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中山大学硕十学位论文 大鼠输卵管上皮细胞原代培养和有机阳 离子转运体的鉴定 专业：生理学 硕士生：何昕华 导师：周文良教授 摘要 输卵管是女性重要的生殖器官，是运送精子和卵子的通道及受精的场所。输 卵管液主要由输卵管上皮细胞分泌的蛋白质、氨基酸、碳水化合物和各种有机营 养物质组成，是参与精子获能、卵受精的场所之一，能影响配子的功能和胚胎的 发育。输卵管液的作用在输卵管的不同区段、月经周期的不同时期而不同，因而 特异成分的功能评价将有助于明确输卵管液体环境的多种功能。 细胞内稳态是由不同的膜转运体控制的，其中有机阳离子转运体在男性生殖 系统、肾脏、肝脏、小肠等有重要的作用。有机阳离子转运体是一种转运许多内 源性和外源性有机阳离子的蛋白质家族，依是否能转运肉毒碱可以分为o c t 亚家 族和o c t n 亚家族，前者包括o c t l 、o c t 2 和o c t 3 ，后者包括o c t n l 、o c t n 2 和o c t n 3 。而目前国内外文献尚未见报道输卵管是否存在有机阳离子转运体。 本文通过建立大鼠输卵管上皮细胞原代培养的方法，同时使用免疫组织化学 的方法对培养的细胞进行鉴定，证明培养的细胞是输卵管上皮细胞。通过提取原 代培养的大鼠输卵管上皮细胞的总r n a ，用r t - p c r 方法检测了有机阳离子转运 体的六个成员，发现存在o c t l 、o c t 2 、o c t 3 和o c t n 2 ，且转录量不同。然 后通过提取原代培养的大鼠输卵管上皮细胞的膜蛋白，用o c t n 2 的特异性抗体 经蛋白质印迹分析证明大鼠输卵管上皮细胞存在o c t n 2 蛋白( 6 3 k d ) ，并进一 步用间接免疫荧光染色的方法在细胞水平和组织水平证明了o c i n 2 蛋白存在于 大鼠输卵管的上皮细胞，为进一步阐明有机阳离子转运体在大鼠输卵管上皮细胞 中的作用奠定了基础。 关键词：输卵管上皮细胞，原代培养，有机阳离子转运体 巾山大学硕士学位论文 p h m a f fc u l t u r eo fr a to v i d u c t a le p i t h e l i a lc e l l s a n di d e n t i f i c a t i o no fo r g a n i cc a t i o nt r a n s p o r t e r s m a j o r ：p h y s i o l o g y n a m e ：h ex i n h u a s u p e r v i s o r ：p r o f z h o uw e n l i a n g a b s t r a c t t h eo v i d u c t ，a ni m p o r t a n tr e p r o d u c t i v eo r g a nf o rf e m a l e ，i sa p a s s a g et h a t d e l i v e r st h es p e r ma n do v u ma n dap l a c eo ff e r t i l i z a t i o n t h eo v i d u c t a lf l u i di s c o m p o s e do fp r o t e i n , a m i n oa c i d s ，c a r b o h y d r a t ea n dv a r i o u so r g a n i cn u t r i e n t sw h i c h m a i n l ys e c r e t e db yo v i d u c t a le p i t h e l i u ma n di s o n eo ft h e p l a c e sp a r t i c i p a t i n g c a p a c i t a t i o na n df e r t i l i z a t i o n i ta l s oc a ni n f l u e n c et h ef u n c t i o no fg a m e t e sa n de a r l y e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t t h ef u n c t i o n so ft h eo v i d u c t a lf l u i d sd i f f e rf r o mp a r tt op a r t a n df r o mt i m et ot i m e s ot h ef u n c t i o ne v a l u a t i o no ft h es p e c i a lc o m