（生物物理学专业论文）玉米肽的制备、特性及活性研究.pdf

荫林农业太学硕士学位论文 玉米肚的制备、特性蕊活性研究 摅要 玉米薅白粉蔻玉采温法生产淀粉的主要副产物之一。它舍有6 1 3 淡上的蛋自 质，努舔簸盼蛋由屡为醇溶蛋白，难溶于水。其中越需氨基酸舍登高于大豆和小 袁，撂籁鬣酸拳氛氨酸含量较撼，眼蟋了其在会游簇域妁应j l 。麓茸，多数淀糖 厂家把其低傍鉴馋饲辫艨孝 出售。随麓科学技术妁发展，玉拳蛋白馋为饲挝将不 能满足予淀静工业善l 产茹深蕊工畿要求。面对落夸世界安鸯蕊资源严蘩短缺瑰 状，只有运用高新技术对玉米蛋白粉进行深加工，才能提高其附加值，提高企业 转经涛囊乏蠢，驮蕊提高砖玉泰费嚣翡综合到舅李； 筑代营养学研究发现，人类摄食的薅白贡经消亿酶作礴薏，大多数曼以低敞 薅不是氨基酸形式暖敬秘，豆纽成这糖低默磅氯基酸不一定是妊需氨基簸。这馥 豫肽晗了巽有为消化壤妖槛凌玲，逐葵有静多良好鲢劝貔转穗和生理活髓，可以 被广泛地应用列食品领城申去。 玉米获是蒌拳蛋白霞经酶水簿、靖铡藤器褥翻钧短簸混合物。霹本在她领域 的研究处于世界领先位罄，日本、西欧、羡国的盎米肤类食品早巳上市。我国对 基拳敢妁辑霓还缝于起步玲我，仅隈于联凳投逮，玉券放食嚣几乎空白。盟一簸 均采用单一酶进行水解，对水解后的玉米肢韵理化植质研究较多，对英点物活憾 研究较少。 本文避鹰混合蛋酶对玉米救裁备进行了攥索。分期运璃草翳索试黢和点交 试验方法确定了蹲对酶的最馈水解条佟。对鼹钴黪单独水烬以及双酶共圊水麓制 静玉采腻避嚣了沲较辑凳，最终碡定援双酶分步拳解涤稍备玉拳蘸鼹滚锤酶鼹条 件。即：温度为5 5 ，底物浓度为5 ，p h 分刺为两种酶最迨( 碱性蛋白酶为 8 5 。拳瓜蛋白酶两7 。5 ) ，竞戏4 链弱酶与赢耪宠的兜塌加碱擅蚕密跨，水勰l 。飘 詹，再以3 ，5 的酶与底物比加禾瓜蛋白酶，水解1 5 h 。此时水解液中氯溶指数 x 葶口拳赆淀d h 分裁运到8 t 0 6 锈势8 0 9 7 。分耪了各瓣索霹拳鼹兹装的影响。 靖求辫液进行了腻苦、脱色、减蕊浓臻、冷莲干燥等精秘步骤研究，壤定了予粉 玉米默划备秘工艺漉程及各参数。最终姆到 孥李速6 5 、含量在7 5 左右的于 粉玉来觚。对玉米是乏罅鳃轰、缓博注壤及生璃涤谯遥舒7 研究。表臻：玉米靛富 含谷氨酸和亮氨漩火部分肽分子量分布在5 0 0 0 d a 以下。极太改善了玉米蛋白 粉霹枣幂溶蛙，饕有溶薜幢荸受p h 毯影响及骞滚度抵粒疫等黪姓；透具有焱多 的生理活性：抗氯化、促进酵母发酵活t 生遂嚣有抗疲势，促进乙醇代谢活性。 吉林农业大学硕士学位论文玉米肽的制备、特性及活性辑究 且有量效荧系。 运用酶工程技术对墨米蛋白粉进行深加工制得新一代功能保健因子一一玉 米肽，嚣# 了玉米蛋白粉难溶于水和氨基酸分布不平衡的特性，良好的溶解帔使 玉末默表现毒许多是静的注蓑覆奎联活往，蒋 睾为缳捷食品曲艨翳而广泛应髑于 食品及医药领域。随着人们崇尚保健意识的增强，玉米肽的开发必将会有广阔的 市场前荣。 关键词：嚣寒蛋白耪歪米憝援溪 l l 砉耨袭馥大学磺士学往论文 玉柬靛秘弱备持整聂活挂研究 a b s t r a c t c o r np r o t e i np o w d e ri st h em a i no n eo fb y p r o d u c t st h a tp r o d u c et h es t a r c hi n c 0 1 t 1w e t m i l l i n gp r o c e s s i ti m p l i e sm o r et h a n6 0 p r o t e i na n dt h em a j o rp r o t e i n f r a c t i o n sa r ez e i n ( 6 8 ) i ti si n s o l u b l ei nw a t e r t h ec o n t e n to fe s s e n t i a la m i n o a c i d si sh i g h e rt h a ns o y b e a na n dw h e a t b u tt h ec o n t e n to f l y sa n dt r pi sl o w t h e s e d r a w b a c k sl i m i ti t s a p p l i c a t i o n 幻t h ef 。醴f i e l d s 。n o w 。m o s to fs t a r c h e sf a c t o r i e s r e g a r di t a st h ea n i m a lf e e dt os e l li nl o wp r i c e f a c i n gl a c kp r o t e i nr e s o u r c e si nt h e w o r l d ，t h ec o r np r o t e i ni s u s e da st h ea n i m a lf e e dc a nn o ts a t i s f i e dw i t ht h e r e q u i r e m e n tt h a td e a lw i t ht h eb y - p r o