（生物物理学专业论文）耐辐射球菌中抗氧化蛋白dps（drb0092）的研究.pdf

中文摘要 耐辐射球菌( d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ) 是地球上已知的辐射抗性最强的生 物之一，它以对电离辐射、紫外线、干燥以及一系列d n a 损伤试剂显示超强的 抗性而著称。已有的研究显示，抗氧化保护体系和高效的d n a 损伤修复能力是 该菌具有超强抗性的关键因素。然而，耐辐射球菌体内存在的这种极端抗性机制 至今仍不明确。因此，研究和鉴定耐辐射球菌体内d n a 保护及抗氧化相关的功 能蛋白( 或酶) ，阐明它们的生物学功能和生化特性，对进一步理解耐辐射球菌 的极端抗性机制和探索其潜在的应用价值具有非常重要的意义。 d p s ( 斟a 幽t e c t i o n d u r i n gs t a r v a t i o n ) 蛋白是一类只存在于原核生物中具有 抵抗多种逆境压力功能的含铁蛋白，与真核生物铁蛋白( f e r r i t i n ) 和细菌铁蛋白 ( b a c t e r i o f e r d t i n ) 共同组成铁蛋白超家族。d p s 蛋白能通过两种机制有效保护 d n a 免受损伤：1 ) d p s 能结合游离态亚铁离子，从而防止多余的f e 2 + 和h 2 0 2 发生f e n t o n 反应产生羟自由基攻击d n a ；2 ) d p s 蛋白与d n a 直接结合形成结 构致密的蛋白一d n a 生物共结晶体，从而在物理形态上保护d n a 免受活性氧自 由基( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 等有害物质的攻击。 耐辐射球菌全基因组中有两个基因编码d p s 蛋白，分别是位子i 号染色体 上的d r 2 2 6 3 和位于大质粒上的d r b 0 0 9 2 基因。关于前者的生化特性和晶体结 构特征已有详细的文献报道。本研究围绕后者，应用生物信息学和分子生物学的 方法进行鉴定，并对其基因功能和蛋白生化特性进行分析。研究结果如下： 1 运用生物信息学方法对d r b 0 0 9 2 基因和蛋白序列进行分析。发现 d r b 0 0 9 2 蛋白存在类似f e r r i t i n ( 铁蛋白) 的保守结构域，进一步证明了该蛋白 属于铁蛋白超家族。通过c l u s t a i w 程序对d r b 0 0 9 2 蛋白和其它细菌d p s 蛋白进 行多序列比对，结果显示d r b 0 0 9 2 蛋白与其它物种o p s 蛋白的同源性并不高， 但其n 端前端存在富含赖氨酸( l y s ) 保守位点的区域，可能为d n a 结合结构 域；蛋白中部存在h i s l 0 0 、a s p l 2 7 和g l u l 3 1 等保守氨基酸残基，推测为铁氧化 酶( f e r r o x i d a s c ) 保守结构域。此外，分析结果显示d r b 0 0 9 2 蛋白在其n 一端还 具有其它o p s 蛋白没有的信号肽，预示着d r b 0 0 9 2 蛋白可能具有其它d p s 蛋白 不具有的生化特性。 2 用体外三段连接和体内同源重组的方法对d r b 0 0 9 2 进行全基因缺失突 变。分析突变株和野生型菌株在电离辐照和过氧化氢处理下的生存率曲线，结果 显示突变株的生存率较野生型均有明显下降，而突变株补偿o p s 蛋白则能完全 恢复野生型的表型。此外，n a t i v e - p a g e 活性染色结果表明，d r b 0 0 9 2 的缺失 导致耐辐射球菌体内过氧化氢酶( c a t ) 活性上调，h 2 0 2 压力条件下差异尤为 显著。 3 通过在大肠杆菌中过表达d r b 0 0 9 2 重组蛋白，我们得到纯化的d p s - 2 重组蛋白，并对其进行体外生化功能鉴定结果显示：在交联剂戊二醛作用下， 含5 0 m mn a c i 的缓冲液中的单体d p s - 2 蛋白能形成三聚体、四聚体和十二聚体 等各种多聚体形式；单体d p s 2 蛋白不能结合p u c l 9 质粒，但多聚体d p s - 2 蛋 白能与质粒d n a 发生非特异性结合，并能保护质粒d n a 免受f e 2 + 和h 2 0 2 发生 f e n t o n 反应产生的羟自由基损伤。 综上所述，耐辐射球菌的d p s - 2 蛋白( d r b 0 0 9 2 ) 具有明显的d n a 保护和 抗氧化功能，在该菌的抗氧化体系中扮演举足轻重的角色，可能是该菌极端抗性 机制的重要组成部分。 