（生物化学与分子生物学专业论文）青稞中β13葡聚糖酶分离纯化及性质研究.pdf

青稞中b 一1 , 3 一葡聚糖酶分离纯化及性质研究 生物化学及分子生物学专业 研究生丁平指导老师杜林方 8 1 ，3 一葡聚糖酶【e c 3 2 1 3 9 存在于大多数高等植物中，并由一个小基因家 族编码，在植物不同的生理活动中起着重要的作用。如细胞分裂、小孢子发生、 花粉的形成、受精作用和胚的发生，并参与了植物对损伤，低温、臭氧和u vb 等做出的生理反应，而且是植物种子发芽和防御反应中的关键物质。青稞是我 国青海、西藏特有的高原作物，研究发现青稞种子中含有较高的b 1 ，3 葡聚糖 酶，但是未有从青稞中提纯0 - 1 ，3 - 葡聚糖酶的文献报道。本文运用硫酸铵沉淀、 d e a e a 2 5 和c m c e l l o s e 离子交换柱层析、s e p h a r y l s 3 0 0 h r 的f p l c ，从青 稞发芽种子的胚中提纯得到一种b 1 ，3 - 葡聚糖酶，分析了此酶的等电点、最佳 反应温度和最佳反应p h ，运用非变性凝胶电泳胶板直接活性染色方法对酶进行 了快速鉴定，测定了近紫外和远紫外圆二色光谱，并计算出酶二级结构和三级 结构，并结合酶活测定和内源荧光光谱分析，考察了金属离子对酶的影响，并 对酶热稳定性和荧光发射光谱变化进行研究。 结果表明：采用上述方法，可以从3 8 克发芽青稞种子胚中提纯得到0 9 8 毫克的b 1 ，3 葡聚糖酶，此酶可以特异水解海带多糖。在非变性p a g e 银染时 只出现一条带。活性染色也在同一位置出现了唯一条亮红色的活性带。 s d s p a g e 表明纯化酶的分子量为3 1k d a ，属于单亚基酶。聚焦电泳分析等电 点口i 值为8 1 ，为碱性酶蛋白。此酶的最适反应温度和反应p h 分别为3 5 c 和 5 0 。根据c d 谱计算酶的二级结构，表明其含有1 4 8 q 螺旋，2 2 9 3 b 折叠 和6 2 2 无规则卷曲。外加金属离子对酶有激活作用，且与金属离子的种类、价 态和浓度相关，其中二价离子的作用大于一价离子，特别是低浓度c a 2 + 或b a 2 + 可以显著提高酶活。蛋白内源荧光光谱分析也表明，n a + 对酶的荧光发射峰的影 响较小；而加入m g ”，c e + 或b a 2 + 后荧光强度下降及发射峰红移，且以c a 2 + 和 b a 2 + 影响最大。这可能是金属离子与蛋白质的侧链基团作用，而使酶分子中的 t r p 和= y r 残基的微环境发生了改交。热稳定性实验结果表明，此1 3 - 1 ，3 一葡聚糖 酶对热敏感，随温度升高，酶活力下降；内源荧光分析也显示荧光强度增加、 最大发射峰蓝移。此酶可能属于热敏感蛋白，与其二级结构中无规则卷曲较多， 而a 螺旋和b 折叠较少有关。 关键词：青稞、1 3 1 ，3 葡聚糖酶、活性染色、圆二色光谱、荧光光谱、金属离 子 p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f f l - 1 ，3 - g l u c a n a s e sf r o m h i g h l a n db a r l e y s p e c i a l t y ：b i o c h e m i s t r y & m o l e c u l a rb i o l o g y g r a d u a t es t u d e n t d i n gp i n g t u t o rd u l i n f a n g 1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s e e c 3 2 1 3 9 i sp r e s e n ti nm a n yh i g hp l a n t s ，e n c o d e db yas m a l l g e n ef a m i l y i tp l a y si m p o r t a n tr o l e s i nd i v e r s e p h y s i o l o g i c a la n dd e v e l o p m e n t a l p r o c e s s e s i n h i g h e rp l a n ti n c l u d i n g c e l l d i v i s i o n ，m i c r o s p o r o g e n e s i s ，p o l l e n g e r m i n a t i o n ，t u b eg r o w t h ，f e r t i l i z a t i o n ，e m b r y o g e n e s i sa n dr e s p o n s e st om o u n d i n g ， c o l d ，o z o n ea n du v b ，e s p e c i a l l yi t i n c l u d e si nt h er e s p o n s eo fp l a n tm i c r o b i a l p a t h o g e n s ，a sw e l l a si nt h e