（生物化学与分子生物学专业论文）新型分子信标的合成及其性能研究.pdf

硕士学位论文 ii 摘 要 上世纪 80 年代，基于经典的固相合成技术演化而来的 dna 自动合成仪的 诞生，突破了 dna 化学合成的瓶颈，使得人们可以相当自由地设计各种类型的 核酸分子探针，广泛地应用于生物学、医学等领域。但在后基因组学和蛋白质组 学时代，人们不断对核酸分子探针在灵敏度、稳定性、分子识别与信号转换方式 等多方面提出更高的要求，以发展新的分子生物学研究方法，这使得核酸分子探 针的设计合成显得更为重要。本论文通过搭建核酸合成平台，开展了新型分子信 标核酸分子探针的合成与性能研究，主要包括了以下三个方面的工作： （1）核酸合成平台的搭建 基于 dna 合成仪和液相色谱技术，合成纯化了普通 dna 引物（cdna） 、 常规分子信标（dna- mb）以及超淬灭分子信标(sq- mb)，利用基质辅助激光解 析飞行时间质谱（maldi- tof- ms）对纯化产物进行了分析，结果表明所得到 的纯化产物均为目标分子。与 cdna 杂交的结果表明，超淬灭分子信标的信背 比达到 40 倍，比常规分子信标高出 4 倍。说明我们已经掌握了普通 dna 引物 以及染料标记的 dna探针的合成与纯化技术。 （2）锁核酸分子信标的合成与性能考察 为了实现活细胞内 mrna 的监测，需要杂交速度快、灵敏度高、抗酶切能 力强、选择性好的核酸分子探针。我们合成了一种茎部具有三对配对碱基的锁核 酸分子信标（lna- mb） ，其与 cdna 杂交反应速度快，5 分钟即可达到平衡。 与常规分子信标相比，该锁核酸分子信标抗酶切能力显著增强，热稳定性有了明 显提高。 （3）锁核酸分子信标与共臂 cdna杂交性能的考察 有研究工作表明分子信标与共臂 cdna（shared- stem cdna）杂交能够提高 其灵敏度。因此我们考察了锁核酸分子信标与共臂 cdna 的杂交性能。结果表 明：与 cdna 相比，共臂 cdna 与锁核酸分子信标杂交的灵敏度更高，信背比 达到 200 倍，线性范围为 20 pmol l- 1 20 nmol l- 1，检测限为 9.8 pmol l- 1，且 具有较好的选择性，杂交反应前 20 s 内的荧光初速度是错配 dna 的 5 倍。该锁 核酸分子信标所具有的高灵敏、高稳定性能有望实现对活细胞 mrna 的高灵敏 检测。 关键词：核酸分子探针；分子信标；锁核酸；dna合成；液相色谱 新型分子信标的合成及其性能研究 iii abstract the first dna autosynthesizer based on the solid- phase synthesis technology was set up in 1980s, which broke the bottleneck of dna chemical synthesis, and people could be free to design and synthesize the optional nucleic acid molecular probes, which were applied in the fields of biology and medicine. however, the high sensitivity, stability and signaling mechanism of nucleic acid molecular probes are required constantly to advance the novel research methods of molecular biology. so the design and synthesis of these molecular probes is indispensable. in this thesis, the dna synthesis platform was set up, and some novel probes were synthesized and investigated. three parts of work were finished in this thesis. 1.the foundation of dna synthesis platform based on the dna autosynthesizer and liquid chromatogram technology, three kinds of nucleic acid molecular probes were synthesized and purified, which included cdna, normal molecular beacon (mb), super- quencher molecular beacon (sq- mb). the products were identified by maldi- tof- ms. the hybridization result of sq- mb with cdna showed that the signal/background ratio increased 40 times, and it was 4 times higher than normal molecular beacon. the distinct change of hybridization signal proved that we can synthesize and purify the dna and dye- modified dna probes. 