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大豆酯酶的固定化及应用研究 摘要 由于农药残留而引起的人畜急、慢性中毒的事件屡见不鲜，食品安全问题引起了高度 重视，传统的农药残留检测方法是气相色谱法和高效液相色谱法，但是此种方法仪器昂贵， 操作复杂，不适合快速检测。近年来利用乙酰胆碱酯酶开展了很多农药快速检测的研究， 但乙酰胆碱酯酶的提取产量低，成本高，不能满足当前农药残留检测的需求，而植物酯酶 的成本大大低于乙酰胆碱酯酶，保质期也比较长，因此本文以大豆为材料，研究植物酯酶 对农药的灵敏性，并且研制了快速检测酶片，主要结果如下： 1 大豆酯酶的最佳提取方案为：将大豆样品按1 ：5 料液比加入到0 3 m o l l ，p h7 0 的 磷酸缓冲液中，磁力搅拌1 2 0 m i n 后，于5 0 0 0 r p m 下离心，上清液即为大豆酯酶粗酶液。 2 研究了大豆酯酶的最适反应条件：大豆酯酶酶液o 1m l ，底物a 一乙酸萘酯0 1 m l ， p h 值为7 5 的缓冲液1 9m l ，浓度为0 2 5 m g m l 的显色剂0 9m l ，反应总体积稀释至1 0m l 反应时间为5 m i n ，反应温度为3 0 。 3 对2 6 种不同品种大豆进行筛选，确定总酯酶活性最高的通农1 0 作为农药快速检测的 品种，考察了大豆酯酶对8 种农药的灵敏度，灵敏度为敌敌畏 敌百虫 对硫磷 甲胺磷 乐果 氧乐果 毒死蜱 西维因。 4 在三种滤纸( 定性滤纸、定量滤纸、厚型层析滤纸) 材料中筛选出厚型层析滤纸作 为固定化酶材料，确定了固定化参数：酶液浓度为8 0 ，p h 值为7 5 ，固定化温度为4 * 0 ， 固定化时间2 4 h ，鼓风干燥的最佳时间2 h ，鼓风干燥的最佳温度为4 0 。 5 硝酸纤维素膜固定化的最佳参数：硝酸纤维素膜预活化条件为：4 下在0 1 m o l l p h 7 0 的磷酸盐缓冲溶液中浸泡4 8 h 。固定化酶液浓度为7 0 ，p h 值为7 5 ，固定化温度 为4 。c ，固定化时间4 8 h ，戊二醛浓度为0 2 5 ，不添加牛血清白蛋白。 6 壳聚糖膜固定化的最佳参数：酶液浓度为8 0 ，p h 值为7 5 ，固定化温度为4 。c ， 固定化时间2 4 h ，戊二醛浓度为0 5 。 7 研究了三种固定化酶的部分酶学性质，并与游离酶特性进比较，结果表明固定于壳 聚糖膜后，最适温度为3 0 。0 ，最适p h 值为7 0 ，有良好的重复使用性能；固定于厚型层 析滤纸后，最适最适温度为3 0 ，最适p h 值为7 5 ，保存期限比游离酶大大提高，4 。c 保 存一个月相对活力为9 0 4 ；固定于硝酸纤维素膜后，最适温度为4 0 。c ，最适p h 值为 8 0 。 8 通过酶活回收率和酶片实用性比较，确定厚型层析滤纸为大豆酯酶固定化的最佳载 体，并用此酶片对8 种农药进行检测，检测限分别为敌敌畏0 0 1 m g l ，敌百虫为0 1m g l ， 对硫磷为o 5m g l ，甲胺磷为o 5m g l ，乐果为1m g l ，氧乐果为1 0m g l ，毒死蜱1 0 m g l ，西维因5 0m g l 。 关键词：大豆酯酶，固定化，农药检测 i i s t u d i e so nt h em e t h o d so fp h y t o e s t e r a s ei m m o b i l i z a t i o na n di t s a p p l i c a t i o n a b s t r a c t f o rt h ep a s tf e wy e a r s ，t h et o x i c o s i si n c i d e n t so fh u m a na n da n i m a lr e s u l t e df r o mt a k i n gf o o dw h i c h c o n t a i n sh i g hl e v e lo fp e s t i c i d er e s i d u e sa r eh a p p e n e du s u a l l y ，s op e o p l eh a st h i n kh i g h l yt ot h es e c u r i t yo f f o o d s a tp r e s e n t ，g ca n dh p l ci st h ec o m m o nm e t h o df o rd e t e c t i n g p e s t i c i d er e s i d u e s ，b u tt h e ya r et o o e x p e n s i v ea n dc o m p l e xt ou s ea sam e t h o df o rf i e l d w o r kd e t e c t i o n b e c a u s et h eo r g a n o p h o s p h o r u sa n d c a r b a m a t ep e s t i c i d e sc a ni n h i b i tt h ea c t i v i t yo fa