关键词：耐辐射球菌；o p s 蛋白；生物信息学；基因突变；抗氧化；d n a 保护 2 a b s t r a c t d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n si so n eo ft h em o s te x t r a o r d i n a r yr a d i a t i o n - r e s i s t a n t o r g a n i s m so nt h ee a r t h i ta l s oh a sah i 曲r e s i s t a n c et od e s i c c a t i o n , u v - r a y , o x i d a t i v e s t r e s sa n dav a r i e t yo fd n ad a m a g i n ga g e n t s a l t h o u g hal o to fs t u d i e ss h o w e dt h a t t h e s em u l t i p l er e s i s t a n tp h e n o t y p c sw a sa t t r i b u t e dt oi t sa n t i - o x i d a n ts y s t e ma n d h i g h l ye f f i c i e n td n ar e p a i rp r o c e s s ，t h em e c h a n i s mo f t h ee x t r e m er e s i s t a n c ei nt h i s b a c t e r i u mi ss t i l lu n c l e a r t h e r e f o r e ，i ti so fs i g n i f i c a n c et oi d e n t i f ya n ds t u d yo nt h e f u n c t i o n a l p r o t e i n sw h i c ha r ei n v o l v e d i nd n ar e p a i ra n dp r o t e c t i o no fn r a d i o d u r a n a i ) p s n al ! r o t e c t i o nd u r i n g _ s t a r v a t i o n ) i sam e m b e ro fi r o n - b i n d i n gp r o t e i n s u p e r - f a m i l yw h i c hw a sf o u n do n l yi np r o k a r y o t e s a l o n gw i t hf c r r i t i ni nc i l k a r y o t e s a n db a c t c r i o f c r r i t i n , t h e yc o n s t i t u t et h es u p c f f a m i l yo ff c r d t i n d p sp r o t e i n sh a v e f c r r i t i n - l i k ea c t i v i t y ( i r o ns t o r a g c - d e t o x i f i c a t i o n ) a n dt h ea b i l i t yt oa t t e n u a t et h e p r o d u c t i o no fr o s d p sp r o t e i np r o t e c t sd n ab yt w om e c h a n i s m s ：1 ) d p sp r o t e i n s u p t a k ea n ds e q u e s t e rf e r r o u si r o ns oa st op r e v e n tt h eg e n e r a t i o no fh i g h l yr e a c t i v e h y d r o x y lr a d i c a l st h r o u g hf e n t o nr e a c t i o ni n d u c e db yf c 2 * a n dh 2 c h ；( 2 ) d isp r o t e i n s p r o v i d ean o v e lw a yo f b i n d i n gt od n a a n dt i g h t l y - p a c k e d , h i g h l yo r d e r e dc r y s t a l l i n e o fd p s - d n ac o m p l e x e sa f o r m e d t h i sp h y s i c a ls e q u e s t r a t i o nl i m i t st h e a c e e s s i b i l i t yo f d n a t od e t r i m e n t a lf a c t o r ss u c h 豳f r e er a d i c a la n dd n a s ei t h eg e n o m eo fd e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n se m b r a c e st w og e n e st h a ta r ep r e d i c t e d t ob e l o n gt od p sf a m i l y ：g e n ed r 2 2 6 3i se n c o d e do nc h r o m o s o