d u c t so f s t a r c hi n d u s t r i e s - - c o r np r o t e i np o w d e r o n l yu s i n gm o d e r nh i g ha n dn e wt e c h n i q u e st o d e a lw i t ht h ec o r np r o t e i np o w d e r d e e p l y ，w ec a n i n c r e a s ei t sa d d i t i o n a lv a l u ea n di n c r e a s et h ee c o n o m i cb e n e f i to ft h e b u s i n e s s t h u si tw i l li m p r o + et o t a lu t i l i z a t i o nr a t eo ft h ec o r nr e s o u r c e s + t h em o d e r nn u t r i t i o nr e s e a r c hd i s c o v e r st h a tt h ep r o t e i ni sd i g e s t e da n da b s o r b e d m a i n l yi n l o wp e p t i d eb u tn o ti na m i n oa c i d sa f t e re n z y m e sh y d r o l y z i n g a n dt h e a m i n oa c i d sw h a ti sc o n s i s t e do fl o wp e p t i d em a yn o tb ee s s e n t i a la m i n oa c i d s 。殛 a d d i t i o n a lt oh a v i n gt h ee a s i l ya b s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i c ，t h e s el o wp e p t i d es t i l lh a v e m a n yg o o df u n c t i o n sc h a r a c t e r i s t i ca n d t h ep h y s i o l o g i c a la c t i v i t y t h e yc a nb eu s e d w i d e l yi nt h ef o o d f i e l d c o r np e p t i d ei st h em i x t u r eo fs h o r tp e p t i d e st h a tt h ec o i t ip r o t e i ni sh y d r o l y z e d b ye n z y m e sa n da g a i n i s r e f i n e d j a p a n t a k e st h ef i r s tp l a c ei nt h ef i e l do fc o f n p e p t i d e s r e s e a r c h c o mp e p t i d ef o o dh a sa p p e a r e do nm a r k e te a r l y i no u rc o u n t r y , t h i sf i e l ds t i l li sp i a c e di nt h es t a r t i n gs t a g ea n do n l yh a st h e o r i e sr e p o r t s t h e r ea r e f e wc o r np e p t i d ep r o d u c t si nt h em a r k e t c o r np r o t e i ni s h y d r o l y z e do n l yb yo n e e n z y m e i nt h e i rr e s e a r c h e sa n dp r o p e r t i e so fc o i mp e p r i d ea r er e s e a r c h e dm o r eb u tt h e p h y s i o l o g i c a la c t i v i t ys t u d i e s a r er e s e a r c h e dl e s s ， t w ok i n d so fp r o t e i ne n z y m e sh a v eb e e nu s e dt o h y d r o l y z ec o r np r o t e i n t o p r o d u c e c o r np e p t i d ei nt h i s a r t i c l e 。