（生物化学与分子生物学专业论文）穿膜肽携带的目的蛋白穿膜效应的研究.pdf

缩写词 k 瓣 b p b s a c d k c k i s c p p s d a e c ec o l i e d t a e g f p f b s f c m h t c g f p v i g 口t g k b k i p m a b m c s o d 2 6 0 o n 主要缩写词 英文全称 a n t e n n a p e d i ah o m o d o m a i n b a s ep a i r f e t a lb o v i n ea l b u m i n c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e c y c l i nd e p e n d e n t k i n a s ei n h i b i t o r c e l l - p e n e t r a t i n gp e p a a e s d a l t o n e s o p h a g e a lc a r c i n o m a c e l l e s c h e r i c h i ac o l i e t h y l e r i ed i a m i n e t e w a a c e t i ca c i d e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n f e t a lb o v i n es e n l m f l o wc y t o m e t r y f l u o r e s e e i ni s o t h i o c y a n a t e g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n h u m a ni m m u n o d e f i c i e n c yv i r u s i m m u n o g l o b u l i n i s o p r o p y lt h i o - 1 3 - d - g a l a c t o s i d e k i l o - b a s e k i n a s ei n h i b i t i o np r o t e i n m o n o c l o n a la n t i b o d y m o n o e l o n a ls i t e s o p t i c a ld e n s i t ya t2 6 0 n m o r g i no f r e l i c a t i o n 1 中文全称 果蝇触角同源异形域 碱基对 牛血清白蛋白 周期素依赖激酶 周期素依赖激酶抑制剂 细胞穿膜肽 道尔顿 食管癌细胞 埃希氏大肠杆菌 乙二胺四乙酸 增强型绿色荧光蛋白 胎牛血清 流式细胞术 异硫氰酸荧光素 绿色荧光蛋白 人类免疫缺陷病毒 免疫球蛋白 异丙基硫代1 3 d 一半乳糖苷 千碱基对 激酶抑制蛋白 单克隆抗体 单克隆酶切位点 吸光度 复制起始点 p a g e p b s p c r p e g p t d r m i n s d s s o d 西f t r i s v e g f p o l y c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l p r o t e i nt r a n s d u c t i o nd o m a i n r o u n dp e rm i n u t e s o d i u n ld o d e c y ls u l f a t e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t r a n s - a c t i v a t i n gt r a n s c r i p t i o n a la c t i v a t o r 2 - a m i n o - 2 - ( h y d r o x y m e t h y l ) - 1 ，3 p r o p a n e d i o l v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲溶液 聚合酶链式反应 聚乙二醇 蛋白转导域 转分钟 十二烷基硫酸钠 超氧化物歧化酶 反式转录激活因子 2 - 氨基- 2 掘甲基一1 ，3 丙二醇 血管内皮生长因子 中文摘要 生物大分子在许多疾病的治疗中发挥着重要作用，如超氧化物岐 化酶( s o d ) 和过氧化物酶( c a t ) 、v e g f 、糖尿病特效药胰岛素、抑癌 基因表达的抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞凋亡的抑瘤蛋白p 5 3 、 p 2 7 等。由于细胞膜的天然屏障作用，只有分子量小于6 0 0 d a 的小分 子化合物、非极性疏水性的、脂溶性的，或细胞膜上有其载体的有机 物才能穿透细胞膜进入细胞内。使得这类有治疗价值但无细胞膜穿透 性且易降解的亲水性分子在细胞生物学、药学等研究领域中的应用大 大受到限制。多年来，研究人员致力于探索将这些效应分子导入活细 胞的有效方法。常用的方法有电穿孔、显微注射、改变大分子物质的 物理和化学性状、基因转染、颗粒( 如脂质体) 包裹法和细胞融合技 术等。尽管这些方法各有优势，但都存在着操作复杂、效率不高和难 于调控等问题。 近年来，相继发现了一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度 为几个至几十个氨基酸不等，多数小于2 0 个氨基酸，被命名细胞穿 膜肽( c e l l - p e n e t r a t i n gp e p t i d e s ，c p p s ) 。细胞穿膜肽也被称之为蛋白转 导域( p r o t e i n 仃a n s d u c f i o nd o m a i n , p t d ) ，或t r o j a nh o r s ep e p t i d e s ， 可以有效地将蛋白、多肽、核酸片段通过无受体介导、无耗能的方式， 导入多种哺乳动物细胞，且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。 