（生物化学与分子生物学专业论文）青贮用纤维素分解工程乳酸菌的构建.pdf

卜、-j1 i | 1 l l liii 2 7 3 目录 目录 中文摘要i 英文摘要l i i 1 弓i 言1 1 1 立题背景1 1 2 研究进展5 1 2 1n i c e 系统的概况和重组乳酸菌的研究进展5 1 2 2r e a i 用m eq u a n t i t a t i v ep c r 应用的研究进展8 1 3 目的与意义1 0 1 4 研究的内容1 0 2 材料与方法。1 1 2 1 材料与仪器：1 1 2 1 1 实验菌株、质粒和引物。1 1 2 1 2 试剂、工具酶和试剂盒1 1 2 1 3 培养基配制和主要溶剂配制1 2 2 2 实验方法1 4 2 2 1c b hi i 基因的克隆1 4 2 2 2 含有重组质粒p e t c b h 的r o s e t t a 工程菌的构建1 7 2 2 3 对含有重组质粒p e t c b h 的r o s e t t a 工程菌进行诱导及活力测定1 8 2 2 4 乳酸乳球菌n z 9 0 0 0 感受态的制各2 0 2 2 5 利用p n z 8 1 4 8 表达引物亚克隆c b h 基因2 0 2 2 6 亚克隆c b h i i 基因回收、连接和宿主菌的转化2 0 2 2 7 工程乳酸菌阳性克隆的验证。2 1 2 2 8 利用r e a i ，n m e r t p c r 对工程乳酸菌c b h i i 基因进行定量分析2 1 2 2 9 对含有重组质粒p n z c b h 的工程乳酸菌进行诱导及目的蛋白检测2 4 3 结果与分析。2 6 3 1 梯度p c r 确定扩增c b hi i 基因最佳退火温度2 6 3 2c b h i i 基因p c r 扩增产物与t 载体连接、转化后的克隆2 7 3 3 验证提取克隆的质粒p e t c b h 2 8 3 4 蛋白质电泳( s d s p a g e ) 检测r o s e t t a 工程菌表达的蛋白2 9 3 5p n p 标准曲线绘制结果2 9 3 6r o s e t t a 工程菌表达的c b hi i 酶活性检测结果3 0 3 7 克隆c b h i i 基因与p n z 8 1 4 8 载体连接、转化后的克隆3 0 3 8 利用r e a l 广t i m er tp c r 对t 程乳酸菌c b hi i 基因进行定量分析3 1 3 8 1 不同方法提取工程乳酸菌总r n a 质量的比较3 1 3 8 2 绝对定量标准曲线的制各3 2 东北农业大学理学硕士学位论文 3 8 3r t 样品与扣除部分样品c t 值的测定和换算3 3 3 8 4 本实验方法的稳定性、重复性检验及r e a l - t i m ep c r 产物的特异性检测3 4 3 9 蛋白质电泳( s d s p a g e ) 检测工程乳酸菌目的蛋白表达情况。3 6 4 讨论3 7 4 1 关于实验材料的选择3 7 4 1 1 纤维素酶c b hi i 基因的选择3 7 4 1 2p e t 载体和r o s e t t a 宿主菌的选择3 7 4 2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的染色方法3 8 4 3 利用荧光定量分析目的基因的表达。3 8 4 3 1 工程菌总r n a 的提取方法3 8 4 3 2 荧光定量分析方法3 9 4 3 3r e a l - t i m er tp c r 定量基因表达与传统转录水平分析基因表达的比较4 0 5 结论4 1 致谢4 2 参考文献4 3 p f i 录4 7 攻读硕士学位期间发表的论文4 9 ， c o n t e n t s c o n t e n t s c h i n e s e a b s t r a c t 。i e n g l i s ha b s t r a c t i i i 1i n t r o d u c t i o n 1 1 1b a c k g r o u n d 1 1 2p r o g r e s s 5 1 2 1n l c es y s t e ma n dp r o g r e s so fe n g i n e e r e dl a c t i ca c i db a c t e r i a 5 1 2 2p r o g r e s so fa p p l i c a t i o no fr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r 8 1 3a i m sa n ds i g n i f i c a n c e sm a i nc o n t e n t s 1 0 1 4m a i nc o n t e n t sp r o g r e s s 1 0 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 1 2 1e q u i p m e n t sa n dm a i nm a t e r i a l s 1 1 2 1 1m a i ns t r a i