t h r o u g h t h e s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s a n d o r t h o g o n a l t e s t ，t h e o p t i m u mh y d r o l y z i n g c o n d i t i o n sh a v eb e e nd e t e r m i n e d ： t e m p e r a t u r e i s5 5 9 c ，p hv a l u ei st w oe n z y m e s o p t i m u mp hv a l u e 珏o f a na l k a l i n e p r o t e a s ei s 8 5a n dp hv a l u eo fp e p s i ni s7 5 、a f t e rh y d r o l y z i n g1 5h o u r sa d d i n g a l k a l i n e p r o t e a s e w i t ht h e 4 e n z y m e c o n c e n t r a t i o n 。c o r n p r o t e i np o w d e r i s i n 吉转袭堑大学磺圣学生论变 至拳靛酶饕l 吝、特性聂活穗磷究 c o n t i n u o u s l yh y d r o l y z e d 1 , 5h o u r s a g a i na d d i n gp e p s i n w i t h 3 5 e n z y m e c o n c e n t r a t i o n i nt h i sc o n d i t i o nn i t r o g e n s o l u b i l i t yi n d e x ( x ) a n dd e g r e e o f h y d r o l y s i s ( d h ) a l er e s p e c t i v e l y 81 。0 6 a n d8 0 9 7 t h ee f f e c to ff a c t o r so n h y d r o l y s i sh a s b e e na n a l y z e d t h e nt h eh y d r o l y s i si sr e f i n e db y r e m o v i n g b i t t e r n e s s 、 c o l 0 0d e c o m p r e s s i o nc o n d e n s i n ga n di c ed r y i n ga n dt h ep r o c e s sp a r a m e t e r s t o p r o d u c ec o r l lp e p t i d ep o w d e rh a sb e e nd e t e r m i n e d a tl a s tc o r np e p t i d ep o w d e ri s g a i n e da n di t sg o t t e n r a t ei sa b o u t6 5 a n dp r o t e i nc o n t e n ti sa b o u t7 5 t h e c o n s t i t u t i o n 、p h y s i c a l a n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sa n dp h y s i o i o g i c a lf u n c t i o no fc o r n p e p t i d ep o w d e r a r es t u d i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ec o r np e p t i d ei sa b u n d a n ti ng l u a n dl e ua n dm o s to fm o l e c u l a rw e i 曲td i s t r i b u t i o n si s b e l o wa b o u t5 0 0 0 d a t h e s o l u b i l i t yi nw a t e r i si m p r o v e da n di sn o tc h a n g e a b l ew i t ht h ec h a n g i n go fp h i th a s l o w v i s c o s i t y i n h i 旗c o n c e n t r a t i o n + f u r t h e r m o r ec o r n p e p t i d e h a s m a n y p h y s i o l o g i c a la c t i v i t y ：a n t i o x i d a t i o n 、p r o m o t i n g y e a s t f e r m e n t a t i o n a c t i v i t y 、 a n t i f a t i g u e 、p r o m o t i n gt h e a l c o h o lm e t a b o l i s ma c t i v i t ya n d h a