（化学工程专业论文）硅胶柱层析分离天然及合成磷脂酰乙醇胺的研究.pdf

摘要 高纯度磷脂酰乙醇胺( p e ) 在提高人体记忆力与增强大脑功能方面优于磷脂酰胆碱 ( p c ) ，磷脂酰乙醇胺具有维持及改善认知功能，其应用价值极其为重要：p e 在天然磷 脂组成中含量较低，这使得对其纯化较为困难：在天然磷脂酰乙醇胺的应用过程中，由 于脂肪链的不饱和性，使得其化学稳定性、分散性、乳化性等都不好，而通过合成具有 饱和脂肪链的磷脂酰乙醇胺，其用途更广、更安全，尤其是在医药和食品工业中。 目前国内所用高纯度磷脂产品多从国外进口，年需求量为数吨以上，而传统研究中 又以p c 居多，忽略了p e 的重要性能，所以本实验的主要目的是研究获得高纯度p e 的 方法，同时对天然磷脂进行改性，提高p e 在天然磷脂中的含量，并得到结构稳定的磷 脂酰乙醇胺，经柱层析分离后能达到医药和食品等领域应用的纯度要求。 本文以天然磷脂p c - 6 0 为原料，运用硅胶柱层析法，考察天然磷脂在硅胶柱中的沈 脱情况，在最佳工艺条件下，即氯仿甲醇= 2 3 ( v v ) ，室温下操作，上样量为0 0 2 5 9 磷脂粗品g 硅胶，流速控制在3 m l m i n 左右，可得到纯度为9 6 2 ，回收率为8 9 6 的 磷脂酰乙醇胺；通过酶转化法使得磷脂酰乙醇胺在天然磷脂中的含量提高到8 0 左右， 对酶转化后合成的磷脂酰乙醇胺进行分离纯化，在最佳沈脱工艺下，得到纯度为9 8 3 ， 回收率达9 0 4 的磷脂酰乙醇胺，能满足高纯度磷脂制备的要求，同时还选用了其它低 毒的洗脱剂，也得到了不错的效果。 本实验还用硬脂酸与天然磷脂中的不饱和链进行脂肪酰置换反应，经柱分离得到纯 度高于9 5 的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺产品，红外分析表明，没有不饱和键的吸收峰，这 丰富了对磷脂酰乙醇胺的研究，为日后磷脂酰乙醇胺的工业化生产提供了可靠的数据支 持。 关键词 磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，柱层析，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 t h es t u d yo fn a t ur a la n ds y n t h e t i c a lp h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e s s e p a r a t i o nb yt h es i l i c ag e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y a bs t r a c t t h eh i g h p u r i t yp h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( p e ) s u r p a s s e sp h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( p c ) r e g a r d i n gi m p r o v i n gh u m a nb o d ym e m o r ya n de n h a n c i n gc e r e b r u n af u n c t i o n s i m u l t a n e o u s l y , t h eh i g h p u r i t yp eh a st h ef u n c t i o no fm a i n t a i n i n ga n di m p r o v i n gc o g n i t i o n i t sa p p l i c a t i o n v a l u ei se x t r e m e l yi m p o r t a n t t h ec o n t e n to fp ei nn a t u r a l p h o s p h o l i p i d si sl o w , s oi t s s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o na r ed i f f i c u l t i nt h ea p p l i c a t i o no fl e c i t h i n ，a sar e s u l to f i n s t a u r a t i o no ft h ef a tc h a i n ，i t sc h e m i c a ls t a b i l i t y , d i s p e r s i v i t y , e m u l s i b i l i t ya n ds oo na r en o t g o o d b u tt h ea p p l i c a t i o no fs y n t h e t i c a ll e c i t h i nh a v i n gt h es a t u r a t e df a tc h a i ni sb r o a d e ra n d s a f e r , p a r