（生物化学与分子生物学专业论文）聚己内酯的改性及其细胞亲和性研究.pdf

南开大学学位论文版权使用授权鳞 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：竞弓 声g 年岁月埸e l 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在岁年解密后适用 本授权书。 指导教师签名： 抛扛 学位论文作者签名： 鸯侈弓 解密时间： 加f 弓 年r月 ) 7 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 本 研究工 的研究 作品的 体，均 由本人 中文摘要 中文摘要 组织工程学是利用工程学和生命科学的原理及技术，研究和开发具有生物 活性的人工替代物，以维持、恢复或提高人体受损组织的功能的交叉学科。种 子细胞、支架材料和调控因子构成了组织工程三要素。支架材料为细胞的黏附、 生长提供支撑，在组织工程中起着十分重要的作用。可降解聚内酯材料( p c l 、 p l l a 等) 在组织工程研究中得到了广泛的重视，它们具有良好的力学性能， 但其存在疏水性、表面缺乏细胞可识别的位点等缺点，影响了细胞在材料上的 黏附和增殖，限制了其在组织工程中的应用。 本研究以p c l 为基材，开展了以下工作。1 ，以共混的方法用明胶对其进 行改性。以测定材料表面接触角来考察材料表面亲水性的变化、以扫描电镜 ( s e m ) 和表面光电子能谱( x p s ) 来考察材料表面物理形貌和化学组成的变化、 以拉伸力学性能测试和差示扫描量热( d s c ) 分析来考察材料力学和热学性能 的变化、以细胞在材料上的培养来考察细胞亲和性的变化。2 ，采用b r e a t hf i g u r e 和电纺丝两种方法分别制备明胶改性前后的p c l 、p l l a c l 膜材料，以扫描电 镜( s e m ) 来考察制备参数变化对材料表面形貌的影响，以细胞在材料上的培 养来考察细胞亲和性的变化。结果表明：( 1 ) 明胶改性后能提高p c l 材料的亲 水性、表面的粗糙度和细胞亲和性，材料的力学和热学性能并未受到显著影响： ( 2 ) b r e a t hf i g u r e 方法中，材料表面引入多孔结构，孔径随环境湿度增加而增 大、随溶液浓度和环境温度的增加而减小，多孔结构的出现能够提高p c l 材料 的细胞亲和性，多孔结构的明胶改性后的p c l 材料细胞亲和性的提高更显著； ( 3 ) 电纺丝方法中，材料表面引入纤维结构，纤维直径随溶液浓度和流速的增 加而增大、随着加速电压的升高而减小，纤维结构的出现能够提高材料的细胞 亲和性，纤维结构的明胶改性后的材料细胞亲和性的提高更显著。 关键词：组织工程聚己内酯( p c l ) 明胶b r e a t hf i g u r ep l l a c l 电纺丝 a b s t r a c t a b s t r a c t t i s s u ee n g i n e e r i n gi sa ni n t e r d i s c i p l i n a r yf i e l dt h a ta p p l i e st h ep r i n c i p l e so f e n g i n e e r i n ga n dt h el i f e s c i e n c e st o w a r dt h ed e v e l o p m e n to fb i o l o g i c a ls u b s t i t u t e s t h a tr e s t o r e ，m a i n t a i n , o ri m p r o v et i s s u ef u n c t i o n t i s s u ee n g i n e e r i n gi n v o l v e st h r e e k e yf a c t o r s ：s e e dc e i l s 、s c a f f o l d sf o rc e l l sa n dc e l lg r o w t hf a c t o r s t h es c a f f o l dn a y s a ni m p o r t a n tr o l ei nt i s s u ee n g i n e e r i n g i nr e c e n ty e a r s ，m u c ha t t e n t i o nh a sb e e np a i d o nb i o d e g r a d a b l ep o l y ( 1 a c t o n e ) ( p c l ，p l l ae ta 1 ) a st i s s u ee n g i n e e r i n gs c