sq u a n t i t ya n de f f e c t c o n n e c t i o n u s i n ge n z y m e e n g i n e e r i n gt e c h n i q u e s ，c o r np r o t e i np o w d e r i sp r o d u c e dd e e p l y i n t oc o r np e p t i d ew h a ti san e wg e n e r a t i o nf u n c t i o nf a c t o nc o r np e p t i d em a k e su p t h e d r a w b a c k so fc o r n p r o t e i n s u c ha su n b a l a n c e da m i n oa c i d s c o n s t i t u t i o n a n d i n s o l u b i l i t y i nw a t e r b e t t e rs o l u b i l i t yc a nm a k ec 0 1 t lp e p t i d ep r e s e n tm a n yg o o d c h a r a c t e r i s t i ca n dp h y s i o l o g i c a la c t i v i t y a tt h es a m et i m e i tw i l lb ee x t e n s i v e l y a p p l i e dt o t h ef a wm a t e r i a lo fh e a t hf o o d ，a sp e o p l e sc o n s c i o u s n e s so fh e a l t hi s b u i l d i n gu p ，t h ed e v e l o p m e n to fc o r np e p t i d ew i l lh a v et h ev a s tm a r k e tf o r e g r o u n d n e c e s s a r i l y k e y w o r d s ：c o mp r o t e i np o w d e r c o r n p e p t i d ep r o p e r t i e s i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 d 学位论文作者签名：召阿钮同签字日期：= 工0 0 3 年月招 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：李身笛网导师签名：了筘幻 签字同期： 彩年月舟日 签字同期：州 年乡月7 开 学位论文作者毕业后去向：高才木谚妙次孳峙物懒乞 酢靴矗警警譬! 酽诲尼弘唧7 7 通讯地址：吉林右妙辑彤邬# p 尸艺葡j 哳匕台邮编：4 d 8 雠 内容提要 玉米献是玉采蛋白质经酶水解所得酶短获混合耘。我嚣在诧方衙的研究正处 于起步阶段，多数集中在用单一酶法水解蚕白质，得率较低，且对燕米肽的理化 性袋强莲较多，对獒生理活注摄遂较步。 本文确定了双酶分步水解玉米礞白粉制备玉米肽的条件，即：温度为5 5 ， 瘾魏浓度为5 ，p r i 分裂荛嚣黪酶袋逐( 碱牲蛋是黪舞8 。5 ，寒基蚕鑫酶老? 。5 ) ， 先以4 的酶与底物比的比例加碱性蛋白酶，水解1 5 h 后，再以3 5 的酶奄底 物比如木瓜簧自酶，水鳃1 5 h 。此跳水解液孛氮溶指数x 和水想度d h 分别达 至8 1 0 6 和8 0 9 7 。并分祈了各因素对荤酶单独水解和双酶分步水解时对水解 效果的影响。确定了双酶水解玉米蚕白粉制备玉米肽的工艺流程，对各工艺参数 遗行了劳旃。得到经精制工痔处理酶玉米靛千粉，获含量( 子蓉) 在7 5 袭右， 得率在6 5 左右。蕊米肽富含谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等氨基酸，大部分肽分 子鬟分布在5 0 0 0 d a 以下。舆赛较褰溶簿疫，显不瞧鹾变诧薅交诧，还买餐褰 浓威低粘度的优点。同时具有众多生理活性：促进酵母发酵、类超氯化物歧化酶 ( 类s o d ) 活牲、促进乙醇霞谢，技疲劳落活性。 玉米肽的性质及活性均弥补了其原料玉米蛋白质水溶设差、氪蕊酸分布不平 衡簿缺点，为提高玉米蛋白粉的附加值提供了一条可行的途径，为其在食品及其 它领域酶应丽提供了依据，为工韭诧生产奠定了一定酶基础。 嵩嚣农韭太擘礤士学饿论文 玉米敷甓钢备，特性及活臻舜究 1 前言 3 0 多年前人们直认为蛋白质经肠管蛩白酶水解成游离氨基酸后才能被吸 收。直至61 9 6 8 年，现代营养学研究发璃，黉白旗经蛋自酶承解后燕l 三 低蕊( 二 膝、三窳) 形式暇敬豹，以游离氨鏊酸彩式强牧游比例攥，、，且蕊 游离蒙基酸 消纯更快、暇收更多h 引。这表翳获妁生物效蛰謦曩营养镰篷比游蹇爨基酸更凑。 髫此默教吸收妁戏点及其生理功熊才教人们广为重视，使其槌关的研究变得非 常活跃。 