（应用化学专业论文）海蒿子水溶性多糖的提取、分离及抗癌活性研究.pdf

摘要 摘要 中药海蒿子是褐藻门，马尾藻科，马尾藻属的一种海藻，学名为 s a r g a s s u mp a l l i d u m 。广泛分布于青岛、烟台、大连等近海海域，海 蒿子中含有海蒿子多糖等多种活性成分，具有广阔的应用开发潜力。 本文选取采集于烟台长岛海域的海蒿子为研究对象，将其晾干粉 碲过筛。海蒿子干粉经氯仿脱脂后，采用热水和稀酸室温提取得到粗 多糖w 、h 。将粗多糖w 、h ，分别用b 型硅胶柱和d e a e s e p h a d e x a 一2 5 凝胶柱分离，前者用蒸馏水洗脱得到b 级分( b w 、b h ) ，后者用 不同浓度的n a c l 梯度洗脱，得到d e 级分( d e w l 、d e w 2 、d e h l 、 d e h 2 ) 。用苯酚硫酸法测各级分的总糖含量，用比浊法测硫酸根含量。 紫外光谱对纯化前后的多糖溶液在2 0 0 4 0 0 r i m 范围扫描，图谱显示在 2 6 0 n m 、2 9 0 n m 处d e 级分无核酸和蛋白质吸收峰。红外吸收光谱测 定表明纯化后的海篙子多糖结构中含吡哺糖苷键。用薄层层析法与气 相色谱一质谱法确定八种级分其单糖组成均为葡萄糖、半乳糖、岩藻 糖、果糖、木糖、甘露糖。将粗多糖w 、h 及d e 级分分别做抗癌活 性鉴定，结果显示均有抗癌活性。 关键词：海蒿子( s a f 9 8 s s u mp a l l i d u m ) ：多糖；分离纯化； 波谱鉴定；抗癌活性 a b s i r a c t a b s t r a c t s a r g a s s u mp a l l i d u m ，( t u r n ，jc a g , ，w i d e l yd i s t r i b u t e di nq i n g d a o ，y a n t a ia n d d a l i a no f f i n gi s l a n d ，i sac h i n e s et r a d i t i o n a la n dh e r b a ld r u g i tc o n s i s t so fa c t i v e c o n s t i t u e n t s a l g ap o l y s a c c h a r i d e sw h i c hm a k ei t ap o t e n t i a lr e s o u r c ef o ra d v a n c e d p h a r m a c e u t i c a lu t i l i z a t i o n t h ep r e s e n tt h e s i sw a sf o c u s e do nt h e s t u d y o ft h e s a r g a s s u mp a l l i d u m c o l l e c t e di nt h ec h a n g d a oi s l a n do fy a n t a i i tw a sc r u m b l e dt od u s ta f t e ra i r d r y i n g 。 t h ec r u d e p o l y s a c c h a r i d e s ( w j h ) w e r eo b t a i n e d f r o mt h e s a r g a s s u mp a u i d u m p o w d e rb yc h l o r o f o r m - d e g r e a s i n g ，b o i l i n g w a t e r - e x t r a c t i o na n dh c i e x t r a c t i o n c r u d ep o l y s a c c h a r i d e sw e r ep u r i f i e db ybs i l i c o ng e la n dd e a e s e p h a d e xa 2 5g e l c o l u m n sa n d g o ts i x ( b w , b h ，d e w l ，d e w 2 ，d e h l ，d e h 2 ) m a i n c o m p o n e n t s r e s p e c t i v e l y t h e i rt o t a lp o l y s a c c h a r i d e sc o n t e n tw a sd e t e r m i n e db yt h em e t h o do f p h e n o l s u l d h u r i ca c i da n d t h e i rs u l f a t er a d i c a lc o n t e n tw a sd e t e r m i n e db yt h em e t h o d o f t u r b i d i m e t r y t h e r ew e r en on u c l e i ca c i da n dp r o t e i na b s o r b a n c