2.the synthesis and investigation of locked nucleic acid molecular beacon in order to detect the mrna in vivo, a novel locked nucleic acid molecular beacon (lna- mb) was synthesized which contained three base- pairings in stem structure. the hybridization kinetics with cdna was fast. comparing with dna molecular beacon (dna- mb), lna- mb showed a higher capability to resist nuclease digestion and high thermodynamic stability. 3.the investigation of hybridization property of lna- mb with shared- stem cdna. the reported work showed that the shared- stem cdna could improve the sensitivity of molecular beacon. so we designed the shared- stem cdna, and investigated the hybridization of lna- mb with shared- stem cdna. the results showed that the sensitivity of shared- stem cdna was superior to cdna, the s/b was up to 200 times, the linear range was 20 pmol l- 1 20 nmol l- 1, the detection limit was 9.8 pmol l- 1, and its initial fluorescence increasing velocity of hybridization with shared- stem cdna was 5 times quicher than the mismatched shared- stem dna. the lna- mb with these prominent characteristics can provide a potential 硕士学位论文 iv in high sensitive detection of mrna in vivo. keywords: nucleic acid molecular probe; molecular beacon; locked nucleic acid; dna synthesis; liquid chromatography i 湖 南 大 学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借 阅。 本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1、保密，在 1 年解密后适用本授权书。 2、不保密。 （请在以上相应方框内打“ v” ） 作者签名： 日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 硕士学位论文 1 第1章 绪 论 人类的身体构造如同一部复杂的机器，和谐的运转中蕴藏着无限的神奇，人 们对生命现象的研究和理解，经历了一个从宏观到微观的过程。1953 年 watson 和 crick 提出了 dna 双螺旋结构的经典模型1，标志着现代分子生物学的诞生， 基因组学迅速成为分子生物学领域的研究热点， 人们不断设计合成出各种不同类 型的核酸分子探针来适应生命科学不断发展的需要。 但早期的核酸分子探针的制 备十分复杂，需要以天然的核酸链为模板，采用 pcr 扩增、逆转录或克隆等方 法制备，整个过程十分费时费力，大大阻碍了分子生物学的研究进展。 直到 60 年代洛克菲勒研究所发表了经典的固相合成方法2，这种情况才得 以改观。固相合成法最初是用于多肽的合成，merrifield 将第一个氨基酸固定在 不溶的聚合物载体上，然后将其他氨基酸逐个连接到固定的目标上，从而得到所 需要的氨基酸序列，合成完毕后，将氨基酸序列从固体支持物上切割下来，进行 纯化得到目标多肽序列。该方法对人们研究激素、酶、多肽药物等具有划时代的 意义。