（生物化学与分子生物学专业论文）鼠肝质膜蛋白质组方法学研究.pdf

摘 要 本文以鼠肝质膜为研究对象，旨在优化提取、纯化以及鉴定质膜 蛋白质的方法。主要进行了两个方面的实验：( 1 ) 纯化鼠肝质膜蛋白 质方法学研究；( 2 ) 肝质膜蛋白质组研究中染色方法比较及优化。 第一方面的实验以鼠肝为材料，采用两步蔗糖密度梯度离心法纯 化质膜，用扫描电镜分析检测质膜纯度，1 d e 、2 d e 分离质膜蛋白质， 且p n o u e s t 软件分析图谱。从不同纯化步骤得到的膜蛋白质的电泳图 谱中找出8 2 个不同的蛋白质点，然后对其进行酶解和质谱分析，最 后共鉴定到5 6 个蛋白质，其中有4 3 个是在p o q u e s t 软件中定义为2 倍差异的点。从蛋白质定位信息中可以看出其中有3 5 个2 倍差异的 点，是定位于质膜上的蛋白质；另外7 个2 倍差异点，5 个为线粒体 蛋白、2 个为过氧化物酶体蛋白。此外1 3 个无明显差异的蛋白质点 由于定位信息不明确，推测为质膜与其它细胞器共定位的蛋白质。以二 上结果说明两步蔗糖密度梯度提取有利于质膜蛋白的富集。 然后探索了几种新方法( 双水相，高盐高p h 结合双水相，双水 相结合蔗糖密度梯度) 对质膜蛋白质进行了富集。研究结果表明：高 盐高p h 结合双水相，以及双水相结合蔗糖密度梯度的方法都能较好 地富集整合膜蛋白质，其中双水相结合蔗糖密度梯度的方法又优于高 盐高p h 结合双水相处理。将所提取的蛋白质用1 1 ) e - p a g e 分离， e s i - q t o f 质谱鉴定。鉴定的结果表明双水相和蔗糖密度梯度离心作 为两种不同的提取及纯化质膜的方法的结合使用，可以进一步纯化质 膜得到更好的分离效果。 为了提高组织细胞质膜的纯度，研究中还摸索使用了一种新的亲 和法纯化组织质膜。即用抗体磁珠免疫亲和分离纯化c 5 7 小鼠肝脏质 膜的方法。与密度梯度离心法相比，质膜富集了3 倍左右，线粒体减 少了约2 倍。同时比较了四种亲和提取方式，优化了样品、磁珠以及 抗体之间量的比例。研究鉴定的质膜或质膜相关蛋白质的比例明显高 于使用其它方法得到的质膜蛋白质的比例。 第二方面，对鼠肝质膜蛋白质组进行了5 种染色方法的比较实 验，发现荧光染色的质谱鉴定准确性高于快速银染法，快速银染法又 高于普通银染法。考染中g - 2 5 0 的效果比r - 3 5 0 好，且背景低、快速。 对考染后切取了高丰度蛋白质点后的胶块进行快速银染，既可以提高 鉴定的准确性又可以不丢失低丰度的蛋白质。 关键词：纯化，质膜蛋白质，蔗糖密度梯度离心，双水相，二抗磁珠 染色方法 i i a b s t r a c t b a s e do nr a tl i v e rp l a s m am e m b r a n eo ft h es t u d yi sf o rt h e p u r p o s eo fo p t i m i z i n gt h ee x t r a c t i o n ，t h ep u r i f i c a t i o na sw e l l a st h ei d e n t i f i c a t i o no fm e m b r a n ep r o t e i n s t h et w om a i na r e a s o fr e s e a r c h ；( 1 ) p u r i f i e dr a tl i v e rp l a s m am e m b r a n ep r o t e o m i c s m e t h o dr e s e a r c h ：( 2 ) c o m p a r ea n do p t i m i z a t i o no fs t a i n i n g m e t h o d si nl i v e rp l a s m am e m b r a n ep r o t e o m ea n a l y s i s f i r s t ，w ei s o l a t e dp l a s m am e m b r a n ef r o mr a t1i v e rb yt w o s t e p so fs u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n te e n t r i f u g a t i o n w eu s e s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p yt od e t e c tp u r i t yo ft h ep l a s m a m e m b r a n e ，w i t hi d e ，2 d es e p a r a t i o nm e m b r a n ep r o t e i n s ，t h e n a n a l y z e sm a p sw i t hp d q u e s ts o f t w a r e 。