p o s i t i o no ft h e o v i d u c t a lf l u i d sw i l lc o n t r i b u t et oi d e n t i f yv a r i o u sf u n c t i o n so ft h eo v i d u c t a ll i q u i d e n v i r o n m e n t t h eh o m e o s t a s i so fc e l l si sc o n t r o l l e db yd i f f e r e n tm e m b r a n et r a n s p o r t e r s t h e o r g a n i cc a t i o nt r a n s p o r t e r s ( o c r s ) p l a ya ni m p o r t a n tr o l e i nm a l er e p r o d u c t i v e s y s t e m 、k i d n e y s 、l i v e r s 、s m a l li n t e s t i n e sa n ds oo n o c t sa r eap r o t e i nf a m i l yw h i c h c a nt r a n s p o r te n d o g e n o u sa n de x o g e n o u so r g a n i cc a t i o nc o m p o u n d s t h e yc a nb e d i v i d e di n t o s u b t y p e so c t l - 3a n do c t n i 3a c c o r d i n gt ow h e t h e rt r a n s p o r t i n g c a r n i t i n eo rn o t s of a r , i th a s n tb e e nr e p o r t e dt h a tw h e t h e rt h e r ea r eo c t s e x p r e s s e d i i lr a to v i d u c t a le p i t h e l i a lc e l l so rn o t a p r o t o c o lf o rp r i m a r yc u l t u r eo fr a to v i d u c t a le p i t h e l i a lc e l l sw a se s t a b l i s h e d r a to v i d u c t a le p i t h e l i a lc e l l sw e r eo b t a i n e ds u c c e s s f u l l ya n dw e r ec h a r a c t e r i z e db y i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t u d i e s a f t e rt h et o t a lr n aw a si s o l a t e df r o mt h ep r i m a r y c u l t u r e dr a to v i d u c t a le p i t h e l i a lc e l l s ，s i xm e m b r a n e so fo c t sw e r et e s t e db yr t p c r a n do c t i ，o c t 2 ，o c t 3 ，o c t n 2w e r ec h e c k e dw i t hd i f i e r e n tt r a n s c r i p t i o n a ll e v e l a f t e rt h em e m b r a n ep r o t e i n sw e r ei s o l a t e df r o mt h ep r i m a r yc u l t u r e dr a to v i d u c t a l e p i t h e l i a lc e l l s ，t h es p e c i f i co c t n 2a n t i b o b yw a su s e dt oi d e n t i f yt h ee x i s t e n c eo f o c t n 2 ( 6 3 k d ) b yw e s t e r nb l o ta n a l y s i s f u r t h e r l y ，t h e0 c r n 2p r o t e i nw a s c h a r a c t e r i z e di nr a to v i