na n dv e c t o r sa n dp r i m e f s 1 1 2 1 2m a i nr e a g e n t sa n de n z y m e s 1 1 2 1 3p r e s c r i p t i o no fm e d i u ma n dr e a g e n t s 1 2 2 2m e t h o d s 1 4 2 2 1c l o n eo fc b hi ig e n e 1 4 2 2 2c o n s t r u c t i o no fv e c t o rp e t c b hi nr o s e t t a ，1 7 2 2 3i n d u c e m e n ta n dd e t e r m i n a t i o no fr e s t r u c t u r e dr o s e t t a 1 8 2 2 4p r e p a r a t i o no fl a bn z 9 0 0 0c o m p e t e n c e 2 0 2 2 5s u b c l o n eo fc b hg e n eb yp r i m e r s 。2 0 2 2 6r e c y c l ec o n n e c t i o na n dt r a n s f e c t i o no fc b hi i 2 0 2 2 7d e t e r m i n a t i o no fp o s i t i v er e s t r u c t u r e dn z 9 0 0 0 2 1 2 2 8a n a l y s i so fr e s t r u c t u r e dn z 9 0 0 0b vr e a i ，- t i m er tp c r 2 1 2 2 9i n d u c e m e n ta n dd e t e r m i n a t i o no fr e s t r u c t u r e dn z 9 0 0 0 2 4 3r e s u l t sa n da n a l y s i s ：1 6 3 1d e t e r m i n a t i o no fb e s ta n n e a lt e m p e r a t u r eo fc b hi ib yp c r 2 6 3 2r e c y c l ec o n n e c t i o na n dt r a n s f e c t i o nc b hi ii nt v e c t o r 2 7 3 3d e t e r m i n a t i o no fp o s i t i v er e s t r u c t u r e dp e t c b h 。2 8 3 4a n a l y s i so fe x p r e s s i o ni nr e s t r u c t u r e dr o s e t t ab ys d s p a g e 2 9 3 5r e s u l to fp n ps t a n d a r dc u r v e 2 9 3 6d e t e r m i n a t i o no fc b hi ie n z y m ea c t i v i t yi nr o s e t t a 一3 0 3 7d e t e r m i n a t i o no fc b hi is u b c l o n e 。3 0 3 8a n a l y s i so fr e s t r u c t u r e dn z 9 0 0 0b yr e a l 厂t i m er tp c r 3 1 3 8 1c o m p a r eo ft o t a lr n ae x t r a c t e db yd i f f e r e n tm o t h o d s 3 1 3 8 2r e s u l to fa b o s l u t eq u a n t i f i c a t i o ns t a n d a r dc u r v e 3 2 东北农业人学理学硕二七学位论文 3 8 3c a c u l a t i o no fc to fr ts a m p l e sa n ds u b s t r a c ts a m p l e s 3 3 3 8 4s t a b i l i t yr e p e t i t i v e n e s sa n ds p e c i f i c i t y 3 4 3 9a n a l y s i so fe x p r e s s i o ni nr e s t r u c t u r e dn z 9 0 0 0b ys d s p a g e 3 6 4d i s c u s s i o n 3 7 4 1s e l e c t i o no fm a t e r i a l s 3 7 4 1 1s e l e c t i o no fc b hi ig e n e 3 7 4 1 2s e l e c t i o no fp e tv e c t o ra n dr o s e t t as t