w ei d e n t i f y8 2d i f f e r e n t p r o t e i n s ，t h e nd i g e s t i o na n dm a s ss p e c t r o m e t r ya n a l y s i s ，t h e f i n a li d e n t i f i c a t i o no fat o t a lo f5 6p r o t e i n s o ft h e m , 4 3a r e i nm a p p i n gs o f t w a r ep d q u e s td e f i n e da sa2 - f o l dd i f f e r e n c ei n p o i n t s l o c a t i o n i n gi n f o r m a t i o nf r o mt h ep r o t e i nc a nb es e e n w i t ht h e3 5p o i n t sd i f f e r e n c ei sl o c a l i z e di nt h ep l a s m at h e r e a r e7s i g n i f i c a n t l yr e d u c et h ed i f f e r e n c ep o i n t s ，i n c l u d i n g5 o fm i t o c h o n d r i a lp r o t e i n sa n dt w of o rp e r o x i s o m ep r o t e i n s i n a d d i t i o n1 3n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si np r o t e i nl o c a t i o n i n f o r m a t i o ni sn o tc l e a r ，c o n j e c t u r ea n do t h e rs u b c e l l u l a r o r g a n e ll em e m b r a n ef o rat o t a lo fp o s i t i o n i n gp r o t e i n s ， a l s ou s i n gs e v e r a ln e wm e t h o d s ( t w o p h a s e ，h i g hs a l i n i t ya n d h i g hp ha q u e o u st w o - p h a s ec o m b i n a t i o n 。a q u e o u st w o p h a s e c o m b i n a t i o no fs u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n t ) o ft h ep l a s m am e m b r a n e p r o t e i nc o n c e n t r a t i o n t h er e s u l t ss h o w ：h i g hs a l tw i t hah i g h p ha q u e o u st w o p h a s e ，a n dt h et w o - p h a s ec o m b i n a t i o no fs u c r o s e d e n s i t yg r a d i e n tm e t h o d sc a nb e t t e ri n t e g r a t ee n r i c h m e n t m e m b r a n ep r o t e i n s ，o fw h i c ht w o p h a s ec o m b i n a t i o no fs u c r o s e d e n s i t yg r a d i e n tm e t h o di sb e t t e rt h a nt h eh i g h s a l tw i t hah i g h p ha q u e o u st w o - p h a s et r e a t m e n t t h ep u r i f i e dp l a s m am e m b r a n e p r o t e i n sb ee x t r a c t e da n dw e r es e p a r a t e db ys d s p a g ea n d d i g e s t e dw i t ht r y p s i n t h ed i g e s tp e p t i d e sw e r ei d e n t i f i e db y e s i q t o fm s m s t h er e s u l t ss h o wt w o - p h a s ea n ds u c r o s ed e n s i t y g r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o na st w od i f f e r e n tp l a s m am e m b r a n e e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d sc o u l dc o m b i n e d ，a n dw i l l n o ta f f e c to n ea n o t h e r ，b u tc a nb ef u r t h e rp u r i f i e dp l a s m a m e m b r a n eb e t t e r i no r d e rt oi m p r o v et h ec e l lm e m b r a n ep