（化学工程专业论文）复合酶法提取大枣多糖的研究.pdf

复合酶法提取大枣多糖的研究 摘要 本文以陕北大枣为原料，比较了大枣多糖的不同提取方法，分别研究用酸性 蛋白复合酶和中性蛋白复合酶来提取大枣多糖，探索出两条较为成熟的不同复合 酶参与的大枣多糖提取工艺路线。并对试验所得大枣多糖进行了红外光谱和紫外 光谱分析。在后续的研究工作中，对大枣渣中食品功能基料膳食纤维进行初步研 究。 首先，通过对大枣多糖不同提取方法的对比，优选出酸性蛋白复合酶提法来 提取大枣多糖，并对复合酶中的酸性蛋白酶以及果胶酶进行酶活测定，明晰其应 用状态。 其次，研究酸性蛋白复合酶参与大枣多糖提取工艺，进行以多糖得率、多糖 纯度为指标的单因素试验，在此基础上研究以酶浓度、温度、加酶p h 值为因素 的三因素三水平正交试验，结合试验结果分析了因素及水平对多糖得率、多糖纯 度的影响和原因，由此法获得的产品多糖得率可达4 9 0 9 6 ，纯度4 7 9 0 9 6 。 再次，研究中性蛋白复合酶参与大枣多糖提取工艺，讨论以多糖得率、多糖 纯度为指标的单因素试验条件，并进一步研究以酶浓度、温度、加酶p h 为因素 的三因素三水平正交试验，分析试验结果以及各因素的影响和原因，最终产品多 糖得率为4 ，8 5 ，多糖纯度为4 6 4 6 ，。 最后，对大枣渣膳食纤维进行分析、检测，确定大枣渣膳食纤维脱色最佳条 件，为实现大枣渣变废为宝、减少环境污染、综合利用大枣渣提供依据。大枣多 糖的药理试验以及药理分析充分表明：本试验产品一大枣多糖属无毒级；对小鼠 s m 肉瘤实体型肿瘤有抑制作用；大枣多糖大、中剂量组对s 。实体瘤小鼠巨噬细 胞吞噬率有显著提高作用。 关键词：大枣多糖提取酸性蛋白复合酶中性蛋白复合酶大枣渣 中图分类号： 西北大学学位论文知识产权声明书 y 8 9 3 8 二7 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：冱亟指导教师签名：堡歪 加占年6 月日纱多年月 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：影畚 一；年多月7 日 及理化性质、免疫学、药理学及应用等。 ( 一) 多糖疫苗 结构简单的多糖，如淀粉等在体内无抗原性，但结构较复杂的多糖往往有抗 原性，细菌的细胞壁或荚膜中含有多种具有种属特异性的多糖，他们是细菌的抗 原决定基，利用这一性质可以制备相应的多糖疫苗。目前在临床上应用的主要有 预防脑炎的m e n i n g o c o c c a la c 型多糖疫苗和a c y w 1 3 5 型疫苗、肺炎链球菌 ， ( s t r e p t o c o c c u sp n e u m o n i a e ) 多糖疫苗、流感嗜血杆菌( h a e m o p h i l u s i n f l u e n z a e ) h i b 多糖疫苗( p r p ) ，正在研究中的包括b 型链球菌( s t r e p t o c o c c u s a g a l a c t i a e ) 及伤寒沙门菌( s a l m o n e l l at y p h i ) 多糖疫苗。 ( 二) 抗肿瘤和免疫促进活性 抗肿瘤多糖从结构来看，包括均多糖、杂多糖、肽聚糖以及多糖衍生物或复 合物，以高等真菌细胞壁中的b d 一葡聚糖活性最显著，其中香菇多糖、裂褶菌 多糖、云芝多糖k 已应用于癌症的免疫治疗。多糖类药物能刺激机体的各种免疫 活性细胞的成熟、分化和繁殖，使机体免疫系统恢复平衡，从而消除、吞噬癌细 胞。多糖对机体细胞无直接细胞毒作用，这是它不同于其它抗肿瘤药的优点之一。 多糖具有多方面的免疫调节活性，如促进网状内皮系统的吞噬功能，增强天 然杀伤性细胞的活性，活化巨噬细胞，诱导免疫调节因子的表达。多糖的免疫促 进作用与抗肿瘤活性有密切的关系，因为抗肿瘤活性多糖是通过提高机体免疫功 能而发挥作用，但二者也有不同之处，它们之间的关系还有待深入研究。 ( 三) 抗病毒活性 早在2 0 世纪7 0 年代就发现有些多糖或衍生物具有抗病毒作用，8 0 年代后 期发现某些多糖对艾滋病病毒( h i v ) 同样具有抑制作用，这些多糖大都含有硫酸 基。以抗h i v 活性为例，现在已知道硫酸化多糖可以在3 个方面产生抗病毒作用： 硫酸化多糖可与t 细胞表面的病毒结合位点( c d 4 受体) 结合，干扰病毒的侵 入；反转录酶( r t ) 是h i v 病毒复制不可缺少的，有的硫酸化多糖能抑制r t 的活性；抑带4h i v 感染的细胞和未感染细胞之间合体细胞的生成。 ( 四) 降血糖活性 自2 0 世纪8 0 年代起，随着对多糖生物活性的广泛研究，人们在药理实验中 发现许多多糖对正常小鼠或药物致高血糖的小鼠有降血糖作用，它们可能通过以 多糖的促小鼠脾细胞增值作用强度，并分析了大枣多荔囊薹鋈翼薹雾毓；黼翻客 辩，酾靼娟蜘酗确斡砖篓聿：高澍疏州砭昏酾l 鞴涫篓美藩壤淄滢赠要塑臻露鬈 蛩。