（生物化学与分子生物学专业论文）短杆菌胆固醇氧化酶基因的表达研究.pdf

摘要 摘要 胆固醇氧化酶( e c l 1 3 6c o d ) 在食品加工、医疗检测、生物抗虫等方面的作用 日益受到人们的重视，并且显示出巨大的应用潜力。本文主要研究短杆菌b r e v i b a c t e r i u m s p d g c d c 8 2 胆固醇氧化酶在大肠杆菌和在巴斯德毕赤酵母中的表达。 用p c r 方法从b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 8 2 染色体d n a 中扩增出含信号肽序列的 胆固醇氧化酶结构基因，插入大肠杆菌表达载体p e t 2 8 a ( + ) 中，构建成重组质粒 p e t 2 8 a c o d ( s + ) 。以p e t 2 8 a c o d ( s + ) 为底物，扩增出不含信号肽的胆固醇氧化酶结构 基因，构建成重组质粒p e t 2 8 a c o d ( s ) 。两种重组载体转化大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 均获得 活性表达，不含信号肽基因的转化子酶活较高。在转化子中，两种结构基因与p e t 2 8 a ( + ) 携带的h i s t a g 融合表达，经i p t g 诱导后均表达出分子量约为5 5 k d 的蛋白质， 目的蛋白大都为没有活性的包涵体，占细胞总蛋白的5 0 以上。 将不含信号肽的胆固醇氧化酶基因克隆至含t r p l a c 双启动子的表达载体p t r c 9 9 a 中，并在大肠杆菌j m l 0 9 中进行了i p t g 诱导表达，并分别考察了诱导温度、时间、i p t g 浓度等因素对重组菌表达的胆固醇氧化酶的影响。在优化条件下，该胆固醇氧化酶的酶 活可以达至l j 7 0 0u l 。酶学特性分析表明其反应的最适p h 为7 5 ，最适温度为4 0 。 将不含信号肽的胆固醇氧化酶结构基因插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体 p p i c 9 k 的e c o ri 和n o ti 位点，构建成p p i c 9 k c o d ，重组质粒以s a ci 线性化后电转 化巴斯德毕赤酵母g s l l 5 。甲醇诱导条件下，重组胆固醇氧化酶仅有少量存在于细胞破 碎液的上清液中，并没有在毕赤酵母中获得分泌表达。 关键词：胆固醇氧化酶：b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c - 8 2 ；信号肽；表达；e c o l i ；巴 斯德毕赤酵母 a b s t r a e t a b s t r a e t t h es i g n i f i c a n tf u n c t i o n so fc h o l e s t e r o lo x i d a s e ( e c1 1 3 6 ，c o d ) i nf o o dp r o c e s s i n g ， m e d i c a la s s a ya n d b i o l o g i c a lp e s t r e s i s t a n c e w e r er e c o g n i z e dg r a d u a l l ya n ds h o w e d p o t e n t i a l l yu s e t h i sr e s e a r c hi sm a i n l yf o c u s e do ne x p r e s s i o no fc h o l e s t e r o lo x i d a s eg e n e f r o mb r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 一8 2i ne s c h e r i c h i ac o l ia n de x p r e s s i o no ft h eg e n ei n e u k a r y o t e s t h es t r u c t u r eg e n eo f b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c - 8 2c h o l e s t e r o lo x i d a s ew i t l ls i g n a l s e q u e n c ew a sa m p l i f i e df r o mg e n o m i cd n ao fb r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 一8 2b yp c r t e c h n i q u e t h er e c o m b i n a n tv e c t o r , p e t 2 8 a - c o d ( s + ) ，w a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gt h e a m p l i f i e df r a g m e n t ( a b o u t1 5 k b ) i