p r o c e s so fg e r m i n a t i o n h i g h l a n db a r l e y ( h a r d e u m v u l g a r ev a rn u d u mh o o k y ) i sd i s t i n c t i v e l yg r o w ni nt i b e t a np l a t e a ua n dq i n g h a i p r o v i n c e ，c h i n a a l t h o u g hp r e l i m i n a r ys t u d i e sh a v er e p o r t e dt h a tt h e r ew e r eh i g h p e r c e n t s o f1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ei n h i g h l a n db a r l e y , t h er e s e a r c ho fp u r i f i c a t i o na n d f u n c t i o no f 1 3 1 ，3 - g l u c a n a s ef r o mh i g h l a n db a r l e ya r ea b s e n c e i nt h i sp a p e r ，am a j o ri s o f o r mo f 1 3 - 1 ，3 g l u c a n a s ef r o mh i g h l a n db a r l e ys e e d l i n g s w a s p u r i f i e df o l l o w i n ga m m o n i u m s u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，d e a e - a2 5a n dc m c e l l o s e i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dg e lf i l t r a t i o nt e c h n i q u e si nf p l c ，t h e nd i r e c t l y a c t i v i t y s t a i n e di n p o l y a c r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i sg e l s i d e n t i f y1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s e s p e e d i l y , a v o i d i n g t r i v i a ld e t a i l so fm a k i n g a n t i b o d y t h ee n z y m ee s p e c i a l l y h y d r a o l y z e d1 3 - 1 ，3 一g l u c a n l a m i n a r i n t h em o l e c u l a r w e i g h to ft h ee n z y m ew a s e s t i m a t e da b o u t31k d ab ys d s - p a g e ，i s o e l e c t r i ef o c u s i n gi n d i c a t e dt h a tt h e 1 3 - 1 3 g l u c a n a s ei s ab a s i c p r o t e i nw i t hp i8 1 o p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp ho f t h ee n z y m ea r e3 5 c 和5 0 c ds p e c t r at e c h n i q u e sw a se m p l o y e dt o s t u d yt h e s e c o n d a r ya n dt e r t i a r ys t r u c t u r eo f1 3 - 1 ，3 一g l u c a n a s e b ya n a l y s i st h ef a ru v c i r c u l a r d i c h r o i s ms p e c t r a ，t h es e c o n d a r ys t r u c t u r ew a se s t i m a t e d 嬲一h e l i x14 8 ，b - p l e a t e d 3 s h e e ta n db t u r n2 2 9 3 ，r a n d o mc o i l6 2 2 e n z y m ei ns o l u t i o nu n d e rd i f f e r e n t m e t a li o n sw a ss t u d i e db ya c t i v i t ya s s