（生物化学与分子生物学专业论文）计算机辅助hsahgcsf融合蛋白的分子改造.pdf

摘要 摘要 粒细胞集落刺激因子( g c s f ) 主要来源于巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞，具 有高度特异性的刺激中性白细胞系的功能。g - c s f 作为药物分子已广泛应用于临床，其 主要的不足有生物活性低、体内稳定性差和体内半衰期短等。本文设计g c s f 突变体期 望提高g c s f 的生物活性，采用白蛋白融合表达技术提高g c s f 的体内稳定性，为长效 g - c s f 的研究创造条件。 依据g c s f 的结晶结构信息，我们利用s w i s s - p d bv i e w e r3 7 软件的同源建模功能构 建出融合蛋白突变体的三维结构。在h y p e rc h e m 软件中计算各融合蛋白突变体的单点 能，并与突变前作比较。单点能计算显示，对远离活性位点的5 个氨基酸残基进行的突 变得到的结构分子能量最小。分析各突变体的g c s f 骨架结构与野生型g - c s f 骨架结构 的差异，表明那些能保留活性作用结构的突变体其突变位点均接近n 端，与单点能计算 结果综合分析，认为m 8 突变体生物特性与天然构象相似，活性位点的两个重要氢键 ( 1 9 g l u - o 与1 7 3 1 弘o 、2 2 - a r g - n 与2 3 8 h i s o ) 得到保留。选取活性和半衰期有望提高的突 变方案m 8 ，将其在毕赤酵母系统中进行表达，并对融合蛋白进行了鉴定，验证理论计 算的合理性和可行性。 全合成人g c s f 基因突变体的序列( h g c s f m ) ，插入克隆载体p b l u 2 k s p h s a q b ， 构建重组质粒p b l u 2 k s p h s a h g c s f m 。测序结果显示克隆得到的h g c s f m 基因与突变 方案的序列完全一致。 用e c o ri 和n o ti 双酶切重组质粒，回收h s a - h g c s f m 片段，插入到毕赤酵母表达载 体p p i c 9 k 中，构建表达载体p p i c 9 k h s a - h g c s f m 。经限制性酶切分析证明融合基因已 经成功地插入到载体p p i c 9 k q 丁，测序结果表明h s a - h g c s f m 融合基因与预期的一致。 表达载体经s a li 线性化后电击转化毕赤酵母g s l l 5 ，以m d 平板进行初筛，得到 的重组子进行诱导表达分析。将表达量较高的重组毕赤酵母进行表达产物鉴定和g - c s f 活性分析，优化诱导时间和诱导剂浓度后，对融合蛋白进行初步的分离纯化。诱导表达 筛选得到1 株表达2 0 0m g l 目标蛋白的重组菌3 2 。w e s t e r n 杂交显示表达产物具有很好 的h s a 抗原性，分子量约8 4k d a ；n f s 6 0 细胞m t t 比色法测定表达产物具有g c s f 的生物学活性，野生型融合蛋白的比活性为5x1 0 4 i u m g ，突变后提高为1 5 1 0 6 i u m g ， 说明重组菌3 2 可成功表达具有g - c s f 生物活性的h s a h g c s f m 融合蛋白。 关键词：人粒细胞集落刺激因子，定点突变，同源建模，长效，融合蛋白，毕赤酵母 a b s t r a c t a b s t r a c t ，玎1 eg r a n u l o c y t ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r ( o - c s f ) m a i n l yc o m e sf r o mm a c r o p h a g o c y l e ， e n d o t h e l i a lc e l la n df i b r o b l a s t i tc a nh i g h l ys p e c i a l l ys t i m u l a t ef u n c t i o n a la c t i v ef a c t o ro f n e u t r a ll e u k o c y t es t r a i na n di sw i d e l yu s e di nc l i n i c a lt r e a t m e n tw h i l e 也el o wb i o l o g i c a l a c t i v i t y ，l a c ko fs t a b i l i t y ，a n ds h o r th a l fl i f ea r em a j o rs h o r t c o m i n g s i no r d e r t oe n h a n c et h e b i o l o g i c a la c t i v i t yo fg c s f , s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i sw a se m p l o y e dt od e s i g ns e v