u r i t y ，t h es t u d ya l s o e x p l o r e dt h eu s eo fan e wa f f i n i t yp u r i f i c a t i o nm e t h o d c 5 7 p l a s m am e m b r a n ew a si m m u n o i s o l a t e db ys e c o n d a n t i b o d y s u p e r p a r a m a g n e t i cb e a d s t h ep l a s m am e m b r a n eo fm o u s e1i v e rw a s e n r i c h e da b o u t3 - f o l di nc o m p a r i s o nw i t ht h ed e n s i t yg r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o nm e t h o d ，a n dc o n t a m i n a t i o nf r o mm i t o c h o n d r i o n w a sr e d u c e d2 - f o l d m e a n w h i l e ，f o u rm e t h o d so fi m n u n o a f f i n i t y w e r ec o m p a r e da n dt h eo p t i m i z e dq u a n t i t i e so fs a m p l e ，b e a d sa n d a n t i b o d i e ss u i t a b l ef o rp r o t e o m ea n a l y s i sw e r eo b t a i n e d t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h er a t i oo fp l a s m am e m b r a n o rp l a s m a m e m b r a n e - r e l a t e dp r o t e i n sw a sm u c hh i g h e rt h a nt h a to b t a i n e d u s i n gt h er o u t i n em e t h o d s i nt h es e c o n dr e s e a r c h ，f i v ek i n d so fs t a i n i n gm e t h o d sw e r e c o m p a r e dt h r o u g hl i v e rp l a s m am e m h r a n ep r o t e o m i c s w i t h c o m p a r i n g , i tw a sf o u n dt h a tt h ea c c u r a c yo f s y p r or u b y s t a i n i n g sh i g h e rt h a nt w os i l v e rs t a i n i n g s ，o fw h i c hf a s t s i l v e rs t a i n i n g ( b l u ms i l v e rs t a i n i n g ) i sb e t t e rt h a ng e n e r a l s i l v e rs t a i n i n g ( p 1 u s o n e “s i l v e rs t a i n i n g ) t h ee f f e c to fg - 2 5 0 s t a i n i n gi sb e t t e rt h a nt h a to fr - 3 5 0 ，w i t hq u i c ks p e e da n dl o w b a c k g r o u n d f a s ts i l v e rs t a i n i n gf o l l o w i n gc o o m a s s i eb l u e s t a i n i n g c a nn o t o n l yi m p r o v et h ea c c u r a c yo fp r o t e i n i d e n t i f i c a t i o n ，b u ta l s oi d e n t i f ym o r el o w - a b u n d a n c ep r o t e i n s k e yw o r d s ：p u r i f i c a t i o n ，p l a s m am e m b r a n ep r o t e i n s ，s u c r o s e d e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n ，t w o p h a s e ，s e c o n da n t i b o d y s u p e r p a r a m a g n e t i c ，s t a i n i n gm e t h o d s v a c n a p s b i s b s a c c a c h a p s c i d d d h 扣 2 - d e 们旧 e d t