（生物化学与分子生物学专业论文）重组尿激酶原突变体的构建与表达.pdf

重组尿激酶原突变体的构建与表达 重组尿激酶原突变体的构建与表达 摘要 为了获得高特异性的溶栓药物，将r g d s 和g p r p 作为双专一性的导向小 肽分子插入到低分子量尿激酶原( s c i l p a - 3 2 k ，l e u l 4 4 一l e u 4 1 1 w 端，同时为了 提高低分子量尿激酶原的半衰期和增加对p a 1 抑制及凝血酶灭活的抗性，删除 了编码尿激酶原1 5 1 - 1 5 7 位( l y s - t h r - l e u - a r g - p r o - m 争p h c ) 和1 7 9 1 8 4 位 ( a r g h i s a r g - g l y g l y s e t ) 氨基酸的核苷酸，从而构建了一种新型的溶栓分子 尿激酶原突变体g z l s p a 。为了获得有活性的重组表达产物，尝试了大肠杆菌 ec o l i 和毕赤巴斯德酵母表达系统来对尿激酶原突变体g z l s p a 进行重组表达， 并在大肠杆菌中获得成功表达。 在大肠杆菌表达系统中，构建了g z l s p a 基因的c 端融合6 x h i s 亲和标签 的原核表达载体p e t 2 1 b g z l 一s p a ，筛选出稳定表达的菌株b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 。与 此同时，还构建了g z i - s p a 基因的融合表达质粒p t r x g z l s p a ，融合蛋白的表 达量高，达到4 0 以上，融合蛋白切割后在纤维平板上显示出纤溶活性。 p e t 2 1 b g z l 一s p a 表达体系的重组蛋白以包涵体形式存在，s d s p a g e 上显 示分子量约为3 1 k d ，w e s t c mb l o t 检测证明重组蛋白可与抗尿激酶的单克隆抗体 发生特异性结合。表达产物用盐酸胍溶解后，在n i 2 + 亲合层析柱上复性，经一步 分离纯化后，纯化产物在纤维蛋白板上表现出较好的纤溶活性。抗血小板聚集实 验证明它可以起到显著的抗活化血小板聚集的作用。实验结果证明尿激酶原突变 体g z l s p a 同时具备溶栓和抗凝功能，是一种很有发展潜力的溶栓分子，但进 一步的验证性的体外实验和体内实验尚待进行。 关键词：尿激酶原突变体；包涵体：融合表达；分离纯化：溶栓；抗凝。 重组屎激酶原突变体的构建与表达 c o n s t r u c t i o na n d e x p r e s s i o no f am u t a n to fp r o u r o k i n a s e a b s t r a c t t o a c h i e v ea t h r o m b l y t i ca g e n t w i t h h i g hs p e c i f i t y , a m u t a n to f p r o 。u m k i n a s e ( g z l 一s p a ) w a sc o n s t r u c t e d ，w h i c hc o n s i s t i n g o ft h e t e t r a p e p t i d e g l y p r o a r g - p r oa n d t h et r i p e p t i d ea r g g l y - a s p s e rf u s e dt ot h en t e r m i n u so ft h e l o w m o l e c u l a rs i n # e c h a i nu r o k i n a s e t y p ep l a s m i n o g e n ( s c u p a - 3 2 k ) m e a n w h i l e ， t h e s e q u e n c ee n c o d i n gl y s l 5 1 t 1 l r l 5 7a n da r 9 1 7 9 s e r l 8 4i ns c b p ae d n aw e r e d e l e t e di nt h i sm u t a n t ，h o p i n gt op r o l o n gt h eh a l fl i f eo fs o l p a - 3 2 ka n d i m p r o v e t h er e s i s t a n c ea g a i n s tt h ep a l 一1a n dt h r o m b i n i no r d e rt o a c q u i r et h er e c o m b i n a n t a c t i v eg z l - s p a , b o t hec o l ia n dm e t h a n o lt r o p h i c y e a s t p i c h i a p a s t o r i sw e r eu s e dt o e x p r e s s t h e d e s i g n e dg e n e t a r g e tp r o d u c tw a ss u c c e s s f u l l