a ya n df l u o r e s c e n c es p e c t r a ，t h er e s u l ts h o w t h a tt h eh i g h l a n db a r l e yw a sa c t i v a t e db yd i f f e r e n tm e t a li o n sa n dt h ed i v a l e n ti o n s w e r ee f f e c tt h a ns o d i u ma te q u a li o n i cs t r e n g t h s w h e nt r e a t e dw i t hn a + ，n oo b v i o u s c h a n g e so fe m i s s i o ni n t e n s i t y a n de m i s s i o nm a x i m u m ，b u tt r e a t e dw i t hm g ”。 c a 2 + a n db a 2 + e m i s s i o ni n t e n s i t yw e r eg r e a t l yd e c r e a s e da n de m i s s i o nm a x i m u mw a s r e ds h i r e ds p e c i a l l yc a 2 + a n db 一+ t h e s er e s u l t si m p l i e dt h a tt h eb i n d i n gm e t a li o n s c h a n g e dt h e m i c r o e n v i r o m e n to fa r o m a t i cr e s i d u e si n b 一1 ，3 - g l u e a n a s e i n h e a t s t a b i l i z a t i o n e x p e r i m e n t ，t h i s k i n do f 1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s e w a si d e n t i f i e da sa h e a t s u s p t i v ep r o t e i n w i t hi n c r e a s i n g o ft e m p e r a t u r e ，i t a c t i v i t y d e s c e n d e da n d o b v i o u sc h a n g ei ne m i s s i o ni n t e n s i t ya n de m i s s i o nm a x i u mw i t ha n a l y s i so f t h e s e r e s u l t si m p l i e dt h a ti r r e g u l a rc h a n g ei nf l u o r e s c e n c es p e c t r am a y b er e l a t e dt oi t st h e s e c o n d a r ys t r u c t u r et h a tw a sh i g hp e r c e n t so f r a n d o mc o i l ， k e yw o r d ：h i g h l a n db a r l e y ，b - 1 ，3 一g l u c a n a s e s ，a c t i v i t ys t a i n ，c i r c u l a rd i c h r o i s m s p e c t r a ，f l u o r e s c e n c es p e c t r a ，m e t a l i o n 4 1 引言 b 1 ，3 葡聚糖酶存在于大多数的种子植物中f l 4 ，一些高等植物的b i ，3 葡 聚糖酶已被纯化，编码它们的基因也已经被分离测序并详细研究。b 1 ，3 葡聚 耱酶可分为外切一p 1 ，3 一葡聚糖酶【e c 3 2 i 5 8 】和内切0 1 ，3 一葡聚糖酶 e c 3 2 1 3 9 】。 外切0 1 ，3 - 葡聚糖酶作用于以b 1 ，3 - 糖苷键连接起来的多聚糖的非还原 端，切下一个葡萄糖残基，而内切b 1 ，3 葡聚糖酶以随机形式作用，如作用于 纤维素的非结区，将其切开，产生大量的非还原端，作为纤维二糖水解酶的底 物。现今研究较多的是内切酶。根据其等电点、细胞定位、m r n a 表达模式 及序列同源性等特点，可将其分为三种不同类型： l 类碱性b 1 ，3 葡聚糖酶( bg l ui ) 主要存在于健康植物的老叶表皮和根细 胞液泡中，在体外具有抑菌活性【6 。8 】。许多高等植物中的目g l u i 已经被提纯并己 测序，发现其是一个单体酶。在烟草中bg l ui 大约为3 3k d a ，在老叶和根中占 植物可溶性蛋白的5 一1 0 。它是由一个3 5 9 残基的酶原前体经过加工而产生 的，酶原前体中含有n 端信号肽及c 端n - 糖基化的液泡导向肽序列，n 端是一个 2 1 残基的疏水性信号肽，而c 端是一个2 2 残基的可能包含糖基活化位点的肽段。 