（生物化学与分子生物学专业论文）海带硫酸多糖降解及其生物学功能研究.pdf

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2 5 脱盐，浓缩冷冻干燥得纯品。用超 滤、分子筛测定其分子量。海带硫酸多糖f 3 分子量可被降解至1 0 ，0 0 0 1 5 ，0 0 0 左右。硫酸酚法测定多糖含量，降解多糖f 3 为4 4 7 ，未降解多糖f 。的含量为 3 6 9 ：比浊法测定硫酸基含量，降解多糖f 。为6 2 7 ，未降解多糖f 。为6 1 2 ： 气相色谱法和纸层析法测定单糖组成，降解前后没有发生变化，均含有岩藻糖、 甘露糖、半乳糖、木糖，还有糖醛酸。利用高碘酸氧化、红外光谱及1 h - n m r 谱 分析等推测，海带硫酸多糖是一系列主链由o ( 1 2 ) 连接的硫酸多糖，半乳糖 山东大学硕士学位论文 为支链和主链相连接的核心。 对环磷酰胺所致小鼠白细胞降低小鼠模型注射不同剂量的海带硫酸多糖，检 测结果表明：同对照组相比，实验组小鼠的白细胞数目恢复较快，脾脏指数明显高 于对照组，说明海带硫酸多糖对环磷酰胺所造成的白细胞减少有很好的拮抗作 用。腹腔注射不同剂量的海带硫酸多糖，然后再腹腔注射环磷酰胺，结果同对照组 相比，实验组小鼠白细胞下降幅度较小，并且恢复快一些，说明海带硫酸多糖对环 磷酰胺所致白细胞减少有很好的预防作用。 关键词：海带硫酸多糖：降解：自由基：分离纯化：理化性质：生物学功能 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t e i g h tf r a c t i o n s ( f 1 r 8 ) w e r eo b t a i n e df r o ml a m i n a r i aj a p o n i c ab ye n z y m o l y s i s ， i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，a n dt h e i rm o l e c u l a rw e i g h ti s1 4 0 - 2 9 0 k d t h e yh a v em a n y b i o l o g i c a l f u n c t i o n s b e c a u s eo ft h eh i g hm o l e c u l a rw e i g h ta n dt h e c o m p l i c a t e s t r u c t u r e ，t h es t u d y o nt h e p h y s i c o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o na n d p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n si sl i m i t e d s oi ti sa nu r g e n tq u e s t i o nt ob es o l v e da b o u tt h el a n f i n a r i a p o l y s a c c h a r i d es u l f a t ep r o d u c t sa n dd e v e l o p m e n t st h r o u g h ap r o p e rw a yt h a tc a l lb e u s e dt od e g r a d ep o l y s a c c h a r i d e ，n o wt h e r ea r em a n ym e t h o d su s e dt od e g r a d e p o l y s a c c h a r i d e ，s u c h a st y p i c a le n z y m o l y s i s ，a c i d o l y s i sa n ds oo n ，w h i c ha r ee f f e c t u a l t ot h eh o m o g e n e o u sp o l y s a c c h a r i d e ，b u tn o tt ol a m i n a r i ap o l y s a c c h a r i d es u l p h a t e m a n yk i n d so fs u g a r sa r ec o m p o s e do f l p sa n dt h e i rl i n ks i t e sa r ed i v e r s e ，a n dt h e s c o p eo ft h em o l e c u l a rw e i g h tb yc o m m o nd e g r