a f f o l d s t h e yh a v eg o o dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，h o w e v e r , c a l la t t a c h m e n ta n dc e l lg r o w t ho n t h i sk i n do fm a t e r i a l sc a nn o tm e e tt h ed e m a n do ft i s s u ee n g i n e e r i n gb e c a u s eo fi t s h y d r o p h o b i c i t y , l a c ko fc e ur e c o g n i t i o ns i t ea n ds oo n t h i ss t u d yi n c l u d e st h r e ep a r t s f i r s t , b i n a r yb l e n d so fp c la n dg e l a t i n , w i t l l d i f f e r e n tc o m p o s i t i o n s ，w e r ep r e p a r e db ys o l u t i o nm i x i n gu s i n gt f ea ss o l v e n t ，t h e c h a n g eo fs u r f a c eh y d r o p h i l i c i t y , s u r f a c em o r p h o l o g y , s u r f a c ec o m p o s i t i o n , t h e t h e r m a lb e h a v i o r sa n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e so fp c l g e l a t i nb l e n df i l m sw e r e i n v e s t i g a t e db yc o n t a c ta n g l e sd e t e r m i n a t i o n , s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) o b s e r v a t i o n , x r a yp h o t o d e c t r o ns p e c t r o s c o p y ( x e s ) a n a l y s i s ，t e n s i l es t r e n g t h d e t e r m i n a t i o na n dd i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) a n a l y s i s ，r e s p e c t i v e l y t h ec e l la f f i n i t yo ft h eb l e n df i l m sw a se v a l u a t e db yc e l lc u l t u r ea n dc o m p a r e dw i t h t h a to fp u r ep c lf i l m s s e c o n d ，t w ot y p e so fd i f f e r e n tp o r o u sf i l m s ，p c lp o r o u s f i l m sa n dp c l g e l a t i np o r o u sf i l m s ，w e r ep r e p a r e db yb r e a t hf i g u r em e t h o d p c l p o r o u sf i l m s 、i mp o r e so nt h es u r f a c ew e r ep r e p a r e db yu s i n gc h c l 3a ss o l v e n t ， w h i l ep c l g e l a t i np o r o u sf i l m sw i m p o r e si n s i d eb yu s i n gt f e a ss o l v e n t a n o t h e r t y p eo ff i l mi sp l l a - c lf i b e rw h i c hw a sp r e p a r e db ye l e c t r o s p i n n i gm e t h o d t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e np