m ei ，a n dg e n e d r b 0 0 9 2i so nm e g a p l a s m i dm p i t h er e s e a r c ho nb i o c h e m i c a lp r o p e r t ya n dc r y s t a l s t r u c t u r eo fd r 2 2 6 3p r o t e i n ( d p s - 1 ) w a sr e c e n t l yp u b l i s h e d o u rs t u d i e sf o c u so n g e n ef u n c t i o na n dp r o t e i np r o p c r t yo f d r b 0 0 9 2 t h e r e s u l t sw e r es h o w na sb e l o w ： 1 u s i n g t h em e t h o do fm o t i fs e a r c hi nd i f f e r e n td a t a b a s e ，w ef o u n dt h a t d r b 0 0 9 2p r o t e i nh a saf e r r i t i n - l i k ec o n s e r v e dd o m a i n ，w h i c hi n d i c a t e dt h a t d r b 0 0 9 2p r o t e i ni sl i k e l yb e l o n g i n gt of e r r i t i ns u p e r - f a m i l y t h em u l t i p l es e q u e n c e s a l i g n m e n to fd r b 0 0 9 2p r o t e i nw i t ho t h e rd p sp r o t e i n su s i n gc l u s t a l ws o f t w a r e s h o w e dt h a tp r o t e i ns e q u e n c eo f d r b 0 0 9 2d i dn o th a v eh i 曲i d e n t i t i e sw i t ho t h e rd v s 3 p r o t e i n s h o w e v e r , t h e r ea r es e v e r a ll y s i n e si nn - t e r m i n a lw h i c hw e r ea s s u m e dt ob e i n v o l v e di nd n ab i n d i n g o t h e rc o n s e r v e dr e s i d u e ss u c ha sh i s l 0 0 、a s p l 2 7a n d g t u l 3 1w e r ei d e n t i f l e da n da s s n m e dt oc o n s t i t u t eac o n s e r v e dd o m a i na sf e r r o x i d a s e c e n t e r f u r t h e ra n a l y s i ss h o w e dt h a t2 1 a a ( a m i n oa c i d s ) c h a i ne x i s t e di nu p s t r e a mo f n t e r m i n a lw a sa s s u m e dt ob eas i g r l a lp e p t i d ei nd r b 0 0 9 2 p r o t e i n , w h i c h c a l ln o tb e f o u n di no t h e rd p sp r o t e i n s t h i sr e s u l ti n d i c a t e dt h a td r b 0 0 9 2p r o t e i nm a yh a v e s o m eu n i q u ep r o p e r t ya n df u n c t i o n 2 b a s e do nt h em e t h o do fp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o ni nv i t r oa n dh o m o l o g o u s g e n e t i cr e c o m b i n a t i o ni nv i v o t h eg e n ed r b 0 0 9 2 w a sd e l e t e df r o mt h ew i d et y p e s t r a i nr 1g e n o m e s u r v i v a lr a t e so f t h em u t a n ta n dw i l dt y p es t r a i nw e r ei n v e s t i g a t e d a f t e r c h a l l e n g e dw i