a d a t i o nw a y si sq u a n t u m t h r o u g h e x p e r i m e n t ，f r e er a d i c a ld e g r a d a t i o n i sa g o o dw a y i nt h ec o u r s eo ft h ef l e er a d i c a l d e g r a d a t i o n ，w ea d o p t e d t h e s y s t e m ( c h c o o h ) 2 + h 2 0 2 + v c i nt h es y s t e m ，i ti sh 2 0 2 + v ct h a th a v ead e g r a d a t i o ne f f e c to n t h ep o l y s a c c h a r i d et o g e t h e r , n o ta s i n g l eo n e w h e n t h ep o l y s a c c h a r i d ew a s d e g r a d e d ， i t sc o l o u rb e c o m e l i g h t a n dm o l e c u l a r w e i g h t r e d u c e d t h e b a n do nt h e e l e c t r o p h o r e s i sp i c t u r e b e c o m ec o n c e n t r a t e d ，b u tt h eb a n do ft h en o nd e g r a d a t i o n p o l y s a c c h a r i d e w a sw i d e t h e d e g r a d a t i o nd e g r e e o ft h e p o l y s a c c h a r i d e w a s c o r r e l a t i o n 、v i t l lt h ee n v i r o n m e n tt e m p e r a t u r e ，t h ev a l u eo fp h ，t h ec o n c e n t r a t i o no f t h es u b s t r a t ea n d0 2 t h ed e g r a d a t i o nd e g r e eb e c o m e sg r e a t e r 谢t l lt h er i s i n go ft h e t e m p e r a t u r e ( 1 5 3 7 c ) a n dw i t ht h ei n c r e a s i n go f t h ec o n c e n t r a t i o no f s u b s t r a t e ，t h e e x t e n to ft h ed e g r a d a t i o na l s og o tb i g g e r b u ti ft h ec o n c e n t r a t i o no ft h eh 2 0 2a n dv c i n c r e a s e d c o n t i n u a l l y , t h ed e g r a d a t i o n e x t e n tc a n n o ti m p r o v e i tw a sp r o v e db y e x p e r i m e n t t h a tt h ep o l y s a c c h a r i d ec a l lb ed e g r a d e dc o n t i n u a l l ya n dt h es y s t e mc a nb e u s e di nt h e d e g r a d a t i o n o ft h eo t h e rl p s ，c r u d e p o l y s a c c h a r i d e ，a l g i n i ca c i d ， c h o n d r o i t i ns u l f a t ea n dh y a l u r o n i c a f t e r d e g r a d a t i o n ，t h ep o l y s a c c h a r i d e c a nb e p u r i f i e db yg e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o na s e p h a d e x g - 2 5a n dc o n d e n s e d ，d r i e di n t op u r i f i c a t i