c p p s 的发现为生物大分子用于疾病治疗带来了曙光，在细胞生物学、 基因治疗、药物体内转运、临床药效评价及细胞免疫学等研究领域均 具有良好的应用前景。细胞穿膜肽有天然存在和人工合成两大类，细 胞穿膜肽的研究始于1 9 8 8 年，g r e e n 和f r a n k e l 分别证实h i v 一1 的 反式激活蛋白t a t 能跨膜转移入细胞质和细胞核内。1 9 9 7 年，v i v e s 等发现h i v t a t 中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片断与蛋白 转导功能密切相关天然存在的c p p s 。目前已经发现的有三种，分别 来自果蝇同源异型域a n t p 、单纯疱疹病毒l 型( h s v - 1 ) v p 2 2 转录因 子以及h i v - l 和s i v ( 2 ，3 ) 的t a t 。这些细胞穿膜肽均为带有正电 荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残 基。利用这一特性，人工合成的多聚精氨酸、赖氨酸，也具有穿膜活 性，且9 个精氨酸和9 个赖氨酸残基构成的基序比t a tp t d 的蛋白转 导活性还要强。经过对天然存在的c p p s 的结构研究m o r r i s 小组设计 合成了2 1 个氨基酸残基的兼性肽段p e p 1 ( k e n v w e t w w t e w s q p v ) ，p e p 一1 不同于天然c p p s ，无需共价键与目的大分 子相连即可发挥转运外源大分子的作用，可以转运天然构像蛋白高效 进入细胞，这大大改善了以往的c p p s 只能高效转运变性蛋白的缺憾。 绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，g f p ) 由2 3 8 个氨基酸组 成，分子量为2 7 k d ，在3 9 5 n m 波长光的激发下可以发射出明亮的绿色 荧光，它的表达没有种属特异性，不需要辅助因子、底物或其他基因 表达产物的协助，灵敏度高。在多数细胞g f p 发出的荧光可以均匀地 充满胞浆、细胞核和诸如轴突的远端突起。g f p 在活细胞、组织或器 官中无需任何处理即可在荧光显微镜下直接观察，加之动物体内不产 生内源性g f p ，它是活细胞的理想标记物，可以在荧光显微镜下直接 对活体细胞进行研究。由于其荧光稳定、检测方便、对活细胞无伤害 等，己被作为报告蛋白在检测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及 追踪细胞系的分化等方面被广泛应用。增强型绿色荧光蛋白 ( e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，e g f p ) 是g f p 的突变体，是由 g f p 的第6 4 、6 5 位的苯丙氨酸和丝氨酸分别置换成亮氨酸和苏氨酸而 形成四j ，e g f p 在4 8 0 n m 波长的激发下可以发射出比g f p 亮3 5 倍的绿色 荧光，使得其观察和检测更为方便灵敏。 p 2 7 基因是= p o l y a k 等于1 9 9 4 年发现的种抑癌基因，其在肿瘤 发生发展和治疗方面的作用正不断被发现。正常情况下p 2 7 基因在g o g l 期表达增高，当细胞进入s 期表达下降。p 2 7 基因编码的p 2 7 蛋白是 细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子( c v - d s ) ，是细胞周期的负调控因子， 能作用于整个细胞周期，广泛抑制各种细胞周期素和c d k 的活性，具 有负调控细胞周期进程、参与细胞分化的调控、诱导细胞凋亡等作用。 除此之外p 2 7 还可调节实体瘤的耐药性，防止炎症对机体的损伤。p 2 7 被广泛应用于各种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、肺癌、宫颈癌等治疗 的试验研究，p 2 7 的降解主要由泛素介导的1 8 7 位苏氨酸磷酸化引起， 半衰期较短( 约2 h ) ，在体内不稳定，因j l t p 2 7 k i p l 被称为“短寿蛋白”。 k u d o 等研究发现将1 8 7 位的苏氨酸置换成丙氨酸，p 2 7 蛋白将不被泛 素激活，蛋白降解明显降低【3 i 】。j e a n 等将p 2 7 转染h e y c 2 细胞，发现细 胞生长明显抑制。 本研究使用的p 2 7 m t 是将天然存在的p 2 7 ( 也称野生型p 2 7 w t ) 编 码1 8 7 位苏氨酸和1 8 8 位脯氨酸的e d n a 序列a c g c c c 突变为a t g a i ， 翻译的氨基酸相应的置换成蛋氨酸和异亮氨酸，突变后的p 2 7 m t 因失 去1 8 7 位苏氨酸活性基团羟基而不能被磷酸化，半衰期延长，能更紧 密的结合c d k c y c l i n 复合物，预示p 2 7 m t 具有更强的抑癌作用。作为 一个含1 9 8 个氨基酸2 7 k d 大小的蛋白质，p 2 7 m t 很难穿透脂质双分子 的细胞膜并在细胞内达到一定的浓度。 本课题分为三个部分 第一部分：t a t - e g f p 融合蛋白对小鼠生物膜穿透性的研究 人工合成编码h i v t a tp t d1 1 个氨基酸的双链寡核苷酸片段， p c r 扩增目的基因e g f p ，分子克隆常规操作构建p e t 2 8 a - t a t e g f p 重组表达载体，转导入宿主菌b l 2 1 后用i p t g 诱导t a t e g f p 融合蛋 白表达，经镍金属鳌合层析柱纯化获得融合蛋白。通过腹腔注射到小 鼠体内，观察t a t e g f p 融合蛋白穿透各组织生物膜及达到各组织的 时间、浓度。