ea t2 6 0 h ma n d 2 9 0 n mo nt h eu l t r a v i o l e ts p e c t r u mo fd e t h e r ew e r eo b v i o u s p y r a ng l u c o s i d eb o n d a b s o r p t i o no nt h ei rs p e c t r ao f a l lt h ep u r i f i e dp o l y s a c c h a r i d e s n l er e s u l t so ft l c a n dg c m si n d i c a t e dt h a ta l lo ft h e p u r i f i e dp o l y s a e c h a r i d e sw e r ec o m p o s e do f g l u c o s e ，g a l a c t o s e ，f u c o i d a n ，f i u c t o s c ，x y l o s ea n dm a r m o s e n e r e s u l t so fa n t i c a n c e r a c t i v i t i e sd e t e r m i n a t i o ns h o w e dt h a tt h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d e sa n dd e c o m p o n e n t s h a de f f e c t i v ei n h i b i t i o no nt u m o re e l 】l i n ep 3 8 8a n da 5 4 9 g r a d u a t es t u d e n t ：j u n - q i n gl i ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db y p r o f e s s o rz h i - p i n g l i k e yw o r d s ：s a r g a s s u m p a i l i d u m ；p o l y s a c c h a r i d e s ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ： s p e c t r a li d e n t i f i c a t i o n ：a n t i - c a n c e ra c t i v i t y n 引言 引言 近年来，海洋生物活性物质研究以及以海洋活性成份作为原料丌发药物、功能 性食品、生化制品等的研究，越来越受到国内外的广泛关注。许多研究工作表明， 海藻是许多海洋生物活性物质的重要来源，海藻多糖又是海藻中一类重要的生物活 性物质，是海藻的重要组成成分。近年来研究表明，海藻多糖除具有传统的工业 价值外，还具有多种生物活性及药用功能，诸如：增强免疫、细胞诱导分化、抗肿 瘤及抗痫毒。现有研究结果显示，在褐藻类植物中最具活性功能的两种多糖是褐藻 酸多糖和岩藻聚糖。目前，关于海藻多糖的生理活性，化学结构以及构效关系的研 究已成为人们关注的热点，所以也逐渐成为当今新药开发的重要方向之一。关于硫 酸酯化多糖的研究是当前多糖研究的一个“兴奋点”，已经证明从某些海藻中提取到 的多糖硫酸酯能阻断病毒对细胞的吸附以及抑制h i v 的反相转录酶，但对f 常细胞 无不良影响”3 。岩藻聚糖是一类主要由岩藻糖组成的不均一硫酸多糖”1 ，是含有硫酸 基团的杂多糖，具有独特结构和多种生物活性，是褐藻细胞壁的组成成分，存在 于褐藻问组织或粘液基质中，主要由l 一岩藻糖和硫酸根构成，其次还伴有半乳糖、 甘露糖、木糖、阿拉伯糖、糖醛酸等。它是1 9 1 3 年k y l i n “1 首次从褐藻掌状海带中 发现的一种酸性粘多糖，他用稀酸提取该藻，所得产物水解后以苯腙分离出一种甲 基戊糖，即l 一岩藻糖( l f u c o s e ) ，他命名这种多糖为f u c o i d i n ( 褐藻糖胶) 。现今根据 国际命名原则统一定名为岩藻聚糖( f u c o i d a n ) 或岩藻聚糖硫酸酯( s u l f a t e d f u c a n ) ， 还有一些一直在国内沿用的名称，如褐藻多糖硫酸酯、岩藻硫酸多糖、褐藻糖胶、 岩藻糖胶等等。近几十年来，岩藻聚糖在抗肿瘤、抗病毒、抗凝血等生物活性方面 一直受到广泛的关注，许多科学工作者在其提取、分离纯化、化学组成、结构及理 化性质、生理活性及构效关系等方面进行了大量的研究工作，取得了一定的研究成 果。褐藻岩藻聚糖具有多种生物活性，有着广泛的药物等方面的开发前景。现就岩 藻聚糖在这几个方面的研究综述如下。 一、岩藻聚糖的存在形式： 研究发现，岩藻聚糖只在褐藻和棘皮类动物( 如海参、海胆等) 中存在，是所 有褐藻所固有的细胞间多糖，已证明是以小滴状存在，能从叶片表面分泌出来，分 泌出的胶质中还掺杂有褐藻酸钠。 d er e v i e r s ”1 发现岩藻聚糖的分散性与它们在细胞中的位置有关。