o ns u b s t a n c e s i t sm o l e c u l a r w e i g h t c a nb ee s t i m a t e d b y u l t r a f i l a t i o na n d g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y t h ep o l y s a c c h a r i d eo ff 3c a nb ed e g r a d e di n t o m w l 0 0 0 0 - 1 5 0 0 0 t h er a t i ow e i g h t so f s u g a ri nd e g r a d a t i o na n dn o n d e g r a d a t i o np o l y s a c c h a r i d ea r e4 4 7 7 a n d3 6 9 a n dt h ec o n t e n to f $ 0 4 2 i nt h eb o t hp o l y s a c c h a r i d ea r e6 2 7 a n d6 1 2 g a s c h r o m a t o g r a p h ya n dp a p e rc h r o m a t o g r a p h ys u g g e s t e dt h a t ，a f t e rd e g r a d a t i o n ，t h eb o t h p o l y s a c c h a r i d e a l s oc o n t a i n e df u c ，m a r l ，g a l ，x y l ，g a ia c i da n dh a dn oc h a n g e 。 p e r i o d a t eo x i d a t i o n ，i ra n d1 h - n m ra n a l y s i sd e t e r m i n e dl a m i n a r i ap o l y s a c c h a r i d e s u l f a t ea r ep y r a n c eh e t e r o g l y c a nm a i n l yc o m p o s e d ( 1 _ 2 ) l i n k a g e s 。 t oo b s e r v et h er o l eo fl a m i n a r i a p o l y s a c c h a r i d es u l p h a t ei ni n c r e a s i n gl e u k o c y t e ， t h em i c ew e r et r e a t e dw i t hc y c t o p h o s p h a m i d e ( c p ) ，t h el e u k o c y t en u m b e rw e r e d e t e c t e da td i f f e r e n tt i m e ，a n dt h es p l e e nw e i g h t sw e r ea l s ot e s t e d t h el e u k o c y t e n u m b e ro ft h ee x p e r i m e n tg r o u p sh a dm o r er a p i d l yr e c o v e r yt h a nc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 5 ) ，a n dt h es p l e e nw e i g h tw a s h e a v i e nt h er e s u l ts u g g e s t e dl p sp o s s e s s e dt h e i n h i b i t o re f f e c t so n m u t a g e n e s i s i n d u c e db yc p k e yw o r d s ：l a m i n a r i ap o l y s a c c h a r i d e s u l f a t e ( l p s ) ；d e g r a d a t i o n ；f l e e r a d i c a l ； i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；p h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n ； b i o l o g i c a lf i m c t i o n 8 山东大学硕士学位论文 剐吾 一海藻多糖研究进展 多糖是构成生物体的一类十分重要的有机化合物，是生命的物质基础。