d u c t a l e p i t h e l i a l c e l l sa n dt i s s u e s l i c e s b y i n d k e c t 中山大学硕士学位论文 i m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y t h e s ew i l lp r o v i d eab a s i sf o rf u r t h e r l yi l l u s t r a t i n gt h e f u n c t i o no ft h eo c t se x p r e s s e di nr a to v i d u c t a le p i t h e l i a lc e l l s k e yw o r d s ：o v i d u c t a le p i t h e l i a lc e l l s ，p r i m a r yc u l t u r e ，o r g a n i cc a t i o nt r a n s p o r t e r 1 1 1 中山大学硕士学位论文 d m e m f 1 2 ul m 访 h m g m l n l m v 班 r n a k d m m m g m l n c d n a f s h d 1 t r i g g t b s p b s m r n a b s a h b s s e d t a d e p c f 1 t c r r _ p c r g a p d h 缩略词( a b b r e v i a t i o n ) d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l em e d i u m f 1 2 g r a m 克 m i c r o l i t r e 微升 m i n u t e 分钟 h o u r 小时 m i l l i g r a m毫克 m i l l i l i t e r 毫升 m i l l i m e t e r 毫米 v o l t 伏特 g r a m l i t r e 克升 r i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 k i l od a h o n 千道尔顿 m i l l i m o l e 1 毫摩尔升 m i l l i g r a m m i l l i l i t e r 毫克毫升 w e i g h t v o l u m e 质量体积 c o m p l e m e n t a r yd n a互补d n a f o l l i c l e s t i m u l a t i n gh o r m o n e 卵泡刺激素 d l - d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 i m m u n o g l o b u l i n 免疫球蛋白 t r i sb u f f e r e ds a l i n e t r i s 盐缓冲液 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 m e s s e n g e rr n a 信使核糖核酸 b o v i n es e r u ma l h u n v i n 牛血清白蛋白 h a n k sb a l a n c e ds a l i n es o l u t i o n h a n k s 平衡液 e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i c乙二胺四乙酸 d i e t h y lp y r o c a b o n a t e 焦碳酸二乙酯 f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e 异硫氰酸荧光素 r e v e r s et r a n s c r i p t - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 逆转录聚合 链式反应 甘油醛一3 磷酸 脱氢酶 中山大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 输卵管的结构和生理学功能 输卵管是一对细长而弯曲的喇叭形管状器官。位于子宫两侧与盆腔侧壁之 间，藏于子宫阔韧带上缘内。每侧输卵管有两个开口，一个开口于子宫腔，另一 个开口于腹膜腔。输卵管自外向内依次分为四部分：漏斗部、壶腹部、峡部和子 图1 - 1 输卵管壶腹部组织结构。