均聚的硫酸化 岩藻聚糖主要发现于细胞壁，而由木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和岩藻糖等组成的杂 聚的泡叶藻褐藻多糖硫酸酯主要存在于细胞间隙。岩藻聚糖的硫酸根、岩藻糖的含 青岛丈学硕士学位论文 量随褐藻的种类、褐藻的生长季节、生长区域等的不同而有很大的差异。 b l a c k ”3 研究了英国产海带目和墨角藻目中各种褐藻的岩藻聚糖含量的季节变 化。墨角藻日中的含量没有规律性的季节性变化，一般说来，3 、4 月份较低，其它 月份较高，其中潮问带生长的沟鹿角菜中的含量在7 月一1 2 月可达1 3 。而靠低水线 的齿缘鹿角菜中只含7 ，深水的海带目中只含i - 4 。海带目叶片中的含量比茎部 多。纪明侯、徐祖洪”3 等对中国人工养殖的海带叶片中岩藻聚糖的分布研究表明： 海带叶片中岩藻聚糖含量分布边缘比中部多，并从基部向叶片尖部逐渐增加。西出 英一”l 等采用自己建立的方法调查了日本产不同褐藻中岩藻聚糖的含量及组成，在 调查的2 1 种褐藻中，其中羽叶藻( e i s e n h 2b i c y c l i s ) 的含量最高( 为l o ) ，最低的 是鼠尾藻只有0 5 ) 。一般说来，生长于潮间带较高区域的褐藻，暴露在阳光中 的时间较长，含量也较高。 二、岩藻聚糖的化学组成： k y l i n 在1 9 1 3 年首先报道岩藻聚糖中含有l 一岩藻糖。继k y l i n 之后，各国学者 先后研究了各种褐藻，如巨藻、海带、裙带菜、羊栖菜、墨角藻、泡叶菜、绳藻， 等，都发现了各不相同的岩藻聚糖。 h o a g l a n d 和l i e b “”在1 9 1 5 年发现从巨藻( m a r o c y s t i sp y r i p e r a ) 中分离的提取 物并将其水解，发现其中含有与钙结合的硫酸酯。 b i r d 和h a s s 1 在1 9 3 1 年将从掌叶海带( l a m i n a r i ad i g i t a t a ) 中分离到的提取物 进行灰分分析发现，灰分含量为3 0 9 ，而提取物总硫酸根含羹为3 0 3 ，是灰分中 硫酸根含量的近2 倍，因此认为该提取物为一种碳水化合物的硫酸酯。同时指出， 该提取物中含有7 3 的糖醛酸。 同年，n e l s o n ”等也证明硫酸根是以基团形式存在于岩藻聚糖中。1 9 3 7 年， l u n d e “”等从新鲜的掌叶海带渗出液中分离到相似的提取物，也证实了总硫酸根含量 为扶分中硫酸根的约2 倍。酸水解发现甲基戊糖的含量在3 3 一3 7 之间。然而这个 数据却不能与以前所建议的岩藻聚糖的化学通式( r r 0 s 0 2 o m ) n 相一 致( r - f u c ，r 一未知物，m 一金属离子如c a 、k 、n a 等) ，因为该式中碳水化合物含 量高达8 0 以上。在r 本，m i w a 在1 9 4 0 年从去除褐藻淀粉的e i s e n i ab i c y o l i s 褐藻 多糖硫酸酯的水溶液中鉴定出d 一葡萄糖。 关于岩藻聚糖的化学组成的报道很不统一，为了协调各种报到的偏差， p e r c v i v a l 1 等在i 9 5 0 年从h i m a m h a l i al o r e a ( l ) l y n g b y e 中，用相同的处理条件提取 纯化岩藻聚糖，分析结果发现，不同来源的岩藻聚糖组分含量不太一致。岩藻糖含 量在3 5 一4 4 ，硫酸根含量3 1 一3 4 ，并指出关于各种来源的岩藻聚糖组分的报道的 引言 偏差。岩藻聚糖对溶剂的吸附也有一定贡献，岩藻聚糖即使在0 1 m m 真空度4 0 。c 条 件下二f 燥1 8 h ，仍顽固的含水达9 4 ，乙醇达6 。因此，通过校正所吸附的溶剂因 素，对从h i m a m h a l i al o r e a 中分离的岩藻聚糖组分分析结果硫酸根，3 8 3 ：余 属，8 2 ；糖醛酸，3 3 ；水解后测得岩藻糖，5 6 7 ，甘露糖，4 1 ，木糖，l _ 5 ， 陔结果与建议的分子通式( c 6 h 9 0 3 s 0 4 c a i ，2 ) n 岩藻多糖硫酸钙中硫酸根：3 9 2 ； c a ：8 2 ：岩藻糖：6 6 9 较为接近。 我国学者纪明候“”等从人工养殖的海带浸泡液中采用c p c ( 氯代十六烷基吡啶) 和乙醇两种分级沉淀法分别得到了较纯的岩藻聚糖。组分分析结果为：前法所得岩 藻聚糖含岩藻糖：2 4 ，7 ；硫酸根：4 5 5 。后者所得岩藻聚糖含岩藻糖：3 1 9 ；硫 酸根：4 1 4 。由此可见，来源相同，处理方法不同所得岩藻聚糖组分也不一致。 刘晓蕙、张翼伸“”也用c p c 和乙醇分级沉淀从渤海湾人工养殖的海带中得到了 8 个提取物。每个提取物都含有较高的岩藻糖和硫酸根。他们将其中一个含岩藻糖 较高的级分经过离子交换、凝胶过滤层析纯化，得到层析成单一对称峰，电泳呈 条带的级分，该级分水解物含硫酸基。经气相色谱分析，含岩藻糖、半乳糖和微量 的甘露糖、木糖等，其中岩藻糖：半乳糖：硫酸根比例为6 8 ：1 ：9 7 ( 摩尔比) 。 l a r s e n 等在19 7 0 年发现从泡叶藻分离到的产物中含有d 一甘露糖和d 葡萄糖醛 酸、l 一古罗糖醛酸、d 一甘露糖醛酸。