t i c u l a r l yi nm e d i c i n ea n df o o di n d u s t r y a tp r e s e n t ，t h em o s th i g h p u r i t y p h o s p h o l i p i d sp r o d u c t su s e di nd o m e s t i cm o s t l y d e p e n d so ni m p o r tf r o mo v e r s e a s t h ed e m a n do fh i g h - p u r i t yl e c i t h i nr e a c h e ss e v e r a lt o n sp e r y e a r b u tt h et r a d i t i o n a lr e s e a r c hf o c u s e so np c ，n e g l e c t i n gi m p o r t a n c eo fp e t h e r e f o r e ，t h e m a i np u r p o s eo ft h i se x p e r i m e n ti st oo b t a i nt h eh i g h p u r i t yp em e t h o d ，s i m u l t a n e o u s l yc a r r y o nt h em o d i f i c a t i o nt ot h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fp et oo b t a i ns t a b l es t r u c t u r e ，w h i c hc a nm e e t t h en e e d so fp ei nm e d i c i n e f o o di n d u s t r i e sa n ds oo n t h i sa r t i c l et a k e sn a t u r a l p h o s p h o l i p i d sp c 一6 0 a sr a wm a t e r i a l ，u s i n gt h es i l i c a g e l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n di s o c r a t i ce l u t i o n ，t oi n s p e c te l u t i o ns i t u a t i o no fp h o s p h o l i p i d si n t h es i l i c ag e lc o l u m n t h eb e s tt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o ni st h a tt h ee l u e n ti sc h l o r o f o r m m e t h y l a l c o h o l ( 2 3 ，v v ) ，u n d e rt h er o o mt e m p e r a t u r e ，l o a d i n ga m o u n ti s0 0 2 5 9p h o s p h o l i p i d sr a w m a t e r i a l gs i l i c ag e l ，a n dt h es p e e do ff l o wi sa b o u t3 m l m i n u n d e ra b o v ec o n d i t i o n s ，t h e p u r i t ya n dr e c o v e r yp e r c e n to fp ec a nr e a c h9 6 2 a n d8 9 6 b ye n z y m a t i cc o n v e r s i o n m e t h o d ，t h ec o n t e n to fp ei nn a t u r a lp h o s p h o l i p i d sc a nb er a i s e dt o8 0 i nt h es e p a r a t i o n p r o c e s so fs y n t h e s i sp eo b t a i n e db ye n z y m a t i cc o n v e r s i o nm e t h o d ，t h eb e s tt e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n si st h a tt h ee l u e n ti s c h l o r o f o r m m e t h y la l c o h o l ( 1 2 ，v v ) ，u n d e rt h er o o m t e m p e r a t u r e ，l o a d i n ga m o u n ti s0 0 3 9p h o s p h o l i p i d sr a wm a t e r i a l 儋s i l i c ag e l ，t h es p e e