多糖 的种类各异，在生物体内行使着不同的生物功能。在植物组织中，多糖类的主要 功能是：能量资源( 贮藏多糖) 、结构强度( 结构多糖) 和竞争性生态系统的生存和 分配“3 。 二十世纪6 0 年代以后，人们逐渐发现多糖具有许多方面的生物活性，并且 多数无毒，可能成为理想的药物来源。如昆布多糖和肝素具有抗凝血作用，硫酸 软骨素可以防止血管硬化，多种食用菌多糖具有增强免疫功能和抗癌作用等。 海藻多糖是一类海藻提取物，有着多种多样的应用价值，如琼胶、卡拉胶、 褐藻酸盐在工业上一直长期被使用；然而海藻多糖作为药物和药物中间体的潜在 功能，只是最近几年才被认识，即海藻多糖表现为抗凝血活性，抗肿瘤活性和抗 病毒活性等。 海藻多糖是一类多组分的混合物，至今为止，对其结构的研究主要集中于其 所包含的糖单元及含量。如褐藻细胞壁中的多糖包括2 5 的l 一岩藻糖、2 6 的d 一 木糖和1 3 的硫酸盐等，细胞壁多糖可能的键连接等也被进行了深入的研究”。通 过对糖组成的分析，硫酸盐和丙酮酸含量测定，以及红外光谱法、”c 一核磁共振法 等，揭示了糖单元组成中半乳糖的特征。利用薄层色谱、纸色谱、气相色谱及经 甲基后的色谱分析，测得多糖所含的糖单元及可能连接。现在从海藻中提取并研 究的海藻多糖主要有海藻酸、海藻淀粉和海藻糖胶。 海藻酸又称褐藻酸，不溶于稀酸，而溶于稀碱，成为粘稠的液体。海藻酸主 要存在于褐藻植物的细胞间隙，为线形分子，主要由b 一1 ，4 一d 一甘露糖醛酸和a 一1 ，4 一古罗糖醛酸组成。褐藻酸分子中含有一c o o h 和一o h 等大量的活性基团，使 其具有良好的亲水性，且能形成凝胶，有增稠、稳定、乳化、分散、成膜和吸附 的功能，在食品和医药工业上应用广泛。褐藻酸能富集多种微量元素，可广泛用 于医疗保健食品的研制，水质净化及污水的处理。1 1 ，稀有、贵重金属及放射性物 质的回收“1 ，痕量、超痕量元素分析“州等方面。研究表明作为金属离子交换剂， 海藻酸可与废水中的n i ”、c o ”、c r ”、c d 2 + 等发生交换作用”1 。因此，栽培大型海 藻是解决海洋污染或者水体富集营养化问题的有效途径。进一步的构效研究发现 古罗糖醛酸的含量越高，这一作用越强。褐藻酸可以被制成膜性医用敷料，在外 伤治疗中有应用价值。口服褐藻酸后能在胃中酸性条件下形成凝胶性保护膜，对 胃创面有覆盖、保护、预防粘膜炎症作用：并且还可以改变消化道症状如恶心、 山东大学硕士学位论文 嗳气、疼痛等。 经硫酸化后，褐藻酸可以制成半合成药物，即褐藻酸双酯钠( p s s ) ，具有降 血脂血压等作用。 褐藻淀粉又称昆布多糖，主要存在于褐藻植物体的细胞质中，为具有分支的 中性葡聚糖，其结构为b 一1 ，3 - d - 葡聚糖，长链上有9 - 1 ，6 结合的分支。1 。 褐藻淀粉是一种免疫调节剂。范蔓芳“”等的研究工作证明，褐藻淀粉可以促 进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，提高血清中溶血素的含量，增强体液免疫功能： 并且促进外周血淋巴细胞的转化，拮抗由环磷酰胺引起的白细胞下降，具有升白 作用。另外，还具有抗辐射的作用，能显著降低”c 。y 一射线处理小鼠的死亡率， 延长生存期；降低血清胆固醇的含量，对动脉粥状硬化具有预防效果。 褐藻淀粉被硫酸化后，可制成硫酸化的褐藻淀粉硫酸酯( l a m i n a r i as u l f a t e l 川s ) 。l a m s 是碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 附着的拮抗剂，和b f g f 依赖 性细胞增殖的抑制剂，能有效的使结合于牛胎心内皮细胞系( f b h e ) 细胞上b f g f 解离下来，并抑制f b h e 细胞的增殖“。体外培养的人微血管内皮细胞( h m e c 1 ) 培养基中加入l a m s ，则细胞增殖受到抑制，切不能形成管状结构，尽管细胞能 聚集成块。在鸡胚中植入含l a m s 的药丸，则鸡胚绒毛膜、尿囊膜不能形成，表 明血管生长受到抑制”1 现已证实，当肿瘤组织直径大于2 m m 时，需要新生血管为其继续增殖提供充 足的营养c o ! ，以便使其能迅速增殖和转移。新生血管的生长是肿瘤迅速增殖和 转移的重要条件之一“，因此，抑制肿瘤的血管生成是肿瘤治疗的一个新战略和 新途径。l a m s 对小鼠移植肿瘤r i f l ，单独给药可以使肿瘤生长延迟2 2 天( p ( 0 叭) ，与其它药物联用，则抑瘤效果更为显著。在体外，l a m s 也能抑制r i f 一1 细胞的增殖。抑制肿瘤血管生成有可能是l a m s 抗肿瘤的作用机制之一。 