yo b t a i n e di n 晟c e l l e x p r e s s i o ns y s t e m i nt h eec o l i e x p r e s s i o ns y s t e m t h eg o n ew a si n s e r t e d i n t ot h ei m m e d i a t e u p s t r e a mo ft h e6 h i st a g o f e x p r e s s i o n v e c t o r p e t 2 1 b i d u c t i 0 w a sc a r r i e do u ti n ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p l y s sc e l l sa n dh i 【g he x p r e s s i o no ff u s i o np r o t e i nw a sa c h i e v e d w eh a v ea l s ot r i e dt ou s ev e c t o rp t r xa n de v e ng o t h i g h e re x p r e s s i o n ( u pt o4 0 o f t h et o t a lb a c t e r i a lp r o t e i n s ) i ni n c l u s i o nb o d y a f t e rr e f o l d i n ga n dt h et r e a t m e n to f p r e s c i s s i o n p r o t e a s e ，t h e r e c o m b i n a n tf u s i o n p r o t e i n d e m o n s t r a t e d f i b r i n o l y t i c a c t i v i t yi nt h ef i b r i np l a t e h o w e v e r , i t w a s p r o v e dn o t t ob ea ne f f e c t i v ew a yt oo b t a i n h i g hp u r i t ya n da c t i v i t yc o m p a r e d w i t h p e t 2 1 b - g z l - s p as y s t e m t h e p r o t e i nf u s i n gw i t h6 h i st a ga l s oa c c u m u l a t e da si n c l u s i o nb o d i e si nt h e c y t o p l a s m i c o fec e l l t h e a p p a r e n t m o l e c u l a rw e i g h to fg z l 一s p aw a s3 1 k d a c c o r d i n g t os d s p a g e w e s t e r n b l o t t i n gs h o w e d t h a tt h er e c o m b i n a n tp r o t e i nc o u l d i n t e r a c ts p e c i f i c a l l yw i t ht h em o n o c l o n a ia n t i b o d yo f u r o k i n a s e t a k i n ga d v a n t a g eo f 6xh i st a g t h ed e n a t u r e dp r o t e i nw a si m m o b i l i z e d u s i n gn i c k e l - c h e l a t i n ga f f i n i t y v 垩望瑟避堂壁壅窒堡塑翌蹩墨壅垄 c h r o m a t o g r a p h y , a n dp u r i f i e da n dr c f o l d e di nas i n g l es t e p a f t e rr e n a t u r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n ，t h er e c o m b i n a n tg z l 一s p ah a daf i b r i n o l y a ca c t i v i t yt h r o u g ha c t i v a t i n g p l a s m i n o g e no nf i b r i np l a t e f u r t h e r m o r e ，i ts h o w e ds t r o n ga n t i - p l a t e l e ta g g r e g a t i o n a c t i v i t yi nt h ea s s a yo fp r p a g g r e g a t i o n t a k e nt o g e t h e r , t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t g z l - s p aw h i c hh a st h r o m b o l y t i ca n da n t i t h r o m b o t i ca c t i v i t i e s ，a s e x p e c t e d i sa p r o m i s i n gt h r o m b o l y t i ca g e n t m o r e nv i t r oa n d 跏v i v oe x p e r i m e n t sa l en e e d e dt o e l u c i d a t et h e f i b f i n o l y t i cp o t e n c y a n dc h a r a c t e r i s t i c so ft h i s n o v e l p l a m i n o g e n a c t i v a t o r k e y w o r d s ：t h em u t a n to f p r o - u r o k i n a s e ；i n c l u s i o nb o d y ；f u s i o ne x p r e s s i o n ； p u r i f i c a t i o n ；t h r o m b o l y t i ca c t i v i t y ；a n t i t h r o m b o t i ca c t i v i t i e s v 1 重组尿激酶原突变体的构建与表达 a m p a o x l a c r a r g o2 - a p b i s b m e b p c d n a c h o c a c l 2 d e p c d t t d d h 2 0 d 】盯甲 e c o l i e d t a e b f b g a p h r t g k b k d m l n n c o d 缩略语 a m p i c i u i n 氨苄青霉素 a l c o h o lo x i d a s e乙醇氧化酶 a c r y l a m i d e 丙烯酰胺 a r g i n i n e 精氨酸 o2 a n t i p l a s m i n o2 一纤溶酶抑制剂 n ，n m e t h y l e n eb i s a c r y l a m i d e n ，n 一亚甲双丙烯酰胺 1 3 m e r c a p t o e t h a n o l b 一巯基乙醇 b a s ep a i r碱基对 c o m p l e m e n t a r y d n a互补d n a c h i n e s eh a m s t e r o v a r y 中国仓鼠卵巢细胞 c a l c i u mc h l o r i d e氯化钙 d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r双蒸水 d e o x y r i b o n u c l e i ct r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 e s c h e r i c h i ac o l i大肠杆菌 d i s o d i u me t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t a t e乙二胺四乙酸钠 e t h i d i u mb r o m i d e溴化乙锭 肋r i i l纤维蛋白 g l y e e r a l d e h y d e h y d e - 3 一p h o s p h a t e 甘油醛一3 - 磷酸 h o u r小时 l i s o p r o p h y lt h i o - 1 3 d g a l a c t o s i d e 异丙基代一b d 半乳糖苷 k i l o b a s e千碱基对 k i l o d a i t o n千道尔顿 m i n u t e分钟 n i t r o c e l l u l o s em e m b r a n e硝酸纤维素膜 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 重缀艨激酶原突变体酌掬建与表这 p r o u k 秘蛙 p c r p e g p b s p r p p l p l g p a r p m r n a s e a s s d s s d s - 魏懒e s k s c u p a t e m 嚣蛰 t 奴 t r i s 一 i a u p a u l | a r u k p r o - u r o k i n a s e 尿激酶原 p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r 绎添薅藤激溪赛l 穆翱蓑 p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚己二醇 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e磷酸簸缓渖滚 p l a t