r a i n 3 7 4 2p i g m e n t a t i o no fs d s p a g e 3 8 4 3a n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o ni nr e s t r u c t u r e d s t r a i n sb yr e a l - t i m er tp c r 3 8 4 3 1d i f f e r e n tm o t h o d st oe x t r a c tt o t a lr n a 3 8 4 3 2a n a l y s i sm o t h o d so fr e a l - t i m ep c r 3 9 4 3 3c o m p a r eo fr e a l - t i m er tp c ra n dt r a d i t i o n a lm e t h o d s 4 0 5c o n c l u s i o n 4 1 a c k n o w l e d g e m e n t 4 2 r e f e r e n c e s 4 3 a p p e n d i x 4 7 p u b l i s h e da r t i c l e sd u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 5 2 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期：2 4 。年乡月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 靴敝储獬：端 导师签名 日期：2 d 9 年乡月午日 日期：汐，哞6 日 青贮是一种以新鲜的青绿饲料为原料，利用植物表面自然附生的乳酸菌，在密闭条件下， 通过厌氧发酵，将植物表面的可溶性碳水化合物转化为有机酸，导致饲料p h 值降低，来抑 制腐败微生物菌群的生长繁殖，从而达到保持作物的营养特性的目的的技术。其有着其独特 的，其它种类饲料所无法比及的优点：青贮饲料能够较好的保存原料的蛋白、可溶性碳水化 合物、小分子维生素和矿物质的含量，便于牲畜吸收利用，提高青贮饲料的消化率的同时也 提高了生产率；其适口性好，利于牲畜采食；青贮过程中有益微生物的活动，如乳酸菌产生 的乳酸可以杀死很多牲畜的病害微生物、寄生虫卵等。人为的添加一些工程乳酸菌作为青贮 剂，能促进有益微生物的活动，可以进一步降解原料中的纤维素成分转化为小分子的单糖、 寡糖或者低聚糖，便于牲畜吸收利用，提高青贮饲料的消化率。 本实验以在模式大肠杆菌菌株r o s e t t a 和乳酸菌菌株n z 9 0 0 0 中表达瑞氏木霉( t r i c h o d e r m a r e e s e i ) c b h i i 基因的方法，得到两株能表达外源纤维素酶的工程菌；然后，利用r e a l - t i m e r t - p c r 对外源基因在工程乳酸菌中的转录水平表达进行准确的绝对定量分析，建立一种新 的r e a l - t i m er t p c r 分析方法，同时利用p n p c 法测定了工程菌的酶活力，为构建青贮用 工程乳酸菌提供了一种技术路线和对其进行相关指标评价的方法。 通过实验得到如下结果：将纤维素酶基因c b hi i 与表达载体p e t 3 0 a 重组，构建了重组质 粒p e t c b h 。将重组质粒转化r o s e t t a 宿主菌，获得了重组菌株r o s e t t a ( p e t c b h ) 利用l p t g 诱导重组菌株r o s e t t a ( p e t c b h ) ，并通过p n p c 法坝i j 定了重组纤维素酶c b h i i 的活性，其活性 为2 6 7 7 u m l 。将纤维素酶基因c b h i i 与表达载体p n z s l 4 8 重组，构建了重组质粒p n z c b h 。 将重组质粒转化n z 9 0 0 0 宿主菌，获得了重组菌株n z 9 0 0 0 ( p n z c b h ) 。建立了利用基于d n a 扣除法的r e a l - t i m er tp c r 对基因进行定量分析的方法，该方法平行性好，可信度高，可 以在转录水平分析目的基因表达情况：同时，此方法从理论上解决了传统定量法结果不准确 的问题。最后，通过两种聚丙烯酰胺凝胶银染色方法的比较，证明了硝酸银染色法的效果大 大优于传统的考马斯亮蓝染色法。 本实验在以下方面有所创新： 1 建立了一种较准确的在转录水平检测外源基因在原核载体中表达的绝对量的方法。 2 为构建青贮用工程乳酸菌提供了一条可以借鉴的技术路线。 