海藻糖胶( f u c o i d a nf c d ) ，又名为岩藻多糖硫酸酯，是存在于褐藻植物体 细胞间的多糖物质，为白色粉末，易溶于水、稀酸和稀碱，不溶于有机溶剂；水 溶液粘稠具有增稠性。关于褐藻糖胶的组分含量，其来源不同，提取方法不同， 组成含量也不相同。一般情况下f u c 含量越在3 5 4 4 ，s 0 4 含量在3 卜3 4 ，并 且还含有g a l 、x y l 、糖醛酸等。 f c d 具有很强的不均一性，不仅表现在组成成分上，而且还表现在光谱特性、 分子量、结构以及生物活性等方面。岩藻多糖是多种病毒的强大抑制剂，能够抗 h i v l 病毒活性“，硫酸化是其抗毒的必要条件，从海带中提取的岩藻多糖就含 有丰富的硫酸根。岩藻多糖可以降血糖血脂，降低血清胆固醇和血中甘油三脂、 血糖的吸收，这一作用己在小鼠高血脂模型中得到了证实1 。研究工作表明，岩藻 多糖也是一种免疫调节剂，能刺激各种免疫活性细胞成熟、分化和繁殖，使机体免 疫系统恢复平衡或得到加强“”3 。 山东大学硕士学位论文 f c d 组成成分与结构上的复杂性及不均一性，决定着不同的f c d 在许多方面 生理活性及大小是不同的，就海藻硫酸多糖对活性氧诱导的胸腺d n a 片断化的作 用，发现小分子海藻硫酸多糖的效果似乎比大分子硫酸多糖好。从海带中提取的 海藻硫酸多糖其分子量大都在几十万左右，分子量较大，给理化性质分析及生物 学功能研究带来了困难。因此，采取适当的方法把其分子量降低，是当前海藻多 糖研究的一大课题。 二海藻硫酸多糖的部分降解研究 从海带中提取的海带硫酸多糖各组分中均含有岩藻糖、半乳糖和硫酸基，所 以又称为岩藻一半乳多糖硫酸酯( f u c o i d a n - - g a l a c t o ns u l f a t ef g s ) ，除此之 外，还含有木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和糖醛酸。岩藻多糖本身种类繁多， 组成及结构极端复杂，相比之下，比肝素和壳聚糖要复杂的多。甲基化分析结合 s o 。对碱稳定性研究显示岩藻多糖是n ( 1 2 ) 糖苷键连接的岩藻糖链结构，半 乳糖为连接岩藻多糖主链和形成分支的中心。根据海带硫酸多糖的结构及实验要 求，可以对其进行部分或选择性降解。降解产物的结构常具有代表性，如分子量 较原样品小，有利于进行结构分析，减小免疫原性，利于吸收增强生物功能等。 对于海带硫酸多糖来讲，可以有多种降解方法，如酸解法、碱解法、盐解法、酶 解法及超声波降解。“、y 一射线“”和自由基降解“。这些方法对多糖的降解大都 是随机的，所得降解产物分子量范围较大：尽管有专一性的糖苷酶，但由于其价 格较为昂贵，不适合大规模工业生产。 1 部分酸水解 在多糖的降解方法中，经典的h c i 降解法已用于工业化生产。最近几年又有 多种酸解法见诸报道，如过醋酸法1 、浓硫酸法。“、氢氟酸法“2 1 等。在酸性介质 中，不同的单糖残基水解程度不一样，呋哺型单糖残基比吡喃型单糖残基容易水 解”“。故在杂多糖中，呋喃型己糖或戊糖在轻微水解中就先脱落下来：多糖中的 ( 1 6 ) 糖苷键比较稳定。在酸性条件下，多糖降解虽然有上述规律，但大部分 都是在高温条件，糖苷键的断裂基本上是随机的，降解产物分子量分布较大，给 分离纯化带来一定的困难。 2 部分碱水解 在碱性的条件下，也可以使海带硫酸多糖降解，如在4 5 ，0 0 5 nn a o h 作 用1 6 小时进行1 3 一消除反应，可以使糖苷键断裂。但碱性水解可引起多糖残基 上某o s o 。基团因亲核攻击造成的脱落和多糖链结构的变化。而硫酸基是多糖抗 肿瘤和h i v l “”病毒所必须的，所以一般不采用碱水解。 3 盐解 亚硝酸钠可以制备低分子量肝素。b a r n e a 指出1 ，亚硝酸钠降解法可以适 山东大学硕士学位论文 用于从猪肠粘膜、牛肺中提取肝素盐，这是因为肝素中的糖胺可以和亚硝酸盐作 用，使糖苷键断裂，但同时也使和氨基相连的硫酸基丢失，降低了肝素的部分功 能，降解之后需重新补充硫酸化。在海带硫酸多糖中，糖醛酸可以和亚硝酸盐反 应，也可以被降解，并且海带硫酸多糖中的糖醛酸含量可以影响降解的程度。 4 酶解 酶水解是用专一性糖苷酶和非专一性的其它酶的来进行多糖的降解，通过特 异开裂多糖中的某一糖苷键来达到降解的目的。如木质素、纤维素的降解现在已 经发现了合适的酶，并用于造纸业等；壳聚糖在糖苷酶的作用下，b ( 1 4 ) 糖 苷键发生断裂，也达到降解的目的。在酶水解的过程中无其它反应试剂加入，没 有副产物生成，若能找到合适的酶将会大大促进多糖的降解和应用。现己知有很 多微生物可以产生糖苷酶，但糖苷酶的分离纯化比较困难，所以用于工业生产也 有一定的限制。 近年来对于多糖的降解，人们又采用超声波法及y 一射线法，这两种方法同 样可以把大分子量的多糖降解，但对一般的实验室，该方法则受到一定的限制。 