c h e ，s op e o p l eu s et h i sp r i n c i p l et od e v e l o ps o m er e s e a r c h e s o fp e s t i c i d er a p i dd e t e c t i o n b u tt h ee x p e n s i v ea n dt h el o we x t r a c t i o no fa c h em a k ei tc a nn o ts a t i s f yt h e r e q u i r e m e n to fp e s t i c i d er a p i dd e t e c t i o n p h y t o e s t e r a s eh a st h el o wc o s ta n de a s i l yt o s t o r e ，s op e o p l eu s e p h y t o e s t e r a s et or e p l a c et h ea c h e t h i s a r t i c l e su s es o y b e a na sm a t e r i a lt os t u d yt h es e n s i t i v i t yo f p h y t o e s t e r a s et op e s t i c i d e ，a n dt h ef e a s i b i l i t yo fd e v e l o pap r o d u c t i o n t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w ： 1 s t u d yo ne x t r a c t i o no fp h y t o e s t e r a s ef r o ms o y b e a n sa sf o l l o w s ：s o y b e a nf l o u rw a ss u r g e df o r12 0m i n w i t hp h o s p h a t eb u f f e r ( 0 3 m o l l ，p h7 0 ) ，t h e n , c e n t r i f u g a l i z et h ef i l t r a t ea t5 0 0 0 r p m ，s u p e m a t ei st h e e n z y m eo fp h y t o e s t e r a s e 2 o p t i m i z et h eo p t i m a lr e a c t i o no fp h y t o e s t e r a s e ，t h eo p t i m a lr e a c t i o na sf o l l o w s ：o 1m le n z y m e s o l u t i o n ，0 1m ls u b s t r a t e ，1 9m lp h 7 5p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) a n d0 2 5 m g m ld e v e l o p e r 0 9m l ， b u l kv o l u m ei s10m l ，r e a c t i o nt i m ei s5 m i n ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s3 0 c 3t h r o u g he v a l u a t e dt h et o t a le n z y m ea c t i v i t yo f 2 6d i f f e r e n ts o y b e a n s ，t o n gn o n g10w a ss e l e c t e da s t h eb e s tp h y t o e s t e r a s es o u r c e t h r o u g hi n v e s t i g e dt h et h es e n s i t i v i t yt op e s t i c i d e so f8p e s t i c i d e s ，w ek n o wt h e s e n s i t i v i t yi sd i c h l o r v o s t r i c h l o r p h o n p a r a t h i o n a e e p h a t e m e t d i m e t h o a t e o m e t h o a t e d u r s h a n t r i c a r n a m 4t h et h i c kl a m i n a ra n a l y s i sf i l t e rp a p e rw a ss e l e c t e df r o mt h e3m a t e r i a l st oi m m o b i l i z ep h y t o e s t e r a s e t h eo p t i m i z e dp a r a m e t e r sw a sa