1 1 生物活性肽的概述 1 1 1 概念 生物活性肮是一种以失活状态存在的具有氦基酸顺序酾多歃，通过体内清化 释放，并在动衔的硒道消化过程中，充警新陈代瀣酌潜在生理效应物f 3 】。由俸农 产生酾神经幼髓敖被称为内漯辜孛经功链默( e n d e r p h i n s ) ，出援物蛋自屡水艇 ；导到 黪歇波髂为努源摊经功能肽( e x o r p h i n s ) 。 i 。1 。2 性质及生理功能 研究发现，肽较蛋内质相比，具有良好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性， 低分子肽不会产生过敏反应等优点。除此之外，还具有众多的生理活性，如促迸 发酵、抗氧化、降m 压、降胆固醇、抗疲劳、促进乙醇代谢等活性f 4 翔。 1 1 3 分类 活性蕊爵按愿辩采滚和傈髓功来戈1 分( 6 。按器糕来源戈1 分的类别有：乳黢、 太戛效、玉米默、或豆默、卵自肽、謇产肽、水产默等。按摆健功g 划分的类别 有：易泌化吸收肽、抗藏肽、虫管紧张素转换酶抑制歇( 简称a c e i 肽) 、抑制 胆圃醇肽、促进矿物质吸收肽、机体舫御功能肽、肝性脑病防治肽等。 1 1 4 制备 活性肽的铆备方法主要有p 。】：天然活陡肢的分离摄取，食晶蛋白质求躲f 惫 括酸水解、碱水解、酶承解) ，化学合成法，基因重组法、徽生物发酵法等。 过去，科学家一直未对涮角贮藏蛋蠢翔大耍、玉米、小麦等释予蛋自移动甥 营养蛋蠢及乳蛋白承解锻备生黪活性敷给予应有的莛视，但是觋在，科学家逐灏 注意到；在豢养蟹自的多默链内郏可能酱遍存褒着功能区，选择适当的黉白酶水 鳃这些多肽，有可能将其释放出来，从而制备各种各样的生物滔性肽。较酸水解 和碱水解比较，酶法水解蛋白质具有多种优点【i n ”j ：蛋白质的酶水解是一种不完 全、不彻底的水解，其产物主要是肽而不是氨基酸。反应条件温和，反应时间短， 吉林农业大学硕士学位论文玉米肤的制备、特性及活性研究 效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度高，产物易分离，成本低。 而通过基因工程、化学合成的方法生产生物活性肽又需要相当大的投入而且其 安全性还需要进行研究【”。因此酶法水解蛋白质制备活性肽是目前生产活性肽的 主要方法。 1 2 玉米蛋白粉的概述 l _ 2 1 概念 玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的副产物，它是由玉米籽粒经湿磨法工艺制得 的粗淀粉乳经淀粉分离机分出的蛋白质水即麸质水，用浓缩离心机或沉淀池浓缩 后，再经脱水干燥制成1 1 2 ，俗称黄粉子。 1 2 2 组成及性质 玉米蛋白粉含蛋白质高达6 0 以上，其中玉米醇溶蛋白约占6 8 ，能溶于 7 0 8 0 的乙醇：谷蛋白约占2 8 ，不溶于水或醇及盐溶液而溶于稀碱；含少量 的球蛋白和白蛋白【10 。玉米蛋白粉中必需氨基酸含量高于大豆和小麦，含有较多 的亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸等氨基酸，但赖氨酸和色氨酸含量很低， 其化学组成见表1 、表2 ： 表1 玉米蛋白粉的化学成分( ) t a b e l1t h ec h e m i c a lc o m p o s i t i o no ft h ec o r i p r o t e i np o w d e r ( ) 玉米蛋白粉 c o r l 2p r o t e i n1 06 5 】2 3 应用现状 由于玉米蛋白粉水溶性差，且赖氨酸和色氨酸较缺乏，严重限制了它在食品 工业中的应用。目前，玉米蛋白粉在国内主要将它应用于饲料工业或排放自然。 既浪费了宝贵的粮食资源，又造成了对环境的污染”1 。 】3 玉米肽的概述 1 3 1 研究现状 在玉米肽的研究领域，日本处于世界领先位置，文献报道较多，已经将玉米 肽开发成低热量早餐饮料】，还开发出了降血压作用的玉米肽混合物“缩氨肽” 2 吉林农业大学硕士学位论文玉米肚的瓤备、特性爱活性研究 等食品及医药品i l ”。此外，欧洲、美国等国也早已有玉米肽产品上市 7 。1 9 7 7 年，e d l e r - n i s s e n 研究了玉米面筋粉的酶水解，并研究了温度、p h 、酶浓度对水 解的影响“。1 9 8 9 年，j u l i e e 等研究了玉米面筋的酶水解，对酶浓度和粒度对 水解的影响进行了研究【1 。日本的山口孙一 2 0 1 和佐野良史【2 】通过对玉米蛋白进 行特定的酶水解，除去游离氨基酸后制得的玉米肽分子量较小；粘度不随浓度的 增加而上升，即使在5 0 的高浓度下，流动性也很好；透明性好，对热稳定；具 有等电点时不易沉淀等特点。1 9 9 0 年t s h i n ，y a 2 2 1 等采用嗜热菌蛋白酶和肌动蛋 白酶降解玉米醇溶蛋白研制出无苦味高f 值寡肽，产量达5 6 。1 9 9 1 年日本学 者s m i y o s h i l 2 3 , 2 4 】等报道了玉米醇溶蛋白酶解得到的l p p 是迄今发现的蛋白水 解得到的最好的a c e i 肽。1 9 9 6 年y n a k a m u r a a s l 等报道了玉米肽除降血压外还 具有抑制乙醇中毒和恢复机体疲劳的作用。