t l ld i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fi o n i z i n gr a d i a t i o na n dh y d r o g e n p e r o x i d e ( h 2 0 2 ) r e s u l t ss h o w e dt h a tt h es u r v i v a lr a t eo fd p sm u t a n tr e d u c e dr a p i d l y c o m p a r e dt ot h ew i d et y p es t r a i n h o w e v e r , t h es u r v i v a lr a t eo ft h em u t a mw a s r e c o v e r e da f t e rt h ed r b 0 0 9 2g e n ew a s c o m p l e m e n t e d i n t ot h em u t a n t t o d e t e r m i n a t et h ec h a n g e so fc a t a l a s ea c t i v i t yi nd p sm u t a n t , a l li r o ns t a i n i n gm e t h o d w a su s e da f t e rn o n - d e n a t u r e dp o l y a e r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i sg e l s ( n a t i v e p a g e ) t h er e s u l td i s p l a y e dt h a tt w oc a t a l a s e si n 面艚m u t a n tw f f r ee n h a n c e dt h a nt h a to f w i l d 锣p e ，e s p e c i a l l yu n d e rt h ec h a l l e n g eo f h y d r o g e np e r o x i d e 3 t h es o l u b l ed r b 0 0 9 2p r o t e i nw a so b t a i n e db ye x p r e s s i o no fr e c o m b i n a n t p r o t e i ni ne ，c o l i a n df u r t h e rb i o c h e m i c a le x p e r i m e n t si nv i t r os h o w e d ：d p sm o n o m e r a s s e m b l e dt ot r i m e r s ，t e t r a m e r sa n dd o d e c a m e r si nl o ws a l tb u f f e ra f t e rb e i n g e r o s s l i n k e dw i t hg l u t a r a l d e h y d e d p sm o n o m e rc o u l dn o ti n t e r a c tw i t hp u c l 9 p l a s m i d ，w h i l ep o l y m e r i ea s s e m b l i e sc o u l db i n dt op l a s m i dd n aa n dp r o v i d e e f f i c i e n tp r o t e c t i o na g a i n s th y d r o x y lr a d i c a l m e d i a t e dd n a c l e a v a g ec a u s e db yf c 2 + a n dh e 0 2t h r o u g hf e n t o nr e a c t i o n b a s e do nt h e s er e s u l t s w ec o n c l u d et h a td p s 一2 p r o t e i n ( d r b 0 0 9 2 ) i nn r a d i o d u r a n sh a sas t r o n gc a p a c i t yo fd n a b i n d i n ga n dp r o t e c t i o n i tp l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei na n t i o x i d a ms y s t e m ，w h i c hm a yc o n t r i b u t eag r e a td e a lt ot h ee x t r e m e r e s i s t a n c eo fdr a d i o d u r a n s 4 k e yw o r d s ：d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ；o p sp r o t e i n ；b i o i n f o r m a t i c s ；g e n em u t a t i o n ； a n t i o x i d a n t ；d n ap r o t e c t i o n 5 第一章文献综述 第一节耐辐射球菌的研究综述 耐辐射球菌( d e i n o c o c c u sr a d i o d u r a n s ) 是一种具有特殊抗性机制的非致病 性红色球菌，属于d e i n o c o c c a c e a e 家族成员，是至今发现的地球上最耐辐射的生 物之- - 1 ，2 1 。