n i s h i n o o ”等在1 9 9 4 年对美国s i g m a 公司从墨 角藻( f u s u sv e i s i c u l o u s ) 中生产的商品褐藻多糖硫酸酯进行凝胶过滤和离子交换层 析分离纯化，发现其中含有大约0 4 0 6 的氨基葡萄糖，整个岩藻聚糖粗品的各个级分 分子量有较宽的变动范围。 综上所述，关于岩藻聚糖的组分报道，都不尽相同，甚至差异悬殊。这可能是 由于各实验室所采取的方法不同，或者得到的分离物纯度不够，或者得到的是不同 的级分等原因造成的。从众多资料报道的结果看可以这样认识岩藻聚糖：从广义 上讲，岩藻聚糖应该是一类相似的化合物而不是一种，其中有典型的岩藻聚糖，以 岩藻吡喃糖硫酸酯为基本单位或为主要组成成分( 还含有其他微量成分) ，也有非典 型的岩藻聚糖，除了含有岩藻毗喃糖硫酸酯外，还含有相当可观的其他中性糖、糖 醛酸，甚至含有蛋白质。从狭义上讲，岩藻聚糖仅指典型的岩藻聚糖( 这也是人们 常指的岩藻聚糖) 。岩藻聚糖具有很强的不均性，不仅表现在组成成分上，而且还表 现在光谱特性、分子量、结构以及生物活性等方面。不但同一植物中存在着一系列 相似但又不同的岩藻聚糖，而且不同来源的用同一方法纯化的岩藻聚糖也不完全 样。岩藻聚糖组成成分和结构上的复杂性和不均性决定着不同的岩藻聚糖在许多 生理活性及其强弱是不同的。总之，现在人们已经对褐藻岩藻聚糖的化学组成有一 个比较清晰的了解，它是一种化学组分和结构十分复杂的大分子多糖化合物，以l 一 岩藻糖和硫酸基团为主，还含有半乳糖( o a l ) 、木糖( x y l ) 、葡萄糖( g i c ) 、甘露糖 青岛大学硕士学位论文 ( m a n ) 、鼠李糖( r h a ) 和阿拉伯糖( a r a ) 等，有些还含有糖醛酸残基( 如甘露糖醛酸、 半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等) ，氨基己糖、乙酰基及甲基取代等。随着藻的种类、生 长季节和藻体部位不同以及提取分级方法不同而有较大的差异。 三、岩藻聚糖的提取： 从褐藻中提取岩藻聚糖的传统方法一般是：原料经过预处理后用热水、稀酸或 氯化钙溶液浸提，然后向提取液中加入氢氧化铅、氢氧化铝、乙醇或季胺赫类阳离 子表面活性剂，沉淀出岩藻聚糖粗品，粗品再经乙醇沉淀重结晶，得到产品岩藻聚 糖“，为了减少色素、蛋白质等的溶出，提取之前可以先以高浓度醇类或甲醇溶液 处理藻体。 伍志春等”用溶剂萃取法从褐藻浸提液中分离提取岩藻聚糖时发现，采用溶剂 萃取法制备的岩藻聚糖纯度优于乙醇分步沉淀法。 卢睿春。“等采用纤维素酶制剂提取硫酸多糖，改变了中性水法及酸法提取率低 的局面，使提取率高达5 8 4 。 王维香等“用复合酶( 纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等) 解法提取裙带菜硫 酸多糖，得到酶解法结合热水浸提法提取硫酸多糖的最佳工艺条件为：去杂后的藻 体在藻粉水= 5 o ，酶藻粉= 2 o ，p h = 6 0 。4 0 条件下反应2 小时，再在8 0 浸 提1 小时，提取液浓缩后加入3 倍体积的9 5 乙醇沉淀。在此条件下，硫酸多糖得 率为：7 7 6 。 z h u a n g ，c u r t i t o h ，h i r o k o 等人3 用8 0 n a o h 碱溶液不断萃取粉状海藻，之后加 热水与0 t m 赫酸溶液，荐加5 n a o h 溶液，用d e a e 进行离子交换，得到的每一部 分分别用t o y o p e a r lh w - 6 6 f 过滤，得到3 2 份岩藻聚糖。 郑军、王英等“”称取干燥藻体粉末9 0 克，加入8 0 的已醇5 0 0 m l 浸泡2 h ，过滤 除去已醇，加入0 0 5 m 磷酸缓冲溶液3 0 0 0 m l ，9 5 煮提2 h ，将煮提液用纱布过滤， 滤液冷却至5 c 后用6 m 盐酸溶液调节至p h = 2 0 ，2 0 以下，8 0 0 0r m i n 离心2 5 m i n ， 收集上层清液，用2mn a o h 调节p h 至中性，用1 0 0 kd a 滤膜超滤浓缩除盐，浓缩 液用7 5 乙醇醇析，离心得沉淀，再用无水乙醇洗2 次，自然干燥后得粗岩藻聚糖。 刘婉乔、侯振建等“”将马尾藻用流动水冲去杂质，晾干后粉碎，按l ：2 0 ( 质 量比) 的比例于8 0 c 搅拌提取，提取液经粗滤后于蒸馏水中透析4 8 小时，离心， 所得上清液真空缩至t 4 体积，浓缩液加入3 倍体积的9 5 7 , 醇离心，所得沉淀真 窄干燥，即得硫酸岩藻聚糖粗品。 刘桂萍、叶倩萍”1 从斜顶菌中提取岩藻聚糖。将用9 5 乙醇处理三次后的天然 斜顶菌子实体残渣，用3 倍体积的9 5 乙醇研磨至匀浆状，离心、沉淀用乙醇、乙 引言 醚依次沈涤脱水、离心，在真空干燥器中抽空干燥，即得粗岩藻聚糖样品。 四、岩藻聚糖的分离纯化： 提取的卡r 岩藻聚糖通常含有部分水溶性的褐藻胶、蛋白质、褐藻淀粉、色素等， 需要进步纯化，现有的常用纯化方法有： 乙醇重沉淀法，将粗岩藻聚糖溶于水中，加乙醇至浓度达3 0 ，除去不溶物， 继续提高乙醇浓度至7 0 ，加少许氯化钠，使沉淀完全。