的 相黧俸崩成为可施，荠且得到了大量豹实验数据。生物镶患学研究提供丁对大规 模数据的处理分耩手段，已鸯骄究提出通遥一种实验手段，妇基因苍辟方法，依 据嶷验数据构建功能基因网络1 4 】。 男外也有研究遇过整会已鸯懿生物学知识，把生物体内魏终用过稳以统一豹 形式描述生物盼作用通路( b i o l o g i c a lp a t h w a y ) ，如k e g g 计划臣螂和r e a c t o m e 计划【7 s l 等。在某个生物作用通路中，相互关联的蛋白威寝面的变化，将导致两 个鬃篷之翅豹摆纛作用产生交纯，扶嚣导致缨您功能的变纯。这一类数据库掰攒 述戆生物作用通路实际上是簸杂的基因调控网络的一部分。 中山大学硕士学位论文 2 0 0 7 因为现有的实验手段仍然无法实现全基因组的分析各个基因之间的相互作 用，而现有的数据库、文献中记录了丰富的生物知识和数据，生物信息学领域的 研究人员提出通过使用数据整合的方法，分析整合已有的实验数据，构造基因调 控网络。已有的研究成果如l u 等人，提出了综合多种来源的数据( 包括蛋白质 相互作用数据、基因表达数据和细胞定位数据) ，构造模式生物的基因网络的方 法，并且给出了该方法在模式生物酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 上应用所得 到的结果【9 l 。 一个综合的蛋白质一蛋白质相互作用图谱可以协助科研人员发现与疾病 例如某类癌症相关的调控异常。f r a n k e 等通过整合蛋白质互作数据( p p i ) 、 基因芯片的表达相关性分析和g o ( g e n eo n t o l o g y ) 的基因注释数据，提供了一 个统一的人类蛋白编码基因相互调控网络【l o l 。通过对o m i m ( o n l i n em e n d e l i a n i n h e r i t a n c ei nm a n ) 数据库上1 1 1 1 2 1 所有已知疾病的相关基因分析，得出该论文所 提供的数据整合以及过滤策略，可以更优先地定位某个疾病的相关基因，具备医 疗应用的前景。 h p r d 计划通过文献检索的方法，整理出具有很高可信度的蛋白质相互作用 的图谱，总共达到4 0 ，0 0 0 多条记录【b l 。因为蛋白质通常以复合物的形式行使作 用，该研究分析了这些蛋白质相互作用中某些作用的异常是否为导致疾病的原 因。研究通过搜索o m i m 数据库上所有已知疾病与相关蛋白质的研究，发现与 已知疾病相关的蛋白跟其他疾病相关的蛋白之间存在相互作用的概率，比与没有 任何疾病关联的蛋白存在相互作用的概率大( p = 6 l o 彩) ；并且发现在免疫系 统、代谢、血液、眼睛和神经系统相关的异常病变中，与疾病相关的所有基因， 它们的蛋白产物之间存在直接相互作用的概率更高，显示可以从整合的蛋白质互 作网络定位与疾病相关联的基因。 1 1 2 大规模蛋白质相互作用实验研究的进展与现有数据库 蛋白质相互作用研究是构建基因调控网络的基础，根据是否支持高通量实验 可以分为两类。文献n 棚总结了现时可以用于鉴定蛋白质之间的相互作用关系的实 验方法与它们各自的特点，见表1 1 。 基于以上实验方法所得的实验数据，以及采用人工处理综合已有文献发表的 2 鳖盒韭塑璺壁垒坠盟厶耋薹旦塑蕉旦堡塑塞 研究结果，现时有多个研究小组提供查询各种蛋白质基因相互作用信息的数据库 访问服务。其中包括存储蛋白质基因之间相互作用的h p r d 、b i n d 数据库，以 及以生物通路方式描述数据库的k e g g 、r e a e t o m e 。 表1 1 鉴定蛋白质相互作用的方法f 1 4 l t a b l ei - 1m e t h o d sf o ri d e n t i f i c a t i o no f i n t e r a c t i o nb e t w e e np r o t e i n s 【1 4 l 以下介绍四个比较重要的存储蛋白编码基因相互作用的数据库： h p r d ( h u m a np r o t e i nr e f e r e n c ed a t a b a s e ) 1 1 3 1 数据库由霍普金斯大学的生 物信息学研究所维护，该数据库的数据主要来源于己发表的文献，经过研究人员 的审核后添加至数据库。