e l e tr i c hp l a s m a 富禽血小板血浆 p l a s m i n纤溶酶 p t a s m i n o g e n纾洛薅覆 p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r纤潞酶原激活剂 r e v o l u t i o np e rm i n u t e 每分钟转速 r n a e n z y m e a孩糖孩酸酶a s e c o n d秒 s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s d s - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s聚涎烯酝藏凝黢魄泳 s t r e p t o k i n a s e 链激酶 s i n g l ec h a i n u r o k i n a s e p l a s m i n o g e na c t i v a t o r 单链尿激酶型纤溶酶原激活裁 n , n , n n - t e t r a m e t h y l e t h t l e n e d i a m i n en ，n ，n n - 霞甲基荔二胺 t h i o r e d o x i n硫瓤还蛋白 t r i s - h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e三羧( 甲基) 氨旗甲烷 t i s s u e - t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r缓缓穗纤溶酶原激活剂 u r o k i n a s e t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r尿激酶型纤溶酶原激活剂 u r o k i n a s ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r r e c e p t o r 尿激酶型纾溶酶原激活因子受体 u r o k i n a s e 袋激酶 l 重组屎激酶原突变体的构建与表达 刖吾 l 、研究目的 心肌梗塞，脑栓塞及其他血栓病是严重危害人类生命健康的常见病，血栓性 疾病不仅发病率高，而且死亡率与致残率亦高，其中最重要的、且发病率居首位 的有心、脑血管性血栓性栓塞，深静脉血栓形成及其肺栓塞的并发症，外周动脉 闭塞等四大类。据统计，目前全世界约有1 5 0 0 万病人深受其害( 马大龙，2 0 0 0 ) 。 而在我国，1 9 9 8 年，心血管病患者在城市人群为2 4 4 3 1 0 万，在农村人群为 1 9 3 1 1 0 万，均列为第一位死因，并且在2 1 世纪有大幅度上升趋势( 国家“九 五”科技攻关课题协作组，2 0 0 1 ) 。目前对心血管疾病常用的治疗方法是溶栓疗 法( t h eg u s t oi n v e s t i g a t o r , 1 9 9 3 ) ，尽管已有多种溶栓药物用于临床，但治疗过 程中仍然存在不尽人意的地方，如使用后再次栓塞、出血倾向严重等等( c o l l e n ， 1 9 9 7 ) ，因此，研制高效、特异、副作用小的新型溶栓剂十分必要。 因此，本文通过基因工程的方法对溶栓剂天然的尿激酶原进行了结构上 的改造，在大肠杆菌和酵母中尝试表达改构后的突变体，并对其活性进行了初步 的研究，这些结果将为发展新型溶栓剂提供参考数据和新的思路，对严重困扰人 类的心血管疾病的治疗具有重大的意义。 2 、血栓病简介及溶栓疗法 2 1 血栓病简介 血栓类疾病是一组因各种原因致使血液在血管内或心脏中，流动的液体变为 凝固的固体，致使血流发生不同程度的受阻后所形成的综合病征。从大量临床资 料来看，几乎临床各科都有许多疾病与血栓栓塞有关，不仅内、外、妇产科和小 儿科，就是五官科如视网膜血管阻塞与突发性耳聋等，也都证实与血栓栓塞有关。 早在1 8 5 6 年，病理学家v i r c h o w 就指出，血栓形成的基本因素有血管壁的 改变、血流变化和血液性质的改变。在不同的部位上由于这三个因素不同，因而 形成结构上不同的血栓。血栓为非均质性结构，其主要构成物质为血小板、白细 胞、红细胞和纤维蛋白。按血栓的性质与组成可将其分成六类：血小板血栓、白 重组尿激酶原突变体的构建与表达 色血栓、红色血栓、混合血栓、微血栓和感染性血栓。 仅以s sd , 板聚集组成的血小板血栓可见于某些微血管血栓，而多数血小板栓 子伴有纤维蛋白形成而构成白色血栓。白色血栓常见于动脉硬化斑块，动脉性病 灶与心瓣膜病变处。 红细胞血栓主要由纤维蛋白与红细胞组成，局部血液停滞是其发生的主要条 件。故红色血栓多发生在静脉。 混合血栓最为常见，它可出现在动脉、静脉或心脏各个部位，形状大小不一。 大多数是以内皮损坏为基础，首先形成白色血栓，当血栓突入血管腔内使血流改 变并激活了凝血因子后，则使纤维蛋白网形成，并网罗红细胞、白细胞与血小板， 从而构成混合血栓。 微血栓出现于全身凝血功能亢进的情况下，微血栓主要由紧密的纤维蛋白束 组成，其中仅夹有微量的血小板。微血栓多分布于微血管中，特别是毛细血管。 