由于 merrifield 在该研究领域的杰出贡献，当之无愧地得到了 1984 年的 诺贝尔化学奖。该方法报道不久就被用于 dna 化学合成当中3, 4，由其演化而 来的核酸自动合成仪的诞生为核酸分子探针的发展注入无尽的动力， 真正突破了 以前 dna 化学合成费时费力的瓶颈。经过 20 多年不断的发展，目前 dna 的合 成已经变得比较简单易行5，人们几乎可以随意设计合成自己需要的核酸序列， 这迅速拉开了人们大规模研究核酸分子探针的序幕。 1.1 dna化学合成原理 目前，一般 dna 合成都采用固相亚磷酰胺三酯法6合成 dna 片段，此方法 具有合成速度快、偶联效率高等优点，已在 dna化学合成中得到广泛应用。 1.1.1 dna的结构和化学性质对合成的影响 dna 的合成对环境、原料要求很高。 dna 合成单体以亚磷酰胺形式存在7， 由于其极易水解，所以 dna 合成过程当中应该严格防水。单体中磷酸二酯键氧 阴离子和环外一级氨基必须加以保护，因为这些基团是主要的亲核中心，将干 扰核苷酸脱氧核糖的羟基与另外一个核苷酸磷酸基的反应，而且杂环碱基容易 参与许多化学反应，甚至最弱的氧化剂都可以引起腺嘌呤、胞嘧啶形成 n- 氧化 物，或者更严重的破坏8。杂环上所有的氮及氧原子都是潜在的亲电进攻部位， 且杂环上绝大多数的非桥键都是水解的进攻部位，因此要避免用酸和强碱水溶 新型分子信标的合成及其性能研究 2 液，弱酸也会能使得嘌呤脱氧核苷的 n- c1糖苷键不稳定，导致脱嘌呤效果8。 因此 dna合成过程当中一定要注意避免引起碱基脱落。 dna 的一级结构是磷酸二酯键通过 3 - 5 连接而成的 2- 脱氧- d- 核糖环链。 结构中存在可解离的磷酸部分以及胞嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤上环外一级氨基， 因此它具有良好的水溶性，该特性使 dna 的纯化必须在水溶液中进行，多离子 特性使其可被离子交换色谱或电泳利用。同时由于一级氨基具有形成氢键的能 力，以及碱基的堆积力，dna 在合成过程中会形成二级结构，这对 dna 最后 的纯化造成一定的困难，需要采用较强的变性条件9。 1.1.2 dna合成固相支持物 较常用的 dna 合成载体是控制微孔玻璃珠10（controlled pore glass, cpg） 。 cpg 通过一个硅氧烷键将一个连接臂固定在其表面，核苷的 3 - oh 通过琥珀酸 酯键共价的连接到 cpg 表面的连接臂上，5 - oh 被- dmtr 基团封闭。该琥珀酸 酯键对碱不稳定，可以用氨水对其进行水解，从而使合成出来的 dna 序列脱离 cpg。目前市面上有两大类 cpg 出售：已经连接一个碱基的常规 cpg 和没有连 接碱基的通用 cpg。相比较而言，通用 cpg 使用起来更为灵活，在大规模合成 中更为方便。 o ch3 o ob occ h2c h2c nh ch2ch2ch2 o o si o o o cpg och3 dm t o oo r h n o n h （a） (b) 图 1.1 cpg 结构示意图 （a）为常规 cpg；(b)为通用 cpg figure 1.1 the sketch map of cpg （a）normal cpg; (b) universal cpg 1.1.3 dna固相合成循环 图 1.2 是亚磷酰氨法 dna 合成6的化学循环示意图。 以 cpg 为合成支持物， 将所需要的碱基依次偶联上去。 硕士学位论文 3 o b dmto ob o o b dmto o o b dmto o ob h3cco o o b ho o poch2ch2cnipr2n p o och2ch2cn o o b dmto o b o p o och2ch2cn o 氧化 封闭 偶联 脱保护 亚磷酰胺 图 1.2 dna 固相合成原理6 figure 1.2 principle of solid- phase oligonucleotide synthesis6 碱基加成的每一循环包括四步：脱二甲氧基三苯甲基（ detritylation, dmt） 、 偶联、封闭、氧化。这些反应步骤以上述顺序重复进行，继续进行 dna 合成的 另一个循环，直到特定长度的 dna完全合成为止。 1脱 dmt 合成的第一步是除去与载体结合的核苷 5 - oh 上对酸不稳定的 dmt 保护基 团。首先用乙腈冲洗载体，接着输送三氯乙酸（tca）到柱子，切下 dmt 基团， 如图 1.3 所示。冲洗后用氩气从柱的底部到顶部进行“ dmt 冲洗” ，测定反应得 到的 dmt 阳离子的量，可以初步估算出每一步的反应产率，并反映仪器的性能。 dm too b o h o ob o c h+ cc h3 cc h3 三氯 乙酸 图 1.3 脱 dmt6 figure1.3 remove the dmt6 新型分子信标的合成及其性能研究 4 2偶联 dna 合成用的单体以亚磷酰胺的形式存在6，亚磷酰胺是经化学修饰的核 苷，5 - oh 被- dmt 基团封闭。dna 合成当中，首先用乙腈洗涤，对载体作无水 处理和清除亲核试剂。