关键词乳酸菌；纤维素酶；r e a l - t i m er t p c r s i l a g ei st h a t ，i nh e r m e t i cc o n t a i n e r s ，f r e s hg r e e nm a t e r i a li sf e r m e n t e db yp l a n ts u r f a c eo f n a t u r a l l yo c c u r r i n gl a c t i ca c i db a c t e r i a t h er e s u l ti ss o l u b l ec a r b o h y d r a t e si st r a n s f o r m e di n t o o r g a n i ca c i d s ，w h i c h l e a d st ot h el o w e rp h w i t h i n h i b i t i n g t h e g r o w i n g o fh a r m f u l m i c r o - o r g a n i s m s ，t h en u t r i t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c so fc r o p sc a nb em a i n t a i n e d c o m p a r e dw i t ho t h e r t y p e so ff e e d ，s i l a g eh a su n i q u ea d v a n t a g e s f i r s to fa l l ，p r o t e i n ，s o l u b l ec a r b o h y d r a t e s ，s m a l l m o l e c u l e s ，v i t a m i na n dm i n e r a lo fr a wm a t e r i a l sa r em a i n t a i n e d ，a n da b s o r p t i o na n du t i l i z a t i o no f l i v e s t o c ka r ep r o m o t e d s i l a g ei m p r o v e st h ed i g e s t i b i l i t y , b u ta l s oi n c r e a s e sp r o d u c t i v i t y t h e s e c o n do n e ，d u r i n gt h ea c t i v i t i e so fb e n e f i c i a lm i c r o - o r g a n i s m s ，t h ep r o d u c t ss u c ha st h el a c t i ca c i d p r o d u c e db yl a c t i ca c i db a c t e r i a ，c a nk i l lal o to fd i s e a s em i c r o - o r g a n i s m ，p a r a s i t ee g g s ，e t c a d d i n g s o m eg e n e - m o d i f i e dl a c t i ca c i d b a c t e r i aa sa d d i t i v ea g e n tf u r t h e r l yd e g r a d a t et h ec e l l u l o s e c o m p o n e n to fr a wm a t e r i a l si n t os m a l lm o l e c u l e so fs i m p l es u g a r s ，o l i g o s a c c h a r i d e s ，o r o l i g o s a c c h a r i d e s ，a tt h es a m et i m et h es p e c i f i ce n g i n e e r i n gb a c t e r i ai n c r e a s e sp r o d u c t i v i t y i nt h i se x p e r i m e n t ，t h em o d e le c o l is t r a i n sa n dl a c t i ca c i db a c t e r i as t r a i n sn z 9 0 0 0w e r eu s e d t oe x p r e s se x o g e n o u sc e l h l a s eb yt r a n s f e c t e dc b hi ig e n eo ft r i c h o d e r m ar e e s e i t h ea p p l i c a t i o n o fr e a l - t i m er t - p c rw a su s e dt oa n a l y s i st h et r a n s c r i p t i o no ff o r e i g ng e n ei nt h ee n g i n e e r e d l a c t i ca c i db a c t e r i a t h e n ，m e t h o do fp n pi sd e v o t e dt om e a s u