do f f l o wi sa b o u t4 5d r o p m i n u n d e ra b o v ec o n d i t i o n s ，t h ep u r i t yo fp ec a nr e a c h9 8 3 t h e r e c o v e r yp e r c e n ti s 9 0 4 w h i c hc a n s a t i s f yt h er e q u e s to fh i g h p u r i t yp h o s p h o l i p i d s p r e p a r a t i o n m e a n w h i l eo t h e rl o wp o i s o n o u se l u e n t sh a v eb e e ns e l e c t e d ，a l s oo b t a i n i n gt h e g o o dr e s u l t t h i se x p e r i m e n ta l s oc a r r i e so nr e p l a c e m e n tr e a c t i o nb e t w e e nt h es t e a r i ca c i da n dt h e u n s a t u r a t e dc h a i no fn a t u r a lp h o s p h o l i p i d s ， ( d s p e ) w h o s ep u r i t y i s h i g h e rt h a n9 5 o b t a i n i n gd i s t e a r o y l p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e b yc o l u m ns e p a r a t i o n t h ei n f r a r e da n a l y s i s i n d i c a t e dt h a td s p eh a s n ta b s o r p t i o np e a ko fu n s a t u r a t e db o n d ，w h i c hh a se n r i c h e dt h ep e r e s e a r c h ，a n dp r o v i d e dr e l i a b l ed a t as u p p o r tf o r t h ei n d u s t r i a l i z a t i o no fp ep r o d u c t i o ni nt h e f u t u r e k e yw o r d s l e c i t h i n ，p h o s p h a t i d y le t h a n o l a m i n e ，c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ， d i s t e a r o y l - p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e i v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人 允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存禾r i t f 编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构 将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：蝥主耋爿 指导教师签名： 名龇 o c 7 年月j o 日叩年月o 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：祷谨讨 口呷年月 l 两北人学硕l ：学化论义 第一章文献综述弟一早义陬综怂 卵磷脂是一种对人体具有特殊保健功能的物质的总称，在近几十年来的研究中因其 对人类的特殊作用而被受关注，在马良先生编著的卵磷脂健康法一书中将之称为“世 界上最伟大的营养师”l l j ，而高纯度卵磷脂应用更广，效果更好，但获得高纯度卵磷脂 极为困难。其中高纯度磷脂酰乙醇胺( p e ) 在提高人体记忆力与增强大脑功能方面优于 磷脂酰胆碱( p c ) ，同时p e 具有维持及改善认知的功能，其应用价值极其重要；在卵磷脂 的应用过程中，由于脂肪链的不饱和性，使得其化学稳定性、分散性、乳化性等都不好， 而合成具有饱和脂肪链的卵磷脂用途更广、更安全，尤其是在医药和食品工业中。 1 1 卵磷脂结构及其性质简介 1 1 1 卵磷i i i , 勺结构 磷脂最早在1 8 1 2 年由u a u q u e e l i n 发现，1 8 4 4 年法国g l o b l y 首次从蛋黄中分离出来， 俗称卵磷脂( l e c i t h i n ) 1 2 】。 狭义上讲的卵磷脂就是指磷脂酰胆碱( p c ) ，广义上卵磷脂是含p c ，磷脂酰乙醇胺 ( p e ，又称脑磷脂) 、溶血性磷脂酰胆碱( l p c ) 、磷脂酰肌醇( p i ) 、神经鞘磷脂( s m ) 、 磷脂酰丝氨酸( p s ) 等物质的复合磷脂【3 】，它们的组成结构共同有甘油、磷酸、饱和及 不饱和脂肪酸，因此性质上有大的相似，以下几种常见的磷脂结构： 9 一，、v j l - - r 。