指数生长期的耐辐射球菌可以耐受1 5 0 0 0 c , y 的电离辐射剂量和 8 0 0 j m 2 的紫外剂量，它对电离辐射、紫外线的抗性分别是大肠杆菌的2 0 0 倍和 2 0 倍【3 ，4 】。另外，耐辐射球菌对包括干燥、过氧化氢氧化压力和众多的d n a 致 突变化学试剂等也表现极强的抗性【5 7 】。耐辐射球菌存在的这些特性吸引各国科 学家对其进行了六十多年的科学研究，其潜在的高效的d n a 损伤修复机制以及 寻找和鉴定该菌体内可能与修复相关的特殊基因和酶已成为当前的研究热点 【8 1 0 】。研究人员希望通过理解耐辐射球菌的抗性机制，以便能应用基因工程的 技术和方法对放射性、重金属污染物进行生物修复 1 l ，1 2 】，为可能的癌症治疗 尤其是放疗和抗肿瘤药物的研究以及细胞衰老的研究开辟新的途径 1 3 ，1 4 。 1 耐辐射球菌的生理和生化特性 耐辐射球菌是一种不产生孢子和严格需氧的微球菌【1 】。野生型r l 菌株形成 的菌落为圆形，直径约l 2 肛l ，能产生红色色素。单克隆的菌苔呈凸状，表面 光滑，在指数生长期，约9 0 的细菌以二联体形式存在存在，随着细胞的进一 步分裂，在生长后期开始形成四叠体【1 5 】，在稳定期细菌则主要表现为四叠体( 图 1 1 ) 。其最适生长温度是3 0 c 。当温度低于4 c 或高于4 5 ( 2 时，细胞则会停止 正常生长。 耐辐射球菌的细胞壁结构比较特殊，虽然它的细胞壁成分和一般的革兰氏阴 性菌相似，但是由于它细胞壁的肽聚糖层太厚且难以脱色，导致革兰氏染色呈阳 性反应 1 6 1 。耐辐射球菌的细胞壁可以划分为一个1 4 2 0h i l l 的肽聚糖层和一个 未知的分层结构，在电镜观察下，其结构至少可以分为六层【1 7 】。q u i n t e l a 等用 质谱研究了耐辐射球菌s a r k 菌株的细胞壁肽聚糖层的化学结构，结果表明耐 辐射球菌的细胞壁结构和a 3 p 分类是一致的【1 8 1 。此外，有研究指出嗜热菌 6 ( t h e r m u st h e r m o p h i l u s ) h b 8 的细胞壁也是属于a 3 b 型的化学分类，而且它的 肽聚糖也是由同样的单体组成，该结果说明这两种菌在进化上可能关系比较近。 图1 1 耐辐射球菌的细胞形态 f i g 1 1c e l l u l a r m m p h o l o g y o l d r a d i o d u r a n s 耐辐射球菌的细胞外膜和细胞质膜在脂类组成上一样，但是没有发现在其他 菌中普遍存在的脂多糖组分【1 9 】。耐辐射球菌的脂肪酸组成也与众不同，它既不 含有羟基脂肪酸、类脂a 以及庚糖，也不含有多不饱和脂肪酸、环丙基和分支 脂肪酸，而含有一个由1 5 - 、1 6 - 、1 7 - 以及1 8 碳饱和或单不饱和脂肪酸组成的混 合物1 2 0 。耐辐射球菌和其他细菌另一个明显的不同是缺乏磷脂，在该菌细胞膜 的脂类中，4 3 是含有烷基胺的磷酸甘油酯，至于烷基胺具体发挥什么作用，至 今仍不明确 2 1 1 。这些脂类可能起源于同一个前体，即一种新的磷酸甘油酯烷基 胺，通过半乳糖或葡萄糖糖基化形成。尽管，在其他菌中也有发现含有葡萄糖胺 的脂类，特别是嗜热菌属中，但耐辐射球菌含有的磷酸甘油脂被认为可能是该菌 所独有的【2 2 】。 2 耐辐射球菌的基因组分析 耐辐射球菌r l 菌株是研究中应用最普遍的野生型菌株，它是a n d e r s o n 等在 1 9 5 6 年于美国俄勒冈州最早分离获得的【l j 。w h i t e 等在1 9 9 9 年公布了耐辐射球 菌r l 菌株的全基因组测序结果，该菌基因组主要包括两条染色体( 大小分别为 7 2 6 5 m b 和4 1 2 k b ) 、一个巨型质粒( 1 7 7 k b ) 和一个小型质粒( 4 5 7 k b ) ，总共编 码了3 1 9 5 个可预测基因【2 3 】。耐辐射球菌在稳定生长期为每个细胞4 个基因组 拷贝，在指数期为每个细胞8 1 0 个基因组拷贝，基因组的高拷贝数为同源重组 依赖型修复过程提供了充足的底物 2 4 】。对该菌进一步的基因组分析表明，基因 组包括了1 5 1 3 个未知功能的基因，其中有1 2 0 0 多个被认为是耐辐射球菌所特有 的基因，而且在数据库中找不到其它生物的匹配序列。耐辐射球菌中的有些基因 只在真核或古细菌中被发现过，对该菌出现这种现象的可能解释是这些共有的基 因是通过水平基因转移( h o r i z o n t a lg e n et r a n s f e r ) 实现的 2 5 】，而水平基因的转 移被认为对古细菌和细菌的进化具有非常重要的贡献【2 6 】。