e r a l m u t a n t so f ( c s f t h e yw e r ef u s e dw i t hh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) t op r o l o n gt h e h a l f - l i f eo f t h eb i o l o g i e a la c t i v i t yo fg c s fi nv i v o l a s t i n ge f f e c t i v eg - c s fr e s e a r c hw i l lb e b a s e do ns u c hm e t h o d s 3 二dc o n f o r m a t i o no fh s a h g c s f mw a sb u i l tu p b yh o m o l o g ym o d e l i n gi ns w i s s - p d b v i e w e r3 7w h i l ex - r a yd i f f r a c t i o ns t r u c t u r eo fg - c s fw a su s e d 鹊am o d e l s i n g l ep o 硫 e n e r g i e sw e r ec a l c u l a t e da n dc o m p a r e dw i t hh s a - h g c s f i nh y p e r c h e m r e s u l t ss h o w e d t h a tt h em u t a n tw i t ht h e5a m i n oa c i d sa w a yf r o mc o n t a c ts i t es u b s t i t u t e dh a dt h em i n m a x t o t a le n e r g ya m o n g8m u t a n t s b i o l o g i c a lc h a r a c t e r sw e r ep r e d i c t e db yt h e o r e t i c a la n a l y s i so f b a c k b o n ed i f f e r e n c eo ft h e m , e n v i d e n c e sa r ed i s t i n c tt h a tn a t u r ac o n f i g u r a t i o nw a sm a i n t a i n e d w h e nm u t a t i o nl o c a t e di nn - e n d ，i na c c o r dw i t hs i n g l ep o 血e n e r g yr e s u l t s ac a n d i d a t em 8 w h o s et w on e c e s s a r yh b o n d sw a sw e l lr e s e r v e di ns i m u l a t i n gs t r u c t u r ew a st h e r e f o rb e l i e v e d t 0b en e a rt ot h ew i l dt y p eg c s fi nb i o l o g i c a la c t i v i t y , a n dw a sc h o s e nt oe x p r e s s ei ng sl l5 s t r a i no f p i c h i ap a s t o r i s 1 1 1 ef u s i o np r o t e i nh s a h g - c s f mw a si d e n t i f i e db yw e s t e r nb l o ta n d n f s 6 0c e l lp r o l i f e r a t i o ne x p e r i m e n t n l er e s u l t sa r eu s e dt ov e r i f ya n di m p r o v et h em e t h o d mc h e m i c a ls y n t h e t i c a le d n ao fh u m a ng - c s f mg e n e ( a b o u t5 41b p ) w a si n s e r t e di n t o p l a s m i dp b l u 2 k s p h s ab ys a uia n dn o tir e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o nt oa c h i e v et h e f u s i o ng e n e t h es e q u e n c eo fh g - c s f mg e n ew a ss e q u e n c e dt ob ei nc o r r e s p o n d e n c e 谢t l lt h e d e s i g ni na d v