n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t 2 8 a ( + ) t h ed n af r a g m e n t e n c o d i n gm a t u r ep e p t i d eo fc o d w a sa m p l i f i e df r o mp e t 2 8 a c o d ( s + ) a n dw a st h e ni n s e r t e d i n t op e t 2 8 a ( + ) t oc o n s t r u c tp e t 2 8 a c o d ( s - ) b o t hr e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r et r a n s f o r m e d i n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) r e s p e c t i v e l y p r o m o t e da n dc o n t r o l l e db yt 7 l a cp r o m o t e r , t h ef u s i o n p r o t e i nc o n t a i n i n gh i s - t a ga n dt h ep e p t i d eo fc o dw i t ho rw i t h o u ts i g n a lp e p t i d ec o u l db e e x p r e s s e dw i t h i nt h ec e l lo fr e c o m b i n a n te c o l i t h ea c t i v er e c o m b i n a n te n z y m ew a st e s t e d a f t e rt h et w or e c o m b i n a n t s i n d u c e db yi p t g t h ee x p r e s s i o np r o d u c t so ff u l lg e n ea n dm a t u r e e n z y m eg e n ew e r ea n a l y z e db ys d s - p a g ei n d i c a t i n gt h a ta b o u t5 5 k dp r o t e i nw a so b t a i n e d ， w h i c ha c c o u n t e df o ra b o u t5 0 o ft h ec e l lt o t a lp r o t e i n t h em a t u r ee n z y m eg e n eo fc o df r o mb r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c - 8 2w a si n s e r t e di n t o ap r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp t r c 9 9 a t h ev e c t o rw a sc o n t r o l l e db yt r p i a cp r o m o t e r a r e c o m b i n a n tp l a s m i dp t r c 9 9 a - c o dw a so b t a i n e da n dt h e nt r a n s f o r m e di n t ot h ee x p r e s s i o n h o s tj m10 9 t h ei n f l u e n c e so fi n d u c t i o nc o n d i t i o n ss u c ha si p t gc o n c e n t r a t i o n ，t h ei n d u c t i o n t e m p e r a t u r ea n dt i m eo fi n d u c t i o no nt h ee x p r e s s i o no ft h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw e r e i n v e s t i g a t e d u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n ，t h ee n z y m ea c t i v i t yr e a c h e d7 0 0 u l t h ee n z y m a t i c a n a l y s i so ft h ec h o l e s t e r o lo x i d a s er e v e a l e dt h a ti t so p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r ew a s7 5a n d 4 0 。