l u ：腔( h e 染色) f i g 1 1 s t r u c t u r e so f t h ea m p u l l ao f r a to v i d u c tt i s s u e s l u ：l u m e n ( h es t a i n i n g ) ( a ) b a r = 2 5 0g m ( 4 0 )( b ) b a r = 1 0 0g m ( 1 0 0 ) ( c ) b a r = 1 0 0g m ( 1 0 0 ) ( d ) b a r = 1 0 0 a m ( 1 0 0 ) 宫部。输卵管的壁由内至外分为三层，即粘膜、肌层和浆膜。粘膜形成许多纵行 而分支的皱襞，壶腹部的皱襞最发达，高而分支多，故管腔不规则。从壶腹部到 子宫部，皱襞逐渐减少( 如图l - l 、1 2 ) 。输卵管的浆膜由问皮和富含血管的疏松 结缔组织组成。输卵管的肌层为平滑肌，漏斗部的肌层最薄，从输卵管的漏斗部 到子宫部，肌层越来越厚。输卵管平滑肌的收缩可以促进精子和卵子在输卵管内 巾山大学硕士学位沦文 运输。 图1 - 2 输卵管峡部组织结构。l u ：腔 f i g 1 2 s t r u c t u r e so f t h ei s t h m u so fr a to v i d u c tt i s s u e s l u ：l u m e n ( a ) b a r = 2 5 0l l m ( 4 0 x ) ( 1 3 ) b a r = 1 0 0 m ( 1 0 0 ) 输卵管的粘膜形成许多纵行且带有分支的皱襞，尤其是壶腹部的皱襞最发 达，高大而有分支，管腔呈不规则状，输卵管的粘膜由上皮和固有层组成，上皮 为单柱状，主要由纤毛细胞和分泌细胞组成。纤毛细胞呈柱状，游离面有纤毛， 细胞核圆形或卵圆形，染色浅，纤毛细胞在漏斗部和壶腹部最多，峡部和子宫部 呈逐渐减少趋势，哺乳动物输卵管上皮的纤毛有节奏地向子宫方向摆动，可推进 卵子和发育中的胚胎向子宫方向运行：分泌细胞也呈柱状，细胞核椭圆形，染色 深。顶部较宽，表面有微绒毛，顶部胞质内有分泌颗粒，其分泌物形成输卵管液， 内含氨基酸、葡萄糖、果糖和少量乳糖等，并在纤毛表面形成粘稠的膜，既可以 营养卵细胞，又便于向子宫输送卵子，并可防止病原微生物从子宫腔经输卵管进 入腹腔。此外，输卵管上皮内还有少量分布于基部的基细胞。固有层是一薄层结 缔组织，内含胶原纤维及成纤维细胞、肥大细胞和淋巴细胞等( 罗善云等，2 0 0 3 ) 。 输卵管是哺乳动物繁衍生殖的重要器官，是运送精子及卵子的通道和卵受精 的场所，对精子的获能、受精卵的正常卵裂和生存均有重要的作用。输卵管的结 构和功能受激素的调节，雌激素可诱导输卵管上皮增殖和分化，孕激素对雌激素 则具有拮抗作用，在动情周期中，激素水平呈周期性变化，输卵管的结构和功能 也相应地发生动态的变化f 罗善云等，2 0 0 3 ) 。 中山大学硕士学位论文 1 2 输卵管液的形成及其功能 输卯管液是一种透明或略带黄色的液体，主要由输卵管上皮细胞分泌的蛋白 质、氨基酸、碳水化合物和各种有机营养物质组成。 输卵管粘膜上皮细胞分泌的输卵管液参与了输卵管微环境的形成。输卵管在 运输卵子或者受精卵的同时，其上皮细胞在卵巢雌激素的调节下还分泌许多活性 物质，如输卵管糖蛋白、过氧化氢酶、牛磺酸和次牛磺酸等，在受精和胚胎早期 发育过程中起重要的促进作用。近期研究报道，人、牛和猴的输卵管上皮细胞表 达多种生长因子，如i g f - 1 等，并受雌激素的调控，这些生长因子可能在胚胎早 期发生及细胞增殖与分化中发挥重要的作用( 罗善云等，2 0 0 3 ) 。 输卵管自身具有形成和改变输卵管液的能力，输卵管液的分泌量及其蛋白质 的含量受雌激素的调节，随月经周期而变化，在排卵期达到峰值，排卵后雌激素 水平下降，输卵管液分泌量及其蛋白质的含量也随之下降( 罗善云等，2 0 0 3 ) 。输 卵管液形成的根本机制仍然有待在细节上进一步阐明，参与输卵管液形成的激素 和神经调控并没有完全阐明，与机制有关的输卯管肌层和粘膜层的相互作用也有 待进一步研究( l e e s ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 输卵管液是参与精子获能、卵受精的场所之一，构成受精和早期胚胎发育的 微环境。输卵管中的糖蛋白能促进精予的获能和顶体反应，并能促进卵裂和胚泡 的发育。输卵管液中的高钾状态能调节精子的运动，使其顺利和卵子结合，完成 受精作用。输卵管液中的碳酸氢盐有维持输卵管液p h 值和分散放射冠细胞的作 用，由于碳酸氢盐含量较高，输卵管液的p h 值一般为7 2 8 7 7 。输卵管液中的 葡萄糖为精子、卵子、受精卵和胚泡生存和发育提供能量。输卵管液中的免疫球 蛋白具有抑制细菌的功能。在受精卵和早期胚胎的运送过程中，输卵管液的流动 也起非常重要的推动作用( 罗善云等，2 0 0 3 ) 。 