感染性血栓亦以内皮损伤为基础，早期除有白色血栓形成外，血栓中可有白 细胞和细菌的猬集。 血栓形成的过程是多因素发挥作用的过程，主要有以下几个方面： 1 1 血管壁的改变在血栓形成过程中起着极为重要的作用，血管壁的改变与 血管内皮的损伤有关。血管壁的内皮具有抗血栓形成的功能，如各种原因( 动脉 粥样硬化、免疫性血管炎、吸烟等) 使其受损，内皮下胶原纤维的暴露，致使血 小板与凝血因子活化，从而促进血栓形成： 血流变化也是血栓形成的重要原因，主要包括血粘度升高，血流方式异 常； 3 1 血液成分的改变是血栓形成的又一重要原因。血液性质变化包括：白细 胞、凝血因子升高：g r id , 板数量过多与功能亢进；抗凝蛋白含量与活性、抗纤溶 系统的活性降低等( 宋继谒，1 9 9 9 ) 。 2 2 凝血系统与纤溶系统 血液中包含着对立统一的两个系统：凝血系统和纤溶系统。这两个系统的相 互制约，既保证血液在血管中畅通无阻，又保证一旦血管壁破损能及时堵漏a 凝 血和纤溶系统是调节血管内血栓形成的过程的重要因素。生理状态下，机体内保 2 重缝霖激酶簸突变体熬构建每袭选 持着凝血与纤溶系统的动态平衡，以保证纤维蛋白的及时形成和及时清除。若遮 平衡遭到破坏，血管内凝皿倾向增强娥纤溶活性降低，使纤维徽自积累，则可 簿致盘管蠢纛裣形成。 血液凝嘲简称凝血，怒m 液由液体状态转变为凝胶状态的过稷。血液的凝圈 作用过程是系列复杂的生物纯学过稷。这一过程的主要环节有二：一是血浆中 瓣凝盘酶蒙受弱盘浆帮盎小叛中一些鬻予静激活丽形成凝盘酶( t h r o m b i n ) ：二二 是血浆中的w 溶性的纤维殛白原( f i b r i n o g e n ) 在凝肌酶的激活下转变为不溶憔 纾维蛋白( f i b r i n ，f b ) 网状结构，使血波凝固。如果形成豹纤维戳自没有及时技 降解，袄累谯盘管中就会健发盘栓形成。 凝血是一个非常复杂的过程。1 9 6 4 年，m a e f a r l a n e 和d a v i e 镣分别同时提出 凝盘盼瀑布学说。随后，逐渐形成了凝呶理论的传统勰点，认为墩液凝固过程怒 出内源性途径、外源性途辍和共嚣途经鳃成，通过多耱酶原被檑甄激活两褥至l 蕊 强和放大的一种连锁反应( d a v i e ，1 9 6 4 ) 。其中，内源性途径是主爱的，外源性谂 径只起辅助佟髑。两条凝赢途径豹主裘区别在于启动方式及参加的凝盘困予不 闲，结采形成掰条不同静困子x 激滔邋路。僵是蠢外源性凝盘系统并菲截然分 开，而是相甄联系以致可以互相促进( 江钟，1 9 9 7 ) 。现在已经确定的凝血因子 肖1 3 个，包括出国际凝威黝子命名委员会予6 0 年代初主要根据发现的先后顺膨 分剐以罗马数字命名的凝瓶因子1 1 个。现将凝盎遗程的模式圈捌予瑟1 。 凝血系娩具有保护机体的作用，但是，当凝血功能失调的时假，却有凝血形 成盘栓堵塞敷管麴危验，蘑以盘液中还缮缝着另一个系统，即纤维撩臼溶解系统。 它的作用燕使纤维蛋鑫溶熊，这种与凝窳相反的过裰辩于保持盎液豹流动性其肖 麓要意义( c o l l e n ，1 9 8 0 ) 。 纤维蛋巍溶解系统( 麓稼纾溶系统) 一方面与巍波凝星系统菸耀按调，使髂 内血凝块或斑栓溶解，维持盘循环酶畅通；另一方谣可使局部炎穗灶得到清除， 促进伤口愈食，使腺体、导管内的纤维鬣白块及时溶解，以保诚备管道的畅通。 纤溶系统是蛋白东熬瓣系统，趣捻艇浆绥溶酶缀( p l a s m i n o g e n , p i 9 5 、纾溶 酶( p l a s m i n ，p l ) 和在降解纤维蛋白过穗中的激活物( p l a s m i n o g e na c t i v a t o r , p a ) 主要是腺激酶型纤溶酶原激活剂( u r o k i n a s e - t y p ep l a s m i n o g e n ，u p a ) 和组织 型纾溶酶原激活刹( t i s s u e t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r , t - p a ) ，以及绥溶酶搀割携， 3 重组稼激酶原突变俸的摘建与表达 如抗纤溶酶( a 2 a n t i p l a s m i n ，oy a p ) 、纤溶酶原激活剂抑制物( p l a s m i n o g e n a c t i v a t o ri n h i b i t o r , p a d 等等，绎溶系统静主要缀蔽成分确予浚2 。 f p a ，f p b 圈l 凝斑过程示意隧( 擒基_ 瞧栓勰学，李家增等，1 9 9 8 ) r v ( a ) - x l i ! ( a ) ：话纯静凝巍鳓予v x l i hf i i ：凝血酶骧；f l l a ：凝盘酶；f g ：纤维蛋白燕；p 魁：纤维蛋 白单体；躺；交联的纤维龋囱；f p a ( b ) ；纤维蛋白肽a ( b ) # h m w k , 高分子最激肽原；p l ：磷脂；a t - l l h 抗凝斑酶1 1 13c i i n i - i ；c 1 抑制糖；t f pi ：组织因子途襁挪剖钫；一口一：对该反应的抑制。 