、1 r 2 山一罡。阜。- 酬3 ，3 图1 - 1 磷脂酰胆碱的分子结构式 f i g 1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fp h o s p h a t i d y i c h o u n e ( p c ) 第一章义献综述 r 2 且。一品。曰i i r 1 +l o 一宁一o n h 3 图1 - 2 磷脂酰乙醇胺的分子结构式 f i g 1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r eo f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( p e ) o r 止o h oo o 一呈一o 南( c h 3 ) 3 i。i n il h ol o o 一 、 洲u 图l - 3 溶血性磷脂酰胆碱的分子结构式 f i g 1 3c h e m i c a ls t r u c t u r eo fh a e m o l y t i c u sp h o s p h a t i d y l c h o i i n e ( l p c ) o i o 一 65 23 图1 - 4 肌醇磷脂的分子结构式 f i g 1 4c h e m i c a ls t r u c t u r eo fp h o s p h a t i d y h n o s i t o l ( p i ) o cco ；一o 撕3 ) 3 一。一一c h 2 一p 一一v 。、别j h ho 一 图1 5 神经鞘磷脂的分子结构式 f i g 1 5c h e m i c a ls t r u c t u r eo f s p r i n g m y e l i n ( s m ) 2 l 止。善 厂洲l o o 止 2 r 两北人学硕i ：学位论文 o 9厂o j l r l r 2 业。一占h o 。 - o - p - o 、r c o o o n h ， 上 不同的磷脂由于化学结构的差异，其极性、溶解度等性质有所不同，在应用中的作 用也不同，例如p e 与p c 的结构很相似，只是以氨基乙醇代替了胆碱，但二者的性质 差异较大，比如溶解性，在生理功能上也存在差异，p e 对于提高人体记忆力与增强大 脑功能方面要优于p c ，同时对于增进大脑的认知功能也比p c 强。 1 1 2 卵磷脂的分布 磷脂对人体来说，是一种天然、无毒害的营养保健食品，磷脂的来源丰富，如在大 豆、鸡蛋，肉类中都含有大量磷脂，它主要存在于动、植物体的细胞之中。在动物体中 磷脂含量较多的组织有肝、脑、心、卵等，而在植物体中以油料作物种子中磷脂含量较 多。表1 1 列出部分常见的动、植物组织中磷脂的含量。 表1 1 常见动、植物组织中含有的磷脂( 干重吣h 1 t a b l e1 1 p h o s p h o l i p i di n c l u d ei nt h ec o m m o na n i m a l s 、p l a n t st i s s u e s ( d r yw e i g h t ) 1 4 i 然而，不同来源的磷脂其组成成分也不同，营养价值也不同，存在较大差别，如菜 籽磷脂的营养价值相对较低。大豆磷脂和蛋黄磷脂是两个比较重要的磷脂来源，表1 2 列出了大豆磷脂与蛋黄磷脂的组成成分比较，从表中可以看出，蛋黄磷脂中的p c 含量 较高，大豆磷脂中的p e 含量比蛋黄磷脂的含量高，但是就大豆磷脂中的p e 含量而言， 仍然太低，想要从大豆中提取高纯度的p e ，仍是具有较大难度的。 第一章文献综述 表1 - 2 蛋黄磷脂与大豆磷脂中各主要磷脂组成差别 t a b l e1 2t h ed i f f e r e n c eo f e a c hm a i np h o s p h o l i p i dc o m p o s i t i o nb e t w e e n e g g - y o l kp h o s p h o l i p i da n ds o y b e a np h o s p h o l i p i d s 大豆足油脂和蛋白质的重要来源，大豆资源在国内、国外相对比较丰富，然而大豆 卵磷脂中不含胆固醇，这是与蛋黄卵磷脂的特殊区别，所以在目前，市场销售的卵磷脂 产品大多足以大豆为原料的。表1 3 中列出了大豆磷脂中各种成分的组成范围： 表1 3 大豆磷脂的组成i s i t a b l e1 3t h ec o m p o s i t i o no fs o y b e a np h o s p h o l i p i d s i s i 1 1 3 卵磷脂的性质 由于天然磷脂分子中含有大量不饱6 r i l l 肪酸，在空气中放置一段时间脂肪链上的不 饱和键容易被氧化，使得磷脂颜色由白色变为黄褐色，产生难闻气味，久而久之还会变 成棕黑色【6 】，这对磷脂的安全应用受到了极大的限制，尤其在医药、食品工业中。 