c ，r e s p e c t i v e l y t h es t r u c t u r eg e n eo fc o dw i t h o u ts i g n a ls e q u e n c ew a si n t ot h es i t ee c o ri 、 n o tio f p p i c 9 k ，as e c r e t i n ge x p r e s s i o nv e c t o ro f p i c h i ap a s t o r i s t h ep l a s m i dp p i c 9 k c o dw a s l i n e a r 、析t l ls a lia n dt r a n s f o r mp p a s t o r i sg s115 i n d u c t i n gw i t hm e t h a n 0 1 t h ea c t i v ec o d e n z y m ee x p r e s s e df r o mt h er e c o m b i n a n tp p a s t o r i sw a sf o u n do n l ye x s i s t i n gi nt h e s u p e r n a t a n to ft h ec r u d ec e l le x t r a c t ，b u tn o ts e c r e t e di n t oc u l t u r em e d i u m k e y w o r d s ：c h o l e s t e r o lo x i d a s e ：b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 一8 2 ；s i g n a lp e p t i d e ； e x p r e s s i o n ；e c o l i ；p i c h i ap a s t o r i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：姓 日 期： 坦丞墨：三： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名：芷立越 第一章绪论 第一章绪论 胆固醇氧化酶( c h o l e s t e r o lo x i d a s e ，e c1 1 3 6 ) 简称c o d ，是胆固醇降解代谢过程 中的第一个酶，能专一性地催化底物胆固醇生成胆甾一4 一烯一3 一酮。微生物是胆固醇 氧化酶最为主要的来源。胆固醇氧化酶广泛应用于临床血清中胆固醇含量的检测，是一 种重要的诊断用酶，近年来发现它在生化制药、食品加工、抗虫基因工程等方面也具有 良好的应用价值。 1 1 胆固醇氧化酶的来源和分类 动植物来源的胆固醇氧化酶研究较少，目前主要研究集中在微生物来源的胆固醇氧 化酶。1 9 4 8 年t u r f i t t 首次分离鉴定了一株能分解胆固醇的红平诺卡氏菌( n o c a r d i a e r y t h r o p o l i s ) 【l j 。1 9 5 4 年s t a d t m a n 的研究阐明了胆固醇分枝杆菌( m y c o b a c t e r i u m c h o l e s t e r o l i c u m ) 氧化分解胆固醇的产物是胆甾一4 一烯- 3 - 酮和h 2 0 2 ，确定了胆固醇氧化 酶在其中的作用，并对胆固醇氧化酶的性质做了初步研究【2 】。1 9 7 3 年u w a j i m a t 3 】首次获得 了胆固醇短杆菌( b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u ma t c c 2 1 3 8 7 ) 的胆固醇氧化酶的结晶，通过 光谱分析检测到胆固醇氧化酶具有黄素蛋白的特征吸收峰，首次发现了胆固醇氧化酶是 核黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 依赖型辅酶。随着生化技术的发展，通过分析反应产物， 在更多种的微生物中分离纯化和鉴定了胆固醇氧化酶，这些微生物都能够利用胆固醇作 为唯一碳源，主要包括诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 、链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 、短杆菌属 ( b r e v i b a c t e r i u m ) 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、裂殖菌属( s c h i z o p h y l l u m ) 、链轮丝菌属 ( s t r e p t o v e r t i c i l l i u m ) 、红球菌属( r h o d o c o c c u s ) 、芽胞杆菌属( b a c i l l u s ) 、棒状杆菌属 ( c o r y n e b a c t e r i u m ) 等，其中链霉菌属中产生胆固醇氧化酶的菌种最多。近年来国内外 研究较多的是来源于短杆菌属和链霉菌属的胆固醇氧化酶，它们己被日本的t o y o b o 公司 和k y o w a - h a k k o 公司用于工业化生产。 