r et h ee n z y m ea c t i v i t yo fe n g i n e e r i n g b a c t e r i a t h ee x p e d m e n tp r o v i d e dat e c h n i c a lr o u t et oc o n s t r u c tg e n e - m o d i f i e dl a c t i ca c i db a c t e r i a f o rs i l a g e ，a n dw i t hm e t h o d sp r o v i d i n gb yt h i sp r o j e c t ，a s s o c i a t e di n d i c a t o r sc a l lb ee v a l u a t e d p r o p e r l y t h r o u g ht h ee x p e r i m e n tw eo w n e dt h ef o l l o w i n gr e s u l t s ：t h ec e l l u l o s eo fc b hi ig e n ea n d e x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 0 ac o n s t r u c t e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t c b h t h er e c o m b i n a n t p l a s m i dw a st r a n s f o r m e d i n t or o s e t t ah o s tb a c t e r i ao b t a i n e dr e c o m b i n a n ts t r a i nr o s e t t a ( p e t c b h ) i p t gi n d u c e dr e c o m b i n a n ts t r a i nr o s e t t a ( p e t c b h ) ，a n dt h r o u g hd e t e r m i n a t i o no ft h e r e s t r u c t u r i n gp n p cc e l h l a s ec b hi ia c t i v i t y , i t sa c t i v i t yw a s2 6 7 7 u m l i nt h ee x p e r i m e n t ， c e l l u l o s eo fc b hi ig e n ea n de x p r e s s i o nv e c t o rp n z 8 1 4 8c o n s t r u c t e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p n z c b h t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e d i n t on z 9 0 0 0h o s tb a c t e r i ao b t a i n e d r e c o m b i n a n ts t r a i nn z 9 0 0 0 ( p n z c b i - i ) a l s o ，t h ep r o j e c te s t a b l i s h e dt h em e t h o do fr e a l - t i m e r t p c rb a s e do nd n as u b t r a c t i o nf o ra b s o l u t eq u a n t i f i c a t i o no fg e n ee x p r e s s i o ni ne n g i n e e r e d l a c t i ca c i db a c t e r i a m e t h o dw i t hg o o dp a r a l l e l i s m ，h i g hr e l i a b i l i t yc a nb ea n a l y z e dt a r g e tg e n e i i i 东北农业大学理学硕士学位论文 e x p r e s s i o na tt h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l t h i sm e t h o di si nt h e o r yt os o l v et h et r a d i t i o n a lq u a n t i t a t i v e m e t h o dw i t h o u ta na c c u r a t er e s u l t t h ec o m p a r i s o no ft w om e t h o d st os t a i np o l y a c r y l a m i d eg e l c o n f i r m e st