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第五章 固定化酶n 第一节 概述n 第二节 固定化酶的性质及其影响因素n 第三节 固定化酶的制备n 第四节 固定化细胞n 第五节 固定化辅酶和原生质体n 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞） 的应用第一节 概述酶催化的缺陷（1）酶的稳定性较差（2）酶的一次性使用（3）产物的分离纯化较困难设 想如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊的相，使它与整体相（或整体流体）分隔开，但仍能进行底物和效应物（激活剂或抑制剂）的分子交换。这种固定化的酶既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化。进 展1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶固定化酶的研究从20世纪50年代开始1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。20世纪从60年代起，固定化酶的研究迅速发展1969年，日本的千细一郎首次在工业生产规模应 用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸， 实现了酶应用史上的一大变革。进 展经过40多年的研究和发展，酶的固定化技术取得了长足的进步。它不仅在理论研究（如阐明酶作用机理）上发挥独特作用，在实际应用上也显示出强大威力。用这种技术不仅能稳定酶，改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的种种特性，使之更符合人类要求，而且还能创造适应特殊要求的新酶。现状人们对固定化酶极感兴趣，因为其性质比可溶性酶及其相关技术优越，对固定化酶的利用也与日俱增。固定化酶的定义所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体固定化技术水不溶酶（固定化酶）“水不溶酶”（water insoluble enzyme） “固相酶”（solid phase enzyme）固定化酶正式定名在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”（immobilizedenzyme）的名称。固定化酶与游离酶相比，具有下列优点:（l）极易将固定化酶与底物、产物分开；（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；（4）酶反应过程能够加以严格控制；（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；（6）较游离酶更适合于多酶反应；（7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。缺点（l）固定化时，酶活力有损失；（2）增加了生产的成本，工厂初始投资大；（3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5）胞内酶必须经过酶的分离程序。固定化酶的优缺点第二节 固定化酶的性质及其影响因素u 一 影响固定化酶性质的因素u 二 固定化后酶性质的变化u 三 评价固定化酶的指标固定化是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定化后，其催化作用由均相移到异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。一 影响固定化酶性质的因素1酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。2载体的影响（1） 分配效应（2） 空间障碍效应（3） 扩散限制效应3.固定化方法的影响二固定化后酶性质的变化1. 固定化对酶活性的影响固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也可能发生改变。例如用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30%，而对低分子底物苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能过膜与酶接近。值得注意的是也有个别情况，酶在固定化后反而比原酶活力提高。原因可能是偶联过程中酶得到化学修饰，或固定化过程提高了酶的稳定性。2固定化对酶稳定性的影响稳定性是关系到固定化酶能否实际应用的大问题，在大多数情况下，酶经过固定化后一般都有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命，这是十分有利的。酶的稳定性包括：热稳定性对各种有机试剂稳定性对酶抑制剂的稳定性对不同pH稳定性对蛋白酶稳定性贮存稳定性操作稳定性Merlose曾选择50种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现其中有30种酶经固定化后稳定性提高，12种酶无变化，只有8种酶稳定性降低。热稳定性固定化酶的稳定性变化1. 固定化酶；2. 自然酶固定化后酶稳定性提高的原因，可能有以下几点： 固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。 阻挡了不利因素对酶的侵袭。 抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合后，由于酶失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了降解。然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。3固定化对酶最适pH的影响酶由蛋白质组成，其催化能力对外部环境特别是pH非常敏感。酶固定化后，对底物作用的最适pH和pH-活性曲线常常发生偏移pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响1.固定化酶；2.游离酶（1）载体的性质对pH的影响。u载体带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向碱性方向移动）。n载体带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向酸性方向移动）。n载体不带电荷，最适pH一般不改变（有时也会有所改变，但不是由于载体的带电性质所引起的。）（2）产物性质对pH的影响u催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH值比游离酶的pH值高；u催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH值比游离酶的pH值低；u催化反应的产物为中性时，固定化酶的最适pH值一般不变；这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH，才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游离酶的最适pH要低一些。4. 固定化对酶最适温度的影响酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。当然，也有报道最适温度不变或下降的。n同一种酶，用不同的方法或不同的载体进行固定化后，其最适温度也有可能不同。n例如：氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶经离子键结合法固定化后，其最适温度（72）比游离酶的最适温度（60）提高12；用DEAE-纤维素固定化的，其最适温度（67）比游离酶提高7；而用烷基化法固定化的氨基酰化酶，其最适温度却比游离酶有所降低。n固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载体的影响。5固定化对酶底物特异性的影响n 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变 化与底物相对分子质量的大小有一定关系。n 作用于小分子底物的酶 异性没有明显变化n 既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。n 例如： 胰蛋白酶：底物包括：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基纤维素上，对二肽或多肽的作用保持 不变，而对酪蛋白的作用仅为游离酶的3%。