sf o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fe n z y m ei s8 0 ，t h ep hv a l u ei s7 5 ，t h e t e m p e r a t u r ei s4 ca n dt h et i m eo fi m m o b i l i s a t i o ni s2 4 h ，t h et i m eo fd r yb l a s ti s2 ha n dt h et e m p e r a t u r eo f d r yb l a s ti s4 0 c 5 s t u d yo nn i t r o c e l l u l o s em e m b r a n eo fi m m o b i l i z a t i o n t h eo p t i m i z e dp a r a m e t e r sw a sa sf o l l o w s ：d i p t h en i t r o c e l l u l o s em e m b r a n ei np b s ( 0 1 m o l lp h 7 0 ) f o r4 8 ht oa c t i v a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fe n z y m ei s 7 0 ，t h ep hv a l u ei s7 5 ，t h et e m p e r a t u r ei s4 ca n dt h et i m eo fi m m o b i l i s a t i o ni s4 8 h ，t h eg l u t a r a l d e h y d e c o n c e n t r a t i o nw a s0 2 5 b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) c o n c e n t r a t i o nw a so 6 s t u d yo nc h i t o s a na n dc h i t o s a nm e m b r a n eo fi m m o b i l i z a t i o n t h eo p t i m i z e dp a r a m e t e r so fc h i t o s a n m e m b r a n ew a sa sf o l l o w s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fe n z y m ei s8 0 ，t h ep hv a l u ei s7 5 ，t h et e m p e r a t u r ei s4 c i i i a n dt h et i m eo fi m m o b i l i s a t i o ni s2 4 h t h eg l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o nw a s0 5 7 t h ec h a r a c t e r i s t i co f3i m m o b i l i z e de n z y m ew a sr e s e a r c h e da n dc o m p a r e dw i t hd i s s o c i a t i v ee n z y m e t h er e s u l tw a st h a tt h et e m p e r a t u r eo fc h i t o s a nm e m b r a n eo fi m m o b i l i z a t i o nw a s3 0 。c ，t h ep hv a l u ei s7 5 t h et e m p e r a t u r eo ft h i c kl a m i n a ra n a l y s i sf i l t e rp a p e ro fi m m o b i l i z a t i o nw a s3 0 c ，t h ep hv a l u ei s7 5 ，t h e s t o r a g el i f e i sb e t t e rt h a nd i s s o c i a t i v ee n z y m e t h et e m p e r a t u r eo fn i t r o c e l l u l o s em e m b r a n eo f i m m o b i l i z a t i o nw a s4 0 c ，t h ep hv a l u ei s8 0 ，b o t hh i g h e rt h a nd i s s o c i a t i v ee n z y m e 8 c o m p a r e dw i t ht h e s ei m m o b i l i z e de n z y m e ，d e t e r m i n et h et h i c kl a m i n a ra n a l y s i sf i l t e rp a p