以乙醇、乙醚洗涤，干燥。 西出英一对热水提取的粗褐藻多糖硫酸酯水溶液在0 0 5m o l lm g c l ：存在时，以2 0 乙醇沉淀除去作为杂质的水溶性褐藻酸1 。王作芸、赵学斌在研究铜藻中褐藻多糖 硫酸酯时，将制得的粗褐藻多糖硫酸酯溶于水后，先后以4m o l lc a c 。和3 0 乙醇 沉淀除去褐藻胶，然后用8 0 乙醇沉出纯化的褐藻多糖硫酸酯”。 季胺献类沉淀法，利用阳离子表面活性剂如十六烷基氯化吡啶( c p c ) 或十六 烷基三甲基溴化胺( c t a b ) 能与高分子电解质产生沉淀的性质使褐藻多糖硫酸酯沉 淀下来。在提取和纯化过程中，为除去溶液中的离子和小分子物质一般都采用透析 的方法。c o l l i e c 等在沟鹿角菜褐藻多糖硫酸酯的提取中采用了超滤膜分离方法以排 除分子量较小的物质”。有时为除去混杂在提取液中的褐藻淀粉和蛋白质，可采取 酶消化法。f e u r y 等在研究法国褐藻胶工业的副产品时就采用b 一葡聚耱酶和a l c a l a s e 来清除其中的褐藻淀粉和蛋白质啪1 。一般岩藻聚糖的化学成分复杂，其电泳和色谱 检查都呈现不均一性，因此有必要对样品进行分级。常用的分级方法有：乙醇分级 沉淀法、凝胶过滤色谱法和离子交换色谱法。分离褐藻淀粉和褐藻多糖硫酸酯还可 以采用离子交换树脂法，因为前者是电中性的，后者为多聚阴离子形式。 五、岩藻聚糖的结构： 由于褐藻岩藻聚糖化学组分复杂，并且又是大分子化合物，相对分子质量从几 万到几十力i 都有，使得其结构研究进展十分缓慢。随着多糖和寡糖的分级纯化手段 的进步高效液相色谱、离子交换色谱、高效毛细管电泳。、离心分配色谱“”等的 应用，使得能够获得更纯的多糖和寡糖组分，为进一步的结构研究打好了基础。 早期的岩藻聚糖结构分析主要依靠化学方法，如甲基化分析、s m i t h 降解、过碘 酸氧化、乙酰解、三氧化铬氧化等。随着现代分析技术的出现与发展，红外光谱( 1 r ) 、 质谱( m s ) 、核磁共振波谱( n m r ) 等物理方法被广泛的应用于岩藻聚糖结构的研究 中，分析手段更加自动化和智能化，使岩藻聚糖的结构研究取得了更大的进步。核 磁共振自7 0 年代就引入糖化学中，并应用在多糖的结构分析方面。但在早期，由于 设备和技术所限，n m r 在结构解析方面只是起着简单的辅助验证作用。随着科学技 青岛大学硕上学位论文 术的发展尤其是进入9 0 年代以后，n m r 在多糖结构分析中已扮演着越来越重要 的角色，甚至起到了决定性的作用。 5 0 年代，c o n c h i e 和p e r c z v a l 等o ”将从墨角藻( f u c u sv e s i c u l o s i s ) 制备的岩藻聚 糖进行甲基化和水解，得到岩藻糖，3 一甲基岩藻糖和2 ，3 一二甲基岩藻糖( 1 ：3 ：1 ) ， 且总硫酸基大约有1 0 ，对碱不稳定，说明该多糖的主要组成单位是l ，2 一一岩藻 糖，c 4 上带有硫酸基。据此他们提出了2 种岩藻聚糖的结构模型( 图1 ) 。 s o ，。 l 3 2 f t t co1 - 2 f u ea1 - 2 f u cai - 4 f u cal 一2 f u ca1 444 4 tt t t s t ) s o , s o , s g i s 0 ，。- 4 f u c 口l i 2 2 f u c al 一2 f u cai - r 2 f u cal - 3 f u c c i l 一 4 t s 0 3 4 t s 执一 n 4 t s 0 b 4 t s 0 b 图1c o n c h i e 和p e r c i v a l 提出的平均结构模型 对墨角藻岩藻聚糖提出的上述平均模型多年来一直沿用，但近年来随着分离和 检测水乎的提高，p a t a n k a r 等。”对s i g m a 公司生产的商品岩藻聚糖，经甲基化分析 和g c m s 分析，根据分析结果对这一结构进行了修正，提出了新的平均结构模型( 图 2 ) ： 引言 f u ca1 2 3 f u cal 一3 f u cal 一3 f u c 口1 3 f u ci b i 1 - 3 f u ca l 一3 f u c 口i 4 44 t tt s o , 。 s 如一 s o , 图2p a t a n k a r t 提出的修正结构模型 碳链的骨架不是以前所提的l ，2 连接，而是l ，3 ，连接，部分岩藻糖残基c 4 被硫 酸基取代；在碳链上的分支不是随机的，而是每2 3 个岩藻糖残基就有一个岩藻糖 分支。 n i s h i n o 等”。删研究了从昆布( e c k l o n i ak u r o m e ) 中热水提取经一系列分离纯化过 程得到的两个主要组分c - i 和c i i ，化学分析表明其主链均为由a 一( 卜3 ) 连接的l 一 岩藻糖组成，并具有部分卜2 连接的岩藻糖支链，硫酸根主要连接在岩藻糖c 4 位置 上。 c h i z h o v 等。”1 研究了从绳藻( c h o r d a f i l u m ) 提取的岩藻聚糖结构，通过n m r 分析 发现，其碳链骨架也是a - 1 ，3 连接的岩藻糖，有高度的分支，分支主要是。