三 评价固定化酶的指标：1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）3.4.或称偶联效率，活力保留百分数。5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力固定化酶的活力测定方法介绍第二节 小结第三节 固定化酶的制备n 一 固定化酶的制备原则n 二 酶的固定化方法一. 固定化酶的制备原则制备固定化酶要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原则。原则 1必须注意维持酶的催化活性及专一性，保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点。原则 2固定化应该有利于生产自动化、 连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。原则 3固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量，制备固定化酶时所选载体应尽可能地不阻碍酶和底物的接近。原则 4酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用，因此，在制备固定化酶时，应使酶和载体尽可能地结合牢固。原则 5固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。原则 6固定化酶应易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用。原则 7固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用。原则 8充分考虑到固定化酶制备过程和应用中的安全因素。二 酶的固定化方法酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类固定化方法分类非化学结合法结晶法分散法物理吸附法离子结合法化学结合法交联法共价结合法包埋法微囊法网格法（一）非共价结合法 1.结晶法 2.分散法 3.物理吸附法 4.离子结合法1.结晶法就是使酶结晶从而实现固定化的方法。对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。提供了非常高的酶浓度。对于活力较低的酶来说，这一点就更具优越性。结晶法的局限性在不断的重复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。2. 分散法通过酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将干粉悬浮于溶剂中，并且可以通过过滤和离心的方法将酶进行分离和再利用。对于用在水不溶性溶剂中的固定化酶，有许多途径可以提高它们的反应速率正确的体系和贮存状态使酶粉末充分分散，将有助于提高活力。在干燥过程中，加入多种化合物有助于酶的分散，这些化合物也作为稳定剂和保护剂发挥作用。通过与亲脂化合物的共价连接能增加酶在水不溶相中的溶解度。可以通过将其包埋在膜体系中或通过多相反应来实现酶的固定化。3. 物理吸附法酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。载体无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；天然高分子载体有淀粉、白蛋白等；大孔型合成树脂、陶瓷等载体也十分引人注目；具有疏水基的载体（丁基或已基-葡聚糖凝胶）可以疏水性吸附酶，以及以单宁作为配基的纤维素衍生物等载体。物理吸附法也能固定微生物细胞，并有可能在研究此法中开发出固定化增殖微生物的优良载体。物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失很少。若能找到适当的载体，这是很好的方法。但是它有酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等缺点。4. 离子结合法酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。载体阴离子交换剂如DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，Amberlite IRA-93，410，900；阳离子交换剂如，CM-纤维素，Amberlite CG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。离子结合法的优点操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。缺点载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。离子结合法也能用于微生物细胞的固定化，但是由于微生物在使用中会发生自溶。用此法要得到稳定的固定化微生物较为困难。迄今已有许多酶用离子结合法固定化，例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。（二）化学结合法1. 共价结合法2. 交联法1. 共价结合法酶与载体以共价键结合的固定化方法方法：将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体共价结合的酶的功能团a或e氨基、a、b或g-羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。参与共价结合的氨基酸残基不应是酶催化活性所必需的，否则往往造成固定后的酶活性完全丧失。共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比的优点酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。缺陷反应条件苛刻，操作复杂；会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心。因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为30左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。所用载体分三类天然有机载体（如多糖、蛋白质、细胞）无机物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）载体的活化方法依载体性质各不相同羟基聚合物纤维素、葡聚糖、琼脂糖及胶原等可用溴化氰法、活化酯法、环氧化法及三嗪法等。溴化氰法溴化氰法能在非常温和条件下与酶蛋白的氨基发生反应，它已成为近年来普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氢活化的琼脂糖已在实验室广泛用于制备固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。活化酯法环氧化法三嗪法PClClNHN CpH 9-11N CP-NH2N COH + Cl CN CNO CN CNO CNNCClClCl三氯-均-三嗪三氯-均-三嗪纤维素醛基载体纤维素葡聚糖经过碘酸氧化或用二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，产生二醛高聚物，每个葡萄糖分子含二个醛基。CH2OHCH2OHCH2OHCH2OHOOOOP-NH2NaIO4HP-SHOHOORORP-咪唑NORNOROOHOOPP羧基载体OOOOP-NH2COOH+DCCCO NCONHPN OHO OCH2COOHSOCl2CH2COClP-NH2CH2CONH PpH89多胺载体Cl-CS-ClP-NH2HOCH2NH2CH2 NCSCH2 NC NHPCH COOHM eOHCH COOM eNH2NH2NaNO2CH2COONHNH22HCl2HClP-NH2CH2CONHPCH2CON3CH2phNH2NaNO2CH2 phN2+Cl_Tyr-PCH2 phN=N-PHClHis-POOOOHOHNH2O CH2CH2 O SNH2OH +OHSO CH CH O S22OHOHOOOOOHNO2OHCH CH O SN+ -P-NHOHN N-PON Cl2O CH2CH2 O SOH22OHOO无机载体可采用直接法和涂层法（用活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂层）OOP-NH2Si(CH2)3NHCH(CH2)3CHOSi(CH2)3NH CH(CH2)3CH=N-POO(1)OHC-(CH2)3CHOOOOP-NH2OSSiOH H2N(CH2)3Si(OEt)3Si (CH2)3NH2 Cl-CS-ClSi(CH2)3NCSSi(CH ) NHC-NH-POO(2)O2 3SiOHSi(CH2)3NH2OOO(3) Cl-CO- NO2ONa2S2O4ONO2NH2Si(CH2)3NHCOSi(CH2)3NHCOOO重氮化OP-NH2ON2+Cl-Si(CH ) NHCON=N-P2 3Si(CH2)3NHCOOO2. 