h a tt h ee f f e c to fs i l v e rn i t r a t es t a i n i n gm e t h o di sm u c hb e t t e rt h a nt h et r a d i t i o n a l c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e t h ei n n o v a t i v ep o i n t so ft h i st e s ta r ea sf o l l o w s ： 1 am o r ea c c u r a t ew a yt od e t e c tt h ea b s o l u t ev o l u m eo ft r a n s c r i p t i o na n dt h ee x p r e s s i o no f f o r e i g ng e n e si np r o k a r y o t i ca b s o l u t ev o l u m ew a se s t a b l i s h e d 2 t h ep r o j e c tp r o v i d e dam e t h o do fr e c o m b i n a n tl a c t i ca c i d b a c t e r i as t r a i n ，w h i c hc a l ld r a w t h ed r a f to ft h et e c h n i c a lr o u t e k e yw o r d sl a c t i ca c i db a c t e r i a ；c e l l u l a s e ；r e a l - t i m er t - p c r m a s t e r a t ec a n d i d a t e ：s h ir u i m a j o r ：b i o c h e m i s 缸ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y s u p e r v i s o r ：h u og u i c h e n g 引言 ，利用植物表面自然附生的乳酸菌，在密闭条件下，通 过厌氧发酵，将植物的可溶性碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸的过程。有机酸生成同 时导致饲料p h 值降低，抑制腐败微生物菌群的生长繁殖，从而达到保持作物营养特性的目 的( 杨洁彬等，1 9 9 6 ) 。 青贮饲料有着其独特的、其它种类饲料所无法比拟的优点( w e i n b e r ge ta l ，2 0 0 3 ) ： ( 1 ) 青贮饲料可以维持原料的营养特性。青贮过程中养分流失少，能够较好的保持原料中 蛋白质、可溶性碳水化合物、小分子维生素和矿物质的含量。 ( 2 ) 青贮饲料适口性好，利于牲畜采食。青贮过程中产生的乳酸不仅是很好的消化促进剂、 风味剂，还可以与很多矿物质作用生成乳酸盐，使其更好的被牲畜吸收利用。 ( 3 ) 青贮过程可以提高饲料品质。青贮饲料不仅能维持原料的营养价值，而且通过发酵过 程中微生物的代谢，可以产生很多牲畜所必须的小分子营养物质；同时微生物还可以提供菌 体蛋白；青贮过程添加一定的青贮剂可以降解原料中的纤维素，使其转化为小分子的低聚糖、 寡糖和单糖，利于牲畜吸收利用，提高了青贮饲料的消化率和饲料生产率。 ( 4 ) 青贮过程中有益微生物的代谢，如乳酸菌产生的乳酸可以杀死很多对牲畜有害的微生 物、寄生虫卵等，可以起到防病、治病的效果。 ( 5 ) 青贮饲料可以长期保存而不变质。青贮饲料能够常年作为牲畜的口粮，不受气候、地 域等条件的影响。另外青贮饲料还有调制方法简便、所需成本较低、便于生产和保存等优点。 青贮饲料与自然风干的秸秆饲料相比，粗脂肪含量提高1 1 ，粗纤维含量降低2 8 ，消 化率提高2 0 ，更有利于各种营养成分的吸收。据试验，与喂干饲料的奶牛相比，喂青贮饲 料的奶牛可提高产奶量1 0 2 0 。每头奶牛喂青贮秸秆饲料比喂干饲料日产奶量提高l o ( u p 2 5 公斤) ，按牛奶的市场收购价1 7 元公斤( 一般市场收购价为1 6 1 8 元公斤) 计算，扣除增加 成本，平均日增效益3 9 元；全年每头奶牛可增加经济效益1 0 9 2 元f 按全年产奶平均2 8 0 天，喂 青贮饲料的奶牛每年产奶2 6 0 3 0 0 天) 。按每头奶牛年需1 1 吨青饲料计算，青贮饲料可增加效 益9 9 2 7 元吨例、冬霞，2 0 0 7 ) 。 玉米是黑龙江省主要的青贮作物，下面介绍一下国内外青贮玉米生产现状： 世界上畜牧业发达的国家都很重视青贮玉米的种植和生产。在欧关许多国家中，青贮玉 米饲料早已成为反刍牲畜日粮中主要的有效能量成分和幼畜育肥的强化饲料。据统计，1 9 8 8 年欧洲种植的青贮玉米面积达3 3 0 0 0 0 0 h m 2 ，美国1 9 9 0 年生产的青贮玉米价值总额约为1 5 亿美 元。近几年美国青贮玉米种植面积已达3 5 5 0 0 0 0 h m 2 ，占玉米种植总面积的1 2 以上。