哩懋强夔辅馋引嘲嘲篷蟊菩鼎舔盟：强毽墨崔瑶；雌氍割醛巅交汀蕊程蕊两 骚媒派菠涤强辏堙蛩静嚣嚣蒸霖翮矾顽；耍时葡做预备实验虢蛩影豁氅习珀垒囊 鸯鄞舅i 瞍掣全峰璀溶淄噶澄蠹酲嚣霆落裂臻嵩匿l 鐾翅箨著加入l o g几果胶溶液5 i i l l ，在5 2 o 2 水浴中预 热5 1 0 m i n ： b 向甲管( 空白) 中加入p h _ 3 5 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液5 m l ，乙管( 样 品) 中加稀释酶液l i l ，p h _ 3 5 的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液4 l i i l ，立刻摇匀并计 时。在此温度下准确反应o 5 h ，立即取出，加热煮沸5 m i n 终止反应，用流水冷 却； c 取上述甲、乙管反应液各5 i l 放入碘量瓶中，准确加入o 5 m o l l 碳酸钠 溶液1 m l ，0 0 5 m 0 1 l 碘液5 i l i l ，摇匀，于暗处放置2 0 m i n ； d 取出碘量瓶，各加入1 m 0 1 l 硫酸溶液2 m l ，用0 0 5 m 0 1 l 硫代硫酸钠标 准溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液3 滴，继续滴定至蓝色刚好消失为其终点， 记录甲管( 空白) 、乙管( 样品) 反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，同时 做平行样品测定。 2 6 3 试验数据整理 l m l 浓缩酶液在5 0 ，p h = 3 5 的条件下，l h 分解果胶产生1 m g 半乳糖醛酸 为一个酶活单位，计算式为： x = ( a b) c 0 5 l 1 9 4 1 4 n 1 0 ( 5 l c o 5 ) = ( a b )c n 3 9 6 0 5 式中：x 一样品的酶活力，u m l ； a 一空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，m l ； b 一样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，m l ： c 一硫代硫酸 x 中释放出来。 图1 1 酶催化与无酶催化反应的自由能变化 f i g 1 1t h ef r e ee n e r g yc h a n g e so fe n z y m ec a t a l y s i sa n dn oe n z y m ec 8 t a l y s i s 1 3 2 酶催化反应特性 ( 一) 高效性。“删 酶催化反应与一般催化反应不一样，其可以在常温常压和温和的酸碱度下， 高效地进行反应。1 个酶分子在lm i n 内能引起数百万个底物分子转化为产物， 酶的催化能力比一般催化剂的催化能力大1 0 0 0 万倍到1 0 万亿倍。 酶的催化作用不但与底物一接触便发生，而且不用附加剧烈的条件，而一般 催化剂往往需要辅以较高的温度、压力等条件。在看似平静的自然界中，每时每 刻都发生着无法计数的酶促反应，而参与酶促反应的酶量又是极少量的。 ( 二) 专一性 酶促反应的另一个特点，就是酶对底物高度的专一性。一种酶只能催化一种 或是一类物质反应，即酶是一种仅能促进特定化合物、特定化学键、特定化学变 化的催化剂。如淀粉酶只能催化淀粉水解、蛋白酶只能催化蛋白质水解，而无机 催化剂如酸或碱既催化淀粉水解，也催化蛋白质或其他物质水解，对作用物的选 择并无特异性。 传统高温水提法提取多糖不具备以上两个优势，操作周期长，易造成多糖的 生物活性降低，而且 x 1 3 3 应用于植物多糖提取中的酶及酶提法 一在植物多糖提取中，常用的提取酶有蛋白酶，纤维素酶，果胶酶。 ( 1 ) 蛋白酶 蛋白酶对植物中的游离蛋白质具有水解作用，其加入可使植物结构变得松 散；同时蛋白酶还会使糖蛋白和聚糖中游离蛋白质水解，降低了它们与原料的结 合力，有利于植物多糖的浸出汹3 。由于蛋白酶具有除蛋白的作用，其参与的提取 液中只含有少量蛋白质，可减轻下一步除蛋白质的任务，所以，蛋白酶参与植物 多糖提取法是一种理想的提取方法。可应用于植物多糖体取的蛋白酶比较多，现 列举以下三种： a 中性蛋白酶。0 3 中性蛋白酶属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、p h 值下，能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。 b 酸性蛋白酶 酸性蛋酶是一种在酸性条件下( p h 2 5 4 o ) 催化蛋白质的酶抑制剂，适用 于酸性介质中水解动、植物蛋白质。 c 胰蛋白酶 胰蛋白酶是一种肽链内断酶，对精胺酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用， 可把天然蛋白、变性蛋白、纤维蛋白和粘蛋白等蛋白质水解为多肽或氨基酸。 d 胃蛋白酶 胃蛋白酶能水解蛋白质和多肽链，其主要产物是肝和胨。胃蛋白酶最适宜的 p h 为2 至3 2 ，随着p h 的升高胃蛋白酶的活性即降低，当p h 达到6 以上，此酶 将发生不可逆的变性。 ( 2 ) 纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，属生物催化剂，主要用于酿酒、食品、饲料、纺织、 造纸、制药、环保、石油开采等工业”“。 植物中纤维普遍含量较高，而目标产物多糖，被包裹，依附于纤维之中，难 以从细胞壁中释放出来。纤维素酶可以破坏阻碍多糖溶出的细胞壁，缩短提取时 间和周期，并将淀粉和纤维质转化为糖类。“，推动整个提取过程的进行。纤维素 酶参与反应后，在很短时间内就可将依附多糖的纤维素分解，整个提取过程在 9 2 3 h 以内可以完成o ”。 ( 3 ) 果胶酶 在提取过程中，有些植物中的淀粉、果胶、粘液质等在热水中发生胶溶，使 过滤困难，蒸发浓缩操作费时。果胶酶能分解细胞壁中间层和不溶性高分子原果 胶，降低粘度，并能使多糖充分溶解。例如，为了达到充分提取红枣中多糖的目 的，用可果胶酶处理红枣。韩玉杰等人用热水浸提法，多糖纯度为4 6 7 8 ， 果胶酶酶解法多糖纯度为5 6 7 ，较传统的水提法，总糖含量提高了9 8 2 ， 由此可知果胶酶酶解法大大提高了原材料的利用率。 二鉴于各种酶在提取过程中的机理不同，以及被提取植物内部组成的差 异，常用的提取方法有：单酶法，复合酶法。 单酶法就是针对提取过程，结合植物自身的特点，优选出一种酶应用于提取 过程。余冬生等人在提取金针菇多糖时，采用单酶法，分别研究纤维素酶，果 胶酶提取法的最佳工艺条件。单酶法的介入，在很大程度上提高了提取效率。王 元风娜1 在提取金花茶叶多糖时采用单酶法，将多糖的得率提高了7 3 9 。 在提取过程中，为了极大限度的发挥酶法提取的效用，以及各种不同酶的协 同作用，可以选用几种酶同时参与提取，这就是所谓的复合酶法。例如在大枣多 糖的提取过程中，大枣细胞壁比较结实，多糖被包裹之中，难以从细胞中扩散出 来，并且大枣含有丰富的果胶质和蛋白质，因此在提取过程中，可以考虑采用纤 维素酶、果胶酶与蛋白酶的连用。通过杨云。”等人所采用的单酶法和复合酶法从 大枣中提取多糖作比较，单酶法提取多糖含量最高可达4 4 6 9 ，而复合酶法多糖 最高含量可达6 8 1 3 。可以看出，复合酶法在提取过程中的作用显著。复合酶法 的效用也再一次被茶叶活性成分提取的研究所证明，一般情况下，茶叶多糖得率 是同条件下水提法的2 3 倍啪3 。 鉴于以上叙述的酶法提取的应用，对于大枣多糖的提取，复合酶法是比较适 用的。利用多种酶的协同作用，极大限度的发挥酶法提取的功效，使得大枣多糖 活性在不受影响的前提下，较短时间内让多糖从大枣粗大而结实的细胞中释放 出。用复合酶法提取大枣多糖，工艺操作简便，将大大缩短操作周期，经济成本 低，优于大枣多糖的传统提取方法。 1 0 1 4 复合酶法提取大枣多糖的目的和意义 随着科学技术的发展，为了进一步研究和应用大枣多糖，推进大枣多糖产业 化发展，那么，近年来出现的一些新型方法就非常有必要参与改进、完善大枣多 糖的提取工艺。诸如用酶参与大枣多糖的提取工艺，借此来提高大枣多糖产品的 纯度与得率。酶的催化效率高，专一性强，不发生副反应，因此在实际应用中， 产率高，质量好，便于产品的提纯，简化工艺步骤。其作用条件温和，一般不需 要高温、高压、强酸、强碱等条件，且反应产物大多无毒。以上酶的诸多优点， 为酶法提取大枣多糖奠定了理论基础。当然，酶提法也存在一些弊端，诸如，酶 自身对温度，p h 等轻微的改变或抑制剂( 如含c u ”，h g ”，a l ”等离予的溶剂) 的存 在，使其活性发生变化啪1 ，这对进行后续研究，以及今后的工业化发展造成一定 的困难，而这些恰恰是今后研究中主要难点。纯酶自身成本较高，酶的介入，p h 会直接增加植物多糖提取的费用。复合粗酶，使用成本较低，且有较宽的温度， 值等应用范围。例如，宁夏夏盛公司所生产的酸性蛋白酶，其中还含有少量的果 胶酶，淀粉酶，所有的这些酶无疑对大枣多糖的提取十分有利，而且相互之间可 以产生协同作用。这种复合粗酶的应用，可以为大枣多糖提取的产业化发展提供 更广泛的技术支持。 1 5 本研究的创新点 1 研究中采用的酸性蛋白复合酶提法、中性蛋白复合酶提法，在保持大枣多 糖有较高得率及纯度的基础上，大大缩短多糖提取工艺周期，进一步降低多糖提 取成本费用。 2 引入的复合酶体系基本都是在低温条件下提取大枣多糖，既保证了大枣多 糖的高得率和高纯度，又最大限度的抑制大枣多糖在高温提取条件下活性的降 低。 3 在大枣多糖提取工艺研究过程中，将“绿色化工”思想运用于整个工艺， 不使用有毒的有机溶剂、金属离子，提取工艺流程明晰简洁，易于工业化：并且 对被废弃的大枣渣进行分析、检测和处理，为实现大枣渣变废为宝、减少环境污 染、综合利用大枣渣提供依据。 2 1 试验目的 第2 章复合酶的筛选 由文献“1 知，大枣细胞粗大且壁厚，大枣中还含有3 3 左右的蛋白质，使得 多糖难以从细胞中扩散出来，进一步导致大枣多糖提取工艺周期过长。引入复合 酶目的就是借助酶自身的一些特性，在提高大枣多糖产品的纯度与得率的前提 下，直接地克服活性大枣多糖提取过程的难题。酶制剂的品种很多，但功效不一， 必须针对性地选择合适的酶制剂。 