a n c e 1 1 1 eh s a h g c s f mf u s i o ng e n ew a sr e c o v e r e dw i t h & 以ia n dn o ，if r o mt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d ( p b l u 2 k s p h s a 1 1 g c s f m ) a n di n s e r t e di n t op p i c 9 kt oc o n s t r u c t e x p r e s s i o n v e c t o rp p i c 9 k - h s a - h g c s f m 们托s e q u e n c eo ft h ef u s i o ng e n ew a sc o n f i r m e db y s e q u e n c i n g n 圯p p i c 9 k h s a h g c s f mw a sl i n e a r i z e dw i t hs a li a n dt r a n s f o r m e di n t og s115s t r a i n o f p i c h i ap a s t o r i sb ye l e c t r o p o r a t i o n as t r a l _ r ln a m e d 3 2w i t hh i g hp r o d u c t i v i t yw h i c hc o u l d s e c r e t e2 0 0 m g lf u s i o np r o t e i nw a so b t a i n e da f t e rs c r e e n i n g ，a n dt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h e f u s i o np r o t e i nw a s8 4 k d a w e s t e r nb l o td a t as h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nw a sah y b r i d c o m p o u n dc o m p o s e do fl i s aa n dh g - c s f ma n d t h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo f1 5 10 0 1 u m g ， c o m p a r e dw i t h5 10 4 i u m go fw i d et y p ef u s i o np r o t e i n , h a sb e e np r o v e dt ob e3 0t i m e s h i g h e r r a t i o n a ld e s i g n 、析mt h eh e l po fc o m p u t e rc o n f i r m e di t sf e a s i b i l i t ya n di m p o t a n c ei n d r u gm o l e c u l a rd i s c o v e ra n d m o d i f i c a t i o n k e y w o r d s ：g r a n u l o c y t ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r , s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，h o m o l o g y m o d e l i n g ，l o n gl i f e ，f u s i o np r o t e i n , p i c h i ap a s t o r i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是举人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 期： 山曙。镌弓。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并耳拳人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：辜峄导师签名： 日期： 夕c 卜 知胡哆亏。 第一章绪论 第一章绪论 一种生物体的基因组规定了所有构成该生物体的蛋白质，基因规定了组成蛋白质的 氨基酸序列。虽然蛋白质由氨基酸的线性序列组成，但是，它们只有折叠成特定的空间 构象才能具有相应的活性和相应的生物学功能。了解蛋白质的空间结构不仅有利于认识 蛋白质的功能，也有利于认识蛋白质是如何执行其功能的。确定蛋白质的结构对于生物 学研究是非常重要的。 1 1 分子模拟技术 1 1 1 分子模拟技术的兴起 目前，随着d n a 测序技术的发展，人类基因组及更多的模式生物基因组已经或将 要被完全测序。