输卵管液的作用在输卵管的不同区段、在月经周期的不同时期不同，因而特 异成分的功能评价会更有助于明确输卵管液体环境的多种功能。 中山大学硕士学位论文 1 3 有机阳离子转运体的研究进展 有机阳离子转运体对于机体内源性有机阳离子的循环利用很重要，对于外源 性有机阳离子的解毒也是必需的。附睾和精子中的有机阳离子转运体对精子的成 熟、活力以及受精有调节作用。目前研究得比较清楚的是有机阳离子在肝脏、肾 脏和肠中的转运( z h a n g e t a l ，1 9 9 8 ) ，哺乳动物的肝脏、肾脏和小肠对于维持机体 正常生理环境发挥了很重要的作用。肝脏通过有机阳离子的吸收、降解和转化而 解除有害物质的毒性。肾脏通过肾分泌可以调节有机阳离子的l 浆浓度和清除血 液中的毒物、药物和其他有机阳离子。小肠通过有机阳离子的吸收和分泌调节血 液中的有机阳离子浓度。 有机阳离子转运体的研究已经有四十多年的历史了。在近十五年来，由于分 子生物学技术的发展，特别是表达克隆技术的发展，使得许多有机阳离子转运体 的表达鉴定成为可能。 1 3 i 有机阳离子转运体的分类 有机阳离子( o r g a n i cc a t i o n ，简称o c ) 是- 类在生理p h 条件下带一个单位 正电荷的有机离子，包括内源性物质，如单胺类神经递质、胆碱和辅酶等，以及 许多药物等外源性物质( k o e p s e l le ta 1 ，2 0 0 3 ) 。由于大多数有机离子不能穿透细胞 膜，因此这类物质的转运必须通过特殊的转运系统，即有机阳离子转运体( o r g a n i c c a t i o nt r a n s p o r t e r s ，简称o c t ) 。 肉毒碱( c a r n i t i n e ) 3 l 名肉碱、卡尼汀、维生素b t ，是一种水溶性的季胺， 1 9 0 5 年由俄国科学家从牛肉中发现，化学名为3 一羟基一4 一三甲基铵丁酸，分子式 为( c h 3 ) 一n + 一c h 2 一c h ( o 田c h 2 。c o o 。肉毒碱有左旋和右旋两种构象，体内具有生 物活性的是左旋肉毒碱( l - c a m i t i n e ) ( ；杨瑞锋等，2 0 0 5 ) 。肉毒碱的主要功能是协助 细胞中的长链脂肪酰辅酶a 穿过线粒体内膜而进入线粒体基质内进行b 氧化而产 生a t p ( 莫正纪，1 9 9 7 ) ，而且还起调节糖和脂代谢平衡的作用( b i e b e r 1 9 8 8 ) 。肉 毒碱还是一种抗氧化剂，可促进细胞膜磷脂的更新和修复，起膜稳定和细胞保护 作用。乙酰肉毒碱由肉毒碱乙酰转移酶( c a r n i t i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e ) 的催化生成乙 酰基，可以作为体内重要化学物质如神经递质乙酰胆碱的合成原料。而乙酰胆碱 能够引起输卵管的强直性收缩( j a n k o v i c e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，调节输卵管中卵巢类固醇对 中山大学硕士学位论文 谷氨酸脱羧酶活性的影响( a p u d & m o n a s t e r o l o e la 1 ，1 9 9 1 ) 。 o c t 可分为少特异性( o l i g o s p e c i f i c ) o c t 和多特异。眭( p o l y s p e c i f i c ) o c t 。前 者是指转移一种单个的主要底物，也与类似于该主要底物结构的物质结合的有机 阳离子转运体；后者是指转移结构不同的底物的有机阳离子转运体，而且属于溶 质载体家族2 2 a ( s o l u t ec a r r i e r f a m i l y 2 2 a ，简称s l c 2 2 a ) ( k o e p s e l le t a l ，2 0 0 3 ) 。 有机阳离子转运体依是否可以转运肉毒碱可以分为o c t 亚家族和o c r n 亚 家族，前者包括o c t l 、o c t 2 、o c t 3 三个成员，后者包括o c t n l 、o c t n 2 、 o c t n 3 三个成员。 有机阳离子转运体依转运机制还可以分为两种不同的有机阳离子转运体：一 种是跨膜电位驱动的阳离子内流，另一种是h + 梯度依赖的阳离子的外流( v a n m o n t f o o r te ta 1 ，2 0 0 3 ) 。它们的协调转运保证了有机阳离子转运的一致性。其中 o c t l 3 是电位敏感型转运体，o c t n l 3 是依赖于h + 的转运体。 1 3 2 有机阳离子转运体的结构特征 所有的s l c 2 2 家族成员都含有1 2 个跨膜螺旋、两个大亲水环和位于细胞质中 的n 末端和c 末端。第一个大环连接着第一个和第二个跨膜螺旋，大鼠的o c t l 的第一个大环位于细胞外。