r o c e s sp a r a m e t e r sa n dt h es u r f a c em o r p h o l o g yo ff i l m sh a s b e e ni n v e s t i g a t e du s i n gas c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) t h ec e l la f f i n i t yo f f i l m sw a se v a l u a t e db yc e l lc u l t u r e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ：( 1 ) g e l a t i nc o u l di m p r o v et h eh y d r o p h i l i c i t y ，t h e s u r f a c er o u g h n e s sa n dt h ec e l la f f i n i t yo fp c lf i l m s ，w h i l et h et h e r m a lb e h a v i o r sa n d i i a b s t r a c t m e c h a n i c a lp r o p e r t i e so ft h ef i l m sw e l en o tc h a n g e dr e m a r k a b l y ( 2 ) t h ep o r e d i a m e t e ri n c r e a s e d 谢t l li n c r e a s i n ge n v i r o n m e n t a lh u m i d i t y , w h i l ed e c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n gp o l y m e rc o n c e n t r a t i o na n de n v i r o n m e n t a lt e m p e r a t u r e t h ep o r o u sp c l f i l m sc a ni m p r o v et h ec e l la f f i n i t y , a n dt h ep o r o u sp 9 0 g10f i l m sc a nn o t a b l y i m p r o v et h ec e l la f f i n i t y ( 3 ) t h ef i b e rd i a m e t e ri n c r e a s e d 谢n 1i n c r e a s i n gp o l y m e r c o n c e n t r a t i o na n df l o w i n gr a t e ，w h i l ed e c r e a s e d 丽mi n c r e a s i n ge l e e t r o s p i n n i n g v o l t a g e t h ep l l a c l g e l a t i nn a n o 舳e r sc o u l di m p r o v et h ec e l la f f i n i t y k e yw o r d s ：t i s s u ee n g i n e e r i n gp o l y ( e - c a p r o l a c t o n e ) ( p c l ) ，g e l a t i n , b r e a t hf i g u r e ， p o l y ( 1 一l a c t i d e - c o - 一c a p r o l a c t o n e ) ( p l i 。a c d ，e l e c t r o s p i n n i n g i i i 目录 目录 第一章引言1 第一节组织工程与组织工程支架材料1 1 1 1 组织工程原理1 1 1 2 组织工程支架材料2 第二节组织工程与组织工程支架材料7 1 2 1 细胞在材料上的粘附机理8 1 2 2 影响细胞粘附的因素9 1 2 3 材料改性研究1 2 第三节材料的加工制备技术1 3 1 3 1 电纺丝方法1 4 1 3 2b r e a t hf i g u r e ( 水模板) 法2 2 第四节本课题研究内容2 6 第二章明胶改性p c l 膜基质2 8 第一节引言2 8 第二节材料与方法2 8 2 2 1 原料与仪器2 8 2 2 2p c l 与明胶共混膜的制备2 9 2 2 3 表面形貌观察( s 脚) 3 0 2 2 4 表面接触角测试3 0 2 2 5 表面光电子能谱( ) 【p s ) 3 0 2 