同年，s y a n o 【2 刨等报道用嗜热菌蛋白 酶水解经尿素变性的玉米醇溶蛋白，酶解率可达1 0 0 。 表2 两种原料必需氨基酸含量对照表( 占总蛋白质) t 曲e l2c o n t e n to f o ft w ok i n d so fr a wm a t e r i a l se s s e n t i a la m i n oa c i d s ! ! ! ! 坚! ! 堕! 旦望! ! ! ! ! ! 呈竺2 氨基酸 a m i n oa c i d 玉米蛋白粉 c o r np r o t e i n p o w d e r 大豆粉 s o y b e a np o w d e r 我国对生物活性肽研究开发起步晚，从事活性肽的研究单位也多从医药角度 出发，研究力量及投入较少，限制了活性肽的药食两用功能的发挥，市场上国产 的活性肽药品和食品寥寥无几【7 】。但近几年研究逐步活跃起来，报道渐多，前景 看好。1 9 9 7 年翟瑞文1 等用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶对玉米面筋粉进行水解， 吉林农业大学硕士学位论文 玉米肽的制备、特性及活性研究 获得制取玉米肽饮料的工艺。1 9 9 8 年翟瑞文1 等又报道了玉米肽的制备特j 胜与 应用的研究结果。2 0 0 0 年鲁晓翔 2 鄙等报道了酶法改性玉米蛋白功能特性的研究 结果，该研究主要材料为玉米蛋白粉，所用酶为y 一胰蛋白酶。同年王遂1 等报 道了微生物蛋白酶对玉米皮蛋白水解作用的研究，他们采用枯草芽孢杆菌1 3 9 8 中性蛋白酶对玉米皮蛋白水解，使其转变为可溶性多肽，最终达到分离、提取蛋 白肽的目的。1 9 9 9 年王梅等【3 州报道了酶解黄粉蛋白制备可溶性肽的研究，所用 酶为碱性蛋白酶，讨论了温度、p h 、底物浓度、酶浓度及预处理对水解的影响。 2 0 0 2 年何慧等旧报道了大豆和玉米蛋白酶解肽及其活性研究，所制备活性肽具 有抗羟基自由基活性。目前的研究总结起来还存在如下问题：一是大多集中在高 得率玉米肽所用蛋白酶的筛选上的研究，且一般均是采用单一酶对玉米蛋白粉进 行水解；二是对水解后的玉米肽的性质研究较少，多数是对功能性质如乳化性、 粘度等的研究，而针对有生理活性的肽的研究相对较少。 1 3 2 制备 1 3 2 1 原料的选择 玉米蛋白质中含有高比例的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等疏水性氨 基酸和脯氨酸、谷氨酸等，很少含有赖氨酸等碱性氨基酸，这种独特的氨基酸组 成使玉米蛋白水溶性差，营养价值不高，而这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白 质成为多种生理活性肽的来源 j 7 ，降压肽、抗疲劳肽、醒酒肽等。一般，国外均 用玉米醇溶蛋白 2 3 , 2 4 , 2 6 1 做原料，来生产活性肽，但考虑到玉米蛋白粉中含有6 8 左右的醇溶蛋白，所以以玉米蛋白粉为原料制备玉米肽能降低生产成本，同时变 废为宝，大大提高玉米蛋白粉的附加值和对玉米资源的综合利用率。 1 3 2 2 酶的选择 选择酶主要注意以下几点：一是酶的安全性、经济性、有效性；二是酶具有 选择性，作用于疏水性氨基酸的酶，会去掉或减轻水解产物的苦味。三是单一的 纯化酶水解能力低，不利于底物转化率的提高，一般均采用复合酶【2 】。目前应用 于大豆肽实际生产中用酶有胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中陛蛋白酶、木瓜蛋白酶， 其中碱性蛋白酶水解效果最好【3 ”。在对鸡肉的酶解研究中，木瓜蛋白酶水解物苦 味要小于其它酶类【3 ”。所以本试验选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解玉米蛋白 粉，它们均为食品级用酶，无毒、安全。用两种酶的目的是得到水解度高、小肽 类物质含量多、水解物苦味低的玉米肽。2 7 0 9 碱性蛋白酶能广泛地水解由疏水 氨基酸组成的肽键【3 ”，而木瓜蛋白酶切割分解点很多，大致优先分解精氨酸、苯 丙氨酸组成的肽键。所以采用两种酶共同作用玉米蛋白粉，有望得到较满意的 d 吉林农业大学硕士学位论文玉米肽的制备、特性及活睦研究 效果。 1 3 _ 3 理化性质 玉米肽改善了玉米蛋白粉的水不溶性，具有许多良好的理化性质：( 1 ) 溶解 性好、持水性高、高浓度低粘度等特点f 4 2 7 】( 2 ) 酸性条件下不易凝聚，等电点不 易沉淀( 3 ) 较强的乳化性和起泡性4 , 2 8 3 ( 4 ) 稳定性好”】 1 3 4 生理活性 玉米肽除了具有良好的理化性质外，主要还具有以下生理恬性：( 1 ) 易消化 吸收性1 叫( 2 ) 抗氧化性( 3 ) 消除疲劳( 4 ) 降低血氨浓度( 5 ) 降血压 2 3 , 2 4 , 2 6 ( 6 ) 促进乙醇代谢 1 3 5 开发价值和应用前景 吉林省盛产玉米，拥有得天独厚的资源优势，并有数家规模较大的玉米深加 工企业，但由于我省深加工产品少，因此淀粉厂的经济效益都不是很高口。美国 对玉米的整体利用率高达9 9 ，依靠玉米副产品的收入是全产品的收a - - 倍“。 