a e s i m s g r a v y i 从 i e f i c a t i p g l c m a l d i t o f _ m s m s l s n p 一4 0 p a g e 缩写表( 中英文对照) 乙腈( a c e t o n i t r i l e ) 过硫酸胺( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ) 甲叉双丙烯酰胺 n ，n 一m e t h y l e n e b i s 一( a c r y l a m i d e ) 牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) 一氰基一4 一羟基肉桂酸( d - c y a n o - 4 - h y d o x y c i n n a m i ca c i d ) 3 - ( 胆酰胺丙基) 一二乙胺卜丙磺酸 碰撞诱导解离( c o l l i s i o n - i n d u c e dd i s s o c i a t i o n ) 双蒸水( d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r ) 双向电泳( t w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ) 二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) 乙二胺四乙酸( e t h r l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ，e d i t i ca c i d ) 电喷雾质谱( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ) 疏水值( g r a n da v e r a g eh y d r o p h o b i c i t y ) 碘乙酰胺( i o d o a c e t a m i d e ) 等电聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s i n g ) 同位素标记亲和标签( i s o t o p ec o d e da f f i n i t yt a g s ) 固相p h 梯度( i m m o b i l i z e dp hg r a d i e n t ) 液相质谱( 1 i q u i dc h r o m o t o g r a p h y ) 基质辅助激光解吸飞行时间质谱( m a t r i x - a s s i s t e d l a s e r 。d e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e 。o f - f l i g h t m a s ss p e c t r o m e t r y ) 串联质谱( t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ) 非离子去垢剂( n o n i d e tp 4 0 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p o l y a c r y l u m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) p a i p b s p m 哪 p m s f p s d p v d f r p m r p - h p l c q - t o f m s s b 3 - 1 0 s d s t b p t e m e d t f a t m t r i s 蛋白质丰度指数( p r o t e i na b u n d a n c ei n d e x ) 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e ) 细胞膜( p l a s m am e m b r a n e ) 肽质量指纹图( p e p t i d e s sf i n g e r p r i n t ) 蛋白酶抑制剂( p h e n y l m e t h a n s u l f o n y lf l u o r i d e ) 源后裂解( p o s t s o u r c ed e c a y ) 聚偏二氟乙烯( p o l y v i n y l i d e n ed i f l u o r i d ) 每分钟转数( r o t a t i o np e rm i n i u t e ) 反相高效液相色谱( r e v e r s ep h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ) 四级杆时间飞行质谱( q u a d r u p o l e t i m eo ff l i g h t m a s s s p e c t r o m e t r y ) 甜菜碱一i o ( n d e c y l - n ，n - d i m e t h y l 一3 一a 皿n o n i o 一1 一p r o p a n e s u l f o n a t e ) 十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) 三丁基磷( t r i b u t y lp h o s p h i n e ) 四甲基乙二胺( n ，n ，n 7 ，n 。