除诺卡氏菌n o c a r d i ar h o d o c h r o u s 产的胆固醇氧化酶夕b f 4 j ，其他微生物来源的胆固 醇氧化酶以f a d 作为辅基，接受电子进行氧化磷酸化，提供微生物细胞所需的能量。根 据酶与f a d 的结合方式，可将胆固醇氧化酶分为非共价结合( i 型) 和共价结合( i i 型) 两种形式。链球菌s t r e p t o m y c e ss p s a c o o 产生的胆固醇氧化酶( c h o a ) 和来源于短杆 菌b r e v i b a c t e r i u ms t e r o l i c u m 的胆固醇氧化酶( c h o b l ) 属于i 型酶；来源于另一株短杆菌 b r e v i b a c t e r i u m 的胆固醇氧化酶( c h o b 2 ) 属于i i 型酶【5 1 。g a d d a 等人【6 】对这两种酶的性质 进行比较发现，i 型酶和i i 型酶都具备黄素蛋白氧化酶特性，即具有与亚硫酸盐形成黄 素加合物的能力以及光还原形成热动力学稳定的红半醌阴离子的能力。但i i 型酶产生黄 素加合物的速度是i 型酶的5 0 倍，i i 型酶的氧化还原电势中点比i 型酶的高+ 1 0 0 m v ； 另外，两类酶中f a d 的氧化型、半醌型以及全还原型的光谱特性均有差异。 1 2 胆固醇氧化酶分子研究进展 1 2 1 胆固醇氧化酶的酶学性质 不同微生物来源的胆固醇氧化酶，其分布及其酶学性质各有差异。有的微生物产生 的胆固醇氧化酶吸附在细胞膜上，而有的微生物产生的胆固醇氧化酶能够直接分泌到发 酵液中。胆固醇氧化酶分子量一般在3 0 l 到6 0 l 之间，而红球菌属【7 j 细胞膜上的胆固醇 江南大学硕士学位论文 氧化酶的分子量较大，约为8 0 k d ；胆固醇氧化酶耐受酸碱范围在p h 4 1 1 2 _ 间，最适反 应p h 范围一般为中性偏碱。耐热性最好的是假单胞菌s t 一2 0 0 ( p s e u d o m o n s ss p s t - 2 0 0 ) 产胆固醇氧化酶，其在6 0 c 条件下酶活最高【8 j 。热稳定性较好的还有胆固醇短杆菌 a t c c 2 1 3 8 7 胆固醇氧化酶，在5 0 和6 0 保温3 0 分钟，相对酶活力分别为1 0 0 和8 1 p j 。 去垢剂脱氧胆酸钠和t r i t o nx 1 0 0 一般不会使胆固醇氧化酶失活，但一些金属离子如 铁、铜、银等会不同程度的抑制它的活性。在含l m m o l l 汞离子或银离子的溶液中，酶 的氧化活力下降5 0 - - 1 0 0 ，用谷胱甘肽或半胱氨酸可以解除或部分解除重金属离子对 酶活的抑制作用，说明胆固醇氧化酶的氧化活性中心有巯基存在【9 】。表1 1 列出了不同微 生物产生的胆固醇氧化酶的酶学特性【l 0 。 表1 1 胆固醇氧化酶的酶争 生质 t a b l e1 1p h y s i c a lp r o p e r t i e so fs o m ec o d 微生物酶分子米氏常数等电点 稳定p h 范围最适p h 值活性温度最适 量( k d )( m o l l ) ( p 1 )范围( ) 温度 ( ) 诺卡氏茵( n o c a r d i a ) 6 4 2 8 x 1 0 4 链霉菌( s t r p r o m y c e s ) 6 04 0 1 0 4 红球菌( r h d d o 淞) 5 59 0 x 1 0 49 1 棒 杆菌3 2 3 5 6 2 ( c o r y n e b a c t e r i u m ) 5 0 9 0 7 0 4 o 一1 1 0 7 0 4 0 1 0 0 7 8 6 5 7 5 2 0 6 0 7 0 失活 2 0 7 0 3 0 5 0 6 0 4 7 假单胞茵( p s p 砌聊d ，2 础) 6 0 2 5 x 1 0 4 0 1 1 0 7 0 4 6 06 0 节杆菌( a r t h r o b a c t e r i u m ) 5 7 6 0 1 0 07 5 7 0 。c 失活 5 0 综述研究结果，微生物来源的胆固醇氧化酶具有以下基本特征： ( 1 ) 、通常低分子量较低； ( 2 ) 、稳定的p h 范围较宽，最适p h 一般为7 o 7 5 ； ( 3 ) 、温度耐受性好； ( 4 ) 、等电点一般大于8 0 。 1 2 2 胆固醇氧化酶的结构和反应机理 胆固醇氧化酶是单体酶，只有一条肽链，一般以f a d 作为辅基。1 9 9 1 年v r i e l i n k 等 人【l l j 构建了来源于b r e v i b a c t e r i u ms 胞r o h c u m 的胆固醇氧化酶的晶体模型，它主要由两个 结构域构成：辅酶f a d 的结合区域和底物的结合区域。辅酶f a d 的结合区含有三个不连 续的片段，是由一个六链d 折叠穿插到一个四链p 折叠和3 个a 螺旋之间。底物的结合区 域包括两段不连续的序列片段，主要是由六个反向平行的b 折叠构成，形成一个盖在活 性部位上的盖子，起到屏护活性位点的作用( 图1 1 ) 。酶的活性部位位于两个结构域之间， 紧邻f a d 的黄素环，是一个孔穴结构，其内充满有序排列的水分子点阵，形成一个错综 复杂的氢键网络。