数据主要包括人类蛋白组中蛋白结构域的结构、翻译后 修饰、蛋白相互作用以及一些与疾病相关的蛋白。 b i n d ( b i o m e l e c u l a ri n t e r a c t i o nn e t w o r kd a t a b a s e ) 1 1 5 1 数据库收集了多个物 种的多类分子间的相互作用信息，其中包括蛋白质相互作用的完整描述、分子复 合物及代谢途径的描述。该数据库可以用于识别蛋白质、化合物及生理过程中的 相互作用，并且还可以用于研究生物分子间的相互作用网络、代谢途径和动力学 模拟的信息。 r e a c t o m e l 5 , 6 1 ，k e g g ( k y o t o e n c y c l o p e d i a o f g e n e sa n d g e n o m e ) 1 7 ，8 l 则与前 两个数据库存储的内容有所不同，它们以通路的方式记录人或其他物种的生物作 用过程，包括新陈代谢等基本通路( 图l 1 ) ，数据经过专业的研究人员评审和整 理所得。 中山大学硕士学位论文 图1 - 1k e g g 数据库所显示的赖氨酸合成的通路信息 f i g 1 - 1g f a p h j c a iv i s u a l i z a t i o no f i y s i n es y n t h e s i sp a t h w a yi nk e g g 也有研究通过依据已知数据来源，预测两个基因之间是否存在相互作用。这 些研究通常依据以下观点：( 1 ) 功能相近的基因之间存在着相互作用的可能性比 功能不相关的基因之间的可能性更高；( 2 ) 相近物种之间存在着保守的蛋白质相 互作用。这些研究综合针对某个物种的基因注释的数据，采用与其他相近物种进 行同源性比较分析；或者采用g o 注释数据所分析得到的功能相似程度等方法， 预测出全基因组范围的蛋白质相互作用关系f 1 6 1 。 1 1 3 非编码r n a 基因功能研究的进展 很长一段时间内，生物研究者对人类基因组的关注主要集中在蛋白编码基因 和其产物蛋白质本身。而随着人类基因组计划的完成以及哺乳类转录组数据的不 断积累，研究显示，人类以及其他高级真核生物的基因组中只有小一部分编码蛋 白质，而超过9 7 的转录产物是功能多样的r n a 分子，即非编码r n a ( n o n c o d i n g r n a ) 【朋。 m i r n a ( m i c r o r n a ) 是近年来备受关注的一类非编码r n a ，它在多细胞生 物广泛存在，普遍的长度在1 9 2 4 n t 。它们由一个具有双链结构的前体经过特异 性的剪切形成。它们与多个蛋白结合，通过与m r n a 序列配对的形式对蛋白表 4 墼鱼韭缝塑型叁盟厶耋叁固塑丝旦垒堕塞 达基因行使转录后表达调控的功能。 l i n 4 是首个被发现的m i r n a 分子，实验发现i i n - 4 可以调控与线虫发育阶段 的变化密切相关的l i n 1 4 蛋白，从而起到影响线虫的发育时序控制的作用【l ”。 之后发现的1 e t - 7 以及陆续发现的m i r n a ，不单在线虫中存在，在其他多细胞动 物，包括人以及鼠类均广泛存在，它们所调控的基因类型多样。m i r b a s e 0 9 1 数据 库记录了各个物种实验鉴定的m i r n a 基因，人类基因组中表达数百个m i g n a 基因，而人类的所有蛋白编码基因中，预测其中3 0 受m i r n a 基因调控例。 1 m i r n a 基因的作用机制 以动物的m i r n a 为例，m i r n a 基因首先在细胞核内转录成前体转录本 ( p r i m i r n a ) ，并被d r o s h a 酶加工成茎环结构的前体p r e - m i r n a ，然后被e x p o r t i n 5 转运到细胞质，被d i c e r 酶加工成双链结构，其中一条链形成成熟体m i r n a 。 m i r n a 被组装进入细胞质中的r i s c ( r n a i n d u c a x ts i l e n c i n gc o m p l e x ，r n a 介 导的沉默复合体) ，行使蛋白基因转录后调控的功能( 图1 2 ) 。