第二个环连接第六和第七个跨膜螺旋，位于细胞内， 环上含有蛋白激酶c 依赖的磷酸化位点，大鼠o c t l 的第二个环上的第2 8 6 位丝氨 酸位点是所有的s l c 2 2 家族成员共有的( m e y e r - w e n t r u pe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 在蛋白质水平，来源于人、小鼠和大鼠的相同转运体亚型表现出跨物种相似 性，o c t l 、o c t 2 和o c t 3 的氨基酸相似性分别为7 8 9 5 ，8 1 9 1 和8 7 9 3 。对 于同一个物种，不同转运体亚型之间的氨基酸相似性为：o c t l 和o c t 2 之间有6 7 7 0 相似性、o c t l 和o c t 3 之间有4 7 5 7 相似性、o c l 2 和o c t 3 之间有4 9 5 1 相似性( z h a n ge ta 1 ，1 9 9 7 a ；h a y e re a 1 ，1 9 9 9 ) 。 所有物种的s l c 2 2 超家族成员之间，有3 4 个氨基酸是保守的，这些保守氨基 酸可能是结构和功能上必需的，所有的转运有机阳离子的o c t 和o c t n 转运体之 间有9 2 个保守氨基酸。但是其中有8 2 个保守氨基酸也存在于s l c 2 2 家族的一些 o a t s 中，只有1 0 个是有机阳离子转运体所特有的。o c t s 的三个亚型之问的相关 性l l o c t n s 三个亚型之间的相关性小，o c t n s 的三个亚型之间具有高度的氨基 中山大学硕士学位论文 酸保守性( k o e p s e l le ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 o c t l 3 之间含有3 6 个保守氨基酸，这3 6 个氨基酸不存在于o c t n s 和o a t s 中，所有的o c t 和o c t n 转运体含有许多相同的序列，这些序列是蛋白激酶a 和 蛋白激酶c 的磷酸化位点。这些序列中有一个是s l c 2 2 家族成员所共有的。在大 的细胞外环中还含有相同的糖基化序列，其中有一个序列在大多数家族成员中是 保守的( k o e p s e l le ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 3 3 有机阳离子转运体o c t s 的组织分布 第一个有机阳离子转运体o c t l 是首先在大鼠的肾脏中发现的( g r u n d e m a n n e ta 1 ，1 9 9 4 ) ，随后在小鼠( s c h w e i f e r & b a r l o w , 1 9 9 6 ) 、兔子( t e r a s h i t ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 、 人( g o r b o u l e ve ta 1 ，1 9 9 7 ) 中也发现了o c t l 的存在。在大鼠，小鼠和人中发现存 在三种形式的o c t s ，包括o c t l 、o c t 2 和o c t 3 。在兔子中发现存在o c t l 和 o c t 2 ，在猪中发现存在o c t 2 。 o c t 亚型的组织分布已经研究得比较多了，目前采用的研究手段主要有 n o r t h e r nb l o t t i n g ( g o r b o u l e ve ta 1 ，1 9 9 7 ；g r u n d e m a n ne ta 1 ，1 9 9 4 ；k e k u d ae ta 1 ， 1 9 9 8 ；o k u d ae ta 1 ，1 9 9 6 ；t e r a s h i t ae ta 1 ，1 9 9 8 ；w ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 、r t p c r ( s l i t te ta 1 ， 2 0 0 2 ) 、w e s t e r nb l o t 年l l 免疫组织化学等( r o d r ig u e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 研究发现对于某个特定的物种，m r n a 的组织分布形式具有亚型依赖性 ( b u s c he ta 1 ，1 9 9 8 ；g o r b o u l e ve ta 1 ，1 9 9 7 ；g r u n d e m a n ne ta 1 ，1 9 9 4 ；k e k u d ae ta 1 ， 1 9 9 8 ；o k u d a e t a l ，1 9 9 6 ；z h a n g e t a l ，1 9 9 7 b ) 。