t e t r a m e t h y l e t h l e n ed i a m i n e ) 三氟乙酸( t r i f l u o r o a c e t i ca c i d ) 跨膜区( t r a n s m e m b r a n ed o m a i n s ) 三羟基甲基氨基甲烷 t r i s - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 】 8 0 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果除文中已经注明引用的内容以及与张 丽军博士合作的工作外，本论文不合任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承 担 学位论文作者签名：霭良撇 2 0 0 7 年5 月2 0 日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文 本学位论文属于 l ，保密口，在年解密后适用本授权书 2 、不保密日 ( 请在以上相应方框内打“ ”) 作者鼢煳吼嚏年( 月 翩摊：科嗍：夕“月日 鼠肝质膜蛋白质组方法学研究 第一章前言质膜蛋白质组学研究概况及新进展 1 蛋白质组学研究概况 1 1 蛋白质组学研究的形成和发展 蛋白质组( p r o t e o m e ) 这一概念是由澳大利亚学者w il k i n s 和 w i l l i a m s 等人在1 9 9 4 年提出“。，它源于蛋白质( p r o t e i n ) 与基因 组( g e n o m e ) 两个词的杂合，是指一个细胞或一个组织的基因组所表 达的全部蛋白质。蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 是指应用各种技术手段来 研究蛋白质组的一门新兴学科，其目的是从整体的角度分析细胞内动 态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的 相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律，实现对基因 组序列的“解码”。它主要涉及的内容有两方面：一是研究蛋白质组 的组成成分，即蛋白质组表达模式的研究；二是研究蛋白质组的功能， 即蛋白质组功能模式的研究，目前主要集中在蛋白质组表达模式方面 蛋白质组表达模式研究的支撑技术主要有双向凝胶电泳和以质谱为 代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学口1 。 自从蛋白质组学概念提出以来，在生物学界得到了充分关注，蛋 白质组学研究发展十分迅速，不论是基础理论，还是技术方法，都在 不断的进步和完善，并且肝、脑、血清、微生物、药物、毒物、农作 物等蛋白质组概念也相继提出。蛋白质组研发机构也相继成立。2 0 0 1 年4 月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织( h u m a np r o t e o m e o r g a n i z a t i o n ，h p o ) ，并和欧洲、亚太地区的区域性蛋白质组研究 组织一起，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白 质组计划( h u m a np r o t e o m ep r o j e c t ，职p ) 。 目前蛋白质组学的研究内容不仅包括对各种蛋白质的识别和定 量化，还包括确定它们在细胞内外的定位、修饰、相互反应、活性和 硕士学位论文 最终确定它们的功能。内容大致包括以下四方面：蛋白质组作用、 成分鉴定、数据库构建、新型蛋白质的发现、同源蛋白质比较、蛋白 质加工和修饰分析；基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制 分析；重要生命活动的分子机制( 如细胞周期、分化与发育、环境 反应与调节等) ；医药靶分子的寻找和分析( 包括新药靶分子、肿瘤 分子标记、人体病理介导分子等) 。蛋白质组研究是比基因组研究的 远为复杂的后续部分，无疑将成为本世纪生命科学研究中继基因组研 究后的主要研究热点。 1 2 蛋白质组的研究技术及进展 当今蛋白质组研究能够蓬勃发展，主要归功于以下三大技术突破 旧：( 1 ) 蛋白质组分离技术：8 0 年代固相化p h 梯度( i m m o b i l i z e dp h g r a d i e n t s ，i p g ) 的发明和完善，改善了双向凝胶电泳的重复性和上 样量；( 2 ) 蛋白质组鉴定技术：8 0 年代后期电喷雾质谱 ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ，e s i m s ) 和基质 辅助激光解吸飞行时间质谱( m a t r i x a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i n i o n i z a t i o nt i m eo ff l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ，m a l d i - t o f - m s ) 技术的发明，以及它们在蛋白质分析中的成功应用；( 3 ) 利用生物信 息学进行蛋白质结构和功能预测：蛋白质双向电泳图谱的数字化和分 析软件的问世，不少物种的双向电泳和蛋白质数据库、基因组数据库 的相继建立和完善。