氧化降解法以过氧化氢为代表，主要有i i , 0 ：法、h , o , - - h c i 法、h 。o ：_ n a o c i ：、c i o ： 法等等。 5 自由基降解 具有不配对电子的氧自由基，有着极高的化学反应性。氧自由基主要包括超 氧阴离子自由基0 ：一、羟自由基h 盯、过氧化氢h 。0 2 等。h o 自由基带有一个不成 对电子，性质极为活泼，其反应活性和毒性都很强1 。m i l l e r 发现。，几种植 物多糖，如木聚糖、聚半乳糖醛酸、阿半乳聚糖和纤维素放在一定浓度的h , o ： 可以渐渐被降解。比h ：o ：更有效的是h o 自由基，它能很容易的使多糖包括透明 质酸、脱乙酰壳聚糖、支链淀粉和木聚糖降解。肝素通过该方法也可以被解聚。 解聚之后的成分若进一步采用凝胶过滤、离子交换色谱或超过滤分级法可制得分 子量较均一的组级分。根据对木聚糖降解的结构分析，其侧链上的半乳糖、木糖 易被h o 自由基攻击，从而造成骨架的断裂。对于海带硫酸多糖来讲，其侧链也 是通过半乳耱这个核心与多糖主链相连接的。实验发现，在h ：0 2 作用下，海带硫 酸多糖也容易被降解，并且降解产物分子量范围很集中，这有可能为海带硫酸多 糖的大规模降解提供一条非常好的办法。 我们研究发现，海带硫酸多糖在h , o ：的作用下被降解，起作用的实际上是h o 自由基。h o 的产生需一定的条件，可以通过y 一射线照射h , o ：。”，也可以通过 f e n t o n 反应o ”，也可以模拟植物自身的反应条件，在琥珀酸和v c 作用下，将 h ：o ：还原为h 0 。前两种方法的应用均受到一定的限制，因为y 一射线对人体有危 害，不宜操作；c u 2 + 和f e ”降解之后需处理掉，并且需要大量的螯合剂。而琥珀 酸和v c 均为小分子物质，降解之后通过透析或超滤，都可以被除去。在琥珀酸 山东大学硕士学位论文 + h z 0 ：+ v c 体系中，不是h 2 0 ：的氧化作用，因为在h ：0 ：十琥珀酸中，多糖降解产生的 多糖分子量范围很大，而且降解的程度很低；同样，在v c + 琥珀酸中，也是如此。 当在h 2 0 t + 琥珀酸中加入v c 后，多糖的降解发生了急剧的变化，首先是颜色变浅， 粘度降低，多糖的分子量也降低，在电泳图谱上表现为很集中的谱带。这说明多 糖的降解是自由基参与的过程。维生素c 能将电子供给h 0 或o 州2 “，而使之失 活；维生素c 自身氧化可以产生h 。o ：，也可以产生h o 。在h 2 0 。+ v c 浓度很低的时 候，海带硫酸多糖可以连续被降解，但降解到一定程度，降解产物的分子量变化 不大。这种情况和y 一射线降解壳聚糖相似1 。当分子量很大时，多糖链很长或 分支很多，一定时间内接受的自由基作用大，切点多，分子量变化幅度大：而当 分子量相对较小时，糖链变短，一定时间内所接受的自由基作用较小，切点少， 分子量变化幅度则小。这也有可能和多糖的组成结构有关系，如多糖中的某些单 糖所形成的糖苷键对自由基敏感等。琥珀酸+ h 。0 ：+ v c 体系降解多糖在常温条件下 就可以进行，降解之后通过透析或超滤方法就可以去除小分子的杂质。 三低分子量多糖的生物学功能 低分子量肝素是肝素分级或降解而得到的分子量较小的片段，其作为一类高 抗血栓药物和普通肝素及标准肝素相比，具有抗血栓作用强，使用方便和安全等 优点，是很有希望的一类新型药物。以肝素与抗凝血酶i i i ( a t m ) 相结合为前 提，该结合要求肝素有一个5 糖单位。这种5 糖单位为肝素抗f x a 和f i i a 所必 须。此外，抗f i i a 活性不仅要在5 糖单位上与a t i i i 结合，还必须在1 3 糖单位上 与a t i i i 结合才能表达。这说明抗f x a 和f i i a 活性随肝素的解聚程度而异。为了 保证低分子量肝素f x a 活性，肝素的分子量不得低于2 0 0 0 。并且，不同聚合度 的肝素寡糖和不同蛋白质因子作用也呈现不同的生物学作用。1 1 。如抗血管平滑 肌细胞( v s m c ) 增生活性，抗炎症活性，抗血管生成活性，抗肿瘤活性等，而这 些均和肝素片段有关。如2 糖和4 糖没有抗血管平滑肌细胞增生活性，而6 糖或 6 糖以上的肝素寡糖具有抗v s m c 增生的活性。在大鼠体内肝素寡糖( d p 8 一1 0 ) 片段能有效的抑制由碱性成纤维细胞介导的血管生成，并且也能抑制由盐水介导 的轻度的血管生成。但是该片段对血管内皮生长因子( v e g f ) 介导的血管生成的 抑制效果不明显；而一种5 k d 的肝素寡糖( d p l 4 一1 6 ) 片段能有效地抑制v e g f 介导的血管生成。多糖抗肿瘤也是一定聚合度和一定分子量的多糖，具有抗肿瘤 活性的b ( 1 3 ) 葡聚糖相对分子量1 0 0 0 0 时达到最大，1 0 0 0 0 - - 5 0 0 0 0 0 时之间 保持最大活性。