2 6 差示扫描量热( 9 s c ) 分析3 0 2 2 7 材料拉伸力学性能测试3 1 2 2 8 细胞培养3 l 第三节结果与讨论3 3 2 3 1 明胶改性前后膜材料表面形貌比较3 3 2 3 2 明胶改性前后膜材料表面接触角比较3 3 目录 2 3 3 明胶改性前后膜材料表面光电子能谱( ) 【p s ) 3 4 2 3 4 明胶改性前后膜材料d s c 分析3 7 2 3 5 明胶改性前后膜材料拉伸力学性能测试3 7 2 3 6 细胞黏附3 8 2 3 7 细胞增殖3 9 2 3 8 细胞形态4 0 第四节小结4 2 第三章b r e a t hf ig u r e 方法制备p c l 多孔膜基质材料4 3 第一节引言4 3 第二节材料与方法4 4 3 2 1 主要原料与仪器4 4 3 2 2p c l 多孔膜基质的制备4 4 3 2 3 孔形貌分析4 4 3 2 4 细胞培养4 5 第三节结果与讨论4 5 3 3 1 环境湿度变化对孔形貌的影响4 5 3 3 2 溶液浓度变化对孔形貌的影响4 7 3 3 3 环境温度变化对孔形貌的影响4 8 3 3 4 细胞黏附4 9 3 3 5 细胞增殖5 0 3 3 6 细胞形态5 l 第四节小结5 2 第四章明胶改性p c l 多孔膜基质材料5 4 第一节引言5 4 第二节材料与方法5 4 4 2 1 主要原料与仪器5 4 4 2 2 明胶改性多孔膜基质材料的制备5 5 4 2 3 材料表面形貌观察( s e m ) 5 5 v 目录 4 2 4 材料的溶胀度5 5 4 2 5 细胞培养5 5 第三节结果与讨论5 5 4 3 1 膜材料表面形貌5 6 4 3 2 多孔膜材料溶胀度5 6 4 3 3 细胞黏附5 7 4 3 4 细胞增殖5 8 4 3 5 细胞形态5 9 第四节小结6 0 第五章电纺丝法制备p l l a c l 膜基质材料6 2 第一节引言6 2 第二节材料与方法6 3 5 2 1 主要原料与仪器6 3 5 2 2p l l m l 电纺纤维膜基质的制备6 3 5 2 3 纤维形貌分析6 4 5 。2 。4 细胞培养6 4 第三节结果与讨论6 4 5 3 1 溶液浓度对纤维形貌的影响6 4 5 3 2 溶液流速对纤维形貌的影响6 7 5 3 3 加速电压对纤维形貌的影响6 9 5 3 4 细胞黏附7 2 5 3 5 细胞增殖7 2 5 3 6 细胞形态7 3 第四节小结7 3 第六章明胶改性p l l a - c l 电纺纤维膜基质材料7 5 第一节引言7 5 第二节材料与方法7 5 v l 目录 _ 一 6 2 1 主要原料与仪器7 5 6 2 2 电纺纤维膜的制备7 6 6 2 3 材料表面形貌观察( s e m ) 7 6 6 2 4 拉伸力学性能测试7 6 6 2 5 细胞培养7 7 第三节结果与讨论7 7 6 3 1 纤维膜材料表面形貌7 7 6 3 2 纤维膜材料拉伸力学性能测试7 8 6 3 3 细胞黏附7 9 6 3 4 细胞增殖7 9 6 3 5 细胞形态8 0 第四节小结8 l 全文总结论8 3 参考文献8 5 致谢9 3 个人简历9 4 v i i 第一章前言 第一章前言 第一节组织工程与组织工程支架材料 1 1 1 组织工程原理 w o l t e r 与m e y e r 在1 9 8 4 年首次应用“组织工程”这个词来描述其研究工作【l 】。 1 9 8 7 年春，美国自然科学基金工程理事会在研讨生物工程前景时，确立了组织 工程这一概念。此后美国多次举行专家小组讨论会，以促进多学科的交叉和发 展。目前对组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) 的定义以美国麻省理工学院的l a n g e r 和 哈佛大学医学院的v a c a n t i l 于1 9 9 3 年发表在科学的文章中对组织工程的定 义最具代表性，即：组织工程学是利用工程学和生命科学的原理及技术，研究和 开发具有生物活性的人工替代物，以维持、恢复或提高人体受损组织的功能的 交叉学科【2 】。组织工程的基本原理和方法是将体外扩增的自体或异体细胞种植于 体外构建的细胞外基质模拟物( 支架) 中，形成细胞支架复合物。然后将该复 合物植入受损的组织或器官部位，通过植入细胞的增殖分化和类细胞外基质支 架的降解吸收而形成结构、功能与目标组织或器官相一致的新组织或器官，从 而达到创伤修复和功能重建的目的。 目前临床上常用的组织修复途径大致有3 种：即自体组织移植、异体组织 移植和应用人工代用品。这三种方法都分别存在不足，如免疫排斥反应及供体 不足等。组织工程的发展将从根本上解决组织和器官缺损所致的功能障碍或丧 失治疗的问题。