蛋白质组的整个研究过程包括：样品处理、蛋白 质的分离、蛋白质鉴定和分析等步骤。蛋白质组的研究实质上是在细 胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成 千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技 术平台既蛋白质组学方法学研究是当今乃至相当一段时间内蛋白质 组学研究中的主要任务州。 1 2 1 蛋白质主要分离技术 1 2 1 1 二维凝胶电泳技术 鼠肝质腹蛋白质组方法学研究 二维凝胶电泳( t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o - p h o r e s i s ，2 - d e ) 是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。在2 一d e 中，蛋白质首先根据等电点的不同在第一向等电聚焦电泳( i e f ) 中分 离，接着被转移到第二向s d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 中根据 相对分子质量大小不同被分离，把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二 维平面上分开。 双向电泳具有极高的分辨率和灵敏度，可以同时显示组织或细胞 内各种蛋白，使它在了解细胞活动全貌方面具有无与伦比的优势 1 。 但是，传统的双向电泳技术也有明显的缺点如耗时、操作难度高，动 态范围有限，对于极酸，极碱性蛋白、疏水蛋白、低丰度蛋白效果欠 佳，大大地限制了其在蛋白质组学研究中的应用。 可喜的是近年双向电泳技术的发展使得蛋白质组学研究者可以 更好地利用这一技术来研究蛋自质组学，包括一些挑战性的领域。商 品化的预制胶条使得跑高质量的、高重复性的2 一d e 电泳的技术难度大 大下降。胶条的再水化及加样方式也有改进脚。 在样品制备方面，近年来人们在经典的尿素、去污剂加还原剂体 系的基础上进行了极大的改进，引入些新的离液剂如硫脲和丁基脲、 去污剂如s b 3 - 1 0 、还原剂如d t e ，使裂解液的蛋白溶解能力有了很大 的提高。同时分步连续提取策略的应用使根据溶解性的差别把蛋白分 为可溶性蛋白、膜蛋白和沉淀蛋白，分别采用由弱到强的样品提取液， 结果表明这一策略对于膜蛋白的提取是很成功的阳1 。 多腔电解仪( m u l t i c o m p a r t m e n te l e c t r o l y s e r ) “町是采用与固 相p h 梯度介质相同的化学成分来形成分段的p h 梯度，通过两个等电点 跨越所分级组分等电点范围的固定膜形成一个等电点陷阱将纯化的 蛋白捕获。分级收集的样品被分流到一个腔( 通常配备3 至i j 6 个样品 腔) 。并去除了盐和一些干扰物。如脂肪酸和胺等。 荧光差异双向凝胶电泳( t w o d i m e n s i o n a lf l u o r e s c e n c e 硕士学位论文 d i f f e r e n c ei ng e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 d e - f d i g e ) 。利用传统的双 向电泳及染色方法进行表达蛋白质组的比较研究经常被凝胶，样品和 染色时操作的差异所困扰。近年来，用一块胶来分离不同荧光染料标 记的两个或多个样品显著地减少了这种困扰，提高了重复性n ”。最近 的技术革新，特别是内标的引入，进一步提高了这一技术的定量的准 确性和统计的可靠性n ”。2 d e - f d i g e 所使用的染料为n 羟基琥珀酰二 亚胺衍生物，可以特异性地共价标记蛋白质赖氨酸的氨基，可以补 偿由于标记而失去的赖氨酸残基的正电荷且仅仅带来极小的几乎相 同的分子量增加因而防止了等电点偏离( 至少在p h 低于1 0 和低分子量 范围) 和假的蛋白点的出现。 带有内标的2 d e - f d i g e 的流程是分别将两个蛋白抽提物用两个截 然不同的荧光染料n 羟基琥珀酰二亚胺衍生物p r o p y l - c y 3 和 m e t h y l - c y 5 共价标记。同时再取等量的这两个蛋白抽提物混合后用第 三种染料c y 2 标记作为内标。然后把用三种染料标记的样品混合后加 到一个凝胶条上进行双向电泳，使用每种染料的激发波长交替照射濒 胶就可以显示相应的蛋白点图像。并通过颜色重叠的图像结合标准的 图像分析软件或者使用专门为2 d e - f d i g e 设计的软件如d e c y d e r d i f f e r e n t i a li n g e la n a l y s i s 进行分析。然后从凝胶上将表达的蛋 白点切下来供质谱鉴定。这一技术与通常的考马斯亮蓝和银染方法相 比灵敏度和线性都有显著的提高。而且不需要电泳后的处理( 固定或 染色) 因而减少了蛋白特别是低分子量蛋白的损失。更重要的是同一 块凝胶上荧光蛋白点的差异仅仅是由于样品本身的差异而不是实验 的差异造成的。