一1 ，2 连接的单一单元。硫酸酯主要在0 4 位上，部分在0 2 位上。部分a 一1 ，3 连接的 岩藻糖残基o 一2 位已被乙酰化。模型见图3 ： 斗3 ) a l _ f 7 u c 一( 卜3 ) a l - f u c ( 1 3 ) 吐一l f u c _ ( i _ 3 ) q l f u c 一( i - 3 ) 一a l f u c 一( 1 _ 2 ) f 巾l - f u c 矿( 1 图3c h i 主h o v 提出的绳藻岩藻聚糖模型 长期以来，这些n 一( 1 ，3 ) ，o 一( 1 ，2 ) 连接的模型被广泛接受，然而近来有证 据表明，还有其他结构岩藻聚糖存在。 d a n i e l 等1 研究了用酶解方法获得的泡叶藻0 s c o p h y l l u mn o d o s u m ) 岩藻寡糖的 结构。将岩藻聚糖用从大扇贝( p e c t i nm a x i u m s ) 消化腺中提取的多糖降解酶进行消 化，所得寡糖用n m r 分析，发现糖链主要由n 一( 1 ，3 ) 和a 一( 1 ，4 ) 连接的岩藻糖构 青岛大学硕士学位论文 成，硫酸基团主要在0 - 2 位上，0 4 位上也可能存在。 c h e v o l o t 等”取泡叶藻岩藻聚糖，通过酸水解和双氧水裂解得到相对低分子质 量的岩藻聚糖，用n m r 分析，发现硫酸基主要在0 2 位上，其次在o _ 3 ，0 - 4 位上 也有少量发现，并且第一次找到了0 2 ，0 3 双硫取代的结构。正是由于其硫酸基的 取代模式，使得n 一】，2 连接变得不可能，而d l ，4 连接的比例却很高。他认为图 4i 中的几种结构是泡叶藻岩藻聚糖的组成部分。 在此研究基础上，c h e v o l o t “”对酸水解获得的小分子泡叶藻岩藻寡糖的结构用 n m r 进行了研究，发现该寡糖具有 3 一n l - f u c ( 2 s 0 2 ) - ( 1 _ 4 ) 一a l f u c ( 2 ，3 s 0 3 。) ( 1 ) 。 的重复结构单元，主要由4 到7 个图4 i i 中的结构组成，并证明该结构是未水解岩 藻聚糖的骨架结构，一些含有硫酸根、木糖、岩藻糖、岩藻糖硫酸酯的支链连接在 c 的4 位上。 褐藻岩藻聚糖的结构复杂，主链除了由岩藻糖构成外还含有其它单糖，并且有 较多的分支。p e r v c i v a l 等通过研究褐藻d i c t y o p t e r i s p l a g i o g r a m m a 的岩藻聚糖“，发 现其中的半乳糖以o 一1 ，0 2 ，0 - 3 的三取代物形式存在，而甘露糖则大多是沪l ， 0 - 3 ，0 - 6 位上的三取代物。n i s h i n o 等分析了从e c k l o n i ak u r o m e 分离出的一种岩藻 聚糖，发现除了常见岩藻糖链以外，该糖还含有g a l a ( 1 ，4 ) f u c ，f u c o ( 1 ，2 ) g a l ， 和f u c g a l f u c 等片段。这一结构特点与棘皮动物中存在的岩藻聚糖大不相同。棘皮 动物如海参、海胆等，岩藻聚糖的结构往往呈线形，分支很少，并且具有重复单元 1 工 引言 c a e 乍潞。 警一“ 图4c h e v o l o t 泡叶岩藻聚糖模型 六、岩藻聚糖的理化性质： 6 1 溶解性：岩藻聚糖外观为淡黄色粉末，可溶于水，难溶于乙醇、丙酮等有机溶 剂。苯酚硫酸、蒽酮硫酸反应、次甲基兰颜色反应为阳性。 6 2 旋光性的测定：在水溶液中测得的比旋光度为+ 7 7 5 c 。 6 3 分子量的测定：以粘度法测其平均分子量。 6 4 糖含量的测定：采用葸酮一硫酸法或苯酚一硫酸法。 七、岩藻聚糖的生物活性 褐藻岩藻聚糖是一种独特的水溶性海洋生物多糖，其化学组成和结构决定了它 具有多种生物活性，是当今海洋药物研究与开发的主攻热点之一。 7 1 岩藻聚糖的抗凝血活性 岩藻聚糖的抗凝血活性是最早被发现并研究的。19 5 7 年s p r i n g e r 等“”首次报道 从岩藻( f o c u sv e s i c u l o s u s ) 中提取的岩藻聚糖具有抗凝血作用。进一步研究确定了该 多糖的功能，并且发现从其他一些褐藻中提取的该多糖也具有抗凝功能。随着对抗 凝作用的深入研究，人们发现抗凝效果与多糖相对分子质量、硫酸盐浓度以及硫酸 酯所接的位置都有密切关系。 李智恩“”等报道，小鼠用来自于人工养殖的海带岩藻聚糖灌胃一次，就可以明 青岛大学硕士学位论文 显延长全血凝血时间( c t ) ，血浆复钙时间( r t ) ，凝血酶原时间( p t ) ，凝血酶时间 ( t t ) ，并且有剂量依赖关系。小鼠连续灌胃岩藻聚糖，可显著降低血浆纤维蛋白原 含量，减轻手术结扎静脉法及c h a n d l e r 氏法血栓的形成，也随岩藻聚糖的剂量增大， 抑制血栓形成的效果增强。n i s h i n o t 等对岩藻聚糖中硫酸赫浓度及分子质量对凝 血活性的影响作了研究，发现在存在肝素共因子i i 的情况下，岩藻聚糖的分子质量 越高，抑制凝血酶对血纤蛋白原的凝结和蛋白水解酶的酰胺水解活性作用越强。硫 酸盐浓度越低，这些活性也随之降低。