由于低分子量多糖广泛的生物学功能，寻找合适的降解多糖的新 技术，变得越来越重要，同时为多糖的结构分析也提供了基础。 据研究，从褐藻中提取的硫酸多糖的降解产物或分级产物，如降血脂的类肝 素海洋药物，有特殊的生理活性。张尔贤等。1 ”从马尾藻中提取的多糖( 分 山东大学硕士学位论文 子量为1 0 0 0 0 ) 不仅抑制s 一1 8 0 及e e l 0 9 癌细胞，且具有清除超氧阴离子自由 基的作用。用6 0 - - 8 0 乙醇提取的铜藻多糖( 分子量为3 4 3 4 ) 有清除羟自由基 的作用。薛长湖等”1 从海带中提取的低分子量海带岩藻聚糖硫酸酯能清除活性氧 自由基，显著降低高脂血症大鼠血清和组织中脂质过氧化物( l i p i dp e r o x i d e l p o ) 的含量，具有体内外抗氧化的能力。现研究发现，低聚糖类物质具有防病 抗病及增加健康等生理功能，所以又称为功能性食品。还有一些低聚糖可以促进 机体肠道内健康微生物菌群的形成，提高老年人对钙离子的吸收能力。低聚糖在 植物生长发育过程中也起着重要的调节作用，是一类新的植物信息调节因子；低 聚糖还可作为一种新型农药用于提高农作物对病虫害的抗性“。 随着人们对多糖结构和功能的研究，将会发现更多的降解方法，多糖的生物 学功能也将得到最大的应用。 山东大学硕士学位论文 第一部分 海带硫酸多糖( l p s ) 的提取、分离与纯化 一材料与仪器 1 材料 海带 纤维素酶 c t a b c a c l 2 d e a e 一2 3 d e a e 一4 l t e a e 一4 1 s e p h a d e xg 一2 5 s e p h a r o s e ( 2 b ，6 b ) 2 仪器 核酸蛋白检测仪 离心机 冷冻干燥机 电子恒温水浴锅 循环水式真空泵 山东荣城市人工养殖厂 山东大学生命科学院 上海化学试剂厂 济南化工厂 p h a r m a c i a w a t h m a n w a t h m a n w a t h m a n p h a r m a c i a p h a r m a c i a 上海安亭科学仪器厂 北京博医康技术公司 国华仪器厂 郑州长城科贸有限公司 二实验方法 1 l p s 的粗提取 取海带粉加水，浸泡一段时间，然后用锦纶网挤干。再按一定比例加水浸 泡两小时，加入纤维素酶，在温度5 0 。c 条件下水解5 小时，然后升温至9 0 保 温半小时，使酶失活。冷却至室温挤滤两次，合并两次滤液，离心除去固体杂质。 向除杂滤液中加入氯化钙，离心去除褐藻酸钙：于上清液中加入c t a b ，溶液中 出现沉淀，4 0 0 0 r m i n 离心2 0 分钟，得到c t a b 络合物沉淀，保留上清液：向c t a b 络合沉淀物中加入一定体积的n a c l 溶液进行盐解，然后加入乙醇沉淀，脱盐和 c t a b 后，浓缩、冷冻干燥得酸性多糖a 。上清液用3 0 的n a o h 调p h8 9 ，出现 絮状沉淀，离心i 沉淀加盐酸溶解，透析，浓缩冷冻干燥得中性多糖组分a 2 。将 中性多糖的上清液调p h1 3 一1 4 左右，出现沉淀，离心，沉淀加盐酸溶解，透析， 冷冻干燥得碱性多糖a ，。 山东大学硕士学位论文 2 l p s 分级组分的分离与纯化 ( 1 ) 酸性多糖a 。的分离纯化 取a 。加水溶解，先过d e a e - 2 3c l 一型柱子进行离子交换层析，用蒸馏水洗脱， 收集洗脱峰i ( 此为不上柱子的部分) 的溶液。然后用0 5 和1 o nn a c l 溶液进行 洗脱，分别收集洗脱峰i i 和i 的溶液。将洗脱峰i 的溶液经硼酸处理后再上 d e a e 一4 1 柱( 氢氧根型) ，先用蒸馏水洗脱，收集洗脱峰的溶液：再用0 5 n n a c l 溶液洗脱，收集洗脱峰v 的溶液。将洗脱峰i i 、i i i 、和v 的洗脱液浓缩、冷冻 干燥得四种组分，将四种组分分别进行分子筛( s e p h a r o s e2 b ) 凝胶过滤层析，得 到四个主峰部分，浓缩、冷冻干燥得纯品f , - f 。 ( 2 ) 中性多糖a ：的分离纯化 将中性多糖溶解在蒸馏水中，上t e a e 一4 1 柱子，用0 5 nn a c l 溶液洗脱，收 集洗脱峰的溶液，此即为多糖组分f ；：再用1 o nn a c l 溶液洗脱，收集洗脱峰溶 液，此即为多糖组分f 。：浓缩、冷冻干燥，再过分子筛凝胶过滤层析进行纯化。 ( 3 ) 碱性多耱凡的分离纯化 碱性多糖的分离纯化步骤同中性多糖( 2 ) ，最后可以得到f _ 和f a 两种组分。 3 纯度检测 凝胶过滤法：分别取少量f , - f 。组分溶于水，加到s e p h a r o s e6 b 柱上，以含 i n a c l 和3 0 7 , 醇的溶液进行洗脱，观察洗脱峰的情况。 