然后用氩气冲干燥柱子，除去残留的乙腈，随后将亚磷酰 胺活化剂四唑输送到柱子，亚磷酰胺与四唑快速反应，二异丙酰胺被质子化而且 被四唑取代，亚磷酰胺的亚磷酸根与 cpg 结合的核苷上 5 - oh 发生偶联反应， 形成了 5 - 3 核苷酸键，亚磷酰胺成功连接到与 cpg 结合的核苷上。 3封闭 由于前一步的偶联反应不可能 100%的反应完全，这样就遗留下一些活性反 应位点，在下一个偶联步骤中还可以扩增，产生比产物少一个碱基的失败片段 (failure sequences)，如果不进行处理将影响整个合成质量，而且使产物的分离更 加困难。为解决这一问题，采用乙酰化封闭游离羟基。将乙酐和 1- 甲基咪唑同 时等体积输送到柱子。混合成为强乙酰化剂，在 5 - oh 反应使失败片断封闭， 如图 1.4 所示。 o b o poch2ch2cn o dmto o b o o b o dmto 载体结合的核苷 dmtoo b o poch2ch2cn dmtoob o poch2ch2cnipr2hn o b o poch2ch2cn dmto nh n nn ipr2hn n n nn 图 1.4 未反应链的封闭6 figure 1.4 cap of the failure sequence6 4氧化 新形成的核苷酸间的键是一个亚磷酸三酯， 其易被酸或碱切断， 因此封闭后， 三价的亚磷酸三酯应立即氧化成稳定的五价磷酸三酯。用碘的四氢呋喃(thf)溶 硕士学位论文 5 液作为一种温和的氧化剂，氧化后，核苷酸加成的一个循环就完成了。 经过以上四个步骤,才完成一个单体的加成反应,重复以上循环过程,直到得 到我们需要的核酸序列。 1.1.4 合成后处理 核酸合成完成后，需要进行切割和脱保护处理才能得到需要的产物，用 25% 的浓氨水进行氨解，于 55 oc 下反应 8- 15 小时，将 dna 从载体上切下来。切割 是在载体的起始核苷 3 - oh 之间不稳定的酯键上进行的，切下的 dna 有一个 3 - oh。用氨水处理同时可以除掉氰乙基保护基，这一过程与切割同时发生，使 dna 脱保护很快很简单。完成脱保护后，将氢氧化氨- dna 溶液在冰上冷却， 防止冒泡损失，然后真空除去氨。这样得到的 dna 有游离的 5 - oh 和 3 - oh， 具有生物活性，使用之前可能需要进行脱盐和纯化。 随着合成工艺的日趋成熟，目前 dna 合成不再局限于普通 dna 引物的合 成，已经发展出了放射性标记、硫代化修饰、巯基化修饰、氨基化修饰、磷酸化 修饰、羧基化修饰、2 甲氧基修饰、锁核酸修饰、荧光标记等多种标记 dna 探 针。 1.2 dna纯化方法 合成并脱保护处理后的核酸初产物，其中目的寡核苷酸序列的纯度比较低， 含有大量的杂质,主要杂质有所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨， 腈磷基上脱下的腈乙基以及合成时产生的短链等。 尽管合成时每一步的效率都在 97% - 99%， 但累积的效率并不高。 以链长 20 mer 和 50 mer 为例， (98%)20 = 66.7%、 (98%)50 = 36.4%,可见在粗产品中目的 oligo 含量较低。这些杂质,尤其是存在于 粗产品中的大量盐和短链,不但造成定量不准，而且影响下一步的反应，因此必 须对产物进行纯化。dna 有不同的纯化方法，目前常用的方法包括寡核苷酸纯 化柱芯 （opc） 11、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （page）12, 13、 毛细管凝胶电泳 （hpce） 14, 15和高效液相色谱法（hplc）15, 16等等。 1.2.1 寡核苷酸纯化柱芯 寡核苷酸纯化柱芯11（opc）是专门为快速、简易纯化合成寡核苷酸而设计 的24.25。这种方法的基本工具是一个安装有注射器的小柱芯，芯内装有对 dmt 寡核苷酸有亲和力的吸附材料。分离的时候，带有 dmt 基团的寡核苷酸产物被 保留在柱芯上，没有 dmt 基因的失败片段和其他杂质都被洗脱掉。opc 结合的 寡核苷酸上 dmt 基团可以用弱酸溶液除去，然后用 1 ml 的 20%乙腈溶液脱。 全部操作需要 15 - 20 分钟，100 碱基的寡核苷酸都可以达到有效可靠的纯化。 opc 分离 dna 具有以下几个特点：样品不需处理，opc 材料对浓氨稳定， 新型分子信标的合成及其性能研究 6 氨溶液提供了一个“ 变性” 的基质，排除了二级结构及氨键。dmt 基团容易去除， 完全脱保护的寡核酸用小体积的 20%的乙腈水溶液洗脱，完全脱盐后备用。 1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳12, 13（page）是一种广泛应用于分析和纯化寡核酸的 方法26。当带电荷的分子处在电场中时，将在电场中迁移，其迁移速度主要由 分子的质荷比所决定。质荷比与不同链长的 dna 分子量的对数呈直线关系。长 度增加时，迁移速度降低，形成了非常有序的寡核苷酸系列。 适当的 page 技术， 可以提供只差一个碱基的寡核苷酸的分辨及其制备分离。 寡核苷酸 page 最满意的形式是平板凝胶。 有许多商品化的设计主要是两块 玻璃板夹起来， 中间留有空隙。