研究发现腹腔注射t a t e g f p ，3 0 m i n 后各主要脏器经检 测均有荧光出现，4 h 各组织荧光强度达最大值。研究证明h i v - 1 t a t p t d 与e g f p 形成的融合蛋白可穿透包括脑组织在内的所有生物 膜。这一结果为t a t 携带其他生物大分子穿透生物膜的研究提供了一 个良好的报告蛋白，同时为生物大分子应用于临床治疗开辟了广阔的 前景。 第二部分p e p - 1 e g f p 穿透性研究 人工合成编码p e p l2 1 个氨基酸的两条寡核苷酸片段，p c r 扩增 目的基因e g f p ，利用t a 克隆，构建p g e m - t e g f p 重组质粒，分 子克隆常规操作构建p e t l 5 b p e p 一卜e g f p 重组表达载体，转导入宿主 菌e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) ，i p t g 诱导p e p 一1 一e g f p 融合蛋白表达，经镍金属 鳌合层析柱纯化获得融合蛋白。在体外培养细胞及小鼠体内研究融合 蛋白的穿透性。实验证昵p g e m te a s y 载体的使用使基因克隆过程 更加简便容易，构建更加准确无误。e g f p 的n 端加上p e p l 这一人 工合成的c p p s 形成的融合蛋白，可以无需经过复杂的变性复性过程， 直接以天然有活性的形式穿透体外培养细胞及小鼠各组织器官。这一 研究为使用更加安全有效的穿膜肽奠定了良好的实验基础，为使用天 然构像的e g f p 研究活细胞结构、功能提供了一个良好的报告蛋白。 第三部分：p e p - i - p 2 7 m t 的穿透性研究 人工合成编码细胞穿膜肽p e p 一12 1 个氨基酸的双链寡核苷酸片 段，构建p e t l 5 b p e p 一卜p 2 7 m t 重组表达子，转化大肠杆菌e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 宿主菌，i p t g 诱导，高效表达可溶性p e p 一1 p 2 7 m t 融合 蛋白，利用表达蛋白n 端的组氨酸“标签”，n j 2 + 金属鳌合树脂亲和 层析柱纯化目的蛋白，s d s - p a g e 分析和w e s t e r nb l o t 鉴定纯化目的 蛋白。在体外培养的食管癌e c 9 7 0 6 细胞加入不同浓度的p e p 1 - p 2 7 m t 并作用不同时问，免疫荧光观察加入p e p 一1 p 2 7 m t1 0 m i n 培养细胞即 出现荧光染色，2 h 染色光密度达到最高峰，p e p 1 - p 2 7 m t 终浓度为 l n m o l l 促细胞凋亡作用最强。s d 大鼠腹腔注射p e p 一1 p 2 7 m t 后，免 疫荧光检测发现3 0 m i n 各主要脏器均有荧光出现，4 h 各组织荧光强 度达最大值。实验证明p e p l 能有效携带p 2 7 m t 进入培养细胞及动物 体内，为应用p 2 7 m t 抑制肿瘤细胞生长，治疗肿瘤提供了一种新的生 物学方法。 关键词：细胞穿膜肽t a tp e p - 1蛋白转导域e g f pp g e m - 载体 细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子细胞周期素依赖激酶 突变型p 2 7 a b s t r a c t b i o m a c r o m o l e c u l e sp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nt h et r e a t m e n t o fm a n yd is e a s e s ，s u c ha s s o d ，c a t ，v e g f ，w o n d e rd r u gf o r d i a b e t e s ，i n s u l i n ，a n t i o n c o g e n ee x p r e s s i o ni n h i b i t i n gt h e g r o w t ho fc e l l so ra n t i t u m o rp r o t e i n s ( p 5 3 ，p 2 7 ) c o n t r i b u t i n g t ot h ea p o p t o s i sa n dd e a t ho ft u m o rc e l l s a sar e s u l to fc e l l m e m b r a n e s e r v i n g a st h en a t u r a l b a r r i e r ，o n l yt h es m a ll m o l e c u l a rc o m p o u n d so ro r g a n is m sw h o s em o l e c u l a rv o l u m eis s m a l l e rt h a n6 0 0 d a ，n o n p o l a rh y d r o p h o b i c ，f a t s o l u b l eo r h a v i n gac a r r i e ro nt h ec e l lm e m b r a n ec a ng e tt h r o u g hc e l l m e m b r a n ea n de n t e rt h ec e l l f o ry e a r s ，r e s e a r c h e r sa r et r y i n g h a r dt oe x p l o r ee f f e c t i v ew a y st ot r a n s d u c et h e e f f i c a c y m o l e c u l e si n t ot h ev i a b l ec e l l s a l t h o u g ht h em e t h o d ss u c