e rw a st h e b e s tc a r r i e ro fi m m o b i l i z a t i o n u s et h i si m m o b i l i z e de n z y m et oc h e c kt h ep e s t i c i d e ，t h er e s u l ts h o w s ：i ti sv e r y s e n s i t i v i t yt od i c h l o r v o s ，t h el d c so fd i c h l o r v o s ，t r i c h l o r p h o n ，p a r a t h i o n , a c e p h a t e m e t ，d i m e t h o a t e ，o m e t h o a t e ， d u b h a n , 仃i c a r n a mw e r eo olm g l ，0 1m g l ，0 5m g l ，0 5m g c ，1m g l ，10m g z l ，10m g l ，5 0m g l r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：p h y t o e s t e r a s e ；p e s t i c i d er e s i d u e s ；i m m o b i l i z a t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期：年月日 签字日期：年 吉林农业大学硕士学位论文 大豆酯酶的固定化及应用研究 第一部分文献综述 中国是世界上最早使用农药的国家之一，农药在提高农作物产量的同时却带来了极大 的危害，绝大多数农药都属于高毒化合物，造成人畜急、慢性中毒的现象屡见不鲜，农药 的残留问题更是引起了人们的高度重视，人们对农药残留的检测技术提出了更高的要求。 传统的农药检测技术有薄层色谱法、气相色谱、毛细管气相色谱法、液相色谱法等，这类 传统方法虽然技术成熟，但却存在着预处理时间长、检测时间长、检测费用高、检测仪器 昂贵的缺点，而且检测方法不易被基层单位和工作人员掌握。随着人们对食品安全问题的 日趋关注，发展快速、可靠、灵敏和实用的农药残留分析技术无疑是控制农药残留、保证 消费者安全的基础。 1 我国利用农药现状 1 1 农药的残留现状 我国是一个拥有1 3 亿人口的大国，同时也是重要的粮食产出国及世界上最大的农药 生产国，2 0 0 3 年中国农药产量达7 5 1 7 万吨。农药的广泛应用在提高农作物的产量的同时， 对环境也造成了严重的破坏还危及到人畜安全。 目前，农药残留问题非常严重，孙胜龙等【3 l2 0 0 2 年秋季对长春市9 个蔬菜批发市场 的1 6 种蔬菜进行抽样检测，蔬菜中有机磷类和氨基甲酸酯类农药平均超标率为1 1 0 5 ， 残留的主要农药种类是甲胺磷、氧化乐果和敌敌畏。检测1 6 种蔬菜中有9 种超标。2 0 0 3 年春季同样对9 个蔬菜市场的1 7 种蔬菜进行抽样检测，农药残留平均超标率为1 1 0 ， 残留的农药主要种类是甲基对硫磷、对硫磷、甲拌磷、敌敌畏、氯氰菊酯和氰戊菊酯等， 检测的1 7 种蔬菜中有3 种严重超标。何彩n 2 0 0 3 年从深圳市某农产品批发市场随机抽取 蔬菜样品2 0 6 份进行检测，有机磷农药残留量检出率为1 6 5 ，超标率为1 6 o ，其中农 药检出率最高为毒性大的甲胺磷，占9 7 1 ；同时检出2 种农药的有5 份，占1 4 7 。2 0 0 4 年段志敏等【5 】( 2 0 0 5 ) 对云南省蔬菜农药残留情况的监测发现，在4 2 件检出有农药的蔬菜中， 有1 7 件样品为农药残留量超标不合格的，占4 0 4 。王保成等1 6 1 ( 2 0 0 5 ) 检测了临沂市售蔬 菜有机磷农药的残留情况。在1 6 0 份样品中，2 6 份蔬菜检出残留有机磷农药，检出率为 1 6 2 5 ；2 4 份超标，超标率为1 5 o 。由此可见，目前我国农药残留问题还是相当严重， 各级有关部门应加强对农药检测和监管的力度，将农药残留超标不合格的产品杜绝在市场 之外，防止中毒事故的发生。 1 2 农药的种类、性质 农药可以按照多种方式进行分类。按防治对象分类，农药可分成杀虫剂、杀菌剂、除 草剂、杀鼠剂、杀线虫剂、杀蜗剂等。按化学成分人工合成杀虫剂又可分成有机氯化合物、 有机磷化合物、氨基甲酸酯、有机氮化合物、拟除虫菊酯、有机氟化合物、有机锡化合物、 1 吉林农业大学硕士学位论文 大豆酯酶的固定化及应用研究 特异性杀虫剂等；杀菌剂又可分成有机氯杀菌剂、有机磷杀菌剂、有机硫杀菌剂、有机汞 杀菌剂、无机杀菌剂、抗菌素等。根据农药的作用方式分为胃毒剂、触杀剂、熏蒸剂、内 吸剂、引诱剂、驱避剂、拒食剂、不育剂等。根据农药的化学组成和结构可分为有机农药 和无机农药两大类。农药中除少部分的无机物外，大部分都为有机化合物，其中有元素有 机化合物、金属有机化合物及一般有机化合物之分。另外还有根据农药的来源、农药的使 用方法、防治原理等来分类【7 j 。 有机磷类农药按结构可分为磷酸酯、磷酸酯和磷酰胺及其相应的硫代衍生物。