此结构与g m c ( 葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶酶系) 的结构具有相似 性，在活性部位存在h i s 4 4 7 、a s n 4 8 5 、g l u 3 6 1 等高度保守的功能残基。k a s s 和s a m p s o n 第一章绪论 等雌”1 运用定点突变的方法证明g l u 3 6 1 不仅是这种胆固酵氧化酶反应的官能团，也是异 构化反应的催化基团。 目1 1 胆固醉氧化酶分子立体结构 f i g1 1 t h et h r e e - d l m e n s | o n a i “h m t s t r u c i m r eo fc o d 底物结合区域用红色表示； f a d 的鲒旮区域用蓝色表示； 威物结合环用黄色表示； f a d 辅因子用绿色球棒状表示 t h es u b s w a t eb i n d i n ga n df a d b i n d i n g d o m a i n sa r ec o l o r e d i n m a g e n t aa n db l u e ，r e s p e c t i v e l y t h es u b s t r a t e b i n d i n g l o o p s a r es h o w n i n y e l l o w t h e f a dc o f a c t o r i sr e p r e s e n t e d 越a b a l l a n d - s t i n k m o d e lt h es u r f a c e s i ss h o w n i n g r n 胆固醇氧化酶执行两种催化功能：胆固醇母核3 8 一羟基的氧化和c 5 双键的异构化。 胆固醇氧化酶首先作用胆固醇c 3 上的b 羟基将胆固醇氧化为胆甾一5 烯3 酮，胆固醇上 脱下来的两个氢原子同分子氧结合形成过氧化氢；接着胆甾5 烯一3 一酮在胆固醇氧化酶 的作用下，将4 一碳啦上的质子转移到6 一碳的b 位上，也就是将5 位的双键转移到4 位，形 成晟终产物胆甾一4 一烯一3 一酮。最终，l m o l 胆周醇氧化为l m o l 胆甾一4 烯3 一酮，同时 生成l m o l 过氧化氢并消耗l m o l 氧( 图12 ) 。在氧化反应过程中，产物过氧化氢和胆甾4 烯一3 一酮都会对氧化反应产生反馈抑制作用。 矿一护 圈1 , 2胆回醇氧化辟的作用机理 飓1 2e m , y m a h er h c n h 删b y c h o k _ t e r o l o x i d a s 。 w i t he g o i 篇h r o l 珥t h e “e r o i da n h t r a t e 许多含有3 b 一羟基的胆固醇结构类似物也可被胆固酵氧化酶氧化，如脱氢p 一雄甾 江南大学硕士学位论文 酮、孕烯醇酮、d 一谷箔醇、d 一胆甾烷醇等，但5 1 3 - 胆甾烷一3 d 一醇和5 0 c 一羟甾一8 2 4 一二烯 - 3 p 一醇不能被浅紫链霉菌胆固醇氧化酶氧化【1 4 】。不同胆固醇结构类似物c 1 7 俱u 链的长度 会影响胆固醇氧化酶氧化反应速度。例如，甾短杆菌产生的胆固醇氧化酶随着c 1 7 侧链 的加长而氧化反应速度下降引。 1 2 3 胆固醇氧化酶酶活的测定 常用的胆固醇氧化酶酶活方法有胆甾酮分析法和过氧化氢分析法。其原理是通过检 测该酶氧化底物胆固醇生成产物胆甾一4 一烯- 3 - 酮和过氧化氢( h 2 0 2 ) 的量，从而计算出 胆固醇氧化酶的酶活。 反应产物之一胆甾- 4 - 烯- 3 - 酮由于含有羰基，在波长2 4 0 n m 处有特征吸收峰。通过 测定胆甾- 4 - 烯一3 一酮的生成速率，得出胆固醇消耗的速率，计算得到胆固醇氧化酶的酶 活。但是该方法要求将生成的胆甾一4 一烯一3 一酮用有机溶剂从反应体系中萃取出来，操作 程序繁琐，检测结果误差比较大，因此现在该方法已经使用的比较少。 目前主要应用的是检测另一个反应产物h 2 0 2 的方法。该方法利用h 2 0 2 在过氧化物 酶作用下与一些色素元形成生色物质，在特定波长下有特征吸收峰。如季文明掣1 5 j 利用 h 2 0 2 在过氧化氢酶的作用下将4 一氨基一安替比林、苯酚转化为红色的醌亚胺，其在5 0 0 n m 处有最大吸收峰，通过比色就可以测定h 2 0 2 的生成量，获得胆固醇的消耗量，从而计 算出胆固醇氧化酶的酶活，此方法不仅简化了检测过程，而且提高了检测的稳定性。 1 2 4 胆固醇氧化酶的基因克隆和表达研究 胆固醇氧化酶的分子生物学研究开始于上个世纪8 0 年代。1 9 8 6 年y o s h i k a t s u m u r o o k a 等【1 6 】分离出链霉菌s a c o o 的胆固醇氧化酶基因( c h o a ) 并测定了核苷酸序列； 1 9 9 0 年k i n y af u j i s h i o 等t r 7 】开始研究甾短杆菌a t c c 2 1 3 8 7 的胆固醇氧化酶的基因( c h o b ) 。 近年来，随着分子生物学技术的快速发展，新的胆固醇氧化酶基因不断被发现( 表1 2 ) ， 为基因的表达、调控方式等研究奠定了基础。 