空隙的厚度决定凝胶的厚度，对于 uv 投影， 0.75 mm - 1.5 mm 比较方便。丙烯酰氨溶液灌注在两玻璃板之间，使其聚合。插入梳 齿，形成寡核苷酸加样的样品池。在电泳期间，每一样品池形成了垂直的泳道。 玻璃板的长度约为 16 cm 40 cm，取决于寡核苷酸的长度，其宽度只决定于电 泳的样品数。染料如溴酚兰和二甲苯氰，可以加在样品中，也可以单独电泳作为 寡核苷酸迁移距离的指示剂。 凝胶基质的丙烯酰胺浓度决定了寡核苷酸迁移的速 度。标准范围为 8% - 20%。较长的寡核苷酸需要较低的丙烯酰胺浓度。当染料 指示寡核苷酸产物迁移适当的距离时，关掉电源，拆掉凝胶夹子。 电泳完毕后，需要确认目标产物带，处理方法有 uv 投影、染色、放射标记 /放射自显影等等。得到目标带后进行回收即得到合成产物。 1.2.3 高效毛细管电泳 高效毛细管电泳14,15（hpec）是一种发展迅猛的新型的分离分析技术，近 十多年来已广泛应用于核酸、蛋白质、氨基酸、有机化合物、药物的分离分析， 在生物医药学领域倍受青睐。 与传统的电泳相比，毛细管电泳主要特点有四个：高效、快速、微量、自动 化。在毛细管区带电泳中，柱效一般为每米几十万理论板数，高的可达每米 100 万以上，而在凝胶电泳中这一指标竟能达到几百万甚至上千万，通常的分析时间 不超过 30 min，在采用电流检测器，毛细管电泳的最低检测极限可达 10- 19，即 使是一般的紫外检测器，大体也在 10- 13 - 10- 15mol 之间，因此样品用量仅为纳升 级别。 高效毛细管电泳与高效液相色谱可以互为补充，与 hplc 相比，毛细管电泳 的柱效更高一些，速度更快一些，同时，它几乎不消耗溶剂，而样品用量仅为 hplc 几百分之一。hpce没有泵输运系统，因此成本相对要低，通过改变操作 模式和缓冲液的成分， 毛细管电泳有很大的选择性， 可以根据不同的分子性质 （如 硕士学位论文 7 大小，电荷数，手征性，疏水性等）对极广泛的对象进行有效的分离。相比之下， 为达到类似目的，hplc 要消耗许多价格昂贵的柱子和溶剂。 由于一次分离的样品总量不能太多， 目前 hpce 主要用于对样品进行纯度分 析， 对于需要快速纯化大量样品的研究人员来说， hpce 还不能很好地适应需求。 1.2.4 高效液相色谱法 高效液相色谱法15, 16（hplc）是一种有效的纯化方法，它将寡核苷酸的定 量分析与纯化结合了起来。hplc 的优点之一是高度的自动化。整个系统可以进 行重复的编程进样、 分析、 资料处理和贮存。 液相色谱法根据其分离原理的不同， 总体上可以分为五种：凝胶过滤色谱法（gfc） 、离子交换色谱法（ixc） 、反相 色谱法（rpc） 、亲和色谱法（ac） 、疏水色谱法（hic） 。 在 dna 纯化过程中常采用的纯化方法有离子交换色谱法、反相色谱法。离 子交换色谱和反相色谱两种分离技术有许多相似之处，分离过程包括：柱平衡、 上样、洗脱、柱再生。即首先对色谱柱进行柱平衡，使其处于一个适合工作的状 态，然后上样，将样品吸附在柱体上，再改变流动相比例，将样品依次洗脱下来， 最后冲洗柱体，使柱体再生。 离子交换色谱法是以具有离子交换性能的物质作固定相， 这些带电基团通过 静电相互作用与带相反电荷的离子结合。 如果流动相中存在其他带相反电荷的离 子，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相基团带正电荷的时 候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基 团带负电荷，可用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离 子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是- nh2，及- nh3+：阳离子交换剂的功能 团主要是- so3h 及- cooh。其中- nh3+离子交换柱及- so3h 离子交换剂属于强离 子交换剂，它们在很广泛的 ph 范围内都有离子交换能力；- nh2及- cooh 离子 交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的 ph 值范围内，才能有离子交换能力。 离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如多肽的分离、蛋白质的分离， 核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。对于 dna 的纯化而言，主要根据 dna 链 长洗脱寡核苷酸。增加流动相中盐的浓度依次洗脱样品，短的失败序列先分离出 来，所需要的寡核苷酸产物总是在失败片段后洗脱出来，从而达到分离目的。高 盐流动相也提供了一种变性基质。这两种因素都容易鉴别产物。如图 1.5 所示。 新型分子信标的合成及其性能研究 8 图 1.5 离子交换色谱分离原理15 figure 1.5 principle of ion- exchange chromatography15 反相色谱法中共价结合到载体上的固定相是一些直链烷烃化合物。 