有机磷 农药早期发展的大部分是高效高毒品种，如对硫磷、甲胺磷、毒死蜱和甲拌磷等；而后逐 步开发了许多高效低毒低残留品种，如乐果、敌百虫、敌敌畏、马拉硫磷、二嗦磷和杀螟 松等，成为农药的一大家族。有机磷农药发展较快、品种多、使用广，至今已有6 0 余种【s j 。 由于有机磷农药具有药效高、品种多防治对象多、在环境中易降解等优点，在我国农业生 产中得到大量应用，占农药总使用量的7 7 7 6 t 9 。 氨基甲酸酯类农药( c a r b a m a t ep e s t i c i d e s ) 大都为结晶固体，水中的溶解度及蒸汽压低， 在酸性介质中相对稳定，在碱性介质中易降解，在生物体内易通过氧化、水解和结合三种 形式进行代谢降解，该类农药是一类以甲酸酯为前体化合物发展而来的农药，具有分解快、 残留期短、低毒、高效、选择性强等特点。通常其摄食量的7 0 9 0 在2 4 小时内以代谢 产物葡萄糖醛酸酯的形式由尿排出体外【l 引。 有机磷、氨基甲酸酯类农药化学性质不稳定，在施用后，容易受外界条件影响而分解。 但有机磷和氨基甲酸酯类农药中存在着部分高毒和剧毒品种，如甲胺磷、对硫磷、涕灭威、 克百威，水胺硫磷等，如果被施用于生长期较短、连续采收的蔬菜，则很难避免因残留量 超标而导致人畜中毒。另外，一部分农药虽然本身毒性较低，但其生产杂质或代谢物残毒 较高，如二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂生产过程中产生的杂质及其代谢物乙撑硫脲属致癌 物，三氯杀瞒醇中的杂质滴滴涕，丁硫克百威、丙硫克百威的主要代谢物克百威和3 基克 百威等。 农药的内吸性、挥发性、水溶性、吸附性直接影响其在植物、大气、水、土壤等周围 环境中的残留。温度、光照、降雨量、土壤酸碱度及有机质含量、植被情况、微生物等环 境因素也在不同程度上影响着农药的降解速度及农药残留。 1 3 农药污染对人体的的危害 有机磷农药的生物活性作用机理主要是对动物体内的胆碱酯酶的强烈抑制。动物神经 受到刺激后可分泌乙酰胆碱给神经节，促使肌肉收缩。而动物体内的胆碱酯酶可催化水解 乙酰胆碱，使乙酰胆碱不能累积在神经节。当动物体内摄入有机磷农药时，农药对胆碱酯 酶具有抑制作用从而使酶因活性降低而不能有效催化乙酰胆碱水解，于是乙酰胆碱在神经 系统中积累，造成动物麻痹，以至死亡。 有机磷急性中毒可以导致生命危险，同时长期低剂量接触或食用有机磷污染的食品对 2 吉林农业大学硕士学位论文大豆酯酶的固定化及应用研究 人体的潜在危害也很大。孙运光等对健康成年雄性s d 大鼠进行乐果的亚急性毒性试验发 现，在动物没有明显的急性有机磷中毒情况下，可以从电镜观察到明显的神经元坏死【1 1 1 。 n e l s o nl m 等认为，杀虫剂可能促进了几种神经变性疾病的发生。如帕金森氏病( p d ) 、肌萎 缩侧索硬化( a l s ) 等【l2 1 。李涛，赵玉龙等研究认为有机磷农药敌百虫可能使酪氨酸激酶受 体基因( r e t ) 发生突变，推测是先天性巨结肠症的环境致病因素之一【l3 1 。同时慢性长期食 用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物的慢性中毒， 导致疾病的发生，甚至影响到下一代。 1 4 农产品出口壁垒 在国家质检总局公布的2 0 0 1 年第3 季度全国蔬菜市场被抽查的1 8 1 种蔬菜中，有8 6 种蔬菜农药残留量超标【1 4 】。2 0 0 1 年6 月1 3 日发生在广东省中山市的7 8 人食物中毒就是 食用了含有大量有机磷农药残留的通心菜引起的。据不完全统计【1 5 1 ，全世界每年有2 0 0 万 人中毒，其中死亡约4 万人：1 9 8 1 年我国农药中毒事故高达2 8 9 万人，死亡1 8 7 万人，近 年来，我国平均每年发生农药中毒事故1 0 万人，死亡近l 万人。统计资料显示，在我国 农药中毒、死亡事故中，杀虫剂约占8 0 左右的比例，而在杀虫剂中，又以高毒有机磷农 药为主，占9 0 以上。其主要品种有：甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷、乐果、氧乐果、内 吸磷、倍硫磷、马拉硫磷、杀虫眯、吠喃丹、西维因及杀鼠剂等。 由于农药污染对人类造成的危害性，发达国家对农药残留的要求日趋严格，对登记后 的农药残留投入巨资进行监控。联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 已制定了 2 5 1 0 项农药残留限量标准，欧盟、日本、美国等发达国家制定的农药最大残留限量( m r l l 等技术标准已成为国际贸易中技术性贸易壁垒，即“绿色壁垒”。欧盟2 0 0 4 年4 月通报了 两个有关农残限量的指令草案( 编号分别为g s p s e e c 2 3 6 和2 3 7 ) 涉及的农药包括灭多威、 百菌清、甲霜灵、硫双灭多威、代森锰、代森锰锌、代森联、代森锌、丙森锌、苯锈咤、 嚓菌酯、环酸菌胺、i p r o v a l l c a r b 和异恶唑草酮等2 2 种农药在农产品中的残留限量标准【l 刚。 日本政府新农药残留法规将对食品进口实行“肯定清单，制度【l 7 1 。