表1 2 胆固醇氧化酶基因的类别 t a b l e 1 2g e n eo fs o m ec o d 目前国内外研究较多的胆固醇氧化酶基因是c h o a 和c h o b ，两者的核苷酸序列同源性 为6 4 ，含有六个与酶结构和功能相关的高度保守序列。c h ob 只有一个c y s l 0 2 ，而c h o a 则有四个半光氨酸( c y s 9 3 ，c y s 3 1 9 ，c y s 4 8 2 ，c y s 4 8 9 ) ，其中c h o a 的c y s 9 3 和c h o b 的 第一章绪论 c y s l 0 2 与酶活密切相关。两基因在5 端有很大差异：c h o b 的上游没有发现原核微生物启 动子所具有的- 1 0 和- 3 5 的保守序列，而c h o a 的上游不但具有此保守序列，还具有一个编 码细胞色素蛋白p 4 5 0 的基因c h o p ，它与c h o a 串联在一起，共用一个启动子；c h o a 和c h o b 起始密码子上游与宿主r r n a 结合的位点也存在很大差异。研究发现，在野生菌株中， c h o b 的表达水平高于c h o a ，这可能与两者的基因结构不同有密切联系u 8 | 。 野生菌株产胆固醇氧化酶的量比较低，一般为3 0 0u l 左右，并且产酶过程中大都 需要底物胆固醇的诱导，而胆固醇不溶于水，很难均匀、稳定地分散到水相培养基中， 不便于上罐发酵和下游的分离提取，因此给胆固醇氧化酶的工业化生产带来了很多困 难。研究者期望通过基因工程来提高胆固醇氧化酶的产量和改善胆固醇氧化酶的特性。 m o l n a r 等【1 9 1 将含有链霉菌s a c o o 的c h o a 基因克隆到穿梭载体上，转化变铅青链酶菌 1 3 2 6 后发现，转化子的酶产量比野生菌株提高了7 0 倍，但酶活性只有野生菌株的3 0 。 由于c h o a 基因表达产物酶活不高，o h t a 等【2 0 】将c h o b 基因在变铅青链霉菌t k 2 3 中表达， 酶活力达至t j l 6 8u m l ，为原来的1 0 0 0 多倍。s 锄p s o n 等人1 2 1 】将c h o b 基因n 端2 1 个氨基酸 密码子更换成在e c o l i 中使用频率高的同义密码子，再将突变后的基因连接到丁7 k c 启动 子的下游，使c h o b 在e c o l i 中的表达量提高了6 0 倍。2 0 0 6 年台湾的刘文雄等1 2 2 j 尝试将含 有信号肽和去除信号肽序列的c h o a 分别转入毕赤酵母，发现信号肽的去除有利于c h o a 在毕赤酵母中的表达，甲醇诱导7 2 个小时，产量可达到1 ，0 0 0 u l 。这些表达过程中避免 了胆固醇作为诱导物所带来的难题，为胆固醇氧化酶的工业生产奠定了基础。 为了改善胆固醇氧化酶的特性，研究人员通过随机突变c h o a 基因，筛选获得了热稳 定性较好的工程菌株，生产的胆固醇氧化酶在4 0 存放4 星期，稳定性可保持不变，并 且该酶最适p h 的范围也有所扩大【2 3 2 4 1 。这种热稳定性良好的酶制剂已经实现了商业化 生产。 1 3 胆固醇氧化酶应用前景 微生物来源的酶在很多领域都有广泛的用途，如淀粉酶、蛋白酶等。胆固醇氧化酶 由于在来源方面受限，其应用一直比较有限。近年来，随着高产菌种的选育以及基因工 程方面的研究取得了很大进步，胆固醇氧化酶的应用前景被广大学者关注。目前胆固醇 氧化酶在日本、美国等国家已进行商品化生产，它的应用范围已从最初的临床诊断试剂 扩展到食品加工、制药工业、生物化学和生物抗虫等领域。 1 3 1 临床诊断 临床证明，血清中胆固醇浓度和冠心病等心脑血管疾病的发病率呈正比关系，因而 测定血清中胆固醇的含量就成了临床诊断中一个重要的参考指标。胆固醇氧化酶可将胆 固醇氧化为胆甾4 烯3 酮和h 2 0 2 ，通过检测产物的量可以计算出底物胆固醇的量。将 胆固醇氧化酶、胆固醇脂酶和过氧化氢酶三酶合的分析方法已被广泛应用于血浆总胆 固醇含量的临床诊断。还可将这三种酶做成酶电极，能反复使用且方便。目前国外研究 的热点是酶固定化生物传感器，与微电子技术相结合，开发可以反复使用的微量检测仪 器或家庭使用的简便检测试剂【z 51 。 江南大学硕士学位论文 1 3 2 食品加工 利用微生物及其产生的胆固醇氧化酶可以有效地降低乳、肉、蛋等食品中的胆固醇 含量，预防心脑血管疾病的发生。如本实验室的吕陈峰【2 6 2 7 】等优化了胆固醇氧化酶转化 蛋黄胆固醇的工艺，产物单一且对身体无毒害，此方法用于生产低胆固醇且具有保健功 能的蛋黄制品具有较大的潜在经济效益。目前研究的热点是将产胆固醇氧化酶的基因工 程菌株直接用于奶制品生产来控制胆固醇的含量，如将胆固醇氧化酶基因c h o a 转化奶酪 乳酸杆菌( l a c t o b a c t e r i ac a s e i ) 和嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) ，使这些奶制品 生产菌具备氧化胆固酶的能力2 8 2 9 1 。研究不限制饮食、不干扰人体正常代谢、不影响食 品风味、经济实用的减少胆固醇吸收的食品及其加工方法，已成为当前重要的研究课题。 1 3 3 制药工业 胆固醇氧化酶氧化胆固醇的产物胆甾一4 一烯一3 一酮可以作为治疗肝炎、抗肥胖、防止 皮肤角质化的药物，同时可以作为前体物质合成激素类药物。