耐辐射球菌对外源 d n a 供体具有很高的转化率，它和d g e o t h e r m a l i s 是d e i n o e o e e a l 属中少数具有 遗传转化和复制系统的物种，有可能这一整合d n a 的倾向对其起了重要作用 2 7 ， 2 8 比较基因组学研究了耐辐射球菌和其它细菌基因组的差异性【2 6 】。与其它细 菌相比，耐辐射球菌基因组内有丰富的重复序列，如i s 转座予和一些小的基因 间重复序列，其作用可能是控制损伤d n a 的降解【2 9 】。由于这些不同的存在， 耐辐射球菌可能存在一些不同于其它物种的生物学机制，而这种机制与该菌 d n a 修复依赖的抗性表型一致。 生物进化分析表明耐辐射球菌属和嗜热菌属( t h c r m u s ) 最接近，在分类学 上它们两个形成了真细菌的一个门。嗜热菌属的成员都具有嗜热特性，而有些耐 辐射球菌属的成员也有一定的嗜热性，它们很可能拥有共同的起源【2 6 】。因为生 长在高温环境里也可以引起细胞损伤，耐辐射球菌的辐射抗性也许是从以前的抗 热系统进化而来。另外，耐辐射球菌中和嗜热菌相似的基因都位于i 号染色体上， 只有一个基因例外。因此耐辐射球菌和嗜热菌有着共同起源的染色体主要是i 号 染色体。其它遗传元件如i i 号染色体、大小质粒等可能是在后期的进化过程中获 得的。耐辐射球菌具有易转化的特性，获得外源染色体并非难事。统计学分析表 明，耐辐射球菌的四种染色体的核苷酸组成具有明显的不同，暗示着它们有不同 的进化起源【2 3 】。 3 耐辐射球菌的抗辐射机制 s 指数生长期耐辐射球菌r 1 菌株对紫外线( 2 5 4 n m ) 的存活最高剂量是 8 0 0 j m 2 ，而对y 射线的存活剂量可高达1 5 0 0 0 g y 3 。耐辐射球菌对丝裂霉素、 亚硝酸、羟胺、n 甲基- n 硝基- n 亚硝基胍( m n n g ) 等强氧化剂和一些化学试 剂也具有较强的抗性这些试剂对耐辐射球菌在培养基中进行处理，即使是致死 剂量也不会导致突变率增加【1 3 】。除此之外，耐辐射球菌还具有高度耐干旱的能 力。在干旱环境下培养6 个星期，仍有6 3 的菌体可存活 5 1 。b a t t i s t a 等的研究 发现，耐辐射球菌中的电离辐射敏感株对干燥也很敏感，经过六个星期干燥脱水 处理的细胞产生的d n a 双链断裂( d s b s ) 数量与5 2 0 0 c , y 剂量的电离辐射产生 的d s b s 数目相近。这表明耐辐射球菌的辐射抗性与干燥抗性机制之间存在一定 的相关性 3 0 1 。 研究表明，在一定的辐射剂量下，耐辐射球菌的d n a 双链断裂数日与其它 辐射敏感性微生物的d n a 断裂数目几乎完全相同，可见其并没有特殊的内在保 护机f n 2 6 1 。由此可见，耐辐射球菌在高剂量电离辐射条件下生存的关键在于其 高效的d n a 修复能力 2 7 】。对此目前存在三种假说：( 1 ) 超强的修复能力可能 存在于耐辐射球菌的未知功能基因当中。然而大部分未知基因的突变并未对耐辐 射球菌的生存率产生严重影响【2 3 】。( 2 ) 酶类或非酶类的抗氧化防御体系使得耐 辐射球菌相对保守的修复途径比其它细菌更高效【3 1 】。( 3 ) 高度折叠的指环状染 色体结构被认为是其抗性的关键【3 2 】。有研究发现耐辐射球菌生长丛的每个细胞 都含有其基因组的单个拷贝，形成指环状染色体( r n s ) ，在辐照后进入两步修 复阶段 3 3 】。在第一个阶段，d n a 双链断裂形成的片段间被环状的细胞核间质阻 断其融合，并进行无错平末端连接。在第二个阶段，临近细胞的r n s 融合，并 进行特异性模板重组。然而，有研究指出该模型存在不正确的地方，主要有：( 1 ) 四联球菌体的每个细胞包含了4 8 个基因组拷贝；( 2 ) 染色体d n a 双链断裂 片段的平末端连接并未在耐辐射球菌中被发现。( 3 ) 耐辐射球菌对数生长期不存 在折叠r n s 的细胞当该菌仍具有同样的辐射抗性；( 4 ) 其它高度抗性的d e i n o e o e e i 属中的物种并没有折叠的r n s ：( 5 ) 其它对电离辐射敏感的细菌，如e c o l i 等也 显示有r n s 的核苷酸形态。 耐辐射球菌细胞内有多个基因组拷贝，一般在稳定期的细胞内有4 个拷贝的 染色体，而活化的细胞内则有4 1 0 条染色体。多拷贝的基因组提供了冗余的遗传 9 信息，有利于d n a 的修复 2 3 1 。m o r t i m e r 在1 9 5 8 年的研究中证明了这一点，对于 酿酒酵母( sc e r e v i s i a e ) 来说，二倍体或四倍体的辐射抗性要远大于单倍体 3 4 1 。 从这个结果来看额外的遗传信息能保护多拷贝的细胞，能增强细胞对辐射的抗 性。可能的原因为多重的基因组可以为同源重组修复提供模板，有利于修复因辐 射损伤造成的遗传信息丢失k r a s i n 和h u t c h i n s o n 在对大肠杆菌的研究中也发现 了相似的现象，和生长在贫瘠培养基中的大肠杆菌细胞相比，丰富培养基中的对 数期细胞对辐射的抵抗力更强 3 5 1 。