酶的成熟过程首先是去除信号肽并加上一个寡糖侧链，接着是糖基化中间反应， 失去寡糖侧链并失去c 末端的延伸肽段而成为一个成熟的酶。 i i 类( e g l u i i ) 和i 类酶( p g l u i i i ) 是酸性分泌性蛋白，位于细胞间隙， 无c 端n 糖基化的液泡导向肽序列，分子量为3 4 - 3 6 k d a 。例如i i 类的p r2 a ( p a t h o g e n e s i s r e l a t e d ) ，p r 2 b 、p r 2 c 1 i i 类的p r 2 、p r 2 d 、p r n 、p r o 、p r q 1 9 - 1 1 1 和两种位于花中的4 1 k d a 糖蛋白s p 4 1 a 和s p 4 1 b 1 2 】。烟草中多种i i 类 酶之间在氨基酸序列上至少存在8 2 的相似性，并和i 类酶至少存在4 8 8 差异 1 3 】。 许多植物中的b 1 ，3 葡聚糖酶基因及其结构已被详细地研究。最早获得碱 性葡聚糖酶基因序列的是m o h n e n 和s h i n s h i ( 1 9 8 5 ) ，他们利用激素诱导的烟草总 r n a 构建c d n a 文库，利用分离的m r n a 体外翻译后杂交筛选的方法获得了含 有约l k b 的墨t , 3 葡聚糖酶基因片段的克隆( p g l 4 s ) ，并由此得到了对应的m r n a 和完整基因序列，其基因的全长为t 0 8 3 b p ，开放阕读框中第一个可利甩的起始密 码子位于第四个核苷酸。它对应的序列为t c a a t g c g 。此c d n a 序列有两处推 测的多聚腺苷酸化的信号，分别位于1 2 8 5b p 处的a a g a a a 和1 3 2 l b p 处的 a t t a a t 。在所获得的5 个克隆中，有两个是利用第一位置加多聚腺苷酸尾，而其 中的另一个则从第二个位置加尾。此c d n a 产生一个由3 5 9 个氨基酸组成的多 肽，分子量为3 9k d a 。前体蛋白合成后切去n 端约2k d a 信号肽，并在进入液泡 是切去一个2k d a 左右c 端多肽而成为成熟b 1 ，3 葡聚糖酶。 s t , 3 甍聚耱酶在多秘植物生理活动中起着重要的作用，如细胞分裂【1 4 ”1 、 小孢子发生【1 6 - 1 ”、花粉的形成【1 8 + 19 1 、受精作用 2 0 1 、胚的发生【2 1 22 1 、果实的成 熟【2 3 】、禾本科种子胚乳中储藏物质的动用i ) 、细胞分化 4 1 ，并参与了植物对损 伤，低温、臭氧和u vb 等做出的生理反应 2 4 - 2 8 1 ，b 1 ，3 一葡聚糖酶可能还是种子 发芽中的关键物质。近年来研究的较多是其对病菌的抑制作用。与几丁质酶一 起协同作用时b 1 ，3 葡聚糖酶表现出较强的抗菌活性，并和一些植物的防御反 应有关 2 9 - 3 1 1 ，是植物防御真菌入侵体制中的个主要成分。 在发芽过程中，1 ，3 薷聚糖酶在胚中被强烈得诱导，并专一的定位子珠 孔结构域，其可能和发芽过程中胚乳细胞壁中贮藏的甘露糖聚合物的水解有关。 胚乳部分包围着胚根的尖端，从而机械性的阻止胚根的穿出，因而其部分胚乳 的降解是种子发芽所必需的。电镜实验发现种子发芽中胚乳层破裂是由于胚乳 细胞被降解而不是一个物理过程。检测发芽过程中酶活、bg l ui 和bg l ui 的b 基因( g l b ) m r n a 发现i 类1 3 1 , 3 葡聚糖酶专一的在珠孔结构域积聚而导致胚 乳降解。而且酶在种子发芽使被诱导并不是一种经典的防御反应，因为几丁质 酶( c h n ) 和酸性i i 和i i i 类8 1 ，3 葡聚耱酶没有被诱导。我们用脱落酸( a b a ) 处理过的种子在光照环境下萌发，a b a 并没有影响外种皮的破裂但以浓度依赖 方式明显抑制了i 类t 3 1 ，3 葡聚糖酶在胚乳中积聚的速度而延迟胚乳层的降解 0 2 1 。 研究发现1 3 1 ，3 葡聚糖酶与几丁质酶在体外可以水解许多致病真菌细胞壁 中的b 1 3 蓓聚糖、与几丁质从而抑制真菌的生长，在些植物中只有两种酶 协同作用才能体现明显的抑菌活性。在植物体内1 3 1 ，3 - 葡聚糖酶和二些植物的 防御反应密切相关。在许多的植物中多种胞内和胞外b 一1 , 3 葡聚糖酶已经被鉴 定纯化。一般认为胞外形式是酸性的而胞内是碱性的。液泡中的酶可能起着最 后一道防线的作用，而胞外的b 1 ，3 一葡聚糖酶可能与识别和释放激发因子 ( e l i c i t o r s ) 有关。现今研究发现，大麦b l ，3 一葡聚糖酶gi 在健康的植株的叶 片中存在。此酶为定位于胞质的胞内酶，这种亚细胞定位必定和在细胞中的作 用相一致。在烟草中i 类酶是位于液泡的碱性酶，而i i 酶和i i i 类酶是位于胞内 的酸性分泌蛋白，在大麦中g i i ，g i i i 和g v i i 都位于胞外，而g i v 位于液泡， g v i 的定位现在还不清楚，而g i 和g v 位于胞质。 