随着d n a 序列数量的急增、d n a 序列分析技术和基因识别方法的进步， 大量蛋白质序列的推导丰富了我们的认识。蛋白质序列数据库的数据积累的速度非常 快，但已知结构的蛋白质相对比较少。截止2 0 0 8 年4 月1 日，蛋白质p d b 数据库中 已有被x 射线衍射【1 】和m r 方法【2 捌测定的蛋白质结构4 9 9 7 4 个。尽管蛋白质结构测定 技术有了较为显著的进展，但是，通过实验方法确定蛋白质结构的过程仍然非常复杂， 代价较高，有些蛋白质则根本不能被结晶( 例如膜蛋白) 【4 】。因此，实验测定的蛋白质结 构比已知的蛋白质序列要少得多。人们希望解析蛋白质结构的速度能够跟上明确蛋白质 序列的速度，或者减小两者的差距。1 9 7 3 年，a n f i n s e n 首先发现去折叠蛋白或者说变性 ( d e n a t u r e d ) 蛋白质在允许重新折叠的实验条件下可以重新折叠到原来的结构【5 】，这种 天然结构( n a t i v es t r u c t u r e ) 对于蛋白质行使生物功能具有重要作用，大多数蛋白质只有 在折叠成其天然结构的时候才能具有完全的生物活性。自从蛐e n 提出蛋白质折叠的 信息隐含在蛋白质的一级结构中，科学家们对蛋白质结构的预测进行了大量的研究，分 子生物学家将有可能直接运用适当的算法，从氨基酸序列出发，预测蛋白质的结构。 以计算机技术为依托的分子模拟技术的应运而生，理论上解决了上述两方面的难 题。分子模拟技术被誉为除实验与理论研究之外，了解、认识微观世界的“第三种手段”， 它是以量子化学、统计力学为理论基础的- f l 新兴学科，主要包括计算量子化学( 计算 分子的性质) 和分子模拟( 模拟分子聚集体的行为，从而计算分子系统的宏观性质) 。分 子模拟技术为蛋白质的结构预测和功能测定提供了一种崭新的手段，它在蛋白质的结构 预测和建模工作中占有举足轻重的地位，实现了生物技术与计算机技术的完美结合，同 时该技术在结构与功能关系分析、分子设计、药物筛选等过程中也得到了广泛深入的开 发与应用，正不断显示出巨大的生命力。由于其在理论、方法和计算技术方面所取得的 成就，分子模拟取得了引人瞩目的进展，已成为化学、物理、生物、材料研究中的有力 工具。 1 1 2 结构模拟方法 当前，蛋白质空间结构模拟主要有两类方法：基于结构认识的预测和从头设计( d e 江南大学硕士学位论文 n o v od e s i g n ) ，也叫理论计掣们。对于药物设计还可应用三维定量构效关系( 3 d q s a r ) 的 方法1 7 和虚拟受体的方法。 基于结构认识的预测包括两类i s ：同源建模( h o m o l o g ym o d e l i n g ) 法和反向折叠法。 同源建模仍是当前最为可靠的蛋白质结构预测方法。利用同源蛋白质进行结构建模，其 基本出发点是同一家族蛋白质结构上的保守性比序列保守性更强1 9 - 1 1 】。当序列相似性大 于3 0 时，同源模型构建的可靠性很高，否则，结构预测的结果较差。反向折叠法的主 要原理是把未知蛋白质的序列和已知的这种结构进行匹配，找出一种或几种匹配最好的 结构作为未知蛋白质的预测结构。它的实现过程是总结出已知的独立的蛋白质结构模式 作为未知结构进行匹配的模板，然后用经过对现有的数据库的学习，总结出可以区分正 误结构的平均势函数( m e a nf o r c ef i e l d ) 作为判别的标准，来选择出最佳的匹配方式， 这样的预测方法也有程序可以使用。这种方法的局限性在于它假设蛋白质的折叠类型是 有限的，所以只有未知蛋白质和已知蛋白质结构相像的时候，才有可能预测出未知蛋白 质的结构。如果未知蛋白质结构是现在还没有出现的结构，这种方法就不能应用。另外， 反向折叠法虽然在方法学上有较大的突破，但在技术上仍存在许多需要改进的地方。 理论计算方法是指：根据物理化学、量子化学、量子物理的基本原理，从理论上计 算蛋白质分子的空间结构。主要有分子力学、分子动力学方法 1 2 q 3 l 。这类理论计算方法 所依据的一个基本热力学假定是：蛋白质分子在溶液中的天然构象是热力学上最稳定 的、自由能最低的构象。它们的共同原理是以原子坐标为变量，在一种选定的立场中构 成能量目标函数，通过运算使此能量函数的值减小来获得分子三维结构。从理论上说， 如果正确地考虑了一个蛋白质分子中所有原子间的相互作用以及蛋白质分子与溶剂的 相互作用，应用能量极小化方法就可以在计算机上确定一个蛋白分子的天然构到1 4 l 。不 过，在实际应用时，这类方法存在诸多问题 8 1 ：从理论上计算蛋白质分子空间结构需 要精确地知道描述蛋白质溶剂系统的力场和能量函数，而目前关于系统能量函数的了解 还仅仅处于半定量阶段；能量的极小化方法在数学中属于最优化理论的范畴，存在着 大量的局部极小点，即势阱，虽然有不少工作致力如何跨越局部势阱的研究，但目前从 数学上仍没有有效的方法解决这一问题；迄今为止，所有的研究结果都仅仅表明了每 个蛋白质分子在一定条件下具有特定的、有生物功能的构象，而并没有证明这一天然构 象就是全局自由能最小的构象。因此，目前仍不能用理论计算的方法正确地预测一个小 蛋白质分子的天然构象。尽管如此，还是有不少实验室在继续致力于这方面的研究。 