表2 纤溶系统的主要组成成分( 摘自觚栓病学，李家增等，1 9 9 8 ) l 戎分分子囊氮基酸鼗产生帮整主要毪矮 盘装浓度( u g l ) 纤溶酶原 9 2 k d 7 9 1 ( 7 9 0 ) 肝或内皮细胞纤溶酶2 0 0 t - p a6 8 k d 5 3 0 ( 5 2 7 )舭管内皮细胞纤溶酶原激活剂 o 0 0 5 u - p a5 4 固t4 1 1泌暴上皮绥戆等纾溶酶骧激活裁e 。漱 o2 - a p 7 0 叠口d4 5 2肝抑制纤溶酶7 0 e a l - l5 2 k d3 9 7戚管内皮细胞抑制纤溶激活剂o 0 0 2 拜链_ 24 7 6 03 9 3麓鑫羁p a i - 1 o 5 4 粤# 、 重组尿激酶原突变体的构建与表达 纤溶酶是纤溶系统的中心成分，它由纤溶酶原转变而来。纤溶酶原是由7 9 1 个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，主要产生于肝脏和内皮细胞，其分子量为 9 2 0 0 0 ，2 4 对二硫键，属于丝氨酸蛋白酶家族，它的激活剂通过切开a r 9 5 6 0 _ v a l 5 6 1 间肽链使其转变为纤溶酶( 双链形式，双链由一对二硫键连接) ，后者可直接降 解纤维蛋白。其n h 2 端的a 链含5 个k r i n g l e 区，介导纤溶酶与纤维蛋白及2 抗纤溶酶的非共价结合。c o o h 端的b 链是酶活性部位。天然的纤溶酶n h 2 端 氨基酸为g l u ，但由于自我催化，n h 2 端的7 6 个氨基酸残基很易被切掉，使其 转变为更易被活化的l y s p l a s m i n o g e n ( 刘士辉，1 9 9 4 ) 。 体内存在着两种生理性的纤溶酶原激活剂：组织型纤溶酶原激活剂( t p a ) 和尿激酶型纤溶酶原激活剂( u p a ) ，两者都属于丝氨酸蛋白酶家族成员。 此外，纤溶系统还包括一些激活剂的抑制物，以及灭活纤溶酶的成分，对纤 溶系统的激活起调节作用。这些抑制物不但其氨基酸排列相互间很类似，而且它 们的生化特性亦相互接近，所以人们将它们归为一类，称为s e r p i n s ( s e r i n e p r o t e a s ei n h i b i t o r s ) 。 纤溶系统的主要组成成分的相互作用如图3 所示。 l x l a l u k t + 卜一+ r m + | 一仨 p l g + p l _ 一 i as a t 1 胤t p a 、 + 二心+ 上l a t i i i i 。 觥鼬原下辨鼬一聊 外激活途径 凝血酶 图3 纤溶系统的组成及其相互关系( 摘自纤溶系统与冠心病，徐琳等，1 9 9 6 ) + ：激活作用；u k ：尿激酶； r t p a ：彭l t 组织型纤溶酶原激活剂； f g d p t 纤维蛋白原降解产物： 一，抑制作用：d ，a t ：n1 抗胰蛋白酶； t p a ：组织型纤溶酶原激活剂；f d p ：纤维蛋白降解产 x i a ：活化的x i 凝血因子；a t i i ：抗凝血酶h ha 幽f g ：o 。巨球蛋白 5 重组尿激酶原突变体的构建与表达 2 3 溶栓疗法及溶栓剂的开发现状 溶栓疗法是一种通过对纤溶系统的激活，使已形成的血栓溶解的治疗方法。 纤溶系统激活的基本过程是纤溶酶原在激活剂的作用下转变为纤溶酶，后者催化 血栓中的主要基质纤维蛋白水解，达到溶解血栓实现血管再通的目的( 王振 义，1 9 9 4 ) 。 近年来溶栓药物和溶栓疗法发展很快并取得了丰硕的成果。从六十年代溶栓 剂开始作为药物上市使用到现在，溶栓剂的开发基本分为三代。 2 3 1 第一代溶栓剂 包括链激酶( s k ) 和尿激酶( u p a ，也称为u k ) ，也是我国临床应用最多 的药物。 ( 1 ) 链激酶( s t r e p t o k i n a s e ，s k ) 链激酶是从b 溶血性链球菌培养液中分离提取出的一种非酶糖蛋白。s k 本 身无酶活性，它不直接激活纤溶酶原，而是先以1 ：1 的分子比与纤溶酶原形成复 合物，此复合物使纤溶酶原构象发生变化，成为有活性的复合物再催化纤溶酶原 转变为纤溶酶，而使血栓溶解，但由于是细菌蛋白，所以重复使用会发生过敏反 应，重则导致病人死亡( 黄炳辉等，1 9 9 9 ) 。 ( 2 ) 尿激酶( u r o k i n a s e ，u p a ) 尿激酶是从人胚肾细胞培养液或新鲜尿液中提取的溶栓药，可直接激活纤溶 酶原，与s k 相比，u p a 的优点是不具抗原性。它们虽然具有较好的溶栓效果， 但缺乏纤维蛋白选择性，除了能激活血栓表面的纤溶酶原外，也能结合血浆中游 离的纤溶酶原，使抗纤溶酶大量消耗及纤维蛋白原降解，产生全身性出血的副作 用。此外，u p a 从尿液中提取，而尿液有艾滋病毒、肝炎病毒等污染的可能， 美国早已禁止用尿液为原料做药物制剂( 马大龙，2 0 0 0 ) 。 2 3 2 第二代溶栓剂 组织型纤溶酶原激活荆( t - p a ) 、尿激酶原( p r o u k ) 和对- 甲氧苯甲酚纤溶 6 重组尿激酶原突变体的构建与表达 酶原链激酶激活剂复合物( a c y l a t e dp l a s m i n o g e n s t r e p t o k i n a s e a c t i v a t o r c o m p l e x ， a p s a c ) 属于第二代的溶栓药物。 ( 1 ) 组织型纤溶酶原激活齐l j ( t i s s u e - t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r , t - p a ) t p ：a 和p r o u k 都是内源性的纤溶酶原激活剂，在体外和动物实验中，它们 都有明显的纤维蛋白亲和性，并在一定程度上能抵抗a2 抗纤溶酶的抑制作用， 出血副作用小。但是t - p a 用于溶栓治疗有一定的局限性，它进入血液后容易被 p a l 失活，或者和受体结合，所以它的半衰期仅4 6 分钟，治疗剂量高达 1 0 0 1 5 0 m g ，导致出现颅内出血的几率比s k 要高( m a r c ，2 0 0 0 ) ，而且治疗后容 易发生再栓塞，和s k 的再通率差不多( h o a n g ，1 9 9 2 ) 。 ( 2 ) 尿激酶原( p r o u r o k i n a s e ，p r o u k ) p r o u k 为双链u p a 的前身物质。纤溶酶原与p r o u k 结合后被激活成纤溶 酶，选择性地诱导了血栓部位的纤维蛋白溶解。因此，p r o u k 和t p a 一样， 也是一种纤维蛋白特异性的纤溶酶原激活剂。p r o u k 试用于急性心肌梗死的溶 栓治疗，但溶栓的效果较慢，也会造成出血意外。这可能是由于p r o u k 在纤溶 酶的作用下转变成双链u p a ，失去了对纤维蛋白的特异性( c o l l e n ，1 9 9 9 ) 。 ( 3 ) 甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶复合物( a n i s o y l a t e dp l a s m i n o g e ns t r e p t o k i n a s c a c t i v a t o rc o m p l e x ，a p s a c ) a p s a c 是s k 的换代产品，是在纤溶酶原与s k 复合物的活性中心丝氨酸 上引入可逆的甲苯甲酰基，暂时封闭活性中心，但不影响与纤维蛋白的结合。 a p s a c 在体外没有溶栓活性，进入血液后，能与纤维蛋白结合，形成有活性的 s k - 纤溶酶原复合物，激活纤溶酶原。a p s a c 给药时问短，只需2 巧分钟，半 衰期长，为1 0 5 分钟，并具有与纤维蛋白结合的能力，近年来也很受关注，但缺 点是它为人体异源蛋白，有抗原性，会引起药物抗性，发烧和过敏反应，不能在 短期内反复使用( v e r s t r a e t e ，2 0 0 0 ) 。 7 重组尿激酶原突变体的构建与表达 2 3 3 第三代溶栓剂 包括s t a r 、r t - p a 、k 1 k 2 p u 、k 2 p u 和t n k - p a 等以及正在研制的新型溶 栓剂。其中的重组组织型纤溶酶原激活剂( r t p a ) ，造价昂贵，但在再灌注上成 功率高，与s k 、a p s a c 、u k 相比，具有更强的溶栓能力，副作用也减少了， 从而成为溶栓治疗中的“金”标准( h u b e r , 2 0 0 0 ) 。总的说来，第三代溶栓剂基 本具备阻下特点：溶栓能力强，出血副作用小，在血液中的半衰期长，总使用剂 量小等。 第一代溶栓分子缺乏血栓特异性，所以具有自身难以克服的缺陷如出血副作 用大等。第二代溶栓剂具有一定的血栓特异性，能高效溶解血栓，但一样会引起 全身纤溶系统亢进，导致严重的出血反应( b e l l ，2 0 0 2 ) 。这些限制了第一代及第 二代溶栓剂在临床上的应用。因此，目前，国际上正在致力于用蛋白质工程研制 高效、快速，防止再栓塞及减低出血等不良反应的第三代新型抗凝溶栓药物。研 究方向是在增强或保持其催化活性的前提下，通过对某些特定氨基酸残基的突变 或是通过相关结构域的删除、增加或融合相关的导向基因等手段，达到以下目标： 1 提高对纤维蛋白的选择性；2 提高对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗性；3 延长其 在血液循环中的半衰期；4 具有导向溶栓性能；5 抗血栓形成。 3 、尿激酶原的结构和功能研究概况 尿激酶原( p r o u k ，也称为s c o p a ) 作为尿激酶巾k ，也称为u p a ) 的前体形 式，是近年来新发现的一种溶栓药物，其溶栓效果和尿激酶相似，但能选择性地 在纤维蛋白表面活化纤溶酶原，使之成为纤溶酶，溶解血栓，因而引起全身出血 倾向的副作用要比尿激酶小，在血栓病的治疗中具有广泛的应用前景。 1 9 7 3 年b e m i k 首先在组织培养液中发现尿激酶原( b e r i n k ，1 9 7 3 ) 。1 9 8 1 年 w u n 等证明它是尿激酶的前体0 r u n ，1 9 8 2 ) ，所以称它为尿激酶原( p r o u r o k i n a s e ， p r o - u k ) 。1 9 8 5 年国际血栓形成和止血委员会正式称该酶为单链尿激酶型纤溶酶 原激活剂( s i n g l e - c h a i nu r o k i n a s e - t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r , s c b p a ) 。 