可以假设，液泡中的0 1 ，3 一葡聚糖酶和几丁质酶可能是贮藏的抗病原菌 酶，它们作为最后一道防线在由病原菌入侵而造成细胞溶解时高度聚集。而胞 外的b 1 ，3 葡聚糖酶可能是在病原体入侵的早期起识别作用，通过水解病原菌 细胞壁而释放激活防御反应的激发因子，而胞质中的酶可能提供附加层次上的防 御。 研究发现青稞种子中含有较高量的b 一1 ，3 葡聚糖酶，这可能和它的耐寒和 高海拔特性有关。本文以发芽时的青稞种子为材料，从其胚中快速提纯并在非 变性电泳胶上直接检验青稞中的一种碱性b - l ，3 葡聚糖酶，并借助s d s 队g e 、 c d 谱、荧光光谱等方法对其部分性质进行了研究，以期为0 1 ，3 葡聚糖酶的后 期研究提供方便，从而揭示b l ，3 - 葡聚糖酶在青稞生理活动中的可能作用。 2 材料与方法 2 1 仪器和试剂 2 1 1 仪器 a m e r s h a mp h a r m c i am i n iv e 电泳仪，h i t a c h if 4 5 0 0 荧光分光光度计， j a s c o j 5 0 0 c 圆二色谱仪，a m e r s h a mp h a r m c i a a k t a f p l c ( 快速液相层析系 统) ，e p p e n d o r fc e n t r i f u g e5 8 0 4 1 2 离心机，p g c n e r a c - t u - 1 8 0 0 紫外- 可见光光度 计。 2 1 2 主要试剂 青稞( h o r d e n mv a l g a r e ，v a tn u d u m h o o k e ) 种子采自四川黄龙地区； 7 d e a e a 2 5 ，、c m - c e l l o s e 干粉为w h a t m a n 公司产品；s e p h a r y l s 一3 0 0 h r 柱为 a m e r s h a m p h a r m c i a 公司产品；p m s f 为e m e r c k 产品；海带多糖( l a n a i n a r i n ) 、 丙烯酰胺( a c r ) 和标准分子量蛋白为s i g m a 公司产品，甲叉双丙烯酰胺( b i s ) 、 考马斯亮蓝r 一2 5 0 、g - 2 5 0 为f l u k a 公司产品，2 , 3 ，5 t r i p h e n y l t e t r a z o l i u me h l o r i d e 为a m e r s h a mp h a r m a c i ab i o t e c h 产品，其它试剂为国产分析纯试剂。 2 2 实验方法 2 2 1 植物材料 青稞( h o r d e n mv a l g a r e ，v a tn u d u m h o o k f ) 种子采自四川省黄龙地区夏季 成熟的种子，种子用1 5 n a c i o 浸泡1 0 m i n 消毒后，流水冲洗2 0 m i n 。将表面 消毒过的种子置于湿润的双层滤纸上2 0 c 萌发3 6 h ，在胚根刚刚穿出种子时切 取青稞种子的前小半部分即胚部分。 2 2 2 b 1 , 3 葡聚糖酶的纯化 取青稞胚3 8 9 ，加入7 6 m l 匀浆缓冲液( 5 0 m m o l l n a a c ，3m m o l le d t a ， 3 m m o l l 巯基乙醇，3 m m o l lp m s f ，p h5 0 ) 中匀浆，静置4 0 分钟。离心( 1 0 0 0 0 x g ，2 0r a i n ) ，得上清。上清液用2 0 8 0 饱和硫酸铵沉淀，冰上搅拌l h ，离 心( 1 0 0 0 0 x g ，l h ) ，沉淀用2 0m l 缓冲液悬浮缓冲液( 1 5 m m o l lk a p 0 43 m m o l l 巯基乙醇，p h 7 5 ) 溶解，匀浆后用相同的缓冲液透析过夜，然后上悬浮缓冲溶 液预先平衡好的d e a e a 2 5 柱( 2 1 6 c m ) 。用2 0 0 m l 相同缓冲液洗脱，收集穿 透峰，将收集的穿透峰( 约8 0 m 1 ) 用n a a c 缓冲液( 2 0 m m o l ln a a c ，3 m m o l l 巯基乙醇，p h 5 0 ) 透析过夜，然后上预先平衡好的c m - c e l l o s e 柱( 2 1 6 c m ) ， 先用2 0 0 m l 的n a a c 缓冲液平衡过夜，用梯度为o o 7 5 m o l 1 n a c l 溶液梯度洗 脱，总体积为2 0 0 m l 。收集活性组分用去离子水透析后冷冻干燥。冷冻干燥后 的蛋白样品溶解于4 m lp b s 缓冲液( 5 0 m m o l l n a h p 0 4 ，1 5 m m o l l n a c l ，3 m m o l l n a n l ，p h7 0 ) 中，采用f p l c 系统s e p h a r y l s 3 0 0 h r 柱( 1 6 6 0 c m ) 分离， 压力o 5 m p a ，流速i m l m i n 先用2 个柱床体积平衡后，上样。p b s 缓冲液洗脱。 以上所有步骤都在4 下操作。 