同时大部分磷脂易溶于很多有机溶剂，如乙醚、氯仿、乙醇等，但不溶于丙酮和乙 酸甲酯，而高纯度磷脂酰乙醇胺很难溶于乙醇，粗制磷脂酰乙醇胺能部分溶于乙醇。表 1 4 列出了p c 、p e 在部分溶剂中的溶解性能。 4 两北人学倾t j 学化论文 表1 4 不同磷脂在部分溶剂中的溶解性能7 i t a b l e1 4t h ed i s s o l v e dp e r f o r m a n c eo fd i f f e r e n tp h o s p h o l i p i di np a r t i a lr e s o l v e r s l 7 l 1 1 4 卵磷脂的生理功能 在人体大脑中，卵磷脂的含量在3 0 左右，其含量之高，足见其对人体的重要性， 人体中的卵磷脂对维持生物膜的生理活性和机体的正常代谢起着重要作用，它还是促进 细胞再生机能的基本动力，在对人体的各种细胞活动，维持关节、肌肉等器官组织的正 常功能和各种代谢方面都起着独特的作用，其它物质根本无法办到。卵磷脂主要有以下 几个方面的应用【8 】： 1 卵磷脂具有促进大脑健康功能 食物及药品中的卵磷脂，在人体食用后会被人体的小肠吸收，经过在体内的水解， 最后可以转化为乙酰胆碱，而乙酰胆碱就是记忆素，它对人体而言是一种很重要的神经 传导介质，当乙酰胆碱含量越高，其在人体传递速度越快，记忆能力就越强，乙酰胆碱 含量高还具有抗衰老和抗疲劳功能。 2 卵磷脂具有保护肝脏，防止出现脂肪肝和肝硬化 对于人体的肝脏而言，其含有一定量的磷，当含磷量降低就引起肝脏功能损害，甚 至导致肝癌，而卵磷脂良好的乳化特性可使囤积于肝脏上的脂肪乳化，因而对防治脂肪 肝及肝硬化有显著功效。 2 卵磷脂有改善血管功能 在人体的血液中，常常含有中性脂肪及胆固醇等，如果脂肪在血管内壁停留的时| 、日j 较长，就会引起动脉硬化等疾病，卵磷脂的乳化作用能乳化分解油脂，可促进血液循环、 改善血清质等，从而改善血管功能。 3 卵磷脂对胆结石具有较好的防治作用 胆固醇和胆红素的的大量沉积是形成胆结石的主要原因，而卵磷脂的乳化作用对胆 固醇和胆红素有较好的溶解作用，因而可阻止它的沉积，从根本上可以治疗和预防胆结 石。 4 卵磷脂还是良好的心理调和剂 第一章义献综述 现代生活的人们或多或少都有各种压力，经常处于高压力下会产生焦虑、失h 民等症 状，经常补充卵磷脂，可使人体大脑的各种神经能及时得到营养补充，从而激活人体脑 细胞，消除疲劳，因而可以长时问的保持良好的工作状态，缓和人体心理，使心情得以 放松。 卵磷脂除上述作用外，它还能防治便秘，还是护肾、利尿剂，同时是糖尿病患者的 营养品、胎、婴儿神经发育的必需品，还能改善人体发根微循环，具有美容、防脱发护 发的作用。 1 1 5 多日磷脂的应用 由于卵磷脂具有各种较好的生理活性，比如乳化性、分散性等，因此对其应用较为 广泛，比如在食品工业、医药工业等中的应用，都体现了较好的应用前景，以下是对卵 磷脂在这些领域应用的简单介绍： 1 卵磷脂在食品工业中的应用【9 】 卵磷脂具有较好的乳化效果，在食品工业中，常常与其它乳化剂相互结合使用对食 品起到乳化作用，它还与淀粉、蛋白质结合，从而改良食品的物理性质，对于改善产品 的口味、提高产品的质量及其营养价值有显著作用。 2 卵磷脂在医药工业中的应用【i o 普通的卵磷脂有的可直接应用于医药，有的则不行，然而高纯度卵磷脂比普通卵磷 脂乳化性能更好，在使用中更广泛，高纯度卵磷脂还可作为脂肪注射液中的乳化剂，可 配合其它材料用于制作脂质体，某些卵磷脂还有抗癌活性功能，同时，卵磷脂还可与其 它物质结合作为某些药物的原料。 3 卵磷脂在化妆品工业中的应用【1 1 】 人体食用后的食物经消化后会在人体肠内积蓄大量废物，这些废物能形成肠毒进入 血液循环从而产生青春痘等，造成肌肤粗糙，卵磷脂可化解肠毒。卵磷脂对于人体皮肤 具有很好的渗透性和适应性，能增进皮肤的弹性和柔软性能，而磷脂中的肌醇成分，能 改善发根的微循环，使头发获得足够的营养供物质，对治疗脂溢性脱发也有一定疗效。 4 卵磷脂其它方面的应用 卵磷脂除上述应用外还广泛应用于纺织工业加工过程中、农作物中的防除剂、农作 物的杀菌剂、等其它工业。 6 两北人学颂i j 学化论文 1 。1 ，6 国内外的开发现状【1 2 】 在最近几十年中，国内外对卵磷脂的研究论文有l 二千篇，对磷脂产品的开发已有 几十个品种，目前全世界生产磷脂的厂家很多，而从事高纯度磷脂的生产的却很少，主 要集中在同本、美国、欧洲几家公司生产，对于国际市场而言，精制的卵磷脂产品年需 求量在5 0 0 0 吨左右，但是实际生产中所能提供的卵磷脂还不到一半，还存在较大的市 场差额，关键是得到高纯度的卵磷脂产品的工业化很困难，我国足磷脂资源大国，然而 对于磷脂的，主产及研究没有得到有力发展，对磷脂资源极为浪费，所需的高纯度磷脂仍 然依赖国外进口，和国外相比较而言，还有很大差距。 1 2 卯磷脂的提取及精制方法综述 随着近几十年来对卵磷脂研究及生产，累积了很多对卵磷脂的提取及精制方法，目 i j i 常见的有超临界流体萃取法、溶剂萃取法、柱层析法等，现将常见的几种方法简单介 绍如下： 1 2 1 超临界流体萃取法 超临界流体萃取技术是利用处于临界低压和临界温度以上的流体具有特异增加溶 解能力而发展出来的化工分离新技术，使用超临界流体来取代常用的液体溶媒，比如二 氧化碳流体，利用超临界流体对不同物质的溶解能力不同而达到分离目的。