2 0 0 6 年5 月1 日起执 行肯定列表制度，残留农药标准扩大到超过5 4 0 种。规定农药残留量高于清单中规定标准 的商品不得进口和上市，不在清单中的m r l 最低将按一律标准值o 0 1m g k g t l 8 】。 与此同时我国政府也在加紧农药残留法规的制定，逐渐完善农药监测制度。2 0 0 2 年5 月2 4 日，国家农业部发布了第1 9 9 号公告， 菜、水果、茶叶、中草药上使用的高毒农药， 公布了国家明令禁止使用的农药和不得在蔬 其中包括有机磷农药如甲胺磷、甲拌磷、对 硫磷等。为避免农药对人畜安全、农产品卫生质量、防治效果和环境安全造成一定程度的 不良影响，2 0 0 2 年6 月2 8 日农业部发布了农业部令第1 7 号农药限制使用管理规定， 进一步加强了对农药的管理。迄今为止，我国已颁布7 9 种农药在3 2 种农副产品中的1 9 7 项最高残留限量标准，并且正陆续制定新的m r l 值国家标准【1 9 1 。但与国际标准和其他发 达国家相比，我国仍存在农药残留限量标准制定工作滞后，残留监测体系不健全，残留检 3 吉林农业大学硕士学位论文 大豆酯酶的固定化及应用研究 测能力有限、覆盖面窄，对残留量超标问题监管力度不够等问题，远不能满足农药残留监 测工作的要求。 我国加入w t o 以来，发达国家利用农药残留标准的差异 2 0 1 ，实行了果蔬出售前的农 药残留的检测，我国出口的农副产品均需要进行农药残留的检测。如日本公布对中国菠菜 中的农药毒死蜱残留限量为o o t m g 瓜g ，欧盟增加对进口我国茶叶的农药残留检测指标及 农药品种等，使我国具有比较优势的劳动密集型产品如蔬菜、水果、茶叶、食用菌、水产 品等，因不符合进口国的“绿色条款 而遭到退货、销毁、暂停进口的事件频频发生。其 绿色技术壁垒主要在于检验项目日益增多、标准要求越来越高，对我国的农产品质量提出 了更高甚至苛刻的要求，这些措施使得限量指标更加严格，增加了农药种类和覆盖的农产 品种类，将会对我国劳动密集型农产品果蔬、茶叶等的出口产生重要影响。如何加强对农 产品农药残留的监测，促进我国农产品更多地走向国际市场，保证食品安全，己成为摆在 各级政府和相关技术部门面前的重大课题，尽快提高我国农药残留检测能力、是我国政府 急需面对并解决的重大课题。 2 农药残留的分析检测方法 农药残留速测技术可分为化学检测、生化检测和生物检测三大类，目前这三大类中研 究较多的有仪器分析法、免疫分析法、生物传感器法、活体检测法、酶抑制法、实验室自 动化等。 2 1 农药残留常规色谱仪器分析法 2 1 1 气相色谱( g c ) 气相色谱法是一种经典的分析方法。它具有操作简单、分析速度快、分离效能高、灵 敏度高以及应用范围广等特点。所以气相色谱( g c ) 法在当前农药残留分析领域中仍占绝对 优势。g c 己由过去填充柱为主转为毛细管柱为主，石英毛细管柱的出现和进样系统的不 断改进，大大提高了g c 分析的精密度、准确度及灵敏度。采用双柱双检测器不仅可以进 行农药多残留分析，还大大缩短了检测时间。但g c 对挥发性差、极性及热不稳定性农药 残留分析仍较为困难。g c 常用的检测器有电子捕获检测器( e c d ) ，氮磷检测器( n p d ) 、原子 发射检测器( a e d ) 和火焰光度检测器( f p d ) 等【2 l 】。 使用气相色谱法，多种农药可以一次进样，得到完全的分离、定性和定量测定。再配 置高性能的检测器，使分析速度更快，结果更可靠。但因其技术含量高，操作程序相对复 杂，且需要特定的实验条件和具有一定专业技术人员进行操作。一般不适用现场检测。另 外，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难以应用气相色谱法进行分析【2 2 1 。 2 1 2 高效液相色谱( h p l c ) 高效液相色谱法是2 0 世纪7 0 年代急剧发展起来的一项高效、快速的分析分离技术， 4 吉林农业大学硕士学位论文 大豆酯酶的固定化及应用研究 现在使用仍很广泛。对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大的农药原则上都可用高效 液相色谱法进行分离、分析。由于其只能检测对紫外有吸收和本身能发射荧光的农药，限 制了高效液相色谱法的应用。世界上大约有8 0 有机化合物可以用h p l c 来分析测定【2 3 】。 蒋新明等对六种氨基甲酸酯类农药和三种代谢产物采用h p l c 柱后衍生化法进行测定，最 低检测浓度达到2 u g m l ：2 4 1 。 2 1 3 气相色谱一质谱联用技术( g c m s ) 气相色谱仪是质谱法的理想“进样器”，试样经色谱分离后以纯物质形式进入质谱仪， 就可充分发挥质谱法的特长。质谱仪是气相色谱法的理想“检测器”，色谱法所用的检测器 都有其局限性，而质谱仪能检出几乎全部化合物，灵敏度又高。由于g c m s 所具有的独 特优点，目前已得到广泛的应用。一般来说，凡能用气相色谱法进行分析的样品，大部分 都能用g c m s 进行定性及定量测定。g c m s 兼有气相色谱高分离性能和质谱准确鉴定化 合物结构的特点，可达到同时定性、定量的检测目的。美国已开发了一种较为简便易行的 用于g c m s ；! 