2 2 3 非变性凝胶电泳 非变性凝胶电泳参照p a n 3 4 1 等方法采用不连续t r i s h c i 系统，凝胶厚度 1 5 r a m ，分离胶及浓缩胶浓度分别为1 7 5 和3 7 5 ，胶板采用银染显色，或直 接采用活性染色。 2 2 4 天然等电聚焦电泳( i e f ) 采用a m e r s h a mp h a r m c i am i n iv e 电泳仪，凝胶厚度1 5m m ，凝胶浓度7 5 ， 含有2 载体两性电解质( p h4 一l o ) ，不含尿素。样品经样品处理液( 6 0 甘 油、4 p h4 1 0 载体两性电解质) 处理后上样，2 0 0 v 电泳1 5 h 然后4 0 0 v 电 泳1 5 h 。电泳结束后胶板可直接用于活性染色，或用1 0 t c a 溶液浸泡1 0 m i n ， 再换成1 t c a 溶液浸泡过夜以去除载体两性电解质，然后再用考马斯亮蓝 r 2 5 0 染色。电泳结束后还需将一凝胶条切成0 5 c m 小片，每片在l m li o m m o l l l k c l 中浸泡3 0 r a i n ，测读此k c i 溶液的p h 值，并以迁移率为横坐标，p h 值为 纵坐标作一曲线。根据比对迁移率得出酶的p h 值。 2 2 5 活性染色 主要参照p a n 等【3 4 】的方法并加以改进，直接在电泳胶上进行b l ，3 葡聚活 性染色。非变性电泳和等电聚焦电泳结束后胶板迅速用水冲洗胶三次，将胶放 入平衡缓冲液中( 5 0 m m o l ln a a cp h 5 0 ) ，4 0 c 平衡1 0 r a i n 。然后浸泡在溶有 0 6 6 海带多糖( l a m i n a r i n ) 的n a a c 缓冲液中，4 0 c 孵育l h 。再用乙醇：水： 乙酸5 ：5 ：2 ( v v ) 的溶液浸泡5 r a i n ，最后放入2 ，3 ，5 - t r i p h e n y l t c t r a z o l i u mc h l o r i d e 溶液( o 1 5 2 , 3 ，5 t r i p h e n y l t e t r a z o l i u mc h l o r i d e 溶于1 m o l 1 n a o h ) ，微波炉中加 热染色约3 分钟，每3 0 秒振荡一次使染色均匀，直到亮红色的带出现。染色后 用7 5 乙酸溶液脱去底色以增加对比。 2 2 6s d s p a g e 及分子量测定 s d s p a g e 参照l a e m m l i 系统3 3 1 ，凝胶厚度1 5m m ，分离胶及浓缩胶浓度 分别为1 2 和5 。样品经样品处理液( 5 s d s ，2 0 一巯基乙醇，l o r 油和 5 0 m m o l l i r i s ，p h 6 8 ) 于室温下处理5 m i n 后上样。电泳后胶板用银染染色a 9 分子量标准蛋白包含牛血清白蛋白6 6 0 0 0 ：卵清蛋白4 5 0 0 0 ；兔肌肉中3 - 磷酸 甘浊醛脱氢酶3 6 0 0 0 ；牛碳酸酐酶2 9 0 0 0 ；牛胰蛋白酶原2 4 0 0 0 ；牛胰蛋白酶抑 制剂2 0 1 0 0 ；溶菌酶1 4 2 0 0 。以相对迁移率为横坐标，标准蛋白分子量的对数 为纵坐标，得出线形方程，计算被测蛋白的分子量。 2 2 7b 1 , 3 葡聚糖酶的圆二色谱( c d ) 测定 0 1 ，3 一葡聚糖酶的圆二色谱中，样品浓度0 4 8m g l ，样品悬浮于含3 m m o l l 的p b s 缓冲液中。扫描范围分别为3 3 0 ，2 3 0 i l i n 和2 5 0 - 1 9 0 n m ，光程分别为0 0 5 c m 和2 c m ，灵敏度2 m 。e r a 。结果综合c h e n 、y a n g 和f a s m a n 方法计算各构象单位 的含量。 2 2 8 离子强度对b 1 ，3 葡聚糖酶酶活和内源荧光光谱的影响 酶溶液用i 、5 、1 0 、2 0 、3 0m m o l l 的n a c i 、c a c l 2 、m g c l 2 和b a c l 2 处理 2m i n 后，分别测量酶溶液的酶活，以及以2 8 0 m 和2 9 5 m 为激发波长的内源 荧光光谱。 2 2 9 酶热稳定性实验和内源荧光分析 酶溶液分别在1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 中各处理3 0 m i n ， 处理后在l o 下静置1 0 m i n 。检测酶溶液的酶活和以2 8 0 n m 和2 9 5 n m 为激发波 长的内源荧光光谱。 2 2 1 0 酶最佳反应温度和反应p h 的测定 最佳反应温度的测定和酶活力测定方法类似，只是改交反应温度。酶在 2 5 、3 5 、4 5 、5 5 和6 5 中反应2 h ，用3 ，5 二硝基水杨酸法检测还原 糖释放量。最佳反应p h 测定中p h3 5 - 5 5 采用n a a c - h a c 缓冲系统而p h 6 0 - 7 。0 采用n a 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 缓冲系统。