ha s e l e c t r i cp e r f o r a t i o n ，m i c r o i n j e c t i o n ， c h a n g i n gt h ep h y s i c a l a n dc h e m i c a ls t a t eo fl a r g em o l e c u l e s ，g e n et r a n s f e c t i o n g r a n u l a r ( a sli p o s o m e ) p a c kh a v em a n ya d v a n t a g e ，t h e ya r e c o m p l i c a t e dt om a n i p u l a t e ，w i t hl o we f f i c i e n c ya n dd i f f i c u l t y i na d j u s t m e n t m a n yh e a l i n gm e d i c i n ey e tn of u n c t i o no f b i o m e m b r a n ep e n e t r a t i o n e a s yd e g r a d a t i o na n dh y d r o p h i l i c m o l e c u l e sg r e a t l yr e s t r i c t e di nt h e i ra p p l i c a t i o ni ns u c h r e s e a r c hf i e l d sa sc y t o b i o l o g ya n dp h a r m a c o l o g y i nr e c e n ty e a r s ，s e r i e so fs e q u e n c e so fa m i n oa c i da r ef o u n d t oh a v et h ec e l l p e n e t r a t i n gf u n c t i o n ，w i t ht h el e n g t hs e v e r a l a m i n oa c i d so rt e n so fa m i n oa c i d s ，m o s to fl e n g t hb e i n gl e s s t h a n2 0a m i n oa c i d s ，c a l l e dc e l l p e n e t r a t i n gp e p t i d e s ，c c p s c c p s ，a l s oc a l l e dp r o t e i nt r a n s d u c t i o nd o m a i n ，p t do rt r o j a n h o r s e p e p t i d e s ， i sa b l et o t h r o u g h t h eu s eo f 8 n o n r e c e p t o r i n t e r v e n ti o na n dn o n e n e r g yc o n s u m i n gm e t h o d s ， e f f e c t i v e l yi n t r o d u c es e g m e n t so fp r o t e i n ，p o l y p e p t i d e s ， n u c l e i ca c i di n t ot h ec e l l so fm a n ym a m m a la n i m a l sa n di tw i l l n o tw i t h i nt h es p e c i f i cc o n c e n t r a t i o nl e a dt oc e l ld a m a g e t h e d i s c o v e r y o fc p p ss h e d s b r i g h t 1i g h to nt h e u s eo f b i o m a c r o m o l e c u l e si nt r e a t i n gd i s e a s e s i th a sa v e r yg o o d a p p li c a b l ep r o s p e c ti ns u c hr e s e a r c hf i e l d sa sc y t o b i o l o g y ， g e n e t h e r a p y ，d r u g t r a n s d u c t i o ni n v i v o ， e v a l u a t i o no f c li n i c a lm e d i c i n ea n dm e d i c a li m m u n o l o g y t h e r ea r et w ok i n d s o fc p p s ：n a t u r a la n ds y n t h e t i c t h es t u d yo fc p p sb e g a ni n1 9 8 8 w h e ng r e e na n df r a n k e lp r o v e dt h a tt h et r a n s a c t i n gp r o t e i n f a c t o ro fh i v ic a na c t i v a t et a tt op e n e t r a t ei n t oc y t o p l a s m a n dn u c l e u s i n1 9 7 7 ，v i v e se ta lf o u n di nt h eh i v t a t ，t h e r e w a sac l o s ec o r r e l a t i o nb e t w e e na na b u n d a n ta l k a l i n ea m i n o a c i d s ，s e g m e n t so fp o l y p e p t i