贝i j 定的样品前处理方法，建立了检测水果和蔬菜样品中2 5 1 种农药及其代谢物 的残留的检测方法。日本也开发了用g c m s 同时检测1 0 1 种农药残留的快速检测方法。在 中国，g c m s 技术仅用于结果的确认，尚未建立利用g c m s 检测农药多残留的标准分析 方法【2 5 1 。 近些年国内有少量关于g c m s 检测农产品中有机磷农药的报道，李永香等【2 叫( 2 0 0 4 ) 对g c m s 法同时测定水果、蔬菜、粮食中3 1 种有机磷农残的方法进行了研究，该方法定 量检测限在：6 6 1 1 0 。m g & g 一4 7 8 1 0 。2 m g 瓜g 之间，对加混标终浓度为0 s m g k g 的样品重复测定两次，测定结果的绝对误差在5 2 - 1 3 5 之间。 2 1 4 液相色谱一质谱联用技术( l c m s ) 对于高极性、热不稳定性、难挥发的大分子有机化合物，使用g c m s 有困难，而液 相色谱的应用不受沸点的限制，并能对热稳定性差的试样进行分离、分析。但液相色谱的 定性能力更弱，因此液相色谱与质谱的联用，其意义是显而易见的。液相色谱质谱联用 对分析技术和仪器的要求高，但它是一种很有利用价值的高效率、高可靠性分析技术。 l c m s 技术是通过一种内喷射式和粒子流式接口技术将液相色谱与质谱联接起来的 检测方法，用于分析对热不稳定、分子量较大、难以用气相色谱分析的化合物。它具有检 测灵敏度高、选择性好、定性定量同时进行、结果可靠等优点。l c m s 对简单样品可进 行分析前净化，并具备多残留分析的能力，在对初级监测呈阳性反应的样品进行在线确证 方面优势明显。另外，毛细管液相色谱与离子捕获检测器的配合大大拓宽了液相色谱高灵 敏度分析的范围。l a c a s s i e 等1 27 j 用l c m s 测定了苹果、梨中的灭害威、涕必灵、乐果和 亚胺硫磷。使用的固定相为n u c l e o s i l c l 8 柱，以乙睛2 m m o l l 甲酸铵梯度洗脱，以i s p i 为离子源，检测限达到0 0 2 m g k g 。ach o g e n b o o m 等【2 翻( 2 0 0 0 ) 利用l c m s 对蔬菜中的一 吉林农业大学硕士学位论文 大豆酯酶的固定化及应用研究 些农药进行了检测，线性范围为2 1 0 0 9 9 k g ，检出限为0 5 2 9 9 k g 。 2 2 农药残留快速检测法 常规农药残留分析技术检测程序繁杂，设备昂贵，在中国用于农药残留检测受到一定 的限制。为了保障消费者健康，必须加强农药残留的检测。由于农药品种多、化学结构和 性质各异、待测组分复杂，尤其是近年来，高效、低毒、低残留农药品种不断涌现，在农 产品和环境中残留量很低，给农药残留检测技术提出了更高的要求。这些促进了农药残留 速测技术的迅速开发。 农药残留速测技术可分为化学检测、生化检测和生物检测三大类，目前这三大类中研 究较多的有仪器分析法、免疫分析法、生物传感器法、活体检法、酶抑制法、实验室自动 化等。 2 2 1 酶抑制技术 目前，在农药残留检测方面，酶抑制技术主要用于有机磷与氨基甲酸酯农药的检测。 原理：酶抑制技术( e n z y m ei n h i b i t i o n ) 是利用有机磷、氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性 抑制作用而建立起来的用于分析此类农药在食品中的残留量的技术。有机磷和氨基甲酸酯 类农药品种繁多，分子结构各不相同，但它们的作用机理却近乎相同，都能抑制乙酰胆碱 酯酶以及植物酯酶的活性。如果在果蔬提取液中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，可抑 制酯酶的活性。在酶抑制试验中加入底物和显色剂，如果有微量的有机磷或氨基甲酸酯类 农药，酶活性将受到抑制，底物不能被酶水解，造成颜色变浅或不显色，根据颜色的变化， 即可判断反应液中是否存在有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留，酶液比色法与纸片速测卡 法都是基于同一检测原理而设计的；酯酶活性受到抑制时，与底物作用的产物之一醋酸生 成量相应减少，根据反应前后a p h 变化情况，来推断醋酸生成量减少情况，进而判断农药 对酯酶活性抑制程度大小，电位法则是根据这一原理而设计的。酶抑制技术可在短时间内 将高毒蔬菜从众多蔬菜样本中筛选出，并可区分菊酯与有机磷、氨基甲酸酯类农药造成的 污染。作为大量样品检测的第一道安全屏障和防止农药残留的急性中毒中有很高的实用价 值【2 9 1 。 近些年来国内外在这一方面作了大量得研究，所选用的酶与显色反应大致有以下几 种。 ( 1 ) 以碘代硫化乙酰胆碱作为底物，5 ，5 - 一- - 硫代2 ，2 - - 硝基苯甲酸( d t n b ) 作为显色 剂。 ( 2 ) 氯化乙酰胆碱在胆碱酯酶作用下产酸，根据指示剂颜色或反应液p h 值变化对农残 进行判别。 ( 3 ) 植物酯酶水解2 ，6 二氯乙酰靛酚，根据反应溶液水解前后颜色的变化，用眼睛或 仪器辨别农药对酶抑制程度，间接观察农残情况。 