分别测量酶在p h3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、 6 o 、6 5 、7 o 中的酶活力。 0 2 2 1 l 酶活力测定 参照y u k i oa n dh i s a s h i 方法【3 5 】，海带多糖作为反应底物，每一管中含l m g 底物、1 0 0 u l 被测样品、o 3 9 m l 测活缓冲液( 5 0 m m o l l n a a c ，p h 5 5 ) ，3 5 c 温 浴2 h ，测定反应生成的还原糖量。一个单位的b 1 ，3 葡聚糖酶活力定义为1 分 钟水解生成1u m o l 还原糖( 1 a m o lm i n 。1m g 1 ) 。 2 2 1 2 蛋白质浓度测定 蛋白质浓度采用l o w r y 法 3 6 】测定，以牛血清白蛋白( b s a ) 为标准。 3 实验结果 3 1 1 3 1 , 3 葡聚糖酶的纯化 提纯过程中各个步骤蛋白得率及纯化倍数见表一。 表一纯化各步中的蛋白得率及纯化倍数 青稞胚的匀浆液进行硫酸铵分布沉淀发现大部分的活性物质在饱和度 2 0 8 0 时沉淀下来，占总活力的7 4 6 ，2 0 8 0 硫酸铵沉淀后得蛋白溶液2 0 m l ， 根据b r a d f o r d 法测定蛋白浓度为4 m g m l 。而在d e a e a 2 5 柱中，碱性的1 3 l ，3 - 葡聚糖酶在口h7 5 时因带正电而没有被柱子吸附，在穿透峰中6 9 4 的总活力 被保留，比活力比胚匀浆液提高了3 3 4 倍。活性组分在n a a c 缓冲液中透析过 夜后上c m c e l l o s e 柱。用梯度为o 一0 7 5 m o l ln a c i 溶液梯度洗脱，活性组分 大约在盐离子浓度为o 5 m o l l 时被洗脱下来( 见圈1 ) 051 01 52 02 53 03 54 04 55 05 5 洗脱管教 围1c m - c 梯度洗脱益线 将d e a e - a 2 5 柱的未结合部分上c m - c e l l o s e 柱，平衡后用0 一o 7 5 m o l l n a c 溶液梯度洗脱，每管3 m l 。 收集活性组分并用去离子水透析后冷冻干燥。冷冻干燥后的蛋白样品溶 解于4 m l 含3 m m o l l n a n 3 的p b s 缓冲液中，采用f p l c 系统s e p h a r y l s 3 0 0 - h r 柱分离，流速l m l m i n 每管2 m l 收集2 8 3 l 管( 洗脱曲线见图2 ) 。测定酶活及 蛋白浓度，0 t , 3 一葡聚糖酶被纯化了大约2 2 倍，从3 8 9 青稞胚中共提取酶 0 9 9 r o g ，得率为5 1 。 00 7 0 0 6 0 0 5 0 0 4 0 ，0 3 0 ，0 2 0 0 1 0 5 1 01 52 02 53 03 5 4 04 5 譬数 图2s e p b a r y l - s - 3 0 0 - h r 桂洗戚曲线 每管2 m l ，纯化的b 1 , 3 葡聚糖酶在2 8 3 l 管时洗脱出来 2 5 4 5 3 5 2 5 l 5 0 c；吣叽眦n叭m 3 2 凝胶电泳分析纯化酶的均一性 纯化样品用1 7 5 浓度的非变性p a g e 电泳，胶板银染显色后，在胶的上部 只出现一条带，而且活性染色发现也在同一位置出现了唯一条亮红色的活性带 ( 见图3 ) 。非变性i e f 后，分别用考马斯亮蓝r 2 5 0 和活性染色，在胶板的中 上部分都只有一条带，其迁移率为o 2 5 8 ，和标准p h 曲线比对得出酶的p i 值为 8 ，1 。说明提纯样品中的蛋白就是b 一1 ，3 - 葡聚糖酶。 图3 活性染色和银染对照 1 7 5 分离1 k ，3 7 5 浓缩胶，泳道1 ：银染对照，泳道2 ：泳道活性染色。 3 3s d s p a g e 及分子量 不同纯化阶段的样品用s d s p a g e 检测后发现( 见图4 ) ，酶粗提液经过 d e a e s e p h a d e x a 2 5 柱后，大部分杂蛋白被吸收，穿透峰中蛋白种类明显减少。 通过c m c e l l o s e 柱分离后b 一1 , 3 葡聚糖酶被进一步纯化，最后在 s e p h a r y l s 一3 0 0 一h r 柱的第二个峰中我们得到了一种碱性的b 一1 , 3 - 葡聚糖酶。 s d s - p a g e 检验发现纯化组分含有个3 1k 1 ) a左右的主带，并在 1 4 - 1 6 k d a 处有三个弱的副带。活性检测和电泳胶板直接活性染色证明3 1 k d a 左 右的主带就是1 3 - 1 ，3 一葡聚糖酶。这和先前文献报道一致。在禾本科植物如大麦， 水稻等种子中存在一种碱性3 2 3 4 k d a 单亚基的i 类0 1 ，3 一葡聚糖酶。在种子发 芽过程中此种酶在胚的珠孔结构域中大量积聚。参与水解种子胚乳层细胞层细 胞壁中的1 ，3 ；1 ，4 1 3 一d 葡聚糖，从而促进种子发芽盼3 7 l 。而位于1 4 1 6 k d a 左 右的三条副带可能是由于在提纯过程中缺少蛋白酶抑制剂而产生的蛋白 的降解带。 