因此2 d e - f d i g e 真正可以作为定量蛋白质组学差异显 示的首选工具n ”。 由于一些新设备的出现，如取点机、酶解仪及点处理器等，更有 如点处理工作站将它们集成在一个工作站内，计算机自动控制，机械 臂操作，专用来处理经图像分析后的双向电泳凝胶，使基于双向电泳 4 鼠肝质膜蛋白质组方法学研究 技术的蛋白质组分析的通量大大提高。 1 2 1 2 蛋白质组重叠群 一块双向电泳凝胶对复杂蛋白混合物的分辨率有限，太大的凝胶 无论在电泳、操作及图像分析上都会带来很大麻烦，期望的特殊p h 梯度范围也不易达到。h u m p h e r y - - s m i t h n 铂等创建蛋白质组重叠群来 提高双向电泳的分辨率。利用多块在不同p h 梯度和( 或) 分子量上相互 重叠的双向电泳图谱，结合图像分析技术拼接成一张完整的双向电泳 图谱，其实质是使每一块凝胶在较窄的龃梯度和分子量范围内分离蛋 白，以提高分辨率。蛋白质组重叠群不但增加了上样量，而且扩大了 双向电泳的p h 梯度范围和分子量范围，检测到更多极酸极碱性蛋白 质，分离到更多的蛋白质组组分。该方法己得到成功运用，并将p h 梯度扩展到2 3 - i i 。 1 2 ，1 3 多维l c m s l l s 途径 为克服2 - d e 在分离p i 过大或过小以及疏水性强的蛋白质的局限 性，近几年来发展迅速的方法是液质联用( l c _ m s m s ) 。蛋白质混合 物直接通过液相色谱分离，然后进入m s 系统获得肽段分子量，再通过 串联m s 技术，得到部分序列信息，通过计算机联网查询，对该蛋白质 进行鉴定。 o p i t e c k 等首次报道多维色谱( l c l c ) 整合m s m s 技术分析蛋白 质混合物。l i n k 等人进一步提出蛋白质复合物直接分析( d i r e c t a n a l y s i so fp r o t e i nc o m p l e x e s ，d a l p c ) 方案。最近，w a s h b u r n 等 人【嘲在这方面取得了较大的突破。他们在多维l c - m s m s 的基础上提 出了m u d p i t ( m u l t i d i m e n s i o n a lp r o t e i ni d e n t i f i c a t i o n t e c h n o l o g y ) 方法，成功地分离和鉴定了酵母( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 中1 4 8 4 种蛋白质，其中包括一些低丰度的调控性蛋白激 酶。 多维l c - m s m s 技术尚处于探索阶段，目前还无法完全代替2 一d e 硕士学位论文 途径进行蛋白质组研究。但它能够弥补2 一d e m s 的一些技术上和方法 上的缺陷，如蛋白质在分离过程中的丢失、上样量的限制、较窄的分 离范围等，而且该方法没有偏向性，即能同等分离高丰度和低丰度的 蛋白质，并可以实现自动上样、自动收集、自动在线分析，常用于组 分少于l k d 的蛋白质、膜蛋白及低丰度蛋白质的分离n ”。 1 2 1 4 毛细管电泳 毛细管电泳的原理与蛋白等电聚焦电泳相同，但其分辨率远高于 蛋白等电聚焦电泳，而且可直接同质谱分析仪结合使用，因此具有广 阔的前景。毛细管电泳技术主要包括毛细管区带电泳( c z e ) 、毛细管 等电聚焦( c i e f ) 和筛板- s d s 毛细管电泳“”。c z e 主要依据不同蛋白质 的电荷质量比差异实现分离。c i e f 依据蛋白质等电点不同在毛细管内 形成p h 梯度而分离。筛板s d s - c e 依据蛋白质复合物在网状骨架中迁移 率不同而分离。与2 一d e 比较，c e 对蛋白质的分离可实现在线自动分析， 并可用于分子量范围不适于2 一d e 的样品分析，其缺点在于对复杂样品 的分离不完全。 1 2 2 蛋白质分析和鉴定技术 1 2 2 1 图谱分析 图谱分析作为双向电泳的重要一步，其作用是评价和量化电泳结 果。在蛋白质组学研究中，需要用图像分析软件进行正常和异常。或 发育不同阶段细胞、组织等电泳图谱间的匹配。因为“满天星”式的 2 一d e 图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图像上斑点的上调、下调 及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，因此找出差异蛋白 质点必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。在蛋白质组 学研究中，从样品制备、第一向等电聚焦、第二向s d s 聚丙烯酰胺凝 胶电泳、2 一d e 图像分析到基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪， 整个技术过程环环相扣，更加复杂。在各个环节中，图像分析既要对 上游各个步骤的结果做出定性和定量的评价，将一个直观的蛋白质二 鼠肝质骥蛋白质组方法学研究 维图谱数字化，还要为下一步的分析提供依据。将这些目标点切下， 通过氨基酸组成分析、n 端测序或质谱分析，确定是何种蛋白质，再 结合图谱分析数据和与内部和外部数据库比较的结果，做出结论。第 三代图像分析软件i m a g e m a s t e r2 de l i t e ，p d q u e s t ，m e l a n i e i i 等 应运而生，其共同特点是集成化、模块化和易于使用。