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合 体，这与传统的二维结构( 如细胞培养) 有着本质的区别，其最大优点是可形 成具有生命力的活体组织，对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永 久性替代；用最少的组织细胞通过在体外培养扩增后，进行大块组织缺损的修 复；可按组织器官缺损情况任意塑形，达到完美的形态修复。作为一种新兴产 业，组织工程具有良好的发展前景和广阔的应用市场，其利润非常诱人。所以 一些研究机构与大公司联手进行开发研究，仅1 9 9 7 年直接用于组织工程研发的 费用就达5 亿多美元，并以每年2 2 的速度增长。相信随着科学技术的发展， 组织工程即将或正在成为治疗组织、器官衰竭的有效疗法和辅助手段。 第一章前言 1 1 2 组织工程支架材料 近年来组织工程研究的热点主要集中在：( 1 ) 细胞种植基质材料( 支架材料) ； ( 2 ) 种子细胞；( 3 ) 组织培养中调节细胞增殖，保持表型等特征的生物活性因子。 其中，细胞种植基质支架材料在组织工程化组织或器官中的主要作用包括：( i ) 为细胞的黏附提供物理支撑，并且将细胞准确的投递到受损部位；( 2 ) 为细胞 的增殖、代谢提供空间；( 3 ) 提供特定的宏观与微观结构，引导细胞构建特定 功能的组织或器官；( 4 ) 传递化学或力学信号，调控细胞的表型。鉴于组织工 程的生物支架材料直接与细胞、组织和宿主的生理系统相接触，因此要求其必 须具备一定的物理机械性能、化学稳定性、无毒性和易加工成型等特性。为了 促进细胞的黏附和增殖，材料还应能很好的模拟细胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ) ，e c m 能为细胞提供大量的化学信号，调控细胞功斛3 4 】。 从材料学的角度来看，生物体的组织或器官可被认为是由一定功能的细胞 及其分泌的细胞外基质( e c m ) 所组成的复合材料5 。在组织工程中，人工构建 细胞外基质的模拟物组织工程支架是最为关键的一步。组织工程支架材料由于 直接接触细胞、组织、器官、血液等活体，因此必须满足以下性能要求：( 1 ) 合适的孔尺寸和孔隙率以适应细胞的迁移；( 2 ) 具有良好的生物相容性、细胞 诱导性和细胞传导性，利于细胞粘附及增殖；( 3 ) 充足的表面积和不同的表面 化学性质，以促进细胞的生长和功能分化；( 4 ) 合适的降解速率可以与天然组 织的生长速率相适应；( 5 ) 具有一定力学强度能适应体内微应力环境； ( 6 ) 具有可塑性。可根据需要加工成各种形状；( 7 ) 易于加工、消毒、储存。 其中，生物相容性( b i o c o m p a t i b i l i t y ) 是对支架材料的重要要求。英国著名 的科学家，国际著名学术刊物“b i o m a t e r i a l s ”主编d f w i l l i a r n s 对其作出如下定 义：“t h ea b i l i t yo fam a t e r i a lt op e r f o r mw i t ha l la p p r o p r i a t eh o s tr e s p o n s ei na s p e c i f i ca p p l i c a t i o n 1 6 1 。这个定义包含以下几层意思：首先，材料至少应对宿主 没有负面影响；同样重要的是，具体应用中，材料应能引发或促进那些有益于 宿主的生物学反应，这些生物学反应或与材料所接触的蛋白质有关，或与其所 能影响到的细胞有关，更为通畅的则是与这两者都有关系，而这些生物学反应 与材料的表面性质有着密切的关系。生命的基本单位是细胞，各个细胞及细胞 团之间间隙是细胞外基质( e c m ) ，即细胞生存和发挥作用的微环境。e c m 主 要的成分有胶原白、蛋白多糖、糖胺聚糖、层连蛋白和弹性蛋白等，能为细胞 提供大量的化学信号，影响细胞形态、促进细胞迁移、调节细胞增殖和分化等。 2 第一章前言 为了促进细胞的黏附和增殖，材料应能很好的模拟细胞外基质( e c m ) 。 根据以上特性，具有可生物降解性能的天然或合成高分子材料成为组织工 程支架材料的首选，主要分为以下几类： 1 1 2 1 可降解的天然材料( d e g r a d a b l en a t u r a lm a t e r i a l s ) i r ，j 天然材料是指来源于动物或者人体内天然存在的材料。天然高分子材料是 人类最早使用的医用材料，具有良好的生物相容性。主要包括动物体的细胞外 基质( e c m ) 的主要成份以及其他一些生物体的提取物。天然组织工程材料往 往具有良好的生物安全性和生物相容性。但是，天然生物材料的降解速度一般 都太快，而且机械性能也无法满足组织工程的需要。由于不同生物个体的材料 组成和性能有较大的差异，天然生物材料的质量也难以实现标准化和稳定化。 