图4s d s p a g e 显示b 1 ，3 葡聚糖酶纯化过程 1 2 分离胶，6 浓缩胶，采用银染显色，泳道1 ：标准分子量蛋白，泳道2 ：胚匀浆液， 3 ：d e a e a 2 5 穿透峰，泳道4 ：c m - c e l l o s e 梯度洗脱蜂，泳道5 ：s e p h a r c y ls - 3 0 0 层析 后纯化的b 1 ，3 - 葡聚糖酶 3 。40 1 , 3 一葡聚糖酶的圄二色谱( c d ) 测定 我们分别测定了纯化的b 一1 ，3 - 萄聚糖酶远紫外和近紫外圆二色光谱。对远 紫外进行定性分析发现( 图5 ) ，在2 0 2 n m 附近存在一个主要的负缝，是无规则 卷曲的典型特征。在2 1 0 n m 和2 1 9 n m 左右的双负蜂表明存在q 螺旋结构，其中 2 1 0 n m 负蜂是由q 螺旋肽键- h 跃迁所贡献，2 1 9 r i m 负蜂是1 1 “所致，而 2 0 2 r i m 负蜂明显大于2 1 0 n m 和2 1 9 n r n 双负蜂说明在溶液状态下酶的主要二级结 构是无规则卷曲。综合c h e n 、y a n g 和f a s m a n 方法对远紫外c d 谱计算得到b 一1 ，3 - 葡聚糖酶的二级结构为一螺旋1 4 8 、1 3 一折叠2 2 9 3 、无规则卷曲6 2 2 。 酶溶液近紫外c d 谱在图6 中已给出。在近紫外c d 谱中主要研究蛋白质的 三级结构，芳香氨基酸侧链残基根据蛋白质的构象吸收特定波长。因而近紫外区 中，蛋白质的圆二色性主要是由侧链基团，特别是二硫键和芳香氨基酸贡献的。 图中2 7 0 n m 左右的宽负蜂是p h e 的贡献，而在3 0 0 n m 左右的个小的负蜂则是 t r y 影响造成的。 o 一1 2 一 口 一一3 4 ( n m ) 图5 远素外圃二色光谱 一l 一 口 一2 3 - 4 ( n ) 国6 近蘩外圆二色光谱 3 5离子强度对1 3 1 , 3 葡聚糖酶酶活和内源荧光光谱的影响 分别用l 、5 、1 0 、2 0 、3 0m m o l l 的n a c l 、m g c l 2 、c a c l z 和b a c l 2 处理酶 溶液2 m i n 后，测量溶液的酶活( 图7 ) 。以一不加盐离子的酶溶液为空白对照， 加入n a c l 、m g c l 2 对酶活力影响不大，在3 0m m o l l 盐离子浓度下比活力分别 增加3 0 和7 2 5 。但是加入c a 2 + 、b a 2 + 后酶活力有了较大提高。在5 m m o l l 的离子浓度时c a 2 + 、b a 2 + 对酶活影响较小，只分别增加5 和1 7 5 ，随着离子 强度的增加酶比活力提高较大a 当离子浓度增大到3 0 m m o l l 时酶活力分别提高 了4 9 3 和4 1 倍。结果表明在相同蛋白浓度和离子强度下二价离子对于酶活力 的影响大于一价离子的影响，但是在高离子强度中金属离子对酶活力的影响变 弱。 2 5 2 。一 s 1 5 r 蛰。i 。l i 01 52 02 5 3 0 金属离子诹度( e o l l ) 圉7 金属离子对酶活力的影响 这与b a l l a n c e t 和m a n n e r s 等人的研究结果相一致f 3 7 1 。他们发现多种金属离 子都可以在低离子强度缓冲液中提高b 1 , 3 葡聚糖酶酶活，而且即使是在 0 0 5 t o o l 1 醋酸盐缓冲液中m n ”和b a ”也可以大幅度提高b 1 ，3 - 葡聚糖酶酶活 力。 、 蛋白质的t r p 、t y r 和p h e 由于侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和 发射光谱。其中t r p 的荧光强度最大、r y r 次之、p h e 最小。因为p h e 在绝大多 数条件下不被激发，所以蛋白质的内源荧光主要来自t r p 一和t y r 残基。而且t r p 对于微环境变化非常敏感，因而可以用来研究溶液状态下蛋白质构象。我们分 别采用2 8 0 h m 和2 9 5 n m 激发，研究溶液在离子强度增加时发射光谱的变化。许 多蛋白质的侧基和端基与大多数金属离子均有潜在的键合能力，加入金属离子 后并随着离子浓度的增加可能会使酶中的t r p 和t y r 的微环境发生改变。2 8 0 n m 激发时荧光发射来自t r p 和t y r ，而2 9 5 n m 激发则都来自于t r p 。未处理的酶溶 液中2 9 5 n m 激发发现最大荧光发射峰出现在3 3 0 h m 处。根据b u r s t e r i n 提出的三 种基本t r p 残基微环境模型：i - k m a x = 3 3 0 3 3 2 n m t r p 残基埋藏于非极性区域内。 1 6 i - x m a x = 3 4 0 - 3 4 2 n m 残基则固定在蛋白质分子表面，且与溶液水的接触受到限 制， - 7 l m a x = 3 5 0 3 5 2 n mt r p 残基彻底暴露于水中。说明这种碱性t 8 ，1 ，3 葡聚糖 酶的t r p 残基位于极度疏水环境中或t r p 残基的吲哚环有着特殊的构象。 加入n a + 离子后，酶的2 8 0 r t m 和