在目前利用 超临界流体萃取技术分离磷脂还得不到很高纯度磷脂，如专利u s p5 ，6 1 6 ，5 2 中，最后 只能得到磷脂含量为8 5 的产物，这对磷脂纯度要求低的领域町以使用，而对于药用 卵磷脂则还达不到要求。 1 2 2 溶剂萃取法 溶剂萃取法精制磷脂产品的基本原理是利用磷脂各组分在某些特定的溶剂中的溶 解度不同，将卵磷脂与其它组分进行分离，比如脑磷脂不易溶于乙醇，磷脂酰胆碱不溶 于丙酮，利用此原理可以用乙醇先将脑磷脂萃取出来，在结合其它方法得到精制的磷脂 产品。h a t t a 等1 4 】用z n c i ：乙醇液纯化粗磷脂，可得至0 高达9 9 6 的磷脂。 1 2 3 柱层析法 在近几十年的研究中，柱层析法制备高纯度卵磷脂得到了广泛的研究，这是因为采 用柱层析法制备卵磷脂产品具有产品纯度高、操作简单，生产剧期短等优点，而在柱层 析过程中，通常选用硅胶、氧化铝等固定相，以下是对这两种分离过程的进行简单介绍： 7 第一章文献综述 1 硅胶柁层析法 在天然磷脂的分离过程中，硅胶是比较常用的一种吸附剂，因为硅胶的价格比较低 廉，在柱层析过程中，吸附与解析过程的重复性好，对于天然混合磷脂中的各组分结合 较好；在硅胶柱层析过程中，其分离效果主要取决于流动相的选择，通常选择一种或两 种及两种以上的混合沈脱剂沈脱。 在专利u s p4 ，8 5 7 ，2 3 6 中，将鸡蛋磷脂在室温条件下通入硅胶柱，经过沈脱最后 得到磷脂酰且h 碱含量可达9 4 1 1 5 】。 2 氧化铝柱层析法 对于天然磷脂的分离纯化而言，氧化铝也是一种常见的吸附剂，不过相比硅胶作为 吸附剂而言，氧化铝作为吸附剂分离纯化卵磷脂的的研究相对较少，其对p i 和p e 吸附 较强，乙醇溶液难以洗脱，但其分离效果很好，s i n g l e t o nn 刚等用三氧化二铝为吸附剂， 可得到高纯度p c 。 1 2 4 酶催化精制法 在粗品磷脂中，通过酶转化合成法，可将p i 、p c 和p a 等磷脂转化为p e ，同时可将 p i 、p e 和p a 等转化为p c ，这样可大大提高目标磷脂的含量，通过分离纯化能得到的较 多的日标产物，更加经济，如l e k h 1 等人通过酶催化精制法将蛋黄磷脂中的磷脂酰胆 碱含量由7 5 提高到1 0 0 。 1 2 5 膜分离法1 1 8 】 膜分离过程的原理是利用物质通过膜的传递性质不同而进行分离的方法，在对磷脂 的分离过程中，由于各磷脂各组分的分子量不同，通过半透膜的传递速率以及透过量不 同，可将目标磷脂从混和物中分离出来。 1 2 6 各种精制方法的综合评价 在近几十年的研究过程中，精制高纯度磷脂的方法有很多，有的精制方法还处于探 索阶段，有的方法还有很大的局限性，相比其他的精制方法，柱层析法精制高纯度磷脂 具有设备简单，生产成本低，得到产品的含量高等优点，是较为常用的一种方法。对于 不同精制方法的比较见表1 5 。 8 两北人学硕i ：学位论义 表1 - 5 卵磷腊各种提取和精制方法的综合评价n 9 1 t a b l e1 5t h es y n t h e t i ce v a l u a t i o nf o re a c hk i n do fe x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o nm e t h o d so fl e c i t h i n l l 9 】 1 3 磷脂的改性 天然磷脂的成分比较复杂，要想充分利用磷脂资源，也不是一件容易的事，而我国 是世界上大豆生产的大国，有着丰富的磷脂资源，但对其利用率极低，不到1 0 ，大部 分则作为废料生产低级肥皂；而天然磷脂中所含不饱和脂肪链也是限制其应用的一个主 要原因，因为脂肪链中不饱和键容易被氧化而使其作用退化、消失，甚至危及人体生命， 尤其是对于静脉注射药剂使用，在食品工业中的应用也受到限制，而改性后的磷脂应用 领域更为宽广，对于磷脂的改性方法主要有以下三种：化学改性、物理改性和酶法改性 【2 0 1 0 1 3 1 化学改性 磷脂的化学改性是利用某些化学试剂与磷脂中的官能团进行反应，使磷脂本身的化 9 第一章文献综述 学结构发生了变化，通过化学改性后使得磷脂的性能更优越，结构更稳定，使用更安全， 应用更广泛，比如将磷脂氢化得到色淡，无难闻气味的产品，这使磷脂在食品、医药领 域的应用更广、更安全。国内目自仃完成工业化生产研究的品种主要有水解【2 、酰羟化2 2 1 羟基化、磺化【2 3 】、乙酰化2 4 1 、羟氯化、氢化改性磷脂产品。 1 3 2 物理改性 物理改性就是采用一定的物理方法将混合磷脂中具有特定功能的磷脂分离纯化、富 集的过程，在此过程中，磷脂本身的化学结构不变，在目前，对磷脂用物理改性主要有 低级醇分离法、吸附分离法、膜分离法。但物理改性存在不能改变磷脂的功能和性质的 缺点。 1 3 3 酶法改性 利用酶对磷脂进行改性，具有反应速度快、作用部位准确、条件温和等特点，磷脂 通过酶催化转化后，所得产物容易分离得到，此操作过程方便，所用设备简单，在目前 的研究过程中，常用于磷脂改性的酶包括磷脂酶a 1 ，a 2 ，c ，d 等。 