流动相的 极性比固定相的极性强。反相色谱法在高效液相色谱法中应用最广泛。在反相色 谱法中，使溶质滞留的主要作用是疏水作用，即当水中存在非极性溶质时，非极 性溶质分子与水分子之间的相互作用远小于水分子之间的相互作用， 因此溶质分 子从水中被“ 挤” 了出去，疏水性越强的化合物越容易从流动相中挤出去，在色谱 柱中滞留时间也长， 所以反相色谱法中不同的化合物根据它们的疏水特性得到分 离，如图 1.6 所示。 图 1.6 rpc 分离原理16 figure 1.6 principle of rpc16 反相色谱法适于分离带有不同疏水基团的化合物，亦即非极性基团的化合 硕士学位论文 9 物。此外，反相色谱法可用于分离带有不同极性基团的化合物。可以通过改变流 动相的溶剂及其组成和 ph，以影响溶质分子与流动相的相互作用，改变它们的 滞留行为。另外，反相色谱中水流动相中占的比例伸缩性很大，可以从 0 - 100 ，从而使反相色谱可用于水溶性、脂溶性化合物的分离。反相色谱法中的固定 相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和和烷烃，其链的长短不同，最长的是十 八烷基，这也是使用得最多的固定相。直链饱和烷烃疏水特性随着碳链的长度而 增加， 在反相色谱柱中溶质由于疏水作用而滞留的时间也将随着碳链的长度而增 加。在一般情况下这意味着用碳链长的反相色谱柱能得到较好的分辩率。 在普通 dna 的分离当中，如果选择 rpc，则需要在 dna 合成的时候做相 应的调整，需要在合成的最后一步保留 dmt 基团。当 5 dmt 连在寡核苷酸上 时，dmt 基团与载体吸附剂之间的疏水相互作用使目标产物保留在柱子上面。 流动相一般是一种易挥发的缓冲液，如 0.1 mol l- 1醋酸三乙胺。增加流动相中有 机溶剂如乙腈成分，形成剃度洗脱寡核苷酸。这些条件是非变性的。有时候某些 片段可能显示不可预测的 hplc 洗脱模式， 这是由于分子内或分子间的二级结构 及氢键的影响造成的。 1.3 分子信标核酸探针的研究概况 1.3.1 核酸分子探针研究进展 统观核酸分子探针的发展过程，根据制备方法的不同，我们可以将其分为两 大类： 酶促反应标记探针和化学修饰标记探针。酶促反应标记探针就是利用酶促 反应制备而成的核酸分子探针17- 25，其大体上可以分为放射性标记核酸分子探 针17和非放射性标记核酸分子探针18- 25，非放射性标记核酸分子探针有生物素 标记核酸分子探针19、辣根过氧化物酶标记核酸分子探针法20、地高辛标记核 酸分子探针法21、核酸荧光探针22等等。 利用 dna 合成仪，人们可很简单地制备各种化学修饰寡核苷酸探针，这些 化学合成的核酸分子探针具有以下优点：杂交速度快、特异性强；可以在短时间 内大量制备；合成中易于进行标记制成各种各样的标记探针；可合成单链探针， 避免了用双链 dna 探针在杂交中自我复性，提高杂交效率；寡核苷酸探针可以 检测小 dna 片段，在严格的杂交条件下，可用于检测单碱基错配的目标序列。 这些特点让人们真正做到了可以随意设计开发出自己想要的核酸分子探针。 这极 大地推动了生物化学、分子生物学、分子遗传学以及遗传信息学等学科的长足发 展。20 多年的发展历程中各种各样的核酸分子探针层出不穷，包括 taqman 探针 23, 24、相邻探针25, 26、阴阳探针27、核酸识体探针28- 33、分子信标（molecular beacon, mb）34等等。目前核酸分子探针已经在生化分析、疾病诊断、药物筛 选等各个领域得以广泛应用。其中分子信标由于其检测灵敏度高、选择性强、无 新型分子信标的合成及其性能研究 10 须除去未杂交的探针等优点，已经成为人们研究最多、应用最广泛的核酸分子探 针之一。 1.3.2 分子信标核酸探针的原理与应用 分子信标是 tyagi 于 1996 年首次合成的34，它的设计非常巧妙，其是一段 双标记的茎环型核酸片段，环部是长度在 20 个碱基左右的和目标分子互补的序 列，茎部是 58 个碱基对，5端和 3端通过连接臂(linker)连接上荧光基团 (fluorophore) 和淬灭基团(quencher)。在没有目标分子存在时，分子信标呈自由 的发夹状态，茎部发生分子内杂交，荧光基团和淬灭基团十分靠近，从而发生荧 光共振能量转移，荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收并以热的形式散发,检测 到的荧光背景信号极低。当目标分子存在时，分子信标可与完全互补靶序列形成 相对刚性并且更加稳定的异源双链杂交体，环状部分长于茎部，使得荧光分子与 淬灭分子之间的空间距离增大，荧光几乎完全恢复，所以它具有很高的信噪比， 也无需洗脱（图 1.7）。分子信标已经被广泛应用于核酸的高灵敏检测41- 48、基 因突变、snp 测定49, 50、蛋白分析检测51- 60、dna 传感器和基因芯片61- 66和活 细胞成像67- 69等各个方面。 分子信标的核心在于茎- 环结构和荧光基团与淬灭基团之间的荧光共振能量 转移（fret）的效率，这两点是决定分子信标性能的关键。茎- 环结构决定了分 子信标在热力学、杂交动力学和选择性等各方面的性能。