d e sc a r r y i n gp o s i t i v ec h a r g ea n d p r o t e i nt r a n s d u c i n gf u n c t i o n n a t u r a lc p p sa r e n o wa l r e a d y f o u n dt ob eo ft h r e et y p e s ，c o m i n gf r o mh i v - i s i vo ft a t d r o s o p h i l aa l l o t y p i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r ， a n t pa n d t r a n s c r i p t i o nf a c t o ro fh s v i ，v p 2 2 t h ec p p sa r ep o l y p e p t i d e s e g m e n t so fv a r i o u sl e n g t h sc a r r y i n gp o s i t i v ec h a r g e ，r i c hi n s u c ha l k a l i n ea m i n oa c i dr e s i d u e sa sa r g i n i n e ，l y s i n ea n ds o o n b y ，m a k i n gg o o d u s eo ft h is f e a t u r e ， s y n t h e s i z e d p o l y a r g i n i n ea n dl y s i n ea l s oh a v ec e l l p e n e t r a t i n ga c t i v i t y t h es t r a i n sc o n s t r u c t e db y9a r g i n i n er e s i d u e sa n d9 l y s i n e r e s i d u e sh a v em o r ep o w e r f u lp r o t e i nt r a n s d u c i n ga c t i v i t yt h a n t a tp t d t h r o u g ht h es t u d yo fn a t u r a lc p p s ，m o r r i s g r o u p d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e da2 1 a m i n o a c i d r e s i d u ea m p h o t e r i c 9 p e p t i d e ，p e p 一1 ( k e t w w e t w w t e w s q p k k k r k v ) p e p 一1i sd i f f e r e n t f r o mn a t u r a lc p p s i td o e s n tn e c e s s a r i l yh a v et oc o m b i n ea i m b i o m a c r o m o l e c u l e sw i t hc o v a l e n tb o n dt om a k et h em o s to f e x o g e n o u sb i o m a c r o m o l e c u l e s ，c a r r y i n ge x o g e n o u sp r o t e i n e f f e c t i v e l yi n t oc e l l s ，a n dt h u sg r e a t l yc h a n g i n gt h ep a s t s i t u a t i o no f c p p s sd e f e c to f c a r r y i n go n l ye f f e c t i v e t r a n s p o r td e n a t u r e dp r o t e i n s g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，g f pc o n s i s t so f2 3 8a m i n oa c i d s ， w h o s em o l e c u l a rv o l u m ei s2 7 k da n du n d e rt h ea c t i v a t i o no f3 9 5 a m 1i g h tw a v e ，g f pc a l lg i v eo u tb r i g h tg r e e nf l u o r e s c e n tl i g h t i t se x p r e s s i o nd o e s n th a v ea n ys p e c i f i c i t y ：i td o e s n tn e e d a n yh e l p i n gf a c t o r ，s u b s t r a t eo rc o o r d i n a t i o no fo t h e r g e n e e x p r e s s i o n ：i th a sh i g hs e n s i t i v i t y i nm o s to fc e l l s ，g f p f l u o r e s c e n c ei se v e n l yd i s t r i b u t e de v e r y w h e r ei nt h ec y t o p l a s m ， n u c l e u sa n df a re n d p r o c e s ss u c ha sa x o n ，w h i c hm a k e si t p o s s i b l et oc o n d u c tr e s e a r c hd i r e c t l yo nt h