该功能主要可以 分为两类；导致m r n a 的切割或者翻译抑制。根据已知的研究结果，转录后调 控方式的选择取决于m i r n a 与靶序列互补配对的程度：其中互补配对高的可能 进行切割，而配对低的m i r n a ：m r n a 作用就只是产生抑制翻译表达。一般来 说，植物的m i r n a 与靶基因配对程度高，大多数是进行m r n a 切割。研究发现， 拟南芥的m i r - 1 7 1 可以完全精确地与三个转录因子基因的编码区互补，通过 r a c e 实验可以验证被切割的m r n a 片断【2 l i 。推测m i r 1 7 1 有可能像r n a i 一 样对靶位点进行切割造成植物中常见的转录后沉默现象。从m i r n a - 1 7 1 可以看 出，植物m i r n a 与靶m r n a 的互补区域并不局限在3 u t r ，而是可以分布在 m r n a 的转录区域内。植物中的m i r n a 可以结合到包括编码区域在内的多个位 点上，通过r i s c 使m r n a 被降解，并不抑制m r n a 的翻译。当m i r n a 指导 切割时，切点的位置刚好与s i r n a 介导的切割位点相同。所以植物中的m i r n a 功能与s i r n a 的功能非常相似。m r n a 切割之后，m i r n a 仍然是完整的，而且 能够指导另外的m r n a 的识别和切割。 动物中m i r n a 与靶序列的配对不完整，大多数抑制靶基因的翻译水平 2 2 , 2 3 1 。 在大部分实验结果中显示，m i r n a 与r n a i 切割靶位点作用方式不同，靶m r n a 的稳定性不受影响，而是使其翻译起始后的表达受到抑制。首先发现的m i r n a 基因l i n - 4 和1 e t - 7 ，这两个m i r n a 通过与蛋白编码基因的y u t r 区部分不完全 中山大学硕士学位论文2 0 0 7 互补，通过r n a - r n a 的相互作用，直接负调控蛋白质翻译过程。其他的m i r n a 和目标m r n a 也是通过有限的互补序列相互配对，抑制蛋白质的翻译过程。l i n - 1 4 的稳定性或者多聚腺苷酸状态不受影响，翻译的起始阶段也并没有被阻滞，这是 翻译控制中最普遍的调控机制。l i n - 1 4m r n a 和l i n - 4m i r n a 与多核糖体相联， 提示l i n 1 4 蛋白的表达在翻译起始后受到控制【。l i n 2 8 的m r n a 也在翻译后 受到l i n 4 ( m i r n a ) 的调控，说明m i r n a s 的这种调控方式是普遍存在的。通 常认为，m i r i s c 只是抑制蛋白质合成，并不降解m r n a 。现有两种关于m i r n a 作用机制的假设：在m r n a 起始翻译后，m i r n a 通过与3 u t r 作用抑制翻译 的进行；也可能m r n a 的翻译并不被阻止，但是翻译的多肽不断的被m i r i s c 复合体，或者再结合别的蛋白复合体切割。 o 、_ 一_ _ _ _ _ _ _ 穗螭撇 毫互= = = = 盥 图! - 2m i r n a 的作用过程 f 谚1 - 2m e f h a n i s mo f m i r n ai n d u c e dp o s t - t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o n 随着在动物的m i r n a 作用位点识别方面的深入研究表明，m i r n a 负调控机 制发挥作用的配对区主要是其成熟体2 8 或者2 7 位碱基的关键序列( 也称作 s e e d ，种子序列) 2 6 , 2 1 。研究认为m i r n a 的5 ，端必须要有大于7 个碱基的配对 才能发挥调控作用，在5 端关键配对序列不足的情况下，延长3 端的配对碱基 数对于发挥调控没有多大补偿作用。m i r n a 种子区能很好的与靶序列配对；靶 序列在不同物种中通常保守而种子区在同源的m i r n a 中也保守。