从热力学角度来看，分 子信标的茎越长，完全匹配双螺旋和错配复合物相变温度的差异就越大，从而致 使分子信标的选择性越高38, 39，但是会降低杂交反应速率。要想用长茎分子信 标又要保持高反应速率， 一个解决的方法就是让环部和一个条茎一起作为目标杂 交区域40，即共臂（shared- stem）方式。fret 的效率主要决定于两个因素：荧 光基团与淬灭基团之间光谱重叠程度35, 36和二者之间的距离37。 图 1.7 分子信标工作原理96 fig 1.7 the principle of molecular beacon96 硕士学位论文 11 1.3.3 分子信标核酸探针面临的挑战与发展趋势 随着生命科学的飞速发展，特别是后基因组时代的到来，人们对细胞内 mrna 的表达、折叠，运输和亚细胞定位的了解显得越来越重要，特别是在单 个活细胞内进行 mrna 追踪，对于广大生物学家和化学家来说是一个有趣而又 富有挑战性的课题。尽管一些早期研究证明了分子信标可用于活细胞基因检测， 但是目前这些还都是一些比较初步的结果。要想实现分子信标对活体 mrna 高 灵敏地检测，我们必须面对几个方面的挑战，主要体现在灵敏度、非特异结合以 及细胞质中的核酸酶降解等方面。 在灵敏度方面，dna- mb 的灵敏度要高于其他的 dna/rna 探针，但面对 细胞内低丰度目标检测物的时候， 分子信标的灵敏度还是不够。提高分子信标的 灵敏度可以通过增强荧光基团的信号强度或提高淬灭基团对荧光基团的淬灭效 率得以实现。其中有一些研究工作尝试了偶联多荧光基团、藻胆蛋白以及量子点 (qds)等来提高荧光信号。 如 yang 等70将高密度荧光团 ppes 作为分子信标的荧 光基团，ppes 是一种具有高量子产率的水溶性聚电解质，能够产生较强的荧光 信号，这种强度甚至可与量子点相比。将 ppes 通过聚合反应联结到 dna 的末 端，结果表明 ppes 不会干扰分子信标的发夹结构以及杂交行为，而且常规淬灭 剂 dabcyl 对 ppes 有很好的效的淬灭作用。 从而大大增强了分子信标与目标物结 合后的信号强度，提高了信标的检测灵敏度。如图 1.9 所示。 图 1.8 分子导线分子信标 工作原理 (a) 普通分子信标. (b) 分子导线分子信标70 figure 1.8 the principle of molecular beacon70 (a) normal molecular beacon. (b) aconjugated- polymer- labeled molecular beacon q=quencher, fl=fluorophore. kim等71设计了一种新的分子信标，用巯基乙酸包覆的量子点作为荧光基 团，与分子信标5端的- nh2相连，dabcyl作为淬灭基团，连接到分子信标的3 端，如图1.8所示。目前该方法的灵敏度还不是很高，但作为一种新的分子信标， 还有许多可以尝试改进的地方用于提高检测灵敏度。 用量子点代替有机荧光团克 新型分子信标的合成及其性能研究 12 服了有机染料光漂白速率较快、寿命较短的缺陷。利用不同的量子点进行编码， 则可以同时进行多个dna或rna的分析。 图 1.9 量子点修饰的分子信标71 fig.1.9 schematic illustration of quantum dot modified molecular beacon71 另外， 通过提高淬灭基团对荧光基团的荧光淬灭效率也可以提高分子信标的 灵敏度。有研究工作致力于开发新的高荧光淬灭效率的淬灭剂，其中有 black hole quenchers (bhq- 1、bhq- 2 和 bhq- 3) 72, 73、qsy- 7 以及 qsy- 9 以及 eclipse 等等。还有人将多个淬灭基团组装在一起形成 superquencher，作为淬 灭基团用于分子信标的设计中。与 dna- mb 相比， 其灵敏度提高了将近 14 倍74 （图 1.10）。 图 1.10 超淬灭分子信标的结构图74 figure 1.10 structure of superquencher molecular beacon74 非特异性结合是对分子信标的第二个挑战。有文献报道了 dna- mb 在 ssb 单链结合蛋白作用下可以非特异性打开发夹结构，导致荧光信号的产生51。为 硕士学位论文 13 了降低非特异性结合导致假阳性结果的产生， 有很多研究工作尝试从不同的角度 来解决这个问题，其中有人报道了 dual fret mb 75，利用两种不同的分子信标 与特定的目标链杂交，杂交后两种分子信标的荧光基团彼此距离很近，二者通过 荧光共振能量转移，使检测信号得以改变，由此降低了非特异性结合导致的假信 号（图 1.11） 。 图 1.11 双分子信标的原理图75 figure 1.11 principle of dual fret molecular beacons75 wang 等76合成了新型的锁核酸分子信标（lna- mb） ，通过与常规的 dna 分子信标（dna- mb）相比，发现该 lna- mb 在 ssb 存在下背景信号很低，说 明其不与蛋白非特异性结合。