法国青 贮玉米种植面积已超过1 4 4 0 0 0 0 h m 2 ，占玉米播种面积的8 0 以上。今后欧美畜牧业发达国家 东北农业大学理学硕士学位论文 仍将保持较大比例的青贮玉米种植面积f 陈自胜等，2 0 0 0 ) 。 我国青贮玉米种植面积较小，且多数是收获果穗后对鲜玉米秸秆进行青贮。因此青贮规 模小，青贮玉米饲料质量也低，而且全株玉米青贮量极少。近年来，随着人民生活水平的提 高，国家已经把畜牧业发展行动计划列为2 0 0 2 年农业部门重点实旌的六大产业发展行动计划 之一。据初步统计：2 0 0 4 年全国青贮玉米种植面积已达4 4 0 0 0 0 h r n 2 。但是我国畜牧业的发展 不能完全走欧美一些发达国家的路子。多叶、青绿型的粮饲兼用型玉米可做到粮食与饲料兼 顾，适合我国国情。不同地区根据实际情况发展不同类型、不同规模的青贮玉米，做到既能 促进当地畜牧业持续快速发展，又能满足粮食生产的需要( 戴忠民等，2 0 0 4 ) 。 黑龙江省位于世界三大黄金玉米带，具有发展玉米的自然优势。这里土地平坦连片，土 壤肥沃、雨热同季、气候条件适宜，被农业部列为全国畜产品生产优势区域。畜牧业的大发 展需要大量饲料，使青贮玉米大有用武之地( 苏俊等，2 0 0 6 ) 。 在自然界中，植物上所附着的乳酸菌数量通常较少。因此，可加入能迅速增殖的乳酸菌 来主导青贮发酵( c a iy e ta l ，1 9 9 4 ) 。青贮过程中起主要作用的是青贮接种剂。以往在青贮过 程中主要使用一些化学添加剂作为青贮剂，如甲醛、甲酸、乙酸等，其对畜体健康存在隐患 ( w o o l f o r de ta l ，1 9 8 4 ) 。微生物添加剂作为接种剂，具有生态安全、应用方便、价格低廉等优 点，目前正在被广泛研究。青贮接种剂是微生物青贮接种剂( s i l a g em i c r o b i a li n o c u l a n t s ) 的简 称，也叫青贮接种菌( s i l a g eb a c t e r i ai n o c u l a n t s ) 。人们对青贮接种剂的早期定义是：一种额外 添加到青贮饲料中，以保证快速而良好青贮发酵的添加剂。青贮接种剂中应用最普遍的乳酸 菌是植物乳杆菌( l a c t o b a c i l i u sp l a n t a r u m ) 。接种剂中的乳酸菌通常是从作物或青贮饲料中筛 选出来的，之所以选择这样的乳酸菌是因为其繁殖迅速，并且是同型发酵。同型发酵乳酸菌 接种剂是一种传统的接种剂，经常使用的是具有同型发酵能力的如植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 、粪链球菌( e n t e r o c o c c u s f a e c i u m ) 和片球菌( p e d i o c o c c u s s p p ) 等，它们可以有效的利 用作物的可溶性碳水化合物、增加乳酸的产量、迅速的降低p h 值。当然，很多接种剂含有一 种以上的乳酸菌或含有同一类的几种乳酸菌，因为不同的乳酸菌可以在不同的p h 条件下生长 良好，这样可以使青贮的不同阶段( p h 4 6 ) 都有快速的发酵，多种乳酸菌也可使接种剂对于各 种作物、水分和温度对有良好的表现。但是随着生产和研究的深入，接种剂不只是单一的同 型发酵乳酸菌制剂，一些异型发酵乳酸菌、丙酸菌甚至乙酸菌都成了接种剂的组成成分。它 们或单独使用，或联合应用，有时还与某些酶制剂复合在一起。目前美国市场有2 0 0 多种青贮 添加剂，其中主要是接种剂( 林春健，2 0 0 3 ) 。 目前研究和应用的青贮接种剂按使用目的可以分为两类，一类是促迸发酵的微生物，主 要包括同型发酵乳酸菌；另一类是提高青贮饲料有氧稳定性的微生物，主要包括布氏乳杆菌 ( l a c t o b a c i l l u sb u c h n e 一) 和丙酸杆菌( p r o p i o n i b a c t e r i u m ) ，但这些种类又往往会复合在一起，且 很多商品制剂种还加入了纤维素酶、半纤维素酶等酶制剂，以增加接种菌的发酵底物。因此， 对于商品制剂来说往往很难分类。 w h i t t e n b u r y l 9 6 1 年首先提出了理想接种标准，这一原始标准不断的被完善，可将其主要 内容可归纳茭j ( w o o l f o r d e ta l ，1 9 8 4 ) ： ( 1 ) 快速生长并同自然菌株的成功竞争； ( 2 ) 糖的同型发酵和乳酸的快速产生； 2 对2 1 株乳酸菌进行筛选，结果发现没有一株完全满足这些标准。然而它们的确发现了三株满足大 多数条件的菌株：坚韧链球菌( s t r e p t o c o c c u sd u r a n s ) 、嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 和植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) 。其中植物乳杆菌在厌氧、p h 大于5 时生长缓慢。鉴于 此，接种剂中经