2 2 试验方法 经初步筛选，宁夏夏盛实业集团有限公司提供了三种复合酶较为适合大枣多 糖提取，其分别为：酸性蛋白复合酶( 酶液中含有少量果胶酶、淀粉酶) ，纤维 素复合酶( 酶液中含有少量半纤维素酶、果胶酶) ，果胶复合酶( 酶液中含有少 量半纤维素酶、淀粉酶) ，这三种复合酶比较适用于大枣多糖的提取，更重要的 是这三种酶既是复合酶，使用成本较低，性价比较其它酶高，因此在本试验研究 中，将这三种酶相对于传统去离子水提取剂做比较，确定大枣多糖提取的最佳复 合酶，并测定其活性，明确其应用状态。 2 3 试验 2 3 1 试验原料与试剂 大枣 果胶粉 复合酶 3 ，5 一二硝基水杨酸化学纯 葡萄糖 a r 苯酚a r 氢氧化钠a r 1 2 陕北延安 s i g m a 公司 宁夏夏盛实业集团有限公司 北京化工厂 西安化学试剂厂 南京建业化学试剂厂 天津化学试剂三厂 亚硫酸氢钠 a r 柠檬酸 a r 柠檬酸三钠 a r 酒石酸钾钠 a r 硫代硫酸钠 a r 无水碳酸钠 a r 浓硫酸 a r 碘 a r 可溶性淀粉 a r 福林试剂 三氯乙酸 a r 酪素 2 3 2 试验仪器与设备 天津市塘沽鹏达化工厂 西安化学试剂厂 江苏无锡市民丰试剂厂 西安化学试剂厂 天津市化学试剂三厂 西安化学试剂厂 西安化学试剂厂 天津博迪化工有限公司 四川省彭州市军乐化工厂 西北大学化工学院无机实验室配制 上海化学试剂采购供应站 西安鼎盛分析仪器公司 表2 1 试验用仪器与设备表 t a b 2 1e x p e r i m e n t a l8 p p a r a t u ss c h e d u l e 2 3 3 试液的配制 1 d n s 试剂( 3 ，5 一二硝基水杨酸试剂) 甲液：溶解6 9 9 苯酚于1 5 2 埘l 浓度为l o 的氢氧化钠溶液中，并用蒸馏水 稀释至6 9 m l ，再向此溶液中加入6 9 9 亚硫酸氢钠。 乙液：称取2 5 5 9 酒石酸钾钠，加入3 0 0 m l 浓度为l o 的氢氧化钠溶液中， 再加入8 8 0 m l 浓度为1 的3 ，5 一二硝基水杨酸溶液。 将甲、乙：液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7 1 0 天 以后使用。 2 柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液( p h 4 8 ) 将1 8 4 l l l l0 1 m o l l 的柠檬酸溶液与2 1 6 i l l lo 1 m o l l 的柠檬酸钠溶液混合， 摇匀即可。 3 1 0 9 l 果胶水溶液 称取果胶粉1 0 0 0 0 9 ，精确至o o 0 0 2 9 ，加水溶解，煮沸，冷却。如有不溶 物则需进行过滤，调p h 值至3 5 ，用水定容至1 0 0 i l i l ，在冰箱中贮存备用，使用 时间不超过三天。 4 o 0 5 m 0 1 l 硫代硫酸钠标准溶液 称取1 6 9 无水n a 2 s 2 0 3 ，加o 2 9 无水n a 2 c 0 。溶于l o o o i i l l 蒸馏水中，缓缓煮 沸1 0 m i n ，冷却，放置两周后过滤，得浓度为o 1 1 几的硫代硫酸钠溶液，使 用时准确稀释一倍。 5 0 5 m 0 1 l 碳酸钠溶液 称取5 3 9 无水碳酸钠，加水溶解，并定容于1 0 0 0 l i l l 的容量瓶中。 6 0 0 5 m o l l 碘标准溶液 称取1 3 9 碘及3 5 9 碘化钾，溶于1 0 0 l i i l 水中，稀释至1 0 0 0 i i i l ，摇匀，贮于 棕色瓶中。 7 1 m o l l 硫酸溶液 取浓硫酸( d = 1 8 4 ) 5 6 i i l l ，缓慢加入适量水中，冷却后用水定容至1 0 0 i n l ， 摇匀。 8 1 0 9 l 可溶性淀粉指示液 称取1 9 可溶性淀粉置于烧杯中，加入少量蒸馏水混合成浆状物，然后将沸 蒸馏水缓缓加入烧杯中，边加边搅拌，冷却后用蒸馏水稀释至1 0 0 m l 。 9 0 1 m 0 1 l 柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液( p h = 3 5 ) 甲液称取柠檬酸( c 6 h 鼢h z 0 ) 2 1 0 l g ，用水溶解并定溶至1 0 0 0 m l 。 乙液称取柠檬酸三钠( c e h 5 n a s o 2 h z o ) 2 9 4 1 9 ，用水溶解并定溶至1 0 0 0 m l 。 l o 0 4 m o l l 碳酸钠溶液 称取无水碳酸钠4 2 4 9 ，用水溶解并定容至1o o o 札。 1 4 1 1 0 4 m 0 1 l 三氯乙酸溶液 称取三氯乙酸6 5 4 9 ，用水溶解并定容至l0 0 0 玎l l 。 1 2 o 5 m o l l 氢氧化钠溶液 按g b 6 0 1 配制。 1 3 1 m o l l 及0 1 m 0 1 l 盐酸溶液 按g b 6 0 1 配制。 1 4 硼酸缓冲溶液( p h l o 5 ) 甲液称取硼酸钠( 硼砂) 1 9 0 8 9 ，加水溶解并定容至10 0 0 m l 。 乙液称取氢氧化钠4 o g ，加水溶解并定容至1o o o i l l l 。 