h n i c k e l 等【1 5 】应用递归动力学程序设计方法( r e c u r s i v ed y n a m i cp r o g r a m m i n gr d p ) 进 行蛋白质三维结构的预测，结果表明r d p 是有效的，特别是能对蛋白质的活性位点进行 精确的预测。 现在应用于生物大分子领域的商品化分子模拟软件主要有a c c e l r y s 公司基于l i n u x 系统开发的i n s i g h ti i 和基于w i n d o w s 系统开发的d sm o d e l i n g 。以及q u a n t a 和t d p o s 公司 的s y b y l 软件。在国内，北京大学物理化学研究所也开发了一套“北京大学蛋白质分子 设计系统。而r a s m o l 是一个非常有名的免费软件，用来显示蛋白质、核酸以及小分子 的三维结构【1 6 l 。 2 第一章绪论 1 1 3 结构优化方法 模型构建完成后，还需要作能量优化以获得最接近天然状态的蛋白质构象。用分子 + 热力学作为优化方法主要由三个因素构成；一是蛋白质结构模型，二是要有一个好的蛋 白质构象搜索方法，三是要一个判断蛋白质构象好坏的势能函数。现阶段的主要问题是 选择准确的势能函数和解决势能函数的局部极小问题。能量优化方式主要有m ：m o n t e c a r l o 方法，模拟退火法【埘，遗传算法【眦1 1 、系统搜索法，光滑算法 2 2 1 ，搭建过程以及由 c o m e l l 大学b a k e r 化学实验室提出的构想空间退火法等。 m o n t ec a r l o 方法的基本思想是在解空间中随机地采样并计算目标函数值，经过大量 的采样后，保留已经得到的最优解作为最终解。m o n t ec a r l o 方法不受解的空间结构和分 布的影响，在采样数趋近无穷时以概率1 收敛到全局最优解。 模拟退火算法是k i r k p a r t a c k 等人于1 9 8 2 年引入组合优化领域的 2 3 - 2 ，1 ，其基本思想是 模拟固体的退火过程。模拟退火算法采用m e t r o p o l i s 接受准则，并用一组称为冷却进度 表的参数控制算法过程，使算法在多项式时间内给出一个近似最优解。退火时温度必须 缓慢下降，使得系统在每个温度下都达到平衡态，退火过程中系统的熵值不断减小，系 统的自由能也随之降到最小值。 1 2 粒细胞集落刺激因子 1 2 1 粒细胞集落刺激因子概况 粒细胞集落刺激因子( c r r a n u l o c y t ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r ，g - c s f ) 是由单核细胞、 纤维母细胞、内皮细胞产生的一种调节因子，是调节骨髓中粒系造血的主要因子之一。 它作用于骨髓中性粒细胞系造血前体细胞，促进其增殖、分化，促进中性粒细胞的成熟 和释放 2 6 - 2 7 1 。 1 2 2 粒细胞集落刺激因子的生物学性质 g - c s f 是一种分子量1 9 6k d a 的糖蛋白，等电点约为6 0 。成熟人g - c s f 有两种 异构体：1 7 7 个氨基酸( a 型) 和1 7 4 个氨基酸( b 型) 。天然的a 型活性较b 型低1 0 倍 t a q ，在储存和热变性方面也没有b 型稳定。a 型在l e u 3 5 和c y s 3 6 之间多了缬氨酸、丝 氨酸和谷氨酸，从而导致其活性较低。 1 2 3 粒细胞集落刺激因子基因和蛋白口9 删 g - c s f 基因定位于人染色体1 7 q 1 1 m 或1 7 q 2 1 珑，含有5 个外显子和4 个内含子。在 g c s f 转录起始位点c a p 附近，有3 个启动子元件( 顺式调控元件) g p e ，参与g c s f 的诱导性或组成性表达。g p e 1 中含有结合n f r , b 的保守序列，称c k - 1 ( c s fb o x ) ， 通过与核因子作用参与g c s f 的诱导表达。g p e 2 是8 聚体转录因子( o c t - 1 ) 结合位点， 通过与o t f 2 样核因子作用而发挥转录增强作用。g p e 3 是g c s f 基因特有的转录调 节区域，与肿瘤细胞中g - c s f 的组成性表达有关。 g - c s f 有一个o 糖基化位点，糖基对g - c s f 的生物学活性无贡献，但能增加g - c s f 的稳定性，防止g c s f 间的积聚，与g - c s f 的半衰期延长有关。g - c s f 分子中有5 个 江南犬学硕士学位论文 c y s 残基形成2 对二硫键( c y s 3 6 c y s 4 2 ，c y s 6 4 一c y s 7 4 ) ，维系其高级结构并保持其生物 学活性。c y s 3 6 及其附近序列对g c s f 的生物学活性有重要贡献，如果缺失或被置换， 活性就会丧失。 g - c s f 的晶体构型有4 个a 螺旋，分别为a 、b 、c 、d ，构成典型的四螺旋柬。还 有一个短的螺旋片段e ，又称3 l o 螺旋，螺旋含量很高，达6 9 。螺旋之间是2 个长袢 和1 个短袢折叠方式，属于长链螺旋细胞因子家族，如图1 - 1 。 