ev i a b l ec e l l sw i t h t h eh e l po ff l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e a sar e p o r t i n gp r o t e i n ，g f p i sw i d e l ya p p l i e di nd e t e c t i n ga i mg e n ee x p r e s s i o n ，s t u d y i n g e n d o c e l l u a rs u b s t a n c em e t a b o l i s m a n d t r a c k i n g t h e d i f f e r e n t i a t i o no fc e l ls y s t e m e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n c e p r o t e i n ，e g f pi st h em u t a n to fg f p ，d e r i v i n gf r o mt h e6 4 “a n d 6 5 “p h e n y l a n l a n i n ea n ds e r i n ee x c h a n g e di n t ol e u c i n ea n d t h r e o n i n er e s p e c t i v e l y u n d e rt h ea c t i v a t i o no f4 8 0 a mw a v e l e n g t h ，e g f pc a ng i v eo u t3 5t i m e sb r i g h t e rg r e e nf l u o r e s c e n c e ， m a k i n gi te a s i e ra n dc o n v e n i e n tt oo b s e r v ea n dd e t e c t p 2 7i sa na n t i o n c o g e n e ，d i s c o v e r e db yp o l y a ka n do t h e r si n 1 9 9 4 i t sr o l e si nt h ed e v e l o p m e n to fo n t o g e n e s i sa n di t sv a l u e i o i nt h et r e a t m e n to ft u m o r sh a v eb e e nn o t i c e d u n d e rn o r m a l c o n d i t i o n s ，w h e nc e l l se n t e rs t a g esa n dp 2 7g e n ee x p r e s s i o n d r o p s ，t h el e v e l so fg o g 1a r er a i s e d p 2 7p r o t e i ni sc y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e ( c d k ) i n h i b i t o r s ( c d k i s ) a c t i n ga san e g a t i v e c o n t r o lf a c t o ro fc e l lc y c l e ，w h i c hp l a y sar o l ed u r i n gt h e w h o l ec y c l e c d k - c y c l i n s i tc a ns u p p r e s st h ea c t i v i t yo fm a n yk i n d so f a n dc d k i sb yb i n d i n gt h e mt od e l a yt h ec e l l si ng o o rg 1 ，o rp r e v e n tt h ep r o g r e s s i n gf r o mg 1t os ，t h u st op r e v e n t t h ep r o l i f e r a t i o no fc e l l s p 2 7h a sb e e nw i d e l yu s e di nt h e r e s e a r c ho ft h et h e r a p yo fm a n yt u m o r ss u c ha sa li m e n t a r yt u m o r ， m a m m a r yt u m o r ，l u n gc a n c e ra n dc e r v i xt u m o r m o r e o v e r ，i tc a n r e g u l a t et h ed r u gr e s i s t a n c eo ft h et u m o r ，p r o t e c t i n ga g a i n s t o r g a n i s m si n j u r yf r o mi n f l a m m a t i o n s p 2 7 sd e g r a d a t i o n m a i n l yr e s u l t sf r o mt h eu b i q u i t i n p r o t e a s o m ei n t e r v e n t i o no f t h r e o n i n e sp h o s p h o r y l a t i o na tp o s i t i o n1 8 7 i t sh a l f d e c l i n i n gs t a g ei ss h o r t ( a b o u t2 h o u r s ) ，a n di su n s t a b l ei nv i v o ， a sar e s u l t ， p r o t e i n ” k u p 2 7 