使用溶液：取甲液5 0 0 m l 、乙液4 0 0 i n l 混匀，用水稀释至10 0 0 l i l l 。 1 5 1 0 9 l 酪素溶液 称取酪素1 0 0 0 9 ，精确至0 o o l g ，用少量o 5 1 0 1 l 氢氧化钠溶液湿润后， 加入适量的各种适宜p h 值的缓冲溶液约8 0 m l ，在沸水浴中边加热边搅拌，直至 完全溶解，冷却后，转入1 0 0 i i i l 容量瓶中，用适宜的p h 值缓冲溶液稀释至刻度。 此溶液在冰箱内贮存，有效期为3 天。 1 6 1 0 0 ug m l 酪氨酸标准溶液 ( 1 ) 称取预先于1 0 5 干燥至恒重的酪氨酸o 1 0 0 0 9 ，精确至o 0 0 0 2 9 ，用 1 m 0 1 l 盐酸6 0 m l 溶解后定容至1 0 0 】【i l l ，即为l i i l g m l 酪氨酸标准溶液。 ( 2 ) 吸取l m g m l 酪氨酸标准溶液1 0 0 0 l i i l ，用0 1 m 0 1 l 盐酸定容至 1 0 0 l l ，即得到1 0 0 l lg l i i l 酪氨酸标准溶液。 2 4 复合酶的比较 因为不同溶剂对大枣实体及其多糖的作用不同，所以用不同溶剂进行提取， 可能产生不同的结果。定量称取烘干枣粉2 0 9 各三份，分别加入一定量的水，再 分别添加对底物浓度为1 的果胶酶复合酶液( 调节溶液p h 为7 ) ，纤维素复合酶 液( 调节溶液p h 为7 ) ，酸性蛋白复合酶液( 溶液p h 为4 2 ) ，4 0 下提取2 h ， 每批共进行两次提取，离心合并上层清液，浓缩，加入无水乙醇，进行第一次醇 沉，离心，回收上清液，将下层粗多糖放入锥形瓶，置于真空干燥箱干燥。干燥 后，称量粗多糖，复溶，再用三氯乙酸进行脱蛋白。然后，将处理过的多糖溶液， 加入双氧水脱色。再浓缩，二次醇沉后进行离心，将多糖放入真空干燥箱干燥。 得到大枣多糖。在相同工艺条件下以传统水提法为参照，确立最佳提取方法，结 果见表2 2 。 表2 2 不同提取液的提取结果 t a b l e 2 2c 蚀p 8 r i s o no fd i f f e r e n te x t r a c t i o nw a y s 做柱状图比较： 6 0 5 0 瓣4 0 莰 翘3 0 鬟2 0 l o 4 测定 (1)先将酪素溶液放入(40o2)恒温水浴中，预热5min。( 2 ) 按下列程序操作：试管a ( 空白) 试管b ( 酶试样，需做3 个平行试样)i l加酶液1 o o l n l加酶液1 0 0 i i l l l ( 4 0 0 2 ) ，2 m i n ( 4 0 o 2 ) ，2 m i n加三氯乙酸2 0 0 l i l l ( 摇匀) 加酪素1 0 0 i i l l ( 摇匀) l ( 4 0 0 2 ) ，l o m i n i ( 4 0 o 2 ) ，1 0 m i n加酪素1 0 0 t l l l ( 摇匀) 加三氯乙酸2 0 0 i i l l ( 摇匀)ll 取出静置1 0 m i n ，过滤 取出静置1 0 m i n ，过滤1 1 取1ooml滤液取1 o o m l 滤液ll 加碳酸钠溶液5 0 l l l l 加碳酸钠溶液5 o m lll加福林试剂使用液1 o o l 止 加福林试剂使用液1 0 0 m li ( 4 0 0 2 ) ，显色2 0 l b i n l ( 4 0 o 2 ) ，显色2 0 m i n于6 8 0 n m 波长，用1 0 衄比色皿， 于6 8 0 册波长，用l o 跚比色皿，测其吸光度 测其吸光度 253试验数据整理蛋白酶的酶活力= 整塑警 式中，酪氨酸含量从标准曲线上查得的数值，( 增) f每毫升所用酶液中含酶的质量，(g) 1 0 0 一1 个酶单位释放出相当于1 0 0 蹭酪氨酸的氨基酸由标准曲线得e m = 8 2 0 6 6 章亩液中酪氨酸含量m l + 0 0 0 6 7 ，由三次平行试验 最终测得酸性蛋白酶的活力为7 5 9 u m l 。 2 6 果胶酶活的测定 2 6 1 方法及原理 1 方法：次皿碘酸法“ 2 原理：果胶酶水解果胶，生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸具有还原性糖醛基，可 的生成决定于中间产物e s 的浓度。e s 的浓度越高，反应速度也就越快。在底物大 量存在时，形成中间产物的量就取决于酶的浓度。酶分子越多，则底物转化为产 物也就相应地增加，这就意味着底物的有效转化随着酶浓度的增加而成直线地增 加，如图3 1 。 反 应 速 度 酶浓度 图3 1 酶浓度与反应速度的关系 f i g 3 1t h er e l a t i o nb e t 宵e e nt h ee n z y m ec o n c e n t r a t i o na n dr e a c t i o nr a t e p h 值对酶活力的影响是很大的，不同的酶有一个适用的p h 范围，酶的稳定性 也受p h 的影响，甚至局部的p h 变化也会对酶促反应影响很大。酶对p h 的敏感程度 比对温度还要高，一般在较低温度下，酶的活力小，在高温时，也有一些瞬间活 力。