因为在优化条件下生长时，大肠杆菌染色体 的复制速度要比分裂快的多，从而形成了多基因组细胞。相反，在贫瘠的培养基 里，染色体复制速度慢，分裂后的子细胞是单倍体。耐辐射球菌拥有极其高效的 重组修复系统，从而使其冗余的遗传信息在抗逆性中扮演重要角色。 以电离辐射处理耐辐射球菌及ec o l i ，使它们染色体上的双链d n a 发生断 裂，耐辐射球菌可修复多达一百多处的双链断裂d n a 损伤，而ec o l i 只能修复 2 3 个断裂处 3 6 1 。耐辐射球菌所具有的这种对d n a 损伤表现出的高效修复能力 是当前的研究重点。就耐辐射球菌的d n a 损伤修复机制而言，该菌较一般原核 生物的修复机制更为完善，可归纳为下列四点：( 1 ) 基因组注释预测的编码具有 新型修复功能的假定基n 2 3 ，2 6 1 ，或是仍使用传统的d n a 修复途径，但其修复 效率远远高于其它细菌 3 7 ，3 8 b ( 2 ) 辐射处理后d n a 复制被终止，降解的d n a 片段可作为单链d n a 的重组之用；( 3 ) 通过调节d n a 的复制及辐射后所引起 的d n a 降解，使d n a 修复的效率达最大值【3 9 】；( 4 ) 将受损的核苷酸输送至细 胞外，以防止其掺入到正常的基因组中，避免基因组变异的发生 4 0 1 。 综上所述，耐辐射球菌对电离辐射、紫外、干燥、毒性化学试剂等极端逆境 压力表现明显的耐受性，可归因于它所具有的特殊细胞结构、遗传信息、代谢调 节、高效的损伤修复等多方面形成的一套完善的抗性机制。 4 耐辐射球菌的d n a 损伤修复方式 ( 1 ) 碱基切除修复( b e r ) m a k a r o v a 等报道了碱基切除修复途径，主要涉及几个糖基化酶和核酸内切 酶，如：a l k a 、m u t y 、m u t m f g p 、n t h 、u n g 、m u g 、n f i 、x t h a 等，它们在原 核和真核生物中都含有类似成分 2 6 1 。通过基因组数据库分析发现，耐辐射球菌 1 0 中含有2 个基因编码尿嘧啶d n a 糖基化酶，其中d r 0 6 8 9 为真核类型的尿嘧啶 d n a 糖基化酶，与人的d n a 糖基化酶( u n g ) 比较接近，它被认为很可能是通 过水平基因转移的方式从真核类病毒中获得 4 l 】。此外，耐辐射球菌拥有a i k a 蛋白，而这种具有转移3 甲基腺嘌呤的功能只在人的基因组中发现它的类似功能 蛋白m p g ，而其它哺乳动物中未找到同源物。e c o l i 等生物中含有的r a d a 和 r a d c 等蛋白，在耐辐射球菌却没能找到同源物。与紫外抗性相关的核酸内切酶 和光裂解酶( p h r b ) 在耐辐射球菌体内也不存在。 ( 2 ) 核苷酸切除修复( n e r ) 耐辐射球菌有两条独立的核苷酸切除修复途径：一条途径与大肠杆菌的 u v r a b c 基因切除修复途径相似；另一条途径对紫外线二聚体光合物具有特异性， 但不是由嘧啶二聚体d n a 糖基化酶介导，而是由紫外线核酸内切酶b 介导 4 2 1 。 耐辐射球菌有两种核酸内切酶识别d n a 上的嘧啶二聚体，紫外线核酸内切酶a ( 由m t c a 和m t c b 基因编码) 和紫外线核酸内切酶b ( 由u v s c 、u v s d 、u v s e 编 码) 【4 3 】。这两种核酸内切酶都能独立高效地赋予耐辐射球菌对紫外线抗性的野 生表型。m t c 4 基因和m t c b 基因与其它菌种的u v r a 基因高度同源，而且其基因 产物在功能上与大肠杆菌的u v r a 蛋白相似【4 4 】。 ( 3 ) 直接损伤修复( d r ) 耐辐射球菌中含有能够转移0 6 - 甲基鸟嘌呤6 位甲基的o g t y b a z 酶，但缺 少ec o l i 的a d a 同源物。耐辐射球菌中m u t t ( n u d i x 家族) 是一类已经扩展的 含特殊结构的蛋白家族，中心结构域为m u t t 4 5 。m a k a r o v a 等发现耐辐射球菌 中2 3 个m u t t 超家族成员，其中6 个以多结构域形式存在。这类特异的多结构 域蛋白家族不同于其它生物中存在的单一结构域，其中d r 0 6 0 3 、d r 0 1 9 2 、 d r 0 0 0 4 是该细菌特有的，在其它细菌中尚未找到同源物【2 6 】。有人因此推测， 这些多结构域组合后的功能可能涉及到由环境胁迫所造成的损伤d n a 的修复， 也可能涉及到新的d n a 损伤修复途径。 ( 4 ) 碱基错配修复( m m r ) 耐辐射球菌中含有典型细菌所具有的m u t s 、m u t l 两个基因编码的蛋白质， 能够识别错配的碱基 2 6 1 。真核生物中也发现这两个基因的几个直系同源物，但 在进化的过程中进一步分化，有些在高等生物中识别错配类型的位置已经专一 化，有一部分功能还有待证实。ec o l i 中存在的m u t h 核酸内切酶位和专一化的 甲基化酶d e m ( c 5 胞嘧啶甲基转移酶) 及d a m ( n 6 腺苷酸甲基转移酶) 在耐 辐射球菌中均没有找到同源物。 ( 5 ) 重组修复( r e r ) 耐辐射球菌具有大多数细菌都有的r e e a 、r e e d 、r e e q 、s b e c d 、r u v a b c 等d n a 重组酶 4 6 - 5 0 1 ，但它缺少其它细菌如ec o l i 所具有的r e e b c 、t e c e 、 r e e t 、s b c b 等与重组修复相关的酶。耐辐射球菌的重组修复方式不同于大肠杆 菌的重组修复。大肠杆菌的重组修复是复制后修复，在半保留复制叉后，两条新 的子代染色体问重组，填充复制叉后任一单链留下的空隙。复制后修复仅仅局限 于修复子代两条染色体中的一条单链间隙，并且恰恰在复制叉后 5 1 1 。而耐辐射 球菌的重组修复是两条独立的同源染色体间的重组，可在任一位点，当染色体组 d n a 不进行半保留复制时，也能修复 3 9 1 。耐辐射球菌中r e e a 在d n a 重组过 程中对链的配对和交换起到十分关键的作用，实验表明，缺少r e c a 基因的变异 株对紫外线和电离辐射相当敏感 5 2 】。另外，耐辐射球菌中含有两个具有特殊结 构域的r e e q 螺旋酶，r e e q 可能与r e e a 、s s b ( 单链结合蛋白) 相互作用共同 作用于d n a 的重组修复 4 7 1 。 5 耐辐射球菌的抗氧化机制 有研究指出，耐辐射球菌中d n a 的辐射损伤有8 0 是由辐射诱导的活性氧 自由基( r o s ) 间接产生导致的，只有约2 0 的d n a 损伤是由电离辐射直接产 生的 3 1 1 。因此，清除自由基( 如活性氧) 的功能是耐辐射球菌表现超强抗性的 一个非常重要的因素。为清除多余的r o s ，耐辐射球菌基因组编码有酶类抗氧 化物和其它途径产生的非酶类抗氧化物。前者主要包括超氧化物岐化酶( s o d ) 【5 3 1 、过氧化氢酶( c a t ) 【5 4 1 和过氧化物酶( p o d ) 【5 5 1 。后者包含谷胱甘肽、 铁氧化还原蛋白和以d e i n o x a n t h i n 为主要代谢产物的类胡萝卜素 5 6 1 。 过氧化氢酶、超氧化物岐化酶和过氧化物酶能有效清除细胞内超氧阴离子自 由基( 0 2 ) 、羟自由基( o h ) 和过氧化氢( h 2 0 2 ) 等细胞毒害作用极强的活性 氧自由基 3 1 1 。耐辐射球菌中的过氧化氢酶和超氧化物岐化酶的基因突变株对电 离辐射要比野生型更加敏感 5 7 1 。此外，有研究报道指出耐辐射球菌是过氧化氢 酶( c a t ) 表达活性最高的微生物之- 5 8 。在正常条件下，耐辐射球菌体内超 氧化物岐化酶( s o d ) 的活性要比大肠杆菌高出6 倍【5 9 】，过氧化氢酶( c a t ) 的活性更是比大肠杆菌高出3 0 多倍。因此，耐辐射球菌中s o d 、c a t 和p o d 等保护酶的高含量也是其表现超强抗性的一个重要因素。 d m y 等的最新研究发现，细菌对电离辐射的抗性与其细胞内m n 与f e 的比 例相关1 5 8 。耐辐射球菌相对于其它物种具有更高的m n f e 比例，可能是它具有 极端抗性的重要因素之一。因为高浓度的m n 可以保护细胞免受辐射产生的r o s 损伤，而低浓度的游离铁可以避免其通过f e n t o n 反应和h a b e r - w e i 龉反应将h 2 0 2 还原产生大量的羟基自由基( o h ) 【3 1 1 。 第二节细菌d p s 蛋白的研究综述 生物体内的铁离子对细胞具有特殊的作用，它会参与细胞体内一些重要的生 理作用，如呼吸作用、光合反应、d n a 合成等【6 0 】。然而，过量的亚铁离子会产 生对细胞有害的损伤，如氧化压力导致的d n a 损伤。原因是二价铁离子与一些 毒性较小的自由基如过氧化氢、氧自由基发生氧化还原反应，产生细胞毒性更强 的自由基如羟自由基 6 h 。反应如下： f e 2 + + 0 2 一f e ”+ 0 2 ( 1 ) 2 0 2 。+ 2 r h 2 0 2 + 0 2( 2 ) h 2 0 2 + f 矿一0 h 。+ o h + f 矿( 3 ) 已有的研究表明生物体可以通过铁蛋白超家族来控制细胞内的铁和氧的含 量【6 0 】。铁蛋白由1 2 或2 4 个亚基组成，每个亚基又由4 个围绕一个铁原子的q 螺旋组成。蛋白中心有一个直径在5 8 n m 的洞穴状空腔。铁蛋白的作用包括铁 的进入( 氧化、转移到穴腔内并矿化) 和释放( 还原、水合作用和螯合) 。普遍 认为铁离子是通过一个保守的孔道，沿着对称的三折轴进入铁蛋f l 6 2 。铁蛋白 又可分为大铁蛋白( m a x i f e r r i f i n ) 和小铁蛋白( m i r a f e r r i t i n ) 。大铁蛋白存在于 人类、动物、植物和细菌中。小铁蛋白，又称o p s 蛋白，只存在于原核生物中， 主要包括细菌和古菌【6 3 】。大铁蛋白由2 4 个单体组成，每个蛋白能结合多于4 0 0 0 个铁原子，而d p s 蛋白由1 2 个单体组成，与大约5 0 0 个铁原子结合( 图1 2 ) 【6 4 】。 图i 2 = 十四聚体大铁蛋白和十二聚体d p s 蛋白的结构 f i g 1 2s t r u c t u r e so f t h e2 4