因此，可以用 6 鏊盒蔓箍强壁丛叁鲤厶卷夔垦塑丝壁垫受瑟 种予区序列预测m i r n a 的靶蕊因。动物细胞中大多数已知m i r n a 的靶点序列 在m r n a 茨3 u 豫孛。这一魏象窝瑰在袋懿豹卖拔基瓣黥魏译调控豢要是在 3 u 讯的思想一致，在入、小鼠、大鼠和狗的基因组比对分析指出，程3 佣【 存在大量的调节结构域，而近一半的这些调节结构域与m i r n a 有关【勰1 。 2 。m i r n a 熬凌戆臻究遴袋 幽于m i r n a s 在发育和分化过程中对熬因表达调控越到了广泛丽熙是至关 重鬻的作用，而痰病往往是由予某些基因紊乱或是表达失控所引起的，因此，许 多磅究入员牙始磷究m i r n a 秘疾褒发生之瓣豹关系。一系舞瓣磅究表鹗：羲魏 中m i r n a s 在细胞生长和凋亡，血细胞分化，神经元的极性，胰岛素分泌，大 脑形态形成，心腻发生，胚胎尉期发育等过糨中发挥重要作用。 m i r n a 瑷放议为在瘗瘥形裁孛其套重要焱义。嚣羲亵m i r n a 与疼痰发生赘 相关研究已取得一定进展，在漫性淋巴细胞自血病( c l l ) 中最常见的遗传性异常 是由于染色体1 3 9 1 4 ( 约5 0 * 6 的病例) 中的一段发生缺失。一项研究表明。两个不 嚣熬m i r n a ( m i r - 1 5 翟m i r - i 国蓥霆位子c l l 蔌失孛一袋爱奎辍瘦静3 0 酶熬区 域内。m i r - 1 5 和m i r - 1 6 基因位于一个失活熬因( l e u 2 ) 的内含子中，并在b 淋 巴细胞中大量表达，在这两个m i r n a 高效寝达时，大部分( 约三分之：) c l l 癌 蘩毅麓蘩豫瘗氇一襻) 显著减少随弼。勇多 疆究还发瑗这溪令m i r n a s 攫获骧瘗 中表达下降。研究b u r k i t t 淋巴瘸病人的细胞样品发现m i r - 1 5 5 基因附近的染色 体有踅排现象。但讵常的个体巾在此区域没肖发生重排。临床分离得到的b 细 貔潍毽痞，m i r - 1 5 5 拷哭数羰：蒸鬻豹b 缀稳簿1 0 - 3 0 穰。黧莲零平懿m i r - 1 5 5 存 在予弥漫性大b 细胞淋巴瘤( d l b c l ) 病人被激活的b 细胞中。由予存在被激 活的b 细胞类型的d l b c l 病人临床预后比蒋通病人要麓，研究认为m i r n a 的 定譬在l 褒寒诊羝童霹钷会有簿庞雳辫i 。舅一矮磷究发瑶m i r n a 在蘧痰箨箕毯疾 病的发生过程中发挥一种强大的调节作用。研究表明只耍赢种m i r n a 就可以将 癌交甲状腺组织从其他健康组织中清楚的鉴测出来，为通徒新的甲状腺癌诊断和 治疗舜辟了薪遴路弘2 l 。嚣嚣在入嚣膝部、麟帮、霉部、兹列藤、结弱秘羧稼等楚 的璃细胞都发现了实体癌症m i r n a 信号【3 肌。对十二个结肠癌病人肿瘤和癌旁组 织比较发现，其中有两个m i r n a s 在肿瘤缀织中表达量肖明显下调， 纛其毽入类的疾病与m i r n a 的关系方露毪取得7 豫入静成绩。黉髓噩惩鸯萎 缩瘢( s p i n a l m u s e u l a ra t r o p h y , s m a ) 是一种由于运动神经元的生存基因( s u r v i v a lo f 中山大学硕士学位论文2 0 0 7 m o t o m e u r o ，s m ng e n e ) 突变而引起的蛋白水平降低或功能丧失所致的小儿神 经坏死疾病。s t a n 复合体中的两种蛋白( g e m i n 3 和g e m i n 4 ) 也是m i r n p s 的组 成成份。在s m a 中m i r n a 的生物合成或功能是否受到异常调控及其这些变化 对干发病机理是否起作用等有待进一步研究。有线索表明，m i r n a 可能在其它 的神经性疾病中起作用。其中的一个有趣的发现是，m i r - 2 2 4 的基因位于两个不 同的神经性疾病基因的最小限度的区域：早期的帕金森综合症和x 染色体连锁 的智力障碍。斯坦福大学医学院的研究人员发现肝脏特有的m i r - 1 2 2 与肝炎病毒 m r n a5 非编码区相互作用引起病毒增殖。这是首次在动物细胞中发现m i r n a 可以和5 非编码区相互作用来调控基因表达，似乎是一种积极的表达调控。