囤1 i g c s f 晶体结构 f 瑭i - 1 t h ec r y s t a l l o g r a p h i c o f o c s f 1 2 4 拉细胞集落刺激因子生理活性覆作用机理 3 5 3 9 对造血前体细胞的作用：g - c s f 可延长中性粒细胞系各个阶段的祖细胞在体内外的 存活时间，加速多能干细胞进入细胞周期，刺激其增殖，并且还有诱导分化作用。不仅 诱导正常粒细胞系的分化，还可诱导单核、巨噬细胞的形成及白血病和某些非白血病细 胞株的分化。 对成熟中性白细胞的作用：在感染时产生的内源性g c s f 一方面可诱导骨髓产生 更多的中性粒细胞，另一方面可促进中性粒细胞向炎症部位移动，并促其对细菌和真菌 的调理作用及吞噬功能，加强其抗体依赖的细胞毒介导的细胞毒作用( a n t i b o d y - d e p e n d e n t c e l l - m e d i a t e dc y t o t o x i e i t y ，a d c c ) 以及加快有关的细胞代谢。 对肿瘤细胞的作用：g c s f 能加强中性白细胞对肿瘤细胞的a d c c 作用。此作用 与g c s f 能诱导出高亲和力i g g 受体有关。g c s f 还对血液系肿瘤细胞具有诱导分化 作用如碱性磷酸酶( n a p ) 为中性白细胞成熟与否的标志，而n a p 活性降低为慢性髓性 白血病( c m e ) 的重要特征之一，g c s f 与c m l 患者血标本共同培养后显示出n a p 积分 增高。o c s f 不仅能诱导c m l 病人的恶性细胞分化，还能参与诱导自血病h l 一6 0 细胞 的分化及急性髓系自血病( a m l ) 母细胞的成熟。 1 2 5 粒细胞案落刺激因子的临床应用1 4 0 , 4 1 1 1 9 8 6 年成功地克隆了g c s f ，随着生物技术的发展，重组人g - c s f 逐渐应用于临 床。1 9 9 1 年g c s f 被f d a 批准上市，主要用于骨髓移植和一些肿瘤的治疗，这些肿瘤 包括肺、卵巢、睾丸和淋巴瘤。此外，还用于再生障碍性贫血和骨髓异常伴中性粒细胞 减少症。从1 9 9 3 年始，适应证扩大到多种肿瘤化疗和放疗后所致的中性粒细胞减少， 用于减轻放化疗所致的骨髓抑制。1 9 9 4 年被批准的新的适应证为肾移植或h 1 v 感染伴 中性粒细胞减少。1 9 9 5 年开始，在急性髓样白血病、肺炎、泌尿系感染等方面进行了许 多i 期临床实验。目前，在肿瘤方面，g - c s f 主要用于高剂量化疗的保驾以及随之而来 第一章绪论 的骨髓重建。g c s f 缩短了白细胞低下的持续时间，减少了伴随白细胞减少而出现的发 热的发生率和抗生素的使用剂量并缩短了住院时间，极大地降低了化放疗的危险，所以 在临床方面得到了广泛的应用。g c s f 临床应用方面研究的发展趋势是对其分子结构和 构象进行适当加工和改变。以期获得生物学活性更加单一、更加有效、副作用更少的 r h g - c s f ，也可以得到其相应的有效拮抗剂，更好的应用于临床。 1 3 长效重组蛋白 1 3 1 研究背景【4 2 】 生物技术的发展极大地促进了多肽蛋白药物的研发，截止2 0 0 4 年2 月，美国f d a 批 准t 6 4 种重组多肽蛋白类治疗药物上市。药代动力学研究表明多肽蛋白类药物主要通 过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用在体内被清除。其中分子量小于2 0k d a 的 多肽因子在代谢过程中易被肾小球滤过；通过肾小管时多肽因子又被其中的蛋白酶部分 降解并从尿中排出，因而半衰期短。以g - c s f 为例，无论是天然或基因重组的g c s f 在 人体内的循环半衰期都非常短( t v 2 = 1 3 - - 4 2 h ) ，生物利用度低，为了达到的治疗效果， 需要频繁的大剂量用药，而持续给药会引发药疹、发热、肌痛、骨痛等副作用，增加了 病人的痛苦，给临床应用带来很大的限制，导致实际用量远低于理论上需要用量。长效 多肽蛋白类药物的开发已成为对第一代基因工程多肽蛋白药物进行二次开发的重要方 向。目前延长蛋白药物半衰期的主要基于增大蛋白药物的分子量，减少肾小球滤过率； 减少异源蛋白的免疫原性，从而减少其体内清除率；持续缓慢释放维持药物浓度，延长 药物作用时间等三个方面考虑。常用技术有：构建突变体、p e g 化学修饰、基因融合等。 1 3 2 构建突变体 利用突变技术，引入一些稳定蛋白质结构和提高活性的因素，可以有效提高蛋白稳 定性，增加药物半衰期【4 3 】。李芳等利用定向点突变技术将人重组g c s f 第17 位游离的 c y s 编码序列突变为趾a 序列，在r _ e c o l i 中表达的突变蛋白，与野生型g c s f 相比，具有 更高的生物学活性及稳定性刚。 1 3 3p e g 化学修饰 化学修饰是改变重组多肽蛋白类药物性状的有效方法之一，作用机理包括：修饰剂 可以将抗原决定簇屏蔽，不产生相应抗体，解除异体蛋白免疫原性；在蛋白质表面起到 遮蔽作用，使得蛋白质不易被蛋白酶降解；使分子量大大提高，不易被肾小球过滤。从 而使修饰后蛋白质在体内半衰期延长【4 5 1 。