但对p h 而言，当溶液p h 不是酶适用范围之内时，便可以使酶丧失全部活力。 所以，在进行酶提时，必须事先调好最优p h 值，然后再加入酶，否则酶作用肯定 不好，这是使用时比较关键的一点。 温度对酶提的影响是两方面的：( 1 ) 提高温度可以加快酶提速度，一般而言， 温度每升高1 0 ，反应速度相应增加l 2 倍。( 2 ) 当温度升高到酶的变性温度时， 完成酶的变性过程。在较高的温度下，酶的变性和酶反应的速度将一样快，而且 此种变性是不可逆的。酶在低温下只是催化反应速度慢，甚至慢到不易察觉，但 绝不是不会作用。所以一般可以用低温冷藏技术来保存酶制剂，因为低温下酶的 变性极小。酶变性后，就失去了酶提意义，因此过程存在一个最佳温度，具体随 酶性质而定，例如果胶酶最适温度为4 5 5 0 ，纤维素酶最适温度为5 0 5 5 ， 木瓜蛋白酶最适温度为6 0 7 5 。在实际反应中，酶制剂的作用温度是酶的最适 温度及最佳经济效益的统一。 在实际反应中，酶的露仁敲傅淖钍温度及最佳经济效益的统一。 酶提步骤过后，要进行灭酶，常用的灭酶活方法有：反应到一定时间，将 反应液置于沸水浴中，加热使酶失活；立即加入适宜的酶变性剂；加入酸或 碱溶液，使反应液的p h 值迅速远离酶催化反应的p h ，从而终止反应；将反应液 置于冰粒堆中，使温度迅速降低至1 0 以下等等。对于植物多糖提取体系，将反 应液迅速置于沸水浴中，植物多糖的活性会受到一定的影响，而加酸、加碱，加 酶变性剂，都会影响植物多糖的纯度以及后续含量要求，因此，采用将酶反应液 降温的办法，操作比较简单，基本对目标产物多糖不造成影响。 ( 3 ) 沉析 在提取液中，有机溶剂能破坏多糖分子周围形成的水化层，使多糖分子因为 脱水而相互聚集析出。石油醚、乙醇、乙醚等为植物多糖提取常用的有机溶剂， 而乙醇作为沉析剂，原料丰富、价格较低、回收简单、被广泛应用。因乙醇容易 挥发，在使用时最好在低温环境下进行，一般先将液体冷藏一段时间再进行沉析 步骤。 ( 4 ) 脱蛋白 对于脱蛋白工艺，传统的方法有：s e v a g e 法、三氯三氟乙烷法、三 氯乙酸法。方法操作周期长，多糖容易损失；方法中由于三氯三氟乙烷沸点 较低，易挥发，不宜大量使用；方法参与过程过于剧烈，对多糖活性造成一定 影响。若酶提中采用蛋白酶，大枣中的蛋白质在酶提工艺中几乎被完全分解。而 且过程条件温和，多糖活性不受影响，操作周期又短，至此，原有的除蛋白工艺 步骤就可以省略，在简化提取工艺的同时，也可以达到一个好的提取效果。 3 3 多糖的分析方法 3 3 1 分析原理 多糖的分析检测一般都依靠糖类物质的特征颜色反应。常用的试剂很多。就 反应的化学过程来说，可以概括为两种不同的类型。其一，用无机矿酸( 硫酸或 盐酸) 使糖类脱水形成呋喃醛类衍生物，进一步与酚类或含氮碱缩合生成有色物 质。基于这种原理，提供各种糖类检测试剂。其二，用碱处理糖类，产生复杂的 裂解衍生物，与某些试剂相作用，呈现特殊颜色。目前常用的多糖分析检测方法 硫酸一苯酚法是以第一类分析检测机理为基础，利用多糖在浓硫酸作用下水解成 单糖，单糖进一步脱水成糖醛，糖醛与苯酚直接结合生成橙色衍生物，该衍生物 在4 9 0 m 处出现最大吸收。该法操作简单，试验温度较低，而且具有快速、试验 现象稳定、重现性较好等特点。鉴于以上特点，本实验中以葡萄糖作为标准品， 采用硫酸一苯酚法分析检测大枣多糖。 3 3 2 分析步骤“2 3 1 葡萄糖标准溶液配制 准确称取1 0 5 干燥至恒重的葡萄糖标准品2 4 8 7 3 9 ，用水溶解并定容至 5 0 0 m 1 ，从中移取2 m l 定容至1 0 0 i i l l ，得0 0 9 9 4 9 2 m g m l 的葡萄糖标准溶液。 2 5 苯酚溶液配制 5 苯酚溶液：取苯酚l o o g ，加铝片0 1 9 和n a h c 0 3o 0 5 9 ，蒸馏收集1 8 2 馏分，称取此馏分2 5 9 ，加水4 7 5 9 ，溶解后盛于棕色试剂瓶中，放入冰箱备用。 3 多糖测定的标准曲线 吸取葡萄糖标准溶液o 1 m l ，0 2 m l ，0 3 m 1 ，0 4 m 1 ，0 5 m 1 ，0 6 m 1 ，0 7 m l 于1 0 m l 容量瓶中，再分别加入蒸馏水o 9 m 1 ，0 8 m 1 ，o 7 m 1 ，0 6 m 1 ，o 5 m 1 ，0 4 m 1 ， 0 3 m l ，加入5 的苯酚溶液1 6 m 1 后，加入浓硫酸7 m l ，摇匀放置1 0 分钟，2 5 恒温水浴1 5 分钟，补加蒸馏水至刻度，另取l o m l 容量瓶，加水1 m l ，5 的苯酚 溶液1 6 m l ，后加入浓硫酸7 m l ，按上述方法操作制得空白溶液。以空白溶液为 对照，在4 9 0 n l l l 波长处测定吸光度( 数据见表2 1 ) ，得葡萄糖标准曲线( 见图 2 2 ) ， 线性回归得回归方程a = 0 0 5 4 9 c 一0 0 0 2 4 ，相关系数r = o 9 9 6 6 。 