本实验室曾初步探讨了胆 甾- 4 - 烯- 3 - 酮的生物转化方法，在正辛烷作为有机相的两相反应体系中，以胆固醇氧化 酶催化氧化胆固醇制备胆甾- 4 - 烯一3 一酮【3 ，此方法具有转化率高，产物单一，反应条 件简单等优点，利用合适的反应器可以尝试较大规模的制备。 最新研究表明，编码胆固醇氧化酶的基因能触发抗生素多马霉素的合成，胆固醇氧 化酶是多马霉素合成的信号蛋白【3 l 】，在抗生素的生产中具有重要的作用。 1 3 4 工具酶 胆固醇氧化酶可作为一种工具酶，用于探测3 d 一羟固醇的空间结构以及作为细胞膜 或其他结构胆固醇的探针。例如，胆固醇氧化酶作为不可渗透膜的探针，有选择地作用 于线粒体外膜的胆固醇，用于研究。肾上腺细胞线粒体的胆固醇的结构，以便深入研究肾 上腺皮质激素的体内合成过程【3 2 3 3 1 。通过胆固醇氧化酶作用，还可确定生物膜胆固醇的 分布以及胆固醇与其他膜脂的相互作用。 1 3 5 新型杀虫剂 胆固醇氧化酶( c h o m ) 可使鳞翅目昆虫内消化道的上皮细胞破裂，抑制昆虫的生 长发育特别是对棉籽象鼻虫的幼虫，是非常有效的杀虫剂。通过将胆固醇氧化酶( e h o m ) 基因转入植物中，在植物体内产生胆固醇氧化酶，从而使得转基因植物具有抗虫的能力。 c o r b i n 等1 3 4 1 通过改变c h o m 基因n 端的核苷酸序列，使其抗虫活性更强，并将其克隆 到烟草细胞表达载体p m o n l 0 8 7 9 上，电转化烟草细胞，获得了抗鳞翅昆虫的转基因新 植株。目前胆固醇氧化酶( c h o m ) 已经成为一种重要的抗虫基因。 综上所述，胆固醇氧化酶是一种多功能酶，在食品、医药、和农业等方面具有广泛 的应用前景和很大的开发价值。 1 4 立题背景及本文的主要研究内容 美国和日本对胆固醇氧化酶研究比较深入，尤其是日本，已经率先实现了基因工程 胆固醇氧化酶的商品化。我国对胆固醇氧化酶的研究起步比较晚，研究机构也比较少， 本实验室9 5 年从土壤中分离了一株产胆固醇氧化酶的短杆菌，从此便开展胆固醇氧化 酶的相关研究，经过多次诱变育种，产酶能力有较大的提高 3 5 1 ，并在分离纯化【3 引、 第一章绪论 应用2 6 、2 7 1 等方面取得了一定的成果。近几年开始基因方面的研究【3 9 4 1 1 ，已扩增到了 b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 8 2 的完整基因( g e n b a n k 登录号为d q 3 4 5 7 8 0 ) 。 本文研究的主要目的是对胆固醇氧化酶基因的表达进行研究，为获得酶活和表达量 较高的工程菌株，同时为进一步的基因改造奠定基础。围绕上述目标，将进行以下工作： ( 1 ) 、研究信号肽对胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达的影响。 ( 2 ) 、选择合适的大肠杆菌宿主和载体提高目的蛋白的酶活和表达量，并对诱导条 件进行优化。 ( 3 ) 、胆固醇氧化酶基因转入到真核表达系统毕赤酵母中进行表达的探索。 第二章信口肽对b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c - 8 2 胆同醇氧化酶堆阒在e c o l i 中表达的影响 第二章信号肽对b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 8 2 胆固醇氧化酶基因在 e c o l i 中表达的影响 酶的信号肽除了引导分泌外，对酶的活性往往有复杂的影响。c o r b i n 等【3 4 】将c h o m 基因插入e c o i l 表达载体，全酶基因能够检测到表达而成熟酶基因没有获得表达，作者 分析信号肽对于胆固醇氧化酶的空间构象和表达量有重要作用。银国力等人【4 2 】利用 r h o d o c o c c u se q u i 胆固醇氧化酶基因( c h o e ) 在e c o l i b l 2 1 ( d e 3 驴l u s 中表达c o d ，但酶 活力较低，作者分析其原因可能是由于浓缩液中含有较多的杂蛋白，影响了表达产物的 酶活，也可能是由于n 端添加了六个h i s ，影响了整个酶蛋白的天然结构使其活性降低。 本章主要运用重组d n a 技术研究信号肽对胆固醇氧化酶活性的影响。根据n c b i 网站公布的c o d 序列设计引物，运用p c r 技术分别从b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 一8 2 基 因组d n a 中扩增出含信号肽和不含信号肽的c o d 结构基因，并在t 7 启动子和乳糖操 纵子共同控制下在e c o l i 细胞内融合表达。实验证明，含信号肽与不含信号肽的胆固醇 氧化酶基因都获得了活性表达，后者比前者的酶活略高一些。两株重组菌目的蛋白的表 达量都占到了细胞总蛋白的5 0 以上，但可溶性的活性蛋白较少，说明b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c 8 2 胆固醇氧化酶的信号肽对酶的空间构象和表达量并没有太大的影响。 