目前用作蛋白质的修饰剂有：右旋糖苷、肝素、 聚乙烯吡咯烷酮、聚氯基酸、多聚唾液酸、聚乙二醇等其中以聚7 , - 醇修饰( p e g m o d i f i c a t i o n ) 最为常用。 一， 一 一 p e g 具有良好的生物相容性、无毒性和无抗原性等优点，修饰后的蛋白和多肽类药 物的药代动力学和药效学性质能够得到改善。目前p e g 化的蛋白药物已纷纷上市，如 2 0 0 2 年1 月3 1 日被美国f d a 批准上市的p e g 化的g c s f ( a m g e n 公司，商品名：n e u l a s t a ) 。 江南太学硕士学位论文 1 3 4 基目融合h 6 4 q 通过构建融合蛋白技术可以通过增加多肽蛋白类药物分子量，来达到延长药物半衰 期的目的。目前常用的融合蛋白载体主要有人血清白蛋白( h 啪柚s e r u ma l b u m i n ，h s a ) 和抗体i g g 重链f c 段。人血清白蛋白是血液中含量最高的蛋白( 达4 0 9 几) ，是人体血浆的 主要成分，在体内具有维持血液渗透压，结合内源性和域外源性配体( 包括激素、有毒 代谢产物和药物) ，无酶活性和免疫原性，人体相容性好，分子量大幽为6 6 k d a ) ，半 衰期长约1 9d 等优点。由于这些优点，以白蛋白为载体的融合蛋白技术白蛋白融合 技术( a l b u m i nf u s i o nt e c h n o l o g y ) 倍受关注。其结构如下： _ 。1 。_ 。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ ：臀 袅，蛰! 二 0 ，：謦j ? 4 _ 。 图i - 2 人血清白蛋白晶体结构 f i gl - 2 t h ec r y s t a l l o g r a p h i c o f l i s a 2 0 0 4 年，w c i w a n g 等构建了a l b l | b n p 融合基因f 州，在2 9 3 f 细胞系中进行分泌表达， 纯化得到的融合蛋白在高血压小鼠模型体内半衰期从融合前的3 m i n 延长到1 2 1 9 h ；1 9 9 7 年，s y e d 等利用水蛭素与兔血清白蛋白融合，将水蛭素置于融合蛋白的n 端，在c o s l 中表达，得到的融合蛋白能很好的抑制凝血酶降解纤维蛋白原的活性，保留了白蛋白的 染料结合能力，将水蛭素的体内半衰期提高了近两个数量级；2 0 0 1 年，美国h g s 公司研 制的h s a 与n 2 干扰素、人生长激素、i l 一2 的融合蛋白分别进入临床试验其中人生长激 素临床前数据表明其体内清除速率较融合前降低t s o 倍。 2 0 0 3 年至2 0 0 7 年，国内外相继申请了多篇自蛋白融合蛋白方面的专利。白蛋白融合 技术不需要额外的化学修饰，生产工艺简单，产物均一，质量控制相对容易，可以有效 的延长药物半衰期。 1 4 毕赤酵母表迭系统 1 4 1 蛋白分泌作用 在表达功能活性重组蛋白方面，毕赤酵母( p i c h i a 7 p a s t o r i s ) 现已成为主要表达系统。 真核生物中某些蛋白前端的信号肽可以引导它所连接的蛋白质分泌到细胞膜外，离开核 糖体的线性蛋白质首先进入内质网进行结构折叠，形成正确空间构象的蛋白被切除信号 第一章绪论 肽并转入高尔基体，经过液泡的膜融合机制成功运出胞外。错误的折叠方式则被结构确 认机制截留在内质网中，最终降解消化。构建的工程菌中，外源蛋白自身的分泌信号肽 可以使产物分泌表达。如果不能利用自身分泌信号肽，那么酿酒酵母转换酶或交配对因 子( m a t 叻的分泌信号肽可以非常有效地引导外源蛋白的分泌【5 1 1 。编码这种信号肽的基因 已经被整合到毕赤酵母表达载体p p i c 9 k q b 。对信号肽的处理需要三种蛋白酶作用：( 1 ) 切除1 9 个氨基酸信号肽的蛋白酶；( 2 ) 基因k e x 2 编码的内切酶，用来切开a 交配因子和 外源蛋白间连接区c 端上的l y s - a r g 位点；( 3 ) 基因s t e l 3 编码的二肽水解酶，切除外源 蛋f i n 端的o l u a l a 多余残基。 与大肠杆菌产生的包涵体型目标蛋白相比，这可以大大简化药用级蛋白的后续分离 和纯化处理，保持了较高的生物活性。1 9 9 5 年，l i n g 等以包涵体形式表达的h g m c s f 纯化复性后活性仅为正确折叠蛋白的1 0 。减少了对宿主细胞的毒副作用，拥有最大的 过量表达潜力。在廉价培养基上生长即可达到很高的细胞密度，发酵中得到超过1 0 0 9 l 的菌体量。 1 4 2 翻译后修饰作用 酵母工程菌能进行翻译后修饰，如糖基化和形成正确的二硫键。酿酒酵母的一个问 题是产物的高度糖基化，有些细胞因子类蛋白的活性将会因此而下降。毕赤酵母则有着 更高的产量和与高等生物相似的糖基化方式。甘露糖含量较少。 1 4 3 选择性启动子 两类启动子，组成型的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子( g a p ) 和甲醇诱导型的乙醇氧 化酶启动子( a o x l ) 。诱导外源蛋白表达的甲醇成本低廉，甲醇的过量积累会抑制菌体 生长，继而影响目标蛋白的总量，这使得发酵过程的控制变得较困难【5 2 巧7 1 。 