在几种常见的磷脂酶中，磷脂酶c 和磷脂酶d 应用较广，磷脂酶c 作用于p c ，生成甘 油二酯和磷酸胆碱；而磷脂酶d 是一类特殊的酯键水解酶，其分布较广【2 5 1 ，利用该酶对 磷脂进行改性，可制备高纯度的单一磷脂和稀有磷脂1 2 6 1 ，在目前的研究过程中，对磷脂 酶d 的研究较为广泛。 1 4 课题的研究目的和内容 目前国内尚无高含量磷脂酰乙醇胺的生产工艺，有些品质较差的磷脂酰乙醇胺产 品，其价格低廉，部分产品也出现积压状态；而对于需求量较高的高纯度卵磷脂产品， 如药用卵磷脂和食品工业中的需求的卵磷脂，大部分必须从国外进口，年需求量较大； 然而要想深度开发对天然磷脂的应用，除了要降低在生产过程的生产成本之外，还要进 一步研制和开发磷脂改性产品，因为天然磷脂分子中含有不饱和链，使得其化学稳定性、 分散性、乳化性不好，而饱和结构的卵磷脂具有脱色、脱臭作用，更有利于贮存保管， 对于提高其在医药、高级化妆品、轻工业中的作用也很重要，特别是在做静脉注射脂肪 乳化剂和营养剂，它作为血脂乳化剂，能防止动脉硬化，且具有易消化、易吸收、几乎 不在内脏中残存等优点；同时磷脂酰乙醇胺在天然磷脂中的含量不是很高，而磷脂酰乙 醇胺是大脑和神经发育的基础物质，能增强脑细胞活化程度及智力水平，发展智力，用 1 0 两北人学硕i j 学他论文 于改善汇忆和认知能力，提高智力等，利用人- 丁合成或对大然磷脂酰乙醇胺进行改性可 大大弥补磷脂酰乙醇胺含量低的缺陷；所以，针对我过磷脂资源的现状，l ：发高纯度约 用磷脂酰乙醇胺具有很强的应用背景，其市场经济价值可观，本文作了以下研究： ( 1 ) 以硅胶为吸附剂，对天然大豆磷脂p c 6 0 在柱层析上的洗脱特性进行了系统的研 究，能同时得到含量高达9 0 以上的p c 和p e 产品，并优化上样量及流速两个工艺参 数。 ( 2 ) 以大豆磷脂p c 6 0 为原料，利用本实验室优选出的链霉菌菌株发酵生产磷脂酶d ， 酶转化法合成磷脂酰乙醇胺，解决其在天然磷脂中含量低的问题。 ( 3 ) 以硅胶为吸附剂，对酶转化合成磷脂酰乙醇胺在层析柱上的沈脱特性进行了系统 的研究，能得到纯度高达9 0 以上的磷脂酰乙醇胺产品，并优化上样量及流速两个工艺 参数。 ( 4 ) 在对传统分离工艺的改进基础上，拟在探索一条毒性低、方便、廉价、产品纯度 高的工艺路线，为其工业化的实现提供有用的数据。 ( 5 ) 将硬脂酸与天然磷脂进行脂肪酰置换反应，解决天然磷脂中不饱和链的缺点，获 得二硬脂酰磷脂酰乙醇胺粗品，通过柱层析法分离得到纯度在9 5 以上二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺，为磷脂在医药、食品等领域的应用提供可靠的实验数据。 第一：章卵磷脂分析方法 第二章卯磷脂分析方法 2 1 常见卵磷脂的分析方法 卵磷脂的检测方法有很多，常见的检测方法有薄层层析法( t l c ) 、比色法f 2 7 】、核磁 共振法、液相色潜法等，这罩只介绍薄层层析法、高效液相色潜法、3 p 核磁共振法。 2 2 1 薄层层析法 对于天然磷脂中的各组分，由于结构上的不同，其极性、溶解度等性质也有很大差 异，而薄层板上的硅胶对被检测物质中各组分的吸附能力不同，在展丌剂的作用下，各 组分在板上移动的距离不同，所以可根据其位移值确定目标成分。在t l c 法检测过程中， 不需要昂贵的仪器，操作起来方便，其结果直观，过程快速，目前，t l c 法在对物质的 检测过程中仍被广泛使用。而对于t l c 法来说展开剂很重要，在磷脂的检测中大部分展 开剂都是碱性体系，经t l c 法分离得到的纯品在用其它方法定量分析。对板的显色中显 色剂除常用的碘蒸气外还有茚三酮、苯甲醛【2 8 j 等。 2 2 2 高效液相色谱法 高效液相色谱法简称t t p l c 法，它出现比较晚，对其研究比较迅速，而高效液相色 谱仪价格昂贵，有几十力甚至上百万的，因此其应用受到了一定的限制。在常温下，它 在封闭系统中能准确的定量分析磷脂产品；用h p l c 方法进行分析时，常用的固定相有： 正相柱和反相柱等。流动相一般有乙腈一甲醇体系【2 9 3 1 1 ( 乙腈一甲醇一冰乙酸、乙腈一甲醇一 水、乙腈一甲醇一磷酸等) 和正己烷一异丙醇体系【3 2 。3 3 1 ( 币己烷一异丙醇一磷酸或f 己烷一异丙 醇一醋酸等) 。 2 2 。33 1 p 核磁共振法( 3 1 p n m r ) 在混合磷脂组分中，不同的磷脂其磷酸根上的基团不同，它们对磷原子的作用也不 同，在磁场的作用下，不同磷脂的的化学位移不同，根掘这个原理，可用柬对磷脂中不 同组分进行定量、定性分析。在该法中，其所用仪器是3 1 p 核磁共振光谱仪，价格比较 昂贵，操作条件复杂，在使用过程中，扫描过程中的捕获数量以及线展宽的程度等参数 设定都随着实验的条件而确定。施邑屏等3 4 1 用3 1 p 核磁共振分析大豆磷脂中p c 组分含量， 取得一定效果，然而，到目前为止，用该方法在磷脂检测领域还算是一种新型的检测方 法，有关它对磷脂的实验效果有待于进一步的探索。 1 2 两北人学硕i j 学位论文 2 2 。4 其它方法 对于磷脂的分析方法，除以上介绍的几种以外，目前人们还尝试用其它分析技术来 对磷脂产品进行分析，目的是为了得到较好的磷脂分析方法，比如质谱、傅立叶转变红 外光谱及超临界流体色谱技术3 5 1 等。 