表3 1 葡萄糖标准溶液浓度与吸光度的关系 t a b 3 1r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea b s o r b e n c ya n dc o n c e n t r a t i o no fs t a n d a r ds 0 1 u t i o n o fg l u c o s e 6 p h 4 2 的缓冲液：量取o 1 m o l l 柠檬酸3 0 6 5 m l + o 1 m o l 几柠檬酸三钠 1 9 2 5 m l 。 7 p h5 2 的缓冲液：量取0 1 m o l l 柠檬酸1 8 2 5 m l + o 1 m o l l 柠檬酸三钠 3 1 7 5 m l 。 8 p h7 o 的缓冲液：；量取o 1m 0 1 l l ( h 2 p 0 5 0 0 m l 加o 1 m o l 几n a 0 h2 9 l m l 加水稀释至1 l 。 3 5 4 酸性蛋白复合酶法提取单因素试验 1 加酶浓度的影响 酶添加量是酶提取中一个非常关键的因素，酶添加量与多糖得率和纯度之间 的关系直接反映了酶提法的成功与否。 定量称取烘干枣粉5 份各2 0 9 ，标为1 、2 、3 。、4 。、5 。，分别加入1 ：1 0 的 料水比，调节溶液p h 为4 2 ，溶液温度为4 0 ，一级、二级提取时间都定为 1 2 0 m i n ，酸性蛋白复合酶液添加量分别取o 2 ，o 5 ，1 ，1 2 ，1 5 ，二级 提取时间统一为2 m i n ，低温灭酶活后，提取液浓缩l ：3 ，8 0 醇沉，以后按3 2 ( 第三章第二节) 试验工艺步骤操作，试验结果如图3 3 a ，图3 3 b 所示。 由两图可以看出添加以酸性蛋白酶为主，少量果胶酶、淀粉酶为辅的复合酶 在一定程度上可提高大枣多糖的得率和纯度。在大枣细胞中，蛋白质、粘性果胶 质、淀粉、多糖之间紧密结合，阻挡细胞内物质的外逸；酸性蛋白酶、果胶酶和 淀粉酶协同作用，催化大枣细胞中各部分的水解，细胞内的膜系统就会因内部结 构的变化而发生紊乱、变形或破裂，从而使膜的渗透性增加，促进细胞内物质的 溶出，多糖分子随之释出。 薄 贬 鞭 掩 酶浓度 图3 3 a 加酶浓度对人枣多糖得率的影响 f i g 3 3a e f f e c to fe n zy l l l ec o n c e n t r a t i o no ne x t r a c t i o nr a t i oo fp o l y s a c c h a r i d oo 5l1 5z 酶浓度j 6 图3 3 b 加酶浓度对大枣多糖纯度的影响 f i g 3 3be f f e c to fe n z y m ec o n c e n t r a t i o no nt h ec o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d 在图3 3 a 中，酶添加量在0 2 - o 5 之间大枣多糖得率提高很快，随着酶 的加入量的增加，多糖得率开始有所下降，但得率依旧比较高，直至酶添加量为 1 2 附近，多糖得率急剧下降，酶添加量达到1 5 时。可以说提取液中几乎是 没有大枣多糖。分析认为：当酶添加量少于o 5 时，反应中底物浓度是过量的， 所以反应速度取决于酶浓度，在此时，反应速度与酶浓度之间的关系是符合图 2 1 的，也就是说底物的有效转化随着酶浓度的增加而呈直线的增加，多糖的得 率随之升高：酶浓度在o 5 _ 1 2 之间，反应中底物浓度对于酶浓度来说是只是 部分过量，底物的转化速率是两浓度相互平衡的结果，多糖得率虽有下降的趋势， 但总体来说得率还是比较高；直至酶浓度超过1 2 ，底物浓度开始远远小于酶 浓度，酶对整个反应就不仅仅意味着只将底物转化为目标产物多糖，还会将底物 转化为非目标产物，当酶浓度的增加达到一定程度时，从底物中溶出的多糖将会 被分解掉。由此分析得，反应存在一个最佳酶用量，并非酶添加量越大目标产物 的酶解效果越好。 图3 3 b 中，酶浓度在小于1 时，目标产物浓度平稳增加，此时相对于酶添 加量底物浓度是过量的，那么，目标产物的获得是随酶浓度的增加而增加，当酶 浓度大于1 以后，酶添加量相对于底物浓度是过量的，底物在酶的作用下就会 首先分解掉一部分非目标产物，进而使目标产物纯度相对的升高，酶浓度在越过 1 2 的界限之后，由于酶的大量过量，从底物中溶出的大枣多糖也将要被分解掉， 所以对于大枣多糖的得率和纯度来说都存在一个最佳的酶浓度。 2 提取时间的影响 酶作为催化剂受多种因素影响，其中， p h 、温度、时间为主要影响因素， 首先来观察酶提时间对大枣多糖提取的影响。 蛎 蚰 弘 弱 加 女越蠕据埭 定量称取烘干枣粉6 份各2 0 9 ，标为l 、2 。、3 、4 。、5 。、6 。，分别加入1 ：1 0 的料水比，定酸性蛋白复合酶液添加量为1 ，调节溶液p h 为4 2 ，溶液温度为 4 0 ，一级提取时间分别取4 0 l l l i n ，6 0 i n i n ，1 0 0 m i n ，1 2 0 m i n ，1 4 0 m i n ，1 6 0 m i n ， 二级提取时间统一为1 2 0m i n ，低温灭酶活后，提取液浓缩l ：3 ，8 0 醇沉，以 后按3 2 ( 第三章第二节) 试验工艺步骤操作，试验结果如图3 4 a ，图3 4 b 所 不。 