目前常用于构建组织工程支架的天然材料主要有：胶原( c o l l a g e n ) 、明胶( g e l a t i n ) 、 纤维蛋白( f i b r i n ) 、壳聚糖( c h i t o s a n ) 等哺一。 胶原是细胞外基质( e c m ) 的主要组成成份，在体内以胶原纤维的形式存 在，是人体中含量最丰富的一种结构蛋白，约占机体总蛋白的2 5 。目前己发现 的胶原蛋白类型不少于1 9 种【1 0 】。其中i 型胶原最丰富，且性质优良，因而被广 泛用作生物医用材料。胶原是由三股螺旋多肽链结构组成的，每条链有1 0 5 0 个 氨基酸，由于有规整的螺旋结构，胶原的免疫原性较温和 1 1 1 。天然的肌腱和韧 带就是i 型胶原分子交联的产物。胶原分子在体外可形成较大的有序结构，能 聚合成强度较好的纤维，对胶原分子进行修饰时，可使其发生分子内或分子间 的交联，分子间交联可增加胶原纤维的力学强度，降低胶原对酶降解的敏感性， 延长胶原的降解时间。细胞培养中，多数细胞是贴壁依赖性的，于是细胞生长、 分化、增殖和进行代谢，需要一个结合位点( 氨基酸序列，如r g d 肽段) ，胶 原分子就能够提供这样的结合尉1 2 1 。例如，成纤维细胞在胶原基质上培养时显 示出与体内细胞相似的分化以及同样的细胞形态和代谢能力【1 3 1 ，平滑肌细胞、 上皮细胞在胶原基质上培养时能维持其细胞表型及活力【1 4 1 5 1 ，说明胶原对大多 数细胞来说都可作组织工程支架材料。但是胶原价格昂贵，明胶是胶原不完全 水解的产物，具有和胶原相似的良好的生物相容性等优良特性，而相对于胶原 来说，价格又便宜很多，因此研究中也常引入明胶作为组织工程支架材料【l 引。 第一章前言 图1 1 细胞外基质的成分 f i 9 1 1t h ec o t i 驴s i t i o no fe c m 图1 2 胶原结构示意图( 左模式图，右电镜照片) f i g u r e l 2s t r u c t u r eo fc o l l a g e n 几丁质( c h i t i n ) 又名聚乙酰氨基葡萄糖、甲壳素等，是一种生物合成的线性 氨基多糖，广泛存在于节足动物类( 蜘蛛类、甲壳类) 的翅膀或外壳中。壳聚糖 ( c h i t o s a n ) x 称脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、是由甲壳素经脱乙酰化反应的产 物，以b 1 ，4 糖苷键键和，是众多天然多糖中仅有的具有明显碱性的天然多糖， 侧链带有氨基，氨基的引入有可能使材料在生物p h 值环境下带正电荷，它虽然 不是人体中e c m 的构成物，但其结构和性质与细胞外基质的主要成份氨基葡聚 4 第一章前言 糖非常类似【1 9 1 ，因此壳聚糖在组织工程中受到一定的重视 2 m 2 2 1 。 几丁质 壳聚糖 图1 3 几丁质和壳聚糖的结构式 f i g u r e l 3s c h e m eo f c h i t i na n dc h i t o s a nm o l e c u l a rs t r u c t u r e 透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ) 是一种高度保守的不分支的阴离子多糖类物质， 广泛存在于细胞外基质中，尤其在结缔组织中含量丰富，是氨基葡聚糖的一种。 高纯度的透明质酸免疫原性低、生物相容性好、其降解物对创面愈合具有促进 作用，而且在体内可被血清中的透明质酸酶所降解。 羟基烷酸酯( p o l y h y d r o x ya l k a n o a t e s ) 是可生物降解和生物相容性好的热塑 性聚酯类生物材料【2 3 2 4 ，广泛存在于自然界的许多原核生物中，并可通过细菌 发酵或基因工程获得。随着生长条件的不同，分子量可由一万到几十万。研究 最多的是聚羟基丁酸酯( p h b ) 。 还有一种通过自体组织或异体组织或器官脱去细胞成分而得到脱细胞基质 ( d e - c e l l u l a r i z e dm a t r i x ) 用以构建支架材料，这种脱细胞基质与不同类型的胶 原相混合，在一种中性溶液中处理以除去免疫原性。为增强脱细胞基质材料的 力学强度，还将其与可降解高分子材料相接，用以进行组织工程研究。 第一章前言 1 1 2 2 可降解的合成聚合物( b i o d e g r a d a b l ep o l y m e r ) 合成组织工程用高分子材料可以根据具体组织或器官的特点进行专门设 计，其表面性能以及生物降解速率都可进行调解，且具有良好的力学和加工性 能，因而产品的质量容易标准化，有利于大规模生产。合成组织工程材料的种 类多、选择范围广，是组织工程材料的一个重要来源。