也就是说，肝素共因子i i 介导的抗凝皿酶活 性依赖于岩藻聚糖的硫酸盐浓度和分子质量，岩藻聚糖可优先与肝素共因子i i 形成 复合物，加强抗凝血酶的活性，麸同作用于凝血酶“。组织纤溶酶原活化因子抑制 因子一1 ( p a i 1 ) 是血浆中主要抗组织纤溶酶原活化因子( t p a ) 的分子。岩藻聚糖 抑制p a l 一1 对t _ p a 的竞争性抑制作用，增强t p a 与谷氨酰一纤溶酶原( g i n p l g ) 的亲和力。 岩藻聚糖也能抑制p a i 一1 非竞争性抑制l m w t 一尿激酶对g i n - p i g 的激活作用“”。 s o e d as 1 等的研究结果揭示岩藻聚糖可以促进已形成的血栓的溶解。t p a 能溶化 纤溶酶，而抑制凝血酶活性，岩藻聚糖可以加强t p a 的这一作用，而且将n 一2 纤 溶酶保护起来，并能降低纤维蛋白多聚体形成的机会。岩藻聚糖若被进一步硫酸化 则可形成过度硫酸化的岩藻聚糖( o v e rs u l p h a t ef u c o i d a n ，o s f ) o s f 也能促进抗凝血 酶i i i ( a t i l i ) 和h c1 i 引起的凝血酶活性抑制，并随分子量的下降而活性降低。但分 子量2 0 一4 0 、4 0 一6 0 k b 的o s f 可以抑制由内毒素诱导的高血脂小鼠肝静脉血栓的形成， 活性几乎与1 0 0 1 3 0 k d 的o s f 相同。高血i 旨d , 鼠用2 0 4 0 、4 0 - 6 0 k d 的o s f 给药，血 清胆固醇水平降低，而1 0 0 1 3 0 k d 的o s f 则无此效果“。c h e v o l o t 等。1 研究了从泡 叶藻0 s c o p h y h u mn o d o s u m ) 中提取的5 种多糖组分的抗凝血活性，得到结论：岩藻 糖主链的所有2 位和部分3 位硫酸基团取代的结构是凝血活性所必需的。p e r e i r a 等 ”对不同来源的岩藻聚糖抗凝血作用进行了比较，发现不同来源的硫酸多糖在作用 机理上存在着差别，从褐藻中提取的有支链的硫酸聚糖可以直接抑制凝血酶的作用。 7 2 岩藻聚糖的抗肿瘤活性 多种褐藻岩藻聚糖的提取物都具有抗肿瘤作用。 y a m a m o t o 等1 研究了多种海藻提取物的抗肿瘤作用，其中从褐藻海黍子 ( s a r g a s s u m 幻电l l m a n i a n u m ) 中提取的岩藻聚糖对l - 1 2 1 0 白血病有一定的效果，尤其 足其中硫酸酯含量高的组分。 u s u i ”“等从爱森藻( e i s e n i ab i c y c l i s ) 中提取得到岩藻聚糖，也发现其对肿瘤 s 1 8 0 细胞株有抑制作用，抑制率达3 0 。 z h u a n gc 等“从鼠尾藻( s a r g a s s u mt h u n b e r g i i ) 分离出多种组分，发现了其中两 引言 个不同相对分子质量段的岩藻聚糖能抑制e h f l i c h 腹水疡细胞的生长。c o o m b e 等“” 分析岩藻聚糖抑制肿瘤细胞转移的可能原因，最有可能的是硫酸多糖干扰肿瘤细胞 通过毛细血管壁。 z h a n gc ”“等利用离子交换和凝胶过滤层析，从褐藻s a r g a s s u mt h u n b e g i i 的提取 液中分离得到了3 1 个级分的提取物，每个级分都含有不同比例的岩藻糖。抗癌实验 发现其中的2 个级分能抑制移植的e h r l i c h 癌的生长，分子量分别为1 9 0 0 0 和1 3 5 0 0 ， 在岩藻聚糖长链上3 0 的岩藻糖残基上有硫酸根基团，并且还有1 0 的糖醛酸和不到 2 的蛋白质。i t o h h “”等证明z h a n g c 所报道的分子量为1 9 0 0 0 的级分对小鼠l e w i s 肺癌亦有抑制效果；与5 一f u 联用，则抗癌活性显著加强，并且还能对抗5 - f u 的毒 副作用。从褐藻s a r g a s s u mk j e l l m a n i a n u m 中分离得到的岩藻聚糖，体内可以抑制移 植的s 一1 8 0 肿瘤的生长，但却对l - 1 2 1 0 白血病的荷癌小鼠无效果。 y a r n a m o t o ”等将其中的两级分进行硫酸化，使硫酸根含量增加5 0 ，结果显示 了对l 一1 2 1 0 白血病的抑制活性。看来岩藻聚糖的硫酸化程度与抗癌活性有一定的关 系。o s f ( o v e rs u l p h a t ef u c o i d a n ) 、n f c d ( n a t u r a lf u c o i d a n ) 、d s f c d ( d e s u l p h a t e f u c i o d a n ) 和肝素均能抑制3 l l 细胞侵润人工构建的基底膜，抑制3 l l 细胞粘附于基 底膜上的层粘连蛋白( 1 a m i n i n ) 上，其中o s f 活性最强。岩藻聚糖不仅可以与l a m i n i n 上的肝素结合结构域结合，也可以与3 l l 细胞表面的l a m i n i n 的受体相结合，岩藻 聚糖减轻3 l l 细胞的侵润作用，是由于岩藻聚糖及其衍生物抑制了肿瘤细胞与基底 膜层粘蛋白的相互作用“”，然而，岩藻聚糖若被氨基化。