2 1 材料 2 1 1 菌株和质粒 菌株：胆固醇氧化酶生产菌b r e v i b a c t e r i u ms p d g c d c - 8 2 、e c o l ij m l 0 9 、 e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 由本实验室保存； 质粒：e c o l i 表达质粒p e t 2 8 a 购f in o v a g e n 公司； 2 1 2 工具酶和试剂 限制性内切酶艮d 砒，h i n d l i l ，t 4d n a 连接酶，t a q d n a 酶、i p t g 购自t a k a i h 公司( 大 连) 。 胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。 卡那霉素为上海生物工程有限公司产品。 蛋白胨、酵母膏为o x o i d 产品。 1 0 0 0 b pd n a m a r k e r ，为上海捷瑞生物公司产品，共有1 1 条带：5 0 0 、1 0 0 0 、1 5 0 0 、2 0 0 0 、 2 5 0 0 ，3 0 0 0 ，4 0 0 0 ，5 0 0 0 ，6 0 0 0 ，8 0 0 0 ，1 0 0 0 0b p 。 蛋白质分子量标准( 低) ，为t a k a r a 公司( 大连) 产品，共有6 条带：1 4 3 k d 、2 0 1 k d 、 2 9 0 k d 、4 4 3 k d 、6 6 4 k d 、9 7 2 k d 。 2 1 3 培养基及常用试剂的配制 完全培养基： 牛肉膏3 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，蒸馏水1 l ，p h 7 5 ，高压灭菌，4 c 保存； l b 培养基： 蛋白胨1 0 9 ，酵母提取物5 9 ，氯化钠1 0 9 ，蒸馏水l l ，p h7 0 高压灭菌，4 c 保存。 加入2 0 9 琼脂为l b 固体培养基； 9 江南大学硕士学位论文 卡那霉素： 去离子水溶解至1 0 0 m g m l ，分装后储存于一2 0 ； i p t g 溶液： 将2 9 l p t g 溶于8m l 蒸馏水中，然后定容至1 0m l ，用0 2 2 i - t l 滤器过滤除菌后分 装成l m l ； t a e 电泳缓冲液( 5 0 ) ： 2 4 2 9 i r i s 碱，5 7 1 9 冰醋酸，1 0 0m l 0 5 m o l le d t a ，调p h 8 0 ，定容至1 l ： 质粒提取所用的试剂： 溶液h5 0 m m o l l 葡萄糖2 5 m m o l lt r i s - h c i ( p h 8 0 ) 1 0m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ； 溶液i h0 2 m o l ln a o h1 s d s ( 使用前现配现用) ； 溶液i i i ： 5m o l l 乙酸钾6 0 0 m l 冰乙酸1 1 5m l蒸馏水2 8 5m l ： 饱和酚：氯仿：异戊醇= 2 5 ：2 4 ：l ( 体积比) ； 冷的无水乙醇和7 0 乙醇； t e 缓冲液：10 m m o l lt r i s - h c l ( p h 8 0 ) 1m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ； s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳所用试剂： 1 x t f i s - 甘氨酸电泳缓冲液( p h 8 3 ) ：2 5m m o f lt r i s 2 5 0m m o l l 甘氨酸 0 1 s d s ： 3 0 丙烯酰胺凝胶贮液( w ) ：2 9 0 9 丙烯酰胺，1 0 9n ，n 一亚甲双丙烯酰胺，加蒸 馏水溶解在定容至1m l ； 浓缩胶缓冲液：o 5 m o l lt r i s h c i ( p h 6 8 ) ； 分离胶缓冲液：1 5m o l lt r i s h c i ( p h 8 0 ) ； 1 0 s d s ：将1 0 9 电泳级s d s 溶于1 0 0m l 蒸馏水中； 1 0 过硫酸胺：1 0 0 9 过硫酸胺溶于l l 蒸馏水中，4 c 保存一周； 1 s d s p a g e 电泳上样缓冲液：5 0 m m o l lt r i s h c i ( p h 6 8 ) 1 0 0m m o l l 二硫苏糖 醇( d t t ) 2 s d s ( 电泳级) 0 1 溴酚兰1 0 甘 油； 考马斯亮兰染色液：0 2 5 9 考马斯亮兰2 5 04 5 m l 甲醇1 0 m l 醋酸4 5 m l 水； 脱色液：5 0 m l 甲醇7 5 m l 冰醋酸8 7 5 m l 水。 2 1 4 引物 根据胆固醇氧化酶基因序列( g e n b a n k 登录号d q 3 4 5 7 8 0 ) 设计引物，由北京赛百 盛基因技术有限公司合成。 弓i 物p1 ： 5 一a a t t a c c g g a a t t c a t g a c c g a t a g c c g g g c g