在解决蛋白非特异性结合的问题上，该研究工作十 分出色，为人们提供了有力的借鉴（图 1.12） 。 图1.12 lna- mb/dna- mb与ssb结合情况76 (a) lna- mb示意图 (b) lna- mb结构 (c) lna结构 figure 1.12. response of lna- mb/dna- mb to ssb76 (a) cartoon of lna- mb (b) conformational structure of lna- mb (c) the lna structure. 新型分子信标的合成及其性能研究 14 第三个挑战在于核酸酶对分子信标的酶切效应。dna- mb 在细胞中稳定存 在的时间大概为 35 分钟，此后由于酶切而使背景信号显著增强77。为提高分子 信标在细胞中的稳定性，有很多研究工作尝试从不同的角度来解决这个问题，如 2 - 氧甲基化分子信标68, 69, 78、硫代化分子信标79, 80、肽核酸分子信标81, 82等。 2 - 氧甲基化分子信标在细胞内有良好的抗酶切性能，同时其也有抗 rnase h 酶 切的特性69，但由于与蛋白质的非特异性结合，其在细胞内的背景信号很强68, 83，制约了其在细胞内 mrna 检测的应用。硫代化分子信标本身毒副作用比较 大，在不少研究中受到了限制。肽核酸分子信标有良好的抗酶切性能且能够与 dna/rna 目标物有良好的结合，但受限于其溶解度和团聚现象。近年来发展起 来的锁核酸（lna）84, 85引起了人们的广泛关注。lna 是一种新型的寡核酸衍 生物，其中 - d- 呋喃核糖的 2- o，4- c 位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥， 形成了刚性的缩合结构。 该特殊结构使 lna 具有许多独特的性能， 如：与 dna、 rna 具有很强的亲和力；与 dna、rna 互补杂交形成的双链具有很强的热稳定 性；具有抗 3 脱氧核苷酸酶降解的稳定性等等。最近有人将 lna 用于分子信标 的合成76, 86，如图 1.12 所示。lna 分子信标与常规 dna 分子信标、2 - 氧甲基 化分子信标、硫代化分子信标、肽核酸分子信标等相比，具有许多诱人的特性， 如：抗细胞内核酸外切酶酶切、抗 rnase h 酶切、与蛋白无非特异性结合、细 胞内极底的背景信号、良好的溶解性等等。初步实验证明了 lna- mb 在细胞内 能稳定存在 2 小时以上，其能够很好地与目标物结合且对目标物有良好的选择 性， 所有这些特性昭示了 lna- mb 在活体 mrna 的检测中将有广泛的应用前景。 几种改进型分子信标的性能比较如表 1.1。 表 1.1 几种改进型分子信标的性能 table 1.1 the properties of novel molecular beacons 分子信标类型 抗酶切能力 选择性 杂交亲和力 荷电性 非特异性结合 毒性 硫代化 较强 高 稍微降低 负电 较高 强毒 2 - 氧甲基 较强 高 稍微增强 负电 较高 低毒性 肽核酸 强 高 强 中性 低 低毒性 锁核酸 很强 很高 很强 负电 很底 无毒性 硕士学位论文 15 1.4 本文拟开展的工作 综上所述，核酸分子探针经过了一个长期的发展过程，已经被广泛地应用于 生物、医学等领域。但为了适应生命科学的不断发展对核酸分子探针所提出的新 的要求，人们需要不断设计出灵敏度更高、稳定性更好、选择性更强的核酸分子 探针。其中锁核酸分子探针已经显示了自身在生命科学研究领域的潜在应用前 景。我们可以充分借鉴已经发展成熟的平台技术，如分子信标的结构设计和接触 淬灭、fret34、波长红移87、金属淬灭88- 90、酶91, 92、电化学分析37等信号 产生机制，将其应用于锁核酸分子探针的设计当中。除了传统的荧光基团，我们 还可以充分利用像金纳米颗粒93、超淬灭基团82、芘94、共轭多聚物71、二茂 铁93等作为信号分子来设计相关锁核酸分子探针。 本论文拟顺应生命科学研究发展的要求， 利用锁核酸和分子信标核酸探针的 优良特性，开展以下几个方面的工作： （1）核酸合成平台的搭建 利用 dna 合成仪和液相色谱仪合成并纯化普通 dna 引物、常规分子信标 和超淬灭分子信标，并通过质谱等手段进行解析，证明其是否为目标产物，再通 过 cdna 杂交实验来考察其性能，期望通过这些工作掌握普通 dna 引物以及染 料标记的 dna探针的合成与纯化技术。 （2）锁核酸分子信标的合成与性能考察 为了实现对活细胞内 mrna 的检测，将尝试设计合成一种茎部只有三对配 对碱基的锁核酸分子信标， 希望将其与茎部有六对配对碱基的常规分子信标进行 比较，来考察二者杂交反应速度、灵敏度、稳定性以及选择性等性能差异。希望 为设计真正能够适合活细胞 mrna检测的探针提供前期研究数据支持。 （3）锁核酸分子信标与共臂cdna杂交性能考察 由于分子信标与共臂 cdna 杂交具有灵敏度高的优势，拟根据 p53 基因序 列，设计合成 p53 的锁核酸分子信标，通过开展与 cdna 以及共臂 cdna 的杂 交实验，来考察其与不同类型 cdna 杂交的反应速度、灵敏度、稳定性以及选 择性等方面的差异，为设计真正能够适合活细胞检测的探针提供