1 4 4 基因整合方式 毕赤酵母a o x lm r n a 的5 - u t r 长1 1 4n t ，富含a + u ，外源蛋白m r n a 的5 - u t r 应尽可能与其相近，最好是相同。s r e e k _ r i s h n a 等【5 8 】通过调整人血清白蛋白m r n a 与a o x i m r n a 的5 u t r 相同后表达水平提高5 0 倍。为了确保翻译从外源基因的o r f 的a u g 起始，5 u t r 中应避免出现a u g ；此外，为了使翻译正常进行，应避免a u g 附近的密 码子靠近a u g 附近的r n a 二级结构，使a u g 相对自由。 在不改变氨基酸组成的前提下，将编码外源蛋白的密码子优化为酵母的偏爱密码 子，可以提高外源蛋白的表达量。姚斌等【5 9 】利用巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶时，把编 码a 略8 5 , 1 4 6 , 4 4 6 、a r 9 1 5 9 的密码子c g g 、c g a 定点突变为酵母偏好的a 唱密码子a g a 后表达 水平提高了3 7 倍。 外源基因可以以同源或异源的方式稳定重组入酵母染色体，毕赤酵母表达载体 p p i c 9 k 为整合型载体，可将外源基因整合到酵母的基因组中，随染色体的复制而复制， 遗传性状十分稳定，几十次传代后仍可稳定表达目的蛋白。其整合位点主要位于a o x l 和h i s 4 中，整合方式有双交换和单交换两种。双交换主要发生在a o x l 位点，产生菌株 7 江南大学硕士学位论文 表型为h i s + m ：u t s 。单交换重组主要发生在a o x l 基因的3 端和h i s 4 基因中。通过多次单 交换可以得到高拷贝重组子多拷贝整合有利于充分发挥表达潜力硎。 1 4 5 外源蛋白稳定性 利用毕赤酵母系统表达融合蛋白，常会出现产物降解现象【6 1 1 ，我们可以通过降低发 酵p h 、加入适量的蛋白酶抑制剂( 如e d t a ) 、添加蛋白酶竞争性底物( 酵母提取物和 蛋白胨或酪蛋白水解物) ，来提高外源蛋白的稳定性。另外，还可以考虑使用蛋白酶缺 陷型菌株如s m d l l 6 8 亦可避免产物降解的发生。 一些产物蛋白则可能因为分子间的疏水作用而发生聚集，这可以通过在培养基中添 加非离子型表面活性剂或调节p h 值加以缓解。 1 5 立题背景及研究内容 生物信息学在设计、筛选改造药物方面正发挥着日益重要的作用。19 8 2 年，在美国 只有m e r c k 公司组织了一个研究小组从事以分子模拟为基础的药物设计。今天，美国和世 界几乎所有的大医药公司都有了这样的研究团队，在美国甚至还出现了主要利用结构预 测方法设计药物的公司。 h g - c s f 被医药界公认为是目前基因工程药物中最具有应用价值的三个药品之一。 美国a m g e n 生物技术公司与r o c h e 公司合作对h g c s f 进行了研究，并于1 9 9 1 年2 月 获得美国f d a 批准上市，以商品名n e u p o g e n 上市。世界市场销售额从1 9 9 7 年的1 0 5 6 亿美元稳步提高到2 0 0 2 年的2 0 o o 亿美元。2 0 0 2 年获批的n e u l a s t a ( n e u p o g e n 的长效 剂型) ，在2 0 0 3 年就创下了1 3 亿美元的销售额。因此，h g c s f 的长效化研究有着很好 的市场前景 本论文通过检索文献，对可能提高h g - c s f 活性的氨基酸位点加以突变，用生物软 件构建出融合蛋白突变体h s a - h g c s f m ，分析生物活性的变化，选取最接近天然h g - c s f 活性者，通过实验得到其蛋白质产物，并测定生物学活性，验证理论计算的结果。 本论文综合了两方面的技术：采用分子设计手段，模拟分析药物蛋白突变体的三维 结构，以期提高生物活性；采用白蛋白融合技术，制备融合蛋白，希望改善其药代动力 学性状，达到长效重组g - c s f 的目的。主要研究内容如下： ( 1 ) 融合蛋白突变体h s a - h c 论s f m 的分子设计。 ( 2 ) 表达载体p p i c 9 k - h s a h g c s f m 的构建。 ( 3 ) 毕赤酵母工程菌的构建。 ( 4 ) 融合蛋白h s a - ：h g c s f m 的鉴定。 8 第= 章融台虽白的分子设计 第二章融合蛋白的分子设计 蛋白质发挥其在体内外生物活性的基础是一级肽链序列所决定的空间构象，包括催 化、结构、信号传递、转运等在内的各种功能的行使离不开正确的肽链折叠。解析蛋白 质的三维空间结构是发现其各种作用方式的基础。 2 1 g c s f 活性位点 2 1 1 g c s f 晶体蛄构 1 9 9 5 年，a r a k a w a 等p 】利用x 衍射的手段就已经成功获得了人的g c s f 晶体结构， 其后该工作被不断完善，得到的结构分辨率现在已经提高到28 a 。 t a r o t a m a d a 等于2 0 0 6 年2 月发表的p d b