通过 提高病毒r n a 翻译的关键蛋白的数目，从而在复制水平上调控病毒r n a ，这区 别于转录后水平的调控。虽然这一m i r n a 新作用机制还不明确，但是提供了利 用操纵这种m i r n a 来寻找治疗疾病的新途径阴1 。m i r n a 在心脏细胞的生长及 分化过程中也扮演着极其重要的平衡角色，研究表明，m i r - i 1 和m i g - i 2 在心 脏和肌肉组织中大量表达，并受到几个心脏和肌肉关键转录因子的调控，显示 m i r n a s 也像其他基因一样受到调控，这一发现开启了器官形成过程中调控的一 个全新的研究角度，即有m i r n a 参与调控器官发育形成1 3 5 1 。在另一篇论文中， p o y 等发现了一种进化上保守的胰岛特异性表达的m i r n a ( m i r - 3 7 5 ) ，并且发现 n i i r 3 7 5 过表达可以抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌：相反地，抑制内源性的 m i r - 3 7 5 则可以促进胰岛素的分泌。m i r - 3 7 5 调节胰岛素分泌的机制是独立于葡 萄糖代谢和细胞内c a 2 + 信号的，但与胰岛素细胞外排直接相关。p o y 等因此认为， i i i i r 3 7 5 是一类胰岛素分泌调控因子，可以作为一个新颖的糖尿病治疗的靶分子 3 6 1 最近还证明了脑特异性的m i r - 1 3 4 可以影响生物的学习能力，利用大鼠证 明了m i g - 1 3 4 可以调控树突棘的大小，抑制l i m k l 基因的表达，这个基因是促 进树突形成的。研究推测，在外界环境刺激后，m i r n a 选择性的控制突触的发 育，提高大脑信息存储量和计算能力【3 7 1 。 m i r n a 的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在r n a 水平对 靶m r n a 分子进行更迅速和有效的调节，展现了细胞内基因表达调控全方位多 层次的网络系统。m i r n a 的发现也是对中心法则中r n a 角色的重要补充。由于 m i r n a 在细胞分化，生物发育过程中起到如此重要的作用，并且还参与了疾病 的发生、发展，因而越来越多的引起研究人员的关注。现在需要解决的问题包括： 8 墼金j e 堡亟坠坠丝厶耋墨固塑整旦鳖塑窒 在各类生物中究竟存在着多少m i p u n a 基因和每一类m i r n a 的具体功能，这也 是后基因组时代在完成蛋白编码基因注释后快速发展后需要解决的问题之一。结 合高通量实验手段的发展和应用生物信息学的方法会使m i r n a 功能的研究更简 便高效。通过在不同的生物、不同的发育时期、不同的组织细胞内，检测m i r n a 的表达图谱，研究每一类m i r n a 具体调控的蛋白编码基因，可以更精确地掌握 生物生命活动与发育、分化调控的过程。 3 m i r n a 靶目标基因的预测与验证 因为目前实验方法仍然无法大规模地验证m i r n a 与m r n a 的作用关系，根 据计算机预测可能的靶基因提供了实验验证的重要依据。从2 0 0 3 年多个研究小 组分别发表m i r n a 靶基因的预测算法程序后，最新的生物信息学研究根据实验 结果进行分析，特别是针对m i r n a 与3 u t r 区域作用位点的识别机制的实验， 加深了对m i r n a 靶作用位点的配对方式的了解，使得计算机预测的结果具有更 高的可靠性。 s e t h u p a t h y 等综合分析了当前应用最为广泛的计算机预测靶基因软件的正确 性和敏感性，各个算法对应的计算机程序以及可应用的物种见表l - 2 ： 表! - 2 己发表的计算机预测m i r n a 作用靶目标程序p q t a b l e1 - 2p u b l i s h e dp r o g r a m sf o rm l r n at a r g e tp r e d i c t i o n 3 。