随着科学技术不断发展，玉米蛋白作为饲料将远远不能满足对淀粉工业副产品玉 米蛋白粉的处理的要求。在世界蛋白质资源严重缺乏的情况下，深入开发玉米蛋 白粉的高附加值产品，能提高企业的经济效益，提高玉米资源的综合利用率，具 有重要的现实意义。 对玉米蛋白粉采用高新技术制备玉米肽进行的研究表明：玉米肽良好的溶解 性使其改善了玉米蛋白质的许多不良性质并表现出许多良好的特性。除具有溶解 性好的优点外，还具有良好的功能特性如高浓度低粘度等特性，利用此性质可以 将其应用为普通营养食品如高蛋白流体食品。它具有的生理活性如易消化吸收 性、促进微生物发酵、抗氧化活性可以作为生产酸奶、酱油、发酵火腿等发酵食 品的添加剂、运动食品、老年人食品、动物精饲料、s o d 替代品等食品及其它 原料。可以利用其抗疲劳、促进乙醇代谢等活性，开发成运动饮料，醒酒饮料等 功能饮料及其它原料。所以玉米肽可以被广泛地用作保健食品的原料。随着科学 技术的发展，人们生活水平提高，崇尚保健意识的增强，玉米肽的药食同源性将 更加显示其广阔的应用前景。 吉林农业大学硕士学位论文玉米肤的制备、特睦及活性研究 2 试验材料和方法 2 1 试验材料 玉米蛋白粉( 吉林吉发集团提供) 粉碎过8 0 目筛备用，蛋白质含量6 5 ， 水分含量7 3 碱性蛋白酶( 购自北京美的生物技术有限公司) 酶活力为2 1 6 万u g 木瓜蛋白酶( 购自广州酶制品厂) 酶活力为7 5 万u g 考马斯亮兰g 2 5 0f l u k a 进口分装 葡聚糖凝胶s e p h a d e x g 一2 5p h a r m a c i a 进口分装 胰岛素注射液中国江苏万邦生化医药股份有限公司 溴甲酚绿s e r v a 进口分装 昆明种小白鼠( 体重2 2 2 6 9 ) 吉林大学实验动物中心提供 其它试剂均为国产分析纯试剂 2 2 试验仪器 7 2 2 分光光度计山东高密彩虹分析仪器有限公司 电子天平s a r t o r i u s德国赛多利斯股份公司 水浴恒温振荡器s h z 8 8江苏省金坛市医疗仪器厂 精密酸度计p h 一3 c上海精密科学仪器有限公司 电热恒温水浴锅北京国华医疗器械厂 恒温磁力搅拌器金坛富华仪器有限公司 离心机常卅l 国华电器有限公司 蛋白质测定仪k d n ，0 4 型上海纤检仪器有限公司 旋转蒸发器r e 一5 2 a上海亚荣生化仪器厂 循环水式多用真空泵郑州长城科技有限公司核酸蛋白检测仪 立式灭菌器山东新华医疗器械股份有限公司 a g i l e n t 11 0 0 高效液相色谱仪安捷伦科技有限公司 微型高速万能试样粉碎机河北黄骅科学仪器厂 电子微量泵浙江新昌国康仪器厂 核酸蛋白检测仪h d2 1 c a上海康华生化仪器制造厂 2 - 3 制备玉米肽蛋白酶的筛选 2 3 1 测定指标 2 3 1 1 氮含量的测定1 4 0 6 吉林农业_ = i = 学硕士学位论文玉采献的制备特性厦活陛研究 2 3 1 2 水分含量的测定 2 3 1 3 酶活力的测定 4 1 】 2 3 1 4 氮溶指数( x ) 的测定 4 2 】 取一定量的酶解上清液，蛋白质总氮和上清液中可溶性氮由半微量凯氏定氮 法测得。 x = 清液中可溶性氮t 玉米蛋白质中总氮1 0 0 ( 公式1 ) 2 3 1 5 水解度( d h ) 的测定【4 3 1 取酶解上清液1 0 m l ，加入1 0 m l 的 3 0 m i n ，再将其离心( 4 0 0 0 r m p ) 3 0 m i n ， 性氮由半微量凯氏定氮法测得。 l o 三氯乙酸( t c a ) 溶液，混合振荡 取上清液，蛋白质总氮和上清液中可溶 d h = ( p 2 一p 1 ) ( p o - p 1 ) 1 0 0 ( 公式2 ) 其中：p 0 ：为玉米蛋白质中总氮 p l ：为酶解前玉米蛋白质中溶于1 0 t c a 的氮 p ，：为酶解后酶解液中溶于1 0 t c a 的氮 2 3 2 酶解单元操作： 精确称取玉米蛋白粉于5 0 m l 三角瓶中，按一定的比例( w 厂v ) 加缓冲液， 碱性蛋白酶用硼砂一氢氧化钠缓冲液，木瓜蛋白酶用磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液 配成一定p h 的悬浮液，搅拌均匀。放入恒温水浴振荡仪中，保温至所需温度， 向三角瓶中加适量碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶，开始水解。控制转速为1 0 0 r p m 左 右，并用4 m o l l 的n a o h 维持p h 值恒定。水解一定时问结束后，用4 m o l l h c i 调p h 至4 0 ，把三角瓶放人9 5 。c 水浴锅中，保持1 5 r a i n ，使酶失活。将水解液 离心( 4 0 0 0 r p m ) 1 0 r a i n ，记录上清液体积，并测定水解液的x 值和d h 值。 2 3 3 两种酶单独水解条件的初步确定 2 3 _ 3l 温度的确定 两种酶均按照4 5 。c 、5 0 。c 、5 5 。c 、6 0 。c 、6 5 。c 水浴温度进行水解，其它同 单元操作，水解1 h 。以d h 为指标。 