三结果与分析 1 l p s 的提取、分离与纯化 海带粉经酶解之后，利用c t a b 沉淀结合调p h 值，共得到三种粗分级组分 a 。a ! 和a 。，再分别进行离子交换层析和凝胶过滤层析，a 可以得到f - 、f z 、f a 和f ； 四种组分：a 。可以得到f j 和f 6 ：a 。中可以得到f ，和f 。以a ，为例来说明整个的分 离纯化结果，a 。经d e a e - 2 3 c l 一型柱子分离得到三个峰形组分i 、i i 和i i i ，然后将 不上柱子部分再经硼酸处理后，过d e a e - 4 1 0 h 一柱分离得到两个峰形组分和v ， 每个洗脱峰所对应的多糖物质分别为： 峰i i 为f 。 峰i i i 为f ：见图1 峰为f 。 峰v 为r 见图2 再将四种组分分别进行凝胶过滤层析进行纯化，以f 。为例，见图3 。八种多 糖经s e p h a r o s e6 b 凝胶过滤层析，分别得到八个单一的洗脱峰，说明已经达到层 析纯。以f 。为代表，见图4 山东大学硕士学位论文 0 4 o 3 o 2 0 1 图i a 经d e a e 一2 3 进行离子交换柱层析流速：l o o m l h f i g 1 i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo fa 1 o nad e a e c e l l u l o s e 2 3 ( 5 5 0 c m ) e l u ti o nr a t e ：l o o m h 4 0 08 0 00 ，5 nn a c lv ( m 1 ) 图2 峰i 部分经d e a e 一4 1 进行离子交换柱层析流速( 1 0 0 m l h ) f i g 2 i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y o ff r a c t i o nio na d e a e g e l l u l o s e 4 1 ( 5 5 0 c m ) e l u t i o nr a t e ：l o o m l h 酸性多糖经分离纯化之后，可以得到四种组分f f ：、f 。和f 。，这四种组分在海 带硫酸多糖中所占的含量是不相同的，f 。和f 。含量较多，而f 、和f ：则较少。所 以在后面的性质测定实验以及降解实验过程中都以f 3 和f 。为代表，生物学功能实 验也是如此：再就是我们实验室对酸性海带硫酸多糖的生物学功能研究的较多， 这样可以达到对比的作用。 八 r _ 1 ，八 山东大学硕士学位论文 o4 o 3 o 2 0 1 图3 f 3 经s e p h a r o s e 2 b 进行凝胶过滤层析流速：3 0 m l h f i g 3 g e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o ff 3o nas e p h a r o s e2 b c o l u m n ( 2 4 6 7 c m ) e l u t i o nr a t e ：3 0 m l h 图4 f 。经s e p h a r o s e6 b 进行凝胶过滤层析流速 f i g 4 g e l f i i t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y o ff 3o n c o l u m n ( 2 4 6 7 c m ) e l u t i o nr a t e ：3 0 m l h 1 8 3 0 m l h a s e p h a r o s e 6 b 山东大学硕士学位论文 第二部分海带硫酸多糖降解 一材料与仪器 1 材料 f f f 8 硫酸软骨素 海藻酸钠( s o d i u ma l g i n a t e ) 透明质酸 粗多糖 琥珀酸 维生素c h ? 0 2 巴比妥钠 甲苯胺蓝 肝素 琼脂糖 2 仪器 电泳仪 自制 山东大学生命科学院 日本 山东大学生命科学院 自制 天津市化学试剂厂 中国医药伤害化学试剂公司 上海桃浦化工厂 山东淄搏化学试剂厂 上海新中化学厂 郑州畜产综合加工厂 d e n m a r k 江苏兴华分析仪器厂 二 实验方法与结果分析 ( 一) 海带硫酸多糖降解 1 琥珀酸+ h ：0 ：+ v c ( c f v ) 体系降解海带硫酸多糖f 。 取f 3l o o m g 加水溶解，然后加入一定量的琥珀酸和h 2 0 z ，最后加入维生素c ， 在2 0 。c 条件下半封闭状态孵育1 6 小时。取降解液6 u l 进行琼脂糖凝胶电泳。电 泳条件： 1 琼脂糖凝胶板 缓冲液：0 0 6 m o l l 巴比妥钠缓冲液( p h 8 6 ) 染色液：0 1 甲苯胺蓝溶液，染色2 0 分钟 洗脱液：1 醋酸溶液 电压条件：电压7 0 v ，电流强度4 0 m a ，电泳时间2 小