通过对以上几种方法的分析，鉴于t l c 法不需要昂贵的仪器，操作起来方便，其结 果直观，过程快速等优点，以及本实验条件所需，故在本实验过程中采用t l c 法对卵磷 脂进行分析研究，此外，在原料进行化学反应过程中，还可利用薄层色谱观察原料斑点 的逐步消失来判断反应是否完成。 2 2 薄层层析法 2 2 1 薄层层析法的简介 薄层层析法( t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，i ! j t l c ) 又称薄板色谱法【3 6 】，属于固一液 吸附色谱，是近些年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和 纸色谱的优点。此法特别适用于挥发性较小或在较高温度下易发生变化而不能用气相色 谱分析的物资。t l c 法按其固定相性质和分离机理不同t l c 法可分为：吸附薄层法，分配 薄层法等，在这里主要讨论吸附薄层法。 2 2 2 薄层层析法的基本特点 ( 1 ) t l c 法在检测过程中操作简单，使用方便，而且比较廉价，分析速度快。 ( 2 ) 对于样品而言，将其点于色谱板上检测，组分不会丢失。 ( 3 ) 薄层层析板可使用多种显色剂，如碘、钼酸铵等，有的显色剂对所有组分都能显色， 也可用专属显色剂只检测指定组分。 ( 4 ) 在同一块色谱板上各种物质的比移值不同，因此对于同一个薄层板可同时分离多个 样品。而在检测过程中的样品所需量很少，一般而言样品量低于l o m g 。 ( 5 ) t l c 法应用较广的原凶还有它灵敏度较高，使用效果好。 2 2 3t l c 法的基本原理 t l c 是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，使混合物的溶 液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分丌，它是一种物理化 学分离技术，这种物质就是薄板上的固定相，一般是极性的。当把点好样品的溥层层析 板放入层析缸后，展丌剂则丌始进入薄层层析板中，在展丌剂的极性作用下，层析板中 第一：章卵磷脂分析方法 的样品则随着展丌剂慢慢移动，根据被分离各组分物质的极件差异，使得展丌时各组分 在薄层层析板上移动速度不一样，被分离物质中与固定相吸附剂亲和力弱的组分在离原 点较远的地方，相反组分则留在接近样品滴加点较近的地方，使各组分得以分离丌，达 到分离目的。 2 2 4t l c 的定性分析和定量分析 ( 1 ) r f 值 r f 称为比移值，是溶质的运动速度与展开剂的运动速度之比值。 。 溶质的运动速度 ，k r2 丽币而硬覆两夏 在薄层色谱中，由于一般溶质与展开剂同时由原点运动，囚而r ，值又可表示为移动 距离的比值，即： d 溶质的运动速度 从原点至斑点中心的距离 r2 裒币丽砭祗2 苁瓦砸孬薪孺语丽 r ，值在薄层层析法中是一个很重考察指标，它是判断被检测物质中各组分是否能分 开的一个依据，r ，值最好不要大于0 9 ，也不要小于0 1 ，这样很难对分离组分进行判断， 而在柱层析过程中，流动相的确定可通过薄层层析板进行初步筛选出来，用来考察流动 相是否能分离被分离的组分，可先用用薄层层析板将被分离组分走板判断。影响r ，值的 因素也很多，比如展开距离、薄层厚度、点样的量等，其中最重要的是吸附剂的性质与 展开剂的极性和溶解能力，所以要综合选择才能做出诉确的判断。 ( 2 ) 对样品的定性分析 以下是几种常见的薄层色谱定性分析方法。 将样品的r ，值与标准品的r ，值相比较。r ，值在薄层层析法中是一个很重考察指标，尤 其是在定性研究过程中，因为同种物质的r ，值是一样的，但r ，值一样时也不能肯定就是 同一种物质，有时常需要将多种不同展开剂得到的r ，值与标样的r ，值比较，一致时，才 能基本判断该斑点与标样属同一物质。 对得到的斑点使用斑点的原位扫描。利用薄层扫描仪对展歼后的斑点进行原位扫 描，就可得到在此条件下的扫描图，当斑点扫描图中的吸收峰及最大吸收波长与标样的 吸收峰及最大吸收波长一致时，则可认为是同一种组分。 将被分析成分斑点的显色特性与标样的显色特性相比较，用束确定化合物性质。 1 4 两北人学顺l j 学位论义 ( 3 ) 对样品的定量分析 在对样品进行了定性分析后，还应对其进行定鼍分析，对样品的定量分析比定性难 得多，以下是主要目前几种t l c 定量分析方法： 洗脱测定法：该方法主要是对于样品在薄层板上被分离后，找到要分析物质的斑 点位置，将其斑点所在位置的吸附剂全部取下，用能将该组分溶解的溶剂将化合物洗脱， 再用分光光度法等方法测其含量。虽然该方法测量精度较高，但操作复杂，操作过程繁 琐，耗时较长，有很大的缺点。 测量面积法：通过与已知不同浓度标准样品在相同层析条件下展开所得斑点面积 比较，来确定其含量。 薄层扫描仪法：指用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收 或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测层析谱， 它是一种是微量、快速定量分析的有效手段。 目测比较法：即样品在经薄层层析后的层析板上，能直接观察斑点的大小及颜色 深浅，与在相同层析条件标准样品所得标准斑点相比较，判断样品中所测目标成分的含 量，这种方法准确度很低，操作也比较麻烦。 基