2 , 3 32p h 值的确定 碱性蛋白酶分别在口h 为8 0 、9 0 、9 5 、1 0 0 、1 0 5 、1 】0 的条件下进行水 解木瓜蛋白酶分别在p h 为6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、8 0 的条件下进行水解，其它 同单元操作，水解1 h 。以d h 为指标。 2 3 3 3 底物浓度的确定 两种酶分别在底物浓度为2 、4 、6 、8 、1 0 、1 2 的条件下进行水 吉林农业大学硕士学位论文玉采脑的制备、簪性爱活性研究 解，其它同单元操作，水解1 h 。以d h 为指标。 2 3 3 4 酶与底物比的确定 两种酶分别在酶与底物比为1 、2 、3 、4 、5 、6 的条件下进行水 解，其它同单元操作，水解1 h 。以d h 为指标。 2 3 4 水解条件的优化 依据单因素试验初步确定的酶解条件，选择温度、p h 、底物浓度、酶与底 物比作为试验因子，拟采用i - 9 ( 3 4 ) 正交表进行正交试验，分别对两种蛋白酶水 解玉米蛋白制备玉米肽水解条件进行优化。其它同单元操作，水解1 o h 。以d h 为指标。 表3 碱性蛋白酶试验方案 里些! ! 里苎里! 堕墨! ! ! 型望! ! ! ! 塑! ! 鉴型! ! ! 旦! ! ! ! ! ! ! 温度( ) p h 值底物浓度【s 】( ) 酶与底物比【e ，s 】( ) t e m p e r a t u r ep h s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n e n z y m e c o n c e n t r a t i o n abcd 表4 木瓜蛋白酶试验方案 ：! ! ! ! ! 兰里：堡垒翌! 璺塑! 里! ! ! 竺12 竺璺12 竺! ! ! ! ! 温度( ) p h 值 底物浓度 s 】( )酶与底物比 到s ( ) t e m p e r a t u r ep h ab s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n c e n z y m e c o n c e n t r a t i o n d 2 3 5 水解时间的确定 按正交试验所确定的最佳水解条件即温度、p h 值、底物浓度、酶与底物比， 分别对两种酶水解0 5 h 、1 0 h 、1 5 h 、2 0 h 、3 o h 、4 o h 、5 0 h 时酶解上清液的 d h 进行测定。 拳搏农娃大学硕士学蒜论文差米赋的割备、特蛙最活性铲究 2 3 6 提离酶解液d h 的方法 2 _ 3 6 ，1 加热对d h 的影晌 将配成一定浓度的玉米蛋白粉的三角瓶鬣于9 0 。c 东浴中2 0 m i n 一3 0 r a i n ，冷却 至反应溢度。永解1 , 0 h 。以d h 为指标。 2 3 6 2 髹瓣敉凌对d h 豹影躺 拨酸性臻自瓣为铡，烽玉米蛋白粉经粉碎后分别过4 0 、8 0 、1 2 0 目筛子，水 鼹1 + o h 。以d h 为指标。 2 3 。7 双酶分步水解条件的确定 2 3 7 1 加酶j 慎序的确定 在底物浓度定的条件下，按两种酶的最适条件迸行分步水解，郄先接酶i 的阼用条件加酶作甭一敬对简后湄至酶l i 的作焉条件，褥禳酶娃作掰一段对趣。 种颓序是先翔碱性蛋良酶，后麴本悉蛋自酶。及之为另一秘蹶序。各水勰1 o h 。 以d h 鸯指标。 2 , 3 7 2 瀑度的确定 在酶i 温度确定的条件下，加酶i i 时，分别在温度为5 5 。c 、6 0 。c 进行分步 水船，各水解1 o h ，以d h 为指标。 2 3 7 3 水解时间的确定 在酶1 分舅目承解1 o h 、1 5 h 、2 o h 、2 5 h 、3 o h 后，船酶 l 东籍1 0 h 、l + 5 h 、 2 o h 、3 o h 、4 o h ，以d h 为捂标。 2 3 7 。4 酶与底数毙瓣确定 薅l 的酶与底物比不变按酶i l 的酶与底物比为4 5 、3 5 、2 5 、1 5 进行分步水解，以d h 为指标。 2 4 玉米肽干粉制备的工艺流程 原料一粉碎一水解一灭酶一分离脱色、脱苦、脱嶷一浓缩一冷冻干燥一粉 碎一成品 2 , 4 1 永解 称浆玉米蛋自粉予2 5 0 m 三惫菠中，按一寇的比例( m v ) 腰水配成悬浮滚， 搅拌均匀。救人恒瀑水滏振荡仪中，保温至所嚣温度，用4 m o l l 的n a o h 调至 酶l 所需的p h 值。向三角瓶中加入酶i ，水解一定时间，调至酶i l 的最适条件， 加酶l l ，水解一定时间。水船过程始终用4 m 0 1 l 的n a o h 维持p h 值恒定。 2 4 2 灭酶 水解结求届，用4 m o l l h c i 诵p h 歪4 0 ，将三角瓶放久9 5 | 。c 承浴锅中，保 吉林农业大学硕士学位论文玉米肤的制备特性及活性研究 持1 5 r a i n ，使酶失活。 2 4 3 分离 将失活的水解液迅速冷却，离心( 4 0 0 0 r p m ) 1 0 r a i n ，取上清液。 2 4 4 脱色、脱苦、脱臭 4 4 , 4 5 1 取上清液2 0 0 m l ，按o 5 、1 o 、1 5 、3 0 、5 o 的比例( m v ) 加入 活