l 哥髯丽蔼再啊址 可应用的生物 d i a n a - m i c r o th t t p ：w w w d i a n ap c b iu p e n n e d u ，任意 m i c r o l n s p e c t o rh t t p ：i m i m a i m b bf o 曲g r m i c r o i n s p e c t o r 任意 m i r a n d ah t t p ：h w v w m i c r o m a o r g 果蝇 m i r a n d ah t t p ：w w w m i c r o m a o r g ，脊椎动物 p j c l - a n h t t p ：p i c t a r b i o n y ue d u 果蝇 p i c t a d h t t p ：p i c t a r b i o n y u 。e d u脊椎动物 p i c t a r l i h t t p ：p i c t a n 晡o n y u e d u 任意 r n a 2 2h t i p ：c b c s r v w a t s o n i b m c o m m a 2 2h t m l任意 r n a h v b 砌h t i p ：i b i b i s e r vt e c h f a k u n i - b i e l e f e l d d e 任意 t a r g e t s c a nh t t p ：w w w t a r g e t s c a n o r g l a r c h i v e s h i m i 脊椎动物 t a r g e t s c a n sh t t p ：w w w t a r g e t s c a n o r g ， 脊椎动物 计算机预测m r n a 靶目标的步骤一般分为两步，首先通过m i r n a 基因的“种 子”区域( 即从5 端起的第l 位或第2 位开始的连续7 个核苷酸) ，搜索m r n a 的3 u t r 区域可以与之配对的位点。其中各个搜索程序对配对的要求有差异， 如p i c t a r 允许种子区域不完全配对，而m i r a n d a 则只保留完全配对的位点；另 一方面，p i c t a r 考虑了靶基因作用位点的相互影响关系。第二步将程序将搜索到 中山大学硕士学位论文2 0 0 7 的可能作用位点经过多物种的比对分析，其中t a r g e t s e a n s 要求3 u t r 区的作用 位点在各个物种均出现在相近物种的相同位置上，而p i c t a r 则只是要求相近物种 均具有同一个m i r n a 基因的作用位点。 针对已经发表的验证结果，s e t h u p a t h y 等认为当前的预测程序，针对3 u t r 区域保守的m i r n a 作用位点，使用p i c t a r 3 9 j 及t a r g e t s c a n s 两个软件的预测 结果的交集可以达到在保证一定准确性的同时，预测的靶基因数目较少。而对于 作用位点非保守的m i r n a 靶基因预测，c h e r t 等人发现3 u t r 区分布有着s n p 密度较少的序列模式( m o t i f ) ，经过比较分析，发现有许多已知的m i 鼢认作用 位点与这些序列重叠，提出可以根据s n p 分布的特点查找其他m i r n a 的作用位 点。该研究小组通过使用p i c t a r 程序的序列配对分析方法，但在位点的物种间保 守性方面并不作要求。通过序列分析，结合s n p 分布频率的特征，预测m r n a 的3 l r r r 区域上的m i r n a 可能作用位点。同时对于每一个预测的m i i 斟a 与 m r n a 作用，要求m i r n a 与其预测的靶基因至少要在某个组织共同表达，通过 这两步过滤，研究人员预计可以得到较高的准确率。1 4 0 l 1 1 4 涉及m i r n a 基因的作用模式 在生物体内的基因内各种生命活动是以基因通路( p a t h w a y ) 来执行的，而 在复杂的基因调控网络里面这些通路又存在着一些特殊的“小通路”。 图1 - 3m i r - 2 2 3 ，n f i a ，与c e b p a 组成的调控回路p 1 i f i g i - 3ar e g u l a t o r yl o o pc o m p r i s i n gm i r 2 2 3