6 吉林农业大学硕士学位论文大豆酯酶的固定化及应用研究 ( 4 ) 选用乙酸萘酯作为底物，固蓝b 作为显色剂，根据酯酶催化反应强弱提示农残状 况【3 0 1 。 可用于残留检测的酶有羧酸酯酶1 3 1 1 ( 主要来源于动物肝脏、植物等) 、丁酰胆碱酯酶( 动 物血清等) 口2 】及乙酰胆碱酯酶( 昆虫头部、动物红细胞) 等，但由于动物酯酶制备困难，成本 高，不易保存等缺点，很多学者在开发新的酶源，如植物酯酶。应用酶抑制原理已经制备 出一系列农药残留快速检测仪器如速测卡、酶片、传感器、快速检测仪等，但是目前酶抑 制法的检测限都较高，此外，有些植物如黄瓜、韭菜、菜花、马铃薯、葛芭等本身存在对 a c h e 有抑制作用的活性物质如氯代烟碱类物质，这些活性物质对检测造成一定的干扰， 易引起“假阳性反应”【3 3 】。 2 2 。1 1 乙酰胆碱酯酶比色法 原理：乙酰胆碱酯酶( a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，a c h e ) 是一种生物催化剂，主要功能是胆碱能 在神经突触处通过快速水解神经递质乙酰胆碱( a c h e ) 而中断神经冲动的传递，故a c h e 又 称乙酰胆碱水解酶( a c e t y l c h o l i n eh y d r o l a s e ) 。过程为：首先酶与底物形成可逆的酶底物复合 体，然后酶被乙酰化并释放胆碱；第二步是水分子中电负性的羧基负离子进攻乙酰化基团 中亲电碳原子，形成正常的酶和乙酸【3 4 1 。有机磷和氨基甲酸酯类化合物是乙酰胆碱酯酶的 抑制剂，通过与活性位点的丝氨酸( s e r2 0 0 ) 残基形成共价键而抑制乙酰胆碱酯酶。农药与 正常底物争夺乙酰胆碱酯酶结合部位，形成稳定的抑制剂即a c h e 的复合体，使酶活性丧 失。其反应可表示为：在胆碱酯酶的作用下，硫代乙酰胆碱可以水解为硫代胆碱和乙酸， 硫代胆碱和二硫代二硝基苯甲酸产生显色反应，呈现黄色，在4 1 2 n m 处有最大吸收峰。 当有甲胺磷和氨基甲酸酯类农药存在时，农药抑制了酶的活性，使显色反应速率变慢，不 同浓度、不同毒性的农药对酶的抑制程度不同，以此可以建立农药残留量和酶活性抑制率 之间的对应关系。 该法是目前国内应用最广泛的快速分析方法，己在小型的快速测定仪上得到了应用， 国内己有几家商业化的产品如武汉沃特公司的农药残留快速测定仪和上海电子光学技术 研究所的c l 1 残留农药测定仪，国标g b 厂r5 0 0 9 1 9 9 2 0 0 3 的酶抑制率法也是采用该反应 的原理。该法优点是显色灵敏、测量时间短，可以半定量测定，结果可靠。但目前也存在 一些问题，如：样品预处理大多采用振荡提取的方法，提取效率不高：底物、显色剂等主 要试剂要从国外进口，酶的制备复杂，因此试剂消耗成本仍相对较高，每测一个样品需要 1 元以上：操作步骤繁琐，易受叶绿素、植物次生物质的干扰，容易产生假阳性结果1 3 5 】，酶 和底物不易保存等。 2 2 1 2 植物酯酶比色法 有机磷杀虫剂可以抑制植物中的某些酯酶，因而利用这些酯酶催化的显色反应强弱可 以检测农药残留。基于有机磷对植物酯酶的抑制作用建立的一种定性分析方法。植物酯酶 7 吉林农业大学硕士学位论文大豆酯晦的固定化及应用研究 促使底物2 ，6 一二氯靛酚抑制分解，底物水解前后颜色由橙( 4 8 0 n m ) 变蓝( 61 0 n m ) 。当样品 溶液依次加入酶和底物后，若样品中不含有机磷农药，底物迅速分解，样品溶液很快变色， 否则酶受到抑制，底物分解变慢或者不分解，导致样品溶液较长时间保持橙色不变或呈浅 蓝色，通过与对照样比较可确定样品中是否含有有机磷农药汹3 。同时还可以利用植物酯酶 水解a 乙酸萘酯，生成的产物之一萘酚和固蓝b 盐作用形成紫红色的偶氮化合物，从而 进行显色反应。酶被农药抑制的程度与溶液颜色深浅相关，从而测定农药残留口7 1 。 王仲海对不同来源酯酶的抑制效果进行了比较，并对植物酯酶和动物酯酶的酶活性 及被抑制程度等性质进行了实验研究。研究结果表明，动物酯酶中的苍蝇酶、蝇蛆酶与植 物酯酶中的小麦酯酶相比，它们的活力和被农药抑制程度处于相近的水平。酶抑制法中动 物乙酰胆碱酯酶的专一性最好，灵敏度高，干扰小，但是乙酰胆碱酯酶纯品的价格昂贵， 而液态的乙酰胆碱酯酶不易保存。不同来源的动植物酯酶受农药的抑制不同，使用时必须 选择相应的酯酶，这样才能确保检测结果的可靠性与可比性。 酶抑制技术检测农药残留操作简便、快速、灵敏、经济，样品无需净化，但是此方法 在检测韭菜、生姜、葱、蒜、胡萝b 、辣椒、西红柿等蔬菜容易受到干扰，只能作为有机 磷和氨基甲酸酯类农药残留的初筛。随着研究的深人，酶抑制技术检测农药残留在检测方 法上也有较大的突破，除了目前比较普遍的比色卡法、分光光度计法外，国内外近年又研 究出乙酰胆碱酯酶生物传感器，这些仪器大大地提高检测灵敏度，缩短检测时间。 2 - 2 2 免疫分析法 免疫就是机体接触“抗原性异物”或“异己分子”所发生的特异性生理反应。抗原是引起 机体发生免疫应答的最基本物质。但是有机磷属小分子化合物，只能作为半抗原。如果让 机体产生抗有机磷作用的抗体，就必须将有机磷分子与大分子蛋白质结合后制各成具有抗 原性的物质，再免疫动物，让动物机体产生具有特异性的抗体。抗