由b i o r a d l a b o r a t o r i e s 开发的p d q u e s t 软件包是一个用于分析双向电泳凝胶 的、达到目前最新技术发展水平的多功能软件，可以获得高敏感、高 分辨的三维图像，保证了凝胶分析的快速可靠和易于管理，并且提供 自动蛋白点检测和匹配的可能性。此外。为了处理日渐复杂的2 一d e 图像数据，其他计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因 素分析也已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析等则可在未来 被采用( s m i t he ta 1 1 9 9 7 ) 1 8 o2 - d e 的分析软件正向着高重复性、 高智能化的方向发展。 1 2 2 2 生物质谱技术 伴随电喷雾电离( e s i ) 和基质辅助激光解吸电离( m a l d i ) 两项具 有划时代意义的“软电离”技术的出现，质谱变得更适用于分析生物 大分子聚合物一蛋白质、核酸和糖类，使质谱技术真正走入了生命科 学的研究领域。质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同 离子间的质荷比( m z ) 的差异分离并确定分子量。一个完整的质谱分 析系统由离子源、质量分析器和检测器3 个部分组成，再辅以进样系 统和后续分析系统。质量分析器是质谱的核心元件，决定着质谱的准 确度、灵敏度和分辨率等。常用的质谱分析技术有以下四种：离子阱 质谱( i r o nt r a p ，i t ) 、飞行时间质谱( t i m e o f - f r i g h t ，t o f ) 、四极 杆质谱( q u a d r u p o l e ，q ) 和傅立叶变换离子回旋共振质谱( f o u r i e r t r a n s f o r mi o nc y c l o t r o n 。f t i c r ) 。质谱技术能从复杂的样本中定 性、定量分析蛋白质，由于其灵敏度高 可达到f m o l ( 1 01 5 ) 乃至 a a o l ( 1 0 - 4 ) ，速度快，易于实现自动化，已经成为蛋白质组研究中 硕士学位论文 主要的蛋白质鉴定技术。质谱技术还可用于蛋白质磷酸化、硫酸化、 糖苷化以及其它一些修饰的研究“”。在蛋白质组学研究中，目前最为 常用的质谱分析系统包括两大类：以单一质谱为基础的和以串联质谱 为基础的。以单一质谱为基础的质谱分析系统以m a l d i t o fm s 为代 表，串联质谱以e s i m s m s 为代表。 1 2 2 2 1 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱( m a t r i xa s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o nt i m e - o f - f i g h tm a s ss p e c t r o s c o p y ，m a l d i t o fm s ) 是将作为离子源的m a l d i 和分析检测的飞行时间质谱联用。 m a l d i t o fm s 常用于蛋白质的肽质量指纹图谱( p e p t i d em a s s f i n g e rp r i n t i n g ，p m f ) 鉴定。p 虾是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白 酶( 最常用的是胰蛋白酶) 水解后得到的肽片段质量图谱。 由于每种蛋白质的氨基酸序列不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片 段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹图 谱( f i n g e rp r i n t i n g ) 。将获取的肽质量指纹图谱在蛋白质数据库中 检索，寻找具有相似p m f 的蛋白质，就可以初步完成蛋白质的鉴定。2 d 电泳凝胶上的蛋白质可被原位酶切或转印至u p v d f 膜上酶切获得肽 混合物，经质谱分析得到p m f ，通过数据库查询鉴定蛋白质唧1 。 1 2 2 2 2 电喷雾电离串联质谱 电喷雾电离( e s i ) 利用位于一根毛细管和质谱仪进口间的电势差 生成离子，电喷雾电离的特点是可生成高度带电的离子而不发生碎 裂，这样可将质荷比( m z ) 降低到各种不同类型的质量分析仪都能检 测的范围，离子的真实分子质量可根据质荷比及电荷数算堙”。e s i 的大优势是可方便地与分离技术联用，例如在使用e s i 离子化前， 用高效液相色谱( h p l c ) 和毛细管电泳( c e ) 可方便地去除待测物中的 杂质。通过电喷雾电离串联质谱( e s i m s m s ) 分析质量肽谱的最大 优点在于，不仅获得了每一肽段的分子质量，还可测定肽段的氨基酸 鼠肝质膜蛋白质组方法学研究 序列。由于蛋白质序列有很高的专一性。因此若覆盖率达到2 0 一 8 0 ，根据分子量和肽序列所查询的结果是相当可靠的。实际上， 由于某些蛋白质序列的高度专一性，只需根据2 m 3 段肽的分子量和序 列信息，即可鉴定该蛋白嘲。 1 2 2 2