则促进3 l l 细胞对基底膜 的侵蚀。从岩藻聚糖、o s f 抑制了3 l l 细胞侵润基底膜这体外模型可以推测岩藻 聚糖、o s f 的抑癌活性也可能部分在于这一作用。滕霞等“”研究了褐藻硫酸多糖的 抗氧化和抗肿瘤作用，认为其抗肿瘤作用是因为褐藻硫酸多糖可作为抗氧化剂或通 过提高氧化酶的活性而清除自由基，从而降低活性氧自由基对免疫系统的损伤。 7 3 岩藻聚糖的抗氧化活性 褐藻岩藻聚糖的抗氧化活性是较新的一个研究热点。 张尔贤等删从褐藻类的鼠尾藻中提取的岩藻聚糖能有效地清除活性氧自出基。 嗣小华等”0 1 用e s r 法对褐藻岩藻聚糖清除活性氧的作用进行了动力学研究。薛长湖 等”对海带( l a m i n a r i a j a p o n i c a ) 岩藻聚糖体外抗氧化特性进行了研究，3 种岩藻聚 糖组分都有较强的清除活性氧自由基和抑制脂质过氧化的能力，其作用随多糖浓度 增加而增加，他们还发现1 种小分子海带岩藻聚糖具有清除活性氧自由基和较好的 体内抗氧化的功能。 7 4 岩藻聚糖的免疫调节作用 青岛大学硕士学位论文 小鼠给药岩藻聚糖后，脾脏指数、胸腺指数增大，脾细胞数量增加。岩藻聚糖 是人t 细胞的丝裂原和鼠多克隆b 细胞活化因子( p b a s ) ”，对人外周血单核细胞有 激活增殖作用“”1 ，体外可以诱导白细胞介素i ( i l 1 ) 、丙型干扰素( i e n y ) 的产 生，体内可以增强t - c e l l 、b - c e l l 、m 巾和n k - c e l l 的功能，促进对绵羊红细胞( s r b c ) 的初次抗体应答“”。用岩藻聚糖处理小鼠，外周m m 、肺中m 中数量增加，杀伤功能 增强。移植肺癌细胞的小鼠，静脉注射体外被岩藻聚糖活化的外周m e 后，显示了 明显的抗癌效果，然而值得一提的是岩藻聚糖能阻断诱导期m 巾的活化，在效应期 才促进m 中的激活。 岩藻聚糖能够活化补体，小鼠静脉注射岩藻聚糖，m 中上的c 受体与c ：受体与 c ，切割片断c ：l b 的结合加强，c 。阳性细胞增加，小鼠接受岩藻聚糖，脾t h y l 2 、l 3 t 4 和去唾液酸6 m 1 一阳性细胞的比例显著增加，l 3 t 4 l y t 2 一的比例也显示增大趋势。 岩藻聚糖的抗肿瘤活性也很大程度上归因于岩藻聚糖激活了机体的免疫力。 7 5 岩藻聚糖的抗病毒活性 褐藻岩藻聚糖的抗病毒活性也引起人们相当的重视。 h o s h i n o 等”从铜藻( s a r g a s s u mh o r n e r i ) 的热水浸提物中分离到1 种主要成分是 岩藻糖的组分，该组分有抑制疤疹病毒一1 ，人细胞巨化病毒和h i v 一1 病毒的作用。 这种抑制作用不仅在病毒感染初期有效果，而且在后来的复制阶段同样有效。 李儿等”研究了岩藻聚糖体外抗病毒作用。硫酸多糖抗h i v 病毒的机理可能是 多糖干扰h i v 夹膜糖蛋白的作用点或干扰淋巴细胞受体c d 4 位置，使之阻断了h i v 对靶细胞r 一4 淋巴细胞表面的吸附。 7 6 岩藻聚糖的抗辐射作用 李德远，徐战呻1 等研究了从海带中提取的岩藻聚糖及褐藻胶纯品对小鼠的辐射 防护作用，结果表明，两种多糖经口给药处理1 6 天，不能有效提高受7 5 6 y 或 8 5 g y c o y 射线照射小鼠的存活率和存活时间。岩藻聚糖以1 0 、5 0 、1 5 0 及3 0 0m g k g 腹腔注射给药可分别提高小鼠存活率1 0 0 、8 3 、1 6 7 和2 5 o 。这可能与大分 子多糖不易吸收或在消化道某些酶的作用下失去活性有关。岩藻聚糖以1 0 、1 5 0 、 3 0 0m g k g 剂量腹腔注射给药，分别使受4 5 g y ”c o y 射线照射的小鼠白细胞增加 1 9 1 、4 7 6 及6 1 3 ，使淋巴细胞分别增加2 4 2 、5 8 3 及6 6 9 ，表明岩藻聚 糖腹腔注射给药对外周血自细胞、淋巴细胞具有明显的保护作用。 7 7 岩藻聚糖调节血管平滑肌和内皮细胞增殖的作用 岩藻聚糖有比肝素更强的抗增殖能力， ( a s m c ) 增殖，其抑制效果有时间依赖性， - 1 2 - 岩藻聚糖抑制动脉血管平滑肌细胞 在a s m c 培养的第1 个6 小时内才有 引言 效果，表现为早期调节作用。硫酸根对岩藻聚糖是必要的，脱去硫酸根的岩藻聚糖 则失去抗增殖效应。”5 i 一岩藻聚糖饱和结合实验测定每个细胞可结合2 8 1 0 8 个岩藻 聚糖分子，岩藻聚糖的结合点只能部分的被肝素所取代，这提示肝素作为抗增殖剂 作用机制与岩藻聚糖不同m ，。 m c c a f f e r yt a 等”也证实岩藻聚糖在体外抑制鼠和牛a s m c 增殖。对气囊导管 损伤鼠连续灌注岩藻聚糖，能抑制血管肥大增生而且不引起系统性的抗凝作用。因 此岩藻聚糖可以在血管成形术和心肺再灌注治疗中作为抗血管增生肥大的抑制剂是 非常有益的。0 s f 可体外抑制培养的人脐静脉内皮细胞( h u v e c ) 形成管状结构， 这与前文所述的昆布多糖硫酸酯相似，但天然的岩藻聚糖则效果不显著。0 s f 的这 一作用机制至少部分在于抑制了