合成组织工程材料的最 大缺点是材料表面缺乏细胞可以是别的位点，通常不具备生物活性，而且材料 的降解产物可能存在一定的毒性【2 5 】。 可降解合成材料中，目前研究最多的包括： ( 1 ) 聚乙交酯、聚丙交酯及其共聚物：聚乙交酯( p o l y g l y c o l i c a c i dp g a ) 、 聚丙交酯( p o l y l a e t i c a c i dp l a ) 、两者的共聚物( p g a p l a ) 是合成可降解聚合 物在医药部门应用最广的材料之一。p g a 结晶度高、熔点高、溶解度低，是第 一个全合成的可降解缝合线原料。p l a 有p l d a 、p l l a 、p d l l a3 种异构体，在 体内降解生成糖代谢产物乳酸；p g a 在体内降解为羟基乙酸，参与体内代谢。由 于p g a 的亲水性，植入的纤维在2 - 4 周就失去力学强度，因而人们制得了p g a 、 p l a 的共聚物，可通过改变两者的比例来调控降解时间达数周至数年。因为自然 界存在l 型乳酸，一般应用l 型乳酸与g a 共聚。p g a 、p l l a 、p l g a 的二维结 构已被证明能支持细胞粘附、生长、分化和发挥功能，而且基质的降解不影响成 细胞的形态。但在临床应用过程中发现患者出现非特异性无菌性炎症反应率较 高，约为8 ，目前认为可能与聚合物降解过程中酸性降解产物引起局部p h 值下 降有关【2 6 】。 ( 2 ) 聚己内酯( p c l ) ：p c l 是由己内酯开环聚合所得到的线性脂肪族 聚酯，其结构重复单元上有5 个非极性亚甲基c h 2 一和一个极性酯基 c o o 一，其分子式如图1 4 。p c l 具有良好的力学性能、热稳定性、生物降解 性、药物通过性和生物相容性，其降解产物对人体无毒，目前广泛应用于骨折 固定材料、手术缝线、医用敷料、药物控释和组织工程支架材料等领域【2 7 、2 5 。 o h o + c h 2 c h z c h z c hz c h z c o t h 图i 4 聚己内酯的结构式 f i g u r e l 4s c h e m eo f p c l m o l e c u l a rs t r u c t u r e 6 第一章前言 如上图所示，这样的结构使得p c l 具有很好的柔韧性和加工性。这种结构 特点，使其具有了形状记忆性，具有初始形状的制品，经形变固定后，通过加 热( 它的熔点低，只有6 0 。c ) 等外部条件刺激手段的处理，又可使其恢复初始 形状的现象。并且能够经生物降解，具有良好生物安全性，p c l 已获得美国食 品及药物管理局( f d a ) 的批准。与p g a 和p l a 相比，它的水解或降解速率要慢 得多，因此较适宜做长期植入装置。而且随着它的降解，并不会产生酸性环境。 由于它具有良好的通透性，常由于药物是放载体。 ( 3 ) 聚氨基酸( p o l y ( a m i n oa c i d ) ) 【2 9 1 ，蛋白质是由氨基酸组成，因此，许多 研究者以聚氨基酸作为研究结构、生理和免疫的模型以开发其在生物医学方面 的应用。聚氨基酸作为生物医学材料有以下优点：品种多；支链能够与小肽、 药物或交联剂等连接，制成各种不同性能的产物；由于聚合物降解成氨基酸， 毒性低，因此可作缝合线。但制备氨基酸原料较昂贵且生产时不易操作，使实 际应用受到一定的限制。目前已研制成功的多肽丝绒型人工皮肤就是由聚氨基 酸薄膜与尼龙丝绒复合制成。 如上所述，无论是采用天然材料还是人工合成材料进行组织工程修复重建， 关键问题之一是材料的生物相容性。人们通常利用体外细胞培养技术来评价材 料的生物相容性，因而研究材料的细胞亲和性( c e l la f f i n i t y ) 成为研究的基本内 容。天然高分子材料一般具有良好的细胞亲和性，但由于材料的来源不同，处 理方法不同等造成产品性能难以重现，且此类材料的力学性能常难以符合医学 要求。合成高分子材料( 如p l a 、p l g a 、p c l 等) 虽然可以通过精确调节组成 比，使产品性质的重复性和力学性能达到较高水平，但由于该材料的疏水性、 表面缺乏细胞识别位点等原因，影响了细胞在其表面的黏附生长。因此，可以 通过对单一种高分子材料改性的方法以提高材料的细胞亲和性，以期很好的适 应体内的微环境。 第二节组织工程与组织工程支架材料 生物材料的细胞亲和性与和材料相接触的细胞行为特别是细胞在材料表面 的黏附有着紧密的关系。生物材料的细胞亲和性是指材料能让细胞在其表面粘 附及生长的能力，其中细胞粘附是基础，粘附特性的差异将影响细胞的增殖、分 化等功能。细胞亲和性包括两方面：细胞粘附性与细胞增殖性。细胞在材料上 7 第一章前言 粘附生长是组织工程材料的关键，粘附质量的好坏将会影响此后细胞的增殖与 分化。细胞亲和性好的材料才可以作为组织工程支架材料使用。 