交联法用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法。与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。参与交联反应的酶蛋白的功能团N末端的a-氨基赖氨酸的e-氨基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基等交联剂形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N，N-乙烯双马来亚胺等。最常用的交联剂是戊二醛。OH(CH2)3CHO+E -CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-NCH(CH2)3CHN-CH=N-E-N=CH(CH2)3CH=N-E-N=CH-特点交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。（三）包埋法网格型微囊型网格型将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型微囊型将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。制备微囊型固定化酶有如下方法：n 界面沉淀法n 界面聚合法n 二级乳化法n 液膜法（脂质体包埋法）特点包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。但是在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。由于只有小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变，降低酶活力。因此，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的。方法的特点条件温和，酶失活少但要完全除去膜上残留的有机溶剂 很麻烦制备比较容易，但膜比较厚，会影 响底物扩散。此外还有脂质体包埋法，由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。第三节 小结固定化酶的制备方法各种固定化酶方法的优缺点比较特性物理吸离子结包埋法共价结交联法附法合法合法制备易易易难难结合力中弱强强强酶活力高高高中中底物专一无变化无变化无变化有变化有变化性再生可能可能不可能不可能不可能固定化费低低中中高用没有一个方法是十全十美的， 几种方法各有利弊包埋、共价结合、共价交联三种虽结 合力强、但不能再生、回收；吸附法制备简单，成本低，能回收再 生，但结合差，在受到离子强度、pH 变化影响后，酶会从载体上游离下来。 在使用价格较高的酶与载体时可行；包埋法各方面较好，但不适于大分子底 物和产物。第四节 微生物、植物和动物细胞固定化n细胞特性比较细胞种类植物细胞微生物细胞动物细胞细胞大小/um20-3001-1010-100倍增时间/h120.3-615营养要求简单简单复杂光照要求大多数要光照不要求不要求对剪切力敏感大多数不敏感敏感色素、药物、香醇、有机酸、氨基疫苗、激素、主要产物酸、抗生素、核精、酶等抗体、酶苷酸、酶细胞固定化：u细胞固定化：通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合而制备固定化细胞的过程。固定化细胞在一定的空间范围内能进行生命活动，即能正常的生长、繁殖和进行新陈代谢，所以又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。固定化细胞的特点n 优点：n 1.使用固定化细胞省去了酶的分离过程，显著降低了成本。n 2.固定化细胞为多酶系统，不需要辅助因子n 3.增加了细胞对不利环境的耐逆性，可重复使用。n 4.增加了酶的稳定性。缺点：n 1.对底物和产物的要求是可以穿过细胞壁、 细胞膜。n 2.会形成大量的副产物，降低了纯度。n 3.维持固定化细胞持续的催化活性远比酶 要复杂，有些细胞在条件不适宜的情况下很容易发生自溶，影响产品的稳定性。细胞固定化方法n 吸附法n 包埋法吸附法n 它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细 胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。包埋固定法n 包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情 况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多 酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。n 常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺n 常用凝胶包埋法通过改变载体溶液参数包埋细胞n 改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和 溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。研究热点光交联树脂包埋法n 例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预 聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定 浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮 液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射 3min，就可制得。固定化细胞的目的n 微生物细胞：不需多次培养、扩大，从而缩 短了发酵生产周期n 植物细胞：提高细胞稳定性、缩短生产周期、 提高产率及产品质量n 动物细胞：提高细胞稳定性、缩短生产周期、提高生产速率。第四节 小结n 特点n 方法n 目的第五节 固定化原生质体和辅酶n 一、原生质体固定化的方法n 制备原生质体将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液包埋法固定化原生质体。n 关键：原生质体如何制备？二、原生质体的制备n 将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压 稳定剂的高渗缓冲液中去细胞壁分离纯 化得到原生质体活性鉴定三、辅酶固定化n 1. 原因n 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递电子或递某些化学基团的作用）n 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生n 有机辅因子价格昂贵n 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生n 2. 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺 法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。n 3. 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。n 策略：先在辅酶的一定部位进行修饰-引入功能团和间隔 臂（形成辅酶衍生物）- 再与水溶性高分子结合四、辅酶再生的形式：n辅酶和酶共固定与酶分子偶联成辅酶-酶复合物第五节 小结方法n 原生质体固定化 固定化要点原因方法n 辅酶固定化形式第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用n 酶反应器介绍n 酶反应器的选择和应用n 固定化酶和细胞的应用一、酶反应器n 搅拌罐型分批搅拌罐式反应器n连续搅拌罐式反应器n 固定床型 （填充床式反应器）n 流化床反应器n 膜式反应器n 鼓泡塔式反应器分批搅拌罐式反应器n 反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小 规模试验连续搅拌罐式反应器填充床式反应器n 旋转填充床流化床反应器n 与连续搅拌罐式反应器类似，是让适量的 颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器， 而是底物向上流过固定酶床，因此流速要 适当控制。