嘏 锝 靶 馨 蚺 u4 u8 ul z u1 6 uz u u 提取时间m i n 图3 4 a 提取时间对大枣多糖得率的影响 f i g 3 4 a e f f e c to f t i m eo ne x t r a c t i o nr a t i oo fp o l y s a c c h a r i d 由图3 4 a 可见，随着提取时间的延长，多糖提取率呈上升的趋势，且在达 到6 0 m i n 之前增长速率最大，这说明开始时提取传质推动力大，但在提取时间达 到1 2 0 m i n 左右时，多糖得率随时间变化不明显了，从提高生产效率的角度看， 再延长时间对多糖提取意义已不大。 4 5 4 0 毋 釜3 5 絮3 0 2 5 2 0 u 4 u8 u1 2 01 6 02 0 0 提取时间m i n 图3 4 b 提取时间对多糖纯度的影响 f i g 3 4 b e f f e c to ft i m eo nt h ec o n t e n to fp 0 1 y s a c c h a r i d 图3 4 b 充分的表明酸性蛋白酶对多糖得率和纯度的影响是不同的，随着时 间的延长，多糖纯度也呈上升趋势，但在1 4 0m i n 左右以后纯度速率下降很快， 这同时暗示着，此时，某些糖苷键可能由于提取时间过久在蛋白酶的催化作用下 图3 6 a 、3 6 b 的曲线反映了p h 值对大枣多糖得率以及纯度的影响规律。酶 要表现活性，它的活性部位有关基团必须具有一定的解离形式，p h 值对酶的影 响就是由于p h 会影响酶的活性中心或与之有关的基团的解离状态。每种酶都有 最适p h 值，在此p h 值下催化反应的速率最高。对最适p h 值偏离不很大时，酶 虽不变性，但会使酶活性部位的基团离子化发生改变，从而降低酶的活力；p h 值发生较大偏离时，维护酶的三维结构的共价键就会受到干扰，导致酶蛋白自身 的变性。对本实验所用酶体系，无论是对于多糖得率还是纯度，p h 最适值都为 3 2 。 3 5 5 酸性蛋白复合酶最佳提取条件正交试验 称取烘干枣粉2 0 9 共9 份，按正交设计表条件进行提取，提取液浓缩1 ：3 ， 8 0 醇沉，低温灭酶后，二次单纯采用去离子水提取2 h ，得多糖用无水乙醇、丙 酮、乙醚依次洗涤，4 5 真空干燥。利用正交实验对酶添加量、p h 、温度等因素 进行考察。 1 正交实验条件 对酶添加量、p h 、温度，设计正交实验，实验条件如表3 3 。 表3 3b ( 3 4 ) 因素水平表 f i g 3 3 f a c t o r sa n dt h e i r1 e v e l so fo r t h o g o n a lt e s t 2 正交实验表 以大枣多糖提取率和纯度为指标，采用l 9 ( 3 4 ) 来确定最佳提取条件。正 交试验结果如表3 4 。 由极差结果得，三个因素对大枣多糖酸性蛋白酶法提取的影响顺序为：c b a ，由实验结果确立主要影响因素参数为c 。b 。a 。即最佳提取条件为：酸性蛋白 酶对底物浓度为1 o ，加酶温 i 图3 7 大枣多糖的紫外扫描图 f i g 3 7u l t r a v i o l e ta b s 0 r p t i o ns p e c t r ao fj d p o 图3 8 大枣多糖的鲤外图谱 f i g 3 8i n f r a r e ds d e c t r ao fj d p 3 5 7 结果与分析 1 由单因素试验可知，影响酸性蛋白复合酶法提取大枣多糖的主要因素有加 酶浓度、反应时间、温度、p h 值；单因素试验结果表明，加酶浓度应在o 5 一1 2 、 反应时间1 2 0 l n i n 、反应温度5 0 左右、反应p h 值应维持在3 2 附近。 2 结合单因素和正交试验结果，优选出酸性蛋白复合酶法提取大枣多糖的工 艺条件为：反应时间1 2 0 m i n ，加酶量1 ，反应温度5 0 ，反应p h 值3 2 。 3 试验所得大枣多糖为浅黄色粉末，溶于水，不溶于高浓度乙醇、丙酮、乙 醚、正丁醇等有机试剂：批样试验表明，所得大枣多糖收率和多糖含量都较高， 试验结果较理想。 4 传统的s e v a g e 法脱蛋白，一方面有机试剂用量大，所用试剂有毒且回收 困难，造成环境污染；另一方面脱蛋白须反复多次操作，操作周期长。酸性蛋白 复合酶脱蛋白效果显著，过程温和，试验周期短。经试验跟踪检测和紫外谱图， 可以得出在提取的多糖中几乎不存在蛋白质。 5 所得大枣多糖经硫酸一苯酚法检测，多糖得率可达4 9 0 9 6 ，纯度达4 8 5 3 与传统水体法相比，其多糖得率平均提高1 左右，多糖纯度平均提高1 5 左右。 6 大枣多糖的紫外光谱扫描表明，不具有蛋白质( 2 9 0 n i l l ) 和核酸( 2 6 0 肿) 的 特征吸收峰：其红外图谱表明，特征吸收峰均为多糖类物质的特征吸收峰。 比较高：但当酶浓度在继续下降时，底物浓度开始远远小于酶浓度，酶对整个反 应就不仅仅意味着只将底物转化为目标产物多糖，还会将底物转化为非目的产 物，当酶浓度的增加达到一定程度时，从底物中溶出的多糖将会被分解掉。由此 分析得，反应存在一个最佳酶用量，并非酶添