尿激酶原属于丝氨酸蛋白酶家族，是一种纤溶酶原激活剂，由肾小管上皮细 胞产生并被分泌到尿中( v a n e t a l ，1 9 8 8 ) 。由4 1 1 个氨基酸残基组成的糖蛋白。 m r 5 4 0 0 0 ( s t u m p ，1 9 8 6 ) ，属碱性蛋白，p 1 8 9 ( 史伟等，1 9 9 0 ) ，含2 4 个c y s ， 8 重组尿激酶原突变体的构建与表达 1 2 对二硫键。在a s n 3 0 2 处发生糖基化( 孙天宵等，1 9 9 6 ) 。 图4 尿激酶原的分子结构示意图( 摘自生物技术药物，马大龙等，2 0 0 0 ) 尿激酶原的编码基因位于第1 0 号染色体的长臂，全长6 4 k b ，有1 1 个外显 子( r a j p u t e t a l 1 9 8 5 ) 。1 9 8 5 年美国g e n e t e c h 公司的h o l m e s 博士率先发表了尿 激酶原的全长c d n a 序列( h o l m e s ，1 9 8 5 ) ，此后又有一些公司及大学的实验室 报道了各自克隆的尿激酶原的c d n a 和基因组基因( c h e n g e t a l ，1 9 8 8 ；r i c c i o e t a 1 ，1 9 8 5 ) 。日本的k a s f is 等人首次对它进行了氨基酸的测序，得到了全长的氨 基酸序列( k a s a ie ta 1 ，1 9 8 5 ) 。p r o u k 的前体分子含有2 0 个氨基酸的疏水信号 肽。p r o u k 分子可分为3 个蛋白结构域( h o l m e s ，1 9 8 5 ) ：表皮生长因子区( e 区) ，由第5 4 9 位氨基酸组成，富含半胱氨酸，c y s l l 和c y s l 9 ，c y s l 3 和c y s 3 1 ， c y s 3 3 和c y s 4 2 组成三对二硫键；k r i n g l e 区，由5 0 1 3 6 位氨基酸组成，也含有 三对二硫键，该区和t - p a 的k 2 区高度同源；蛋白酶区，1 5 9 - 4 1 1 位氮基酸，h i s 2 0 4 ， a s p 2 5 5 ，s e r 3 5 6 为活性中心。尿激酶原的分子结构如图4 所示。 p r o u k 的分子中存在4 个酶切位点：1 ) l y s l 5 8 - n e l 5 9 问肽键，可被纤溶酶、 胰蛋白酶及因子x l i a 水解，从p r o u k 转为双链u p a ，同时去除了l y s l 5 8 ，a 链由1 5 7 个氨基酸组成，b 链由2 6 3 个氨基酸组成，两链由c y s l 4 8 一c y s 2 7 9 共价 9 重组尿激酶原突变体的构建与表达 连接( l i j n e n e l a l ，1 9 8 8 ) ；2 ) a r 9 1 5 6 一p h e l 5 7 间肽键，可被凝血酶水解，产生无 活性的尿激酶，也不能被纤溶酶激活了( i c h i n o s e ，1 9 8 6 ) ：3 ) l y s l 3 5 一l y s l 3 6 问 肽键，双链u p a 可被纤溶酶、胰蛋白酶继续水解除去1 3 5 个氨基酸，成为低分 子量的双链u p a ；4 ) g l u l 4 3 一l e u l 4 4 间肽键，尿激酶原可被蛋白酶水解为分子 量为3 2 k d 的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂( s o u p a - 3 2 k ) 。它在1 9 8 6 年被比利 时学者s t u m p 等人从肺腺癌细胞株的培养上清中分离出来，其生化特性、溶栓 特性和p r o u k 相似，与双链尿激酶相比，它具有较高的专一性，能选择性溶解 血栓，对血浆中纤维蛋白原的水平影响较小，具有较长的半衰期( s t u m p ，1 9 8 6 ) 。 p r o u k 的主要生理功能可能是与t - p a 和u k 一起，相互协同，使体内凝血 系统和溶血系统保持平衡，它和t - p a 一样，具有特异的溶血栓作用，只作用于 已被纤维蛋白吸附的纤溶酶原( p l a s m i n o g e n ，p i g ) 而不作用于血液循环中游离的 纤溶酶原，因此，p r o u k 溶栓时不易造成全身纤维蛋白原降解和衰竭，避免系 统性出血等副作用发生。 p r o 。u k 在血浆中的半衰期约为3 r a i n ，其体内清除主要是通过肝脏，由特异 的膜受体介导( c o l l e n 1 9 8 4 ) 。q u a xp h 等人通过定点突变验证了尿激酶原的e g f 区对u p a 与u - p a r 特异性结合具有重要作用，特别是a s n 2 2 、a s n 2 7 ，h i s 2 9 ， t r p 3 0 具有不可替代的作用( q u a x ，1 9 9 8 ) 。 p r o u k 本身对纤维蛋白的亲和性很弱，但是和u p a 相比，在体内的溶栓实 验中，s e l l p a 具有特异性的溶栓作用( s t u m p ，1 9 8 6 ) ，其选择性溶解纤维蛋白的 机制目前还没有一致的看法，主要有以下两种解释；( 1 ) 血浆