k i p l i sa l s or e f e r r e dt oa s “s h o r t 一1 i f e d o sg r o u pa n do t h e r sf o u n do u tt h a tp 2 7w i l l n o tb e a c t i v a t e db yu b i q u i t i n p r o t e a s o m ea n dp r o t e i n s d e g r a d a t i o nw i l l f a l l s i g n i f i c a n t l y i ft h r e o n i n ew i l lb e r e p l a c e db ya l a n i n e j e a na n do t h e r st r a n s f e c t e dp 2 7i n t oh e c e i l sa n dd i s c o v e r e dt h eg r o w t ho ft h ec e l l sw e r es i g n i f i c a n i n h i b i t e d y c 2 t l y p 2 7 m tu s e di nt h ep r e s e n ts t u d yisn a t u r a lp 2 7o rc a ll e d w i l dp 2 7 w t ，ap r o t e i ne n c o d i n gt h r o n i n ea tp o s t i o n1 8 7a n dc d n a a tp o s i t i o n1 8 8 ，w i t ht h es e q u e n c eo fa c g c c cm u t a t e di n t oa t g a t c a f t e rm u t a ti o n ，p 2 7 m tl o s e st h eh y d r o x y la n dc a n n o tb e l i p h o s p h o r y l a t e d ， i t sh a l f d e c l i n i n g 1 i f ei s p r o l o n g e d 。 r e s u l t i n gi nh i g h e rb i n d i n ga b i l i t yw i t hc d k - c y c l i n sa n dh i g h e r a n t i t u m o re f f e c t a s2 7 k dp r o t e i nc o n s i s t i n go f1 9 8a m i n o a c i d s ，p 2 7 m tc a nh a r d l yp e n e t r a t et h r o u g hl i p i db i l a y e ra n d r e a c ht h e r a p e u t i cc o n c e n t r a t i o ni nc e l l sb yi t s e l f t h ep r e s e n tr e s e a r c hi sc o m p o s e do ft h r e es e c t i o n s t h ef i r s ts e c t i o n ：s t u d yo nt h ep e n e t r a b i l i t yo ft a t - e g f pf u s i o n p r o t e i nf o rb i o m e m b r a n e so fm i c e s y n t h e s i z e dd o u b l e s t r a n d e do l i g o m e r i cn u c l e o t i d ee n c o d i n g l l a m i n oa c i dh i v t a tp t d a m p l i f i e da i mg e n ee g f pb y p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o na n du s e dm o l e c u l a rc l o n i n gr o u t i n e o p e r a t i o n st oc o n s t r u c tp e t 2 8 a - t a t e g e pr e c o m b i n a n te x p r e s s i n gc a r r i e r ，t r a n s f o r m e dh o s tb a c t e r i ae c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) a n d i n d u c e db yi p t gw i t ht a t e g f pf o rf u s i o n t h ep u r i f i e df u s i o np r o t e i nw a so b t a i n e d p r o t e i ne x p r e s s i o n ， b yn i 2 + a f f i n i t yg e l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n dt h ep e n e t r a b i l i t yo ft a t - e g f pf u s i o n p r o t e i nu n d e raf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea f t e ri n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o no ft h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a so b s e r v e