1 2 1 细胞在材料上的粘附机理 目标细胞在支架材料上的黏附是组织工程化器官构建的前提。细胞在材料 上的粘附包括两个过程，贴附过程和粘附过程【3 0 】。贴附过程非常迅速，是由细 胞与材料之间的一些物理、化学作用，如范德华力、离子力等所引起的。粘附 过程是由材料与一些生物活性分子如细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白等相互作用 而引起，因此粘附期较长。细胞必须与材料发生适当的粘附，才能在材料上进 行铺展生长，乃至分化、增殖。细胞与材料之间的粘附作用是通过细胞膜上的 受体( r e c e p t o r s ) 来调节的，这些受体能特异性地识别材料表面的粘附分子【3 l j 一 些细胞外基质蛋白如纤维粘连蛋白( f i b r o n e c t i n ，f n ) 、玻璃粘连蛋白 ( v i t r o n e c t i n v n ) 、层粘连蛋白( l a m i n i n ，l n ) 等能够被细胞膜上的受体特异性 地识别，当一些生物材料在培养液或体液中能够吸附这类蛋白时，细胞就可以 以这类蛋白为介导，粘附于材料表面，进行生长、分化、迁移、增殖。荷兰学 者r o l fb o s 在一篇综述中，论述了细胞在材料表面的粘附机理，他认为当细胞 和基质材料在水溶液环境条件中，发生如图1 5 所示的粘附过程：( a b ) 基质材 料吸附有机分子的速度快于吸附细胞的速度，因而会在其表面首先吸附一层有 机分子，形成一层所谓的“条件膜”；( c d ) 接着细胞通过布朗运动、重力、扩 散、对流、范德华力、静电力等作用在条件膜上贴附形成所谓的“生物膜”，( e f ) 贴附细胞再在材料表面进行铺展生长。 第一章前言 图1 5 生物膜形成步骤示意图 f i g u r e1 5s c h e m a t i cs e q u e n t i a lo ft h ei n i t i a ls t e p si nb i o f i l mf o r m a t i o n 实际上细胞与材料之间的作用非常复杂，因此确切的粘附机理目前仍不十 分清楚。从上述论述可以看出，通常认为细胞在材料上的黏附机理是由吸附在 材料表面上的一些黏附分子如细胞外基质蛋白所调节，什么样的材料表面性质 有利于吸附这类物质从而促进细胞在材料表面的黏附，成为材料研究者们关心 的问题。 1 2 2 影响细胞粘附的因素 1 2 2 1 从生物学观点分析 细胞与材料黏附能力的大小与细胞和材料表面的理化性质有关。由二者表 面物理性质所决定的黏附作用称为非特异性黏附：如果细胞黏附涉及二者表面 分子之间的特异相互作用，则称为特异黏附。细胞与材料的黏附不仅是细胞表 面性质的一种表现，而且是细胞内部结构与功能变化密切相关的过程。 细胞对材料的粘附与细胞膜的组成和性能有很大的关系。细胞膜是由蛋白 质、脂类、少量的糖及核酸组成。细胞膜外被覆的是具有分支的亲水性寡糖链， 因而细胞膜具有一定的亲水性，又由于此寡糖链分支末端是带有负电荷的岩藻 糖和唾液酸，故哺乳动物细胞膜一般带负电荷，糖链与细胞识别、细胞免疫、 9 第一章前言 细胞生长调节及细胞增殖抑制等有关，这也是细胞生长需要支架的原因。 一般说来，细胞的代谢状态、细胞与材料的接触时间、细胞的亲疏水性、 细胞的表面电荷、细胞膜分子的侧向运动、细胞膜的柔韧性等可影响细胞在材 料表面的粘附。 1 2 2 2 从材料观点分析 1 2 2 2 1 材料表面的亲疏水性与表面自由能( h y d r o p h i l i c i t y h y d r o p h o b i e i t y a n ds u r f a c ee n e r g y ) 目前对这一影响的研究比较广泛，比较一致的观点认为亲水性材料比疏水 性材料具有更好的细胞亲和性。其原因是疏水表面蛋白黏附的较为牢固，不易 脱落，易导致蛋白的构象变化；而亲水表面对蛋白质的黏附强度较低，有利于 蛋白质的构象调整。这样，当细胞作用于蛋白质时，细胞与蛋白质分子的相互 作用可以使黏附蛋白采取更为有利的空间结构【3 1 。而细胞膜具有一定的亲水性， 材料亲水性太强不利于蛋白吸附，具有适度亲水性的表面最有利于细胞的黏附 和铺展，而亲水性太强反而不利于细胞的黏附和铺展【3 2 】。 与亲疏水性相对应，高表面能的材料表面更有利于细胞的粘附与铺展【3 3 1 ， 即随着表面能的增高，细胞黏附数目、细胞增殖能力有增大的趋势。低表面能 材料与活体组织之间大部分处于分离状态，表面黏附的细胞呈现球形或近球形， 粘附作用极弱。而高表面能材料的表面则可被活体细胞完全覆盖，并呈现出扁 平、拉长的形态粘附作用很强。对于某种特定的细胞同样要求在最佳表面能状 态下，生长情况才比较好。 1 2 2 2 2 材料的表面荷电特性( s u r f a c ec h a r