例如，对于人，肝中主要存在o c t l ， 而肾中主要存在o c r 2 ，而对于某个特定的亚型，m r n a 的组织分布具有物种依 赖性( g o r b o u l e ve ta 1 ，1 9 9 7 ；g r u n d e m a n ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。例如，对于大鼠，肾中的 有机阳离子转运体主要是o c t l ，而在人的肾脏中，主要是o c t 2 。 研究表明，o c t l 主要表达在肝脏中，在啮齿类动物的肾脏中也有很强的表 达( g o r b o u l e ve ta 1 ，1 9 9 7 ；g r u n d e m a n ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。此外，o c t lm r n a 在小肠、 皮肤和脾脏中也有很强的表达( s l r te la 1 ，2 0 0 2 ) ，在脑和乳腺中表达则比较弱 ( g e r ke ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 o c t 2 在人的肾脏( g o r b o u l e ve ta 1 ，1 9 9 7 ；o k u d ae la 1 ，1 9 9 6 ) 、胎盘、中枢神 经系统神经元( b u s c he ta 1 ，1 9 9 8 ；g o r b o u l e ve ta 1 ，1 9 9 7 ) 、大鼠的胸腺( s l i t te ta 1 ， 6 中山大学硕士学位论文 2 0 0 2 ) 以及脉络丛( s w e e te t a l ，2 0 0 1 ) 中都有表达。 对于人，0 c t 3 主要表达在骨骼肌、肝脏、胎盘、肾脏以及心脏中，在脑中 也有少量表达( g r u n d e m a n ne ta 1 ，1 9 9 8 ；w ue ta 1 ，2 0 0 0 ) 。对于大鼠，o c t 3m r n a 则主要在胎盘、小肠、心脏和脑中有表达，在肾脏、胸腺、血管和皮肤则有弱表 达( k e k u d ae la 1 ，1 9 9 8 ；s l i t te ta l ，2 0 0 2 ) 。对于小鼠，o c t 3m r n a 主要表达在胎 盘、海马和小脑神经元 ( v e r h a a g h e ta 1 ，1 9 9 9 ；w ue ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 关于o c t l 3 的亚细胞定位很少报道。在大鼠的肾脏，r o c t l 年i r o c t 2 位于肾 近端小管的基侧膜面上( k a r b a c he la 1 ，2 0 0 0 ；s u g a w a r a y o k o oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 。r o c t l 存在于s 1 矛1 s 2 段，而r o c f 2 存在于$ 2 年h s 3 段。人的o c t 2 也位于7 子近端小管的基 侧膜面上( m o t o h a s h i e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。人的o c t 2 在肾近端小管的s 1 、s 2 和s 3 段都有 表达。在大鼠的肝脏中，i o c t l 蛋白定位于肝细胞的窦状隙膜面上( m e y e r w e n t r u p e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。o c t 2 还存在于人的大脑皮质r = | = i ( b u s c he ta 1 ，1 9 9 8 ) ，大鼠的o c t 2 贝0 在脉络丛上皮细胞的顶膜面有分布，可能参与了胆碱的摄取和脑脊液中胆碱的重 吸收( s w e e te ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 深入研究o c t s 的组织和细胞分布有助于加深对这些转运体的认识。 1 3 4 肉毒碱有机阳离子转运体o c t n s 的组织分布 o c t n l 对肉毒碱的亲和力很低，是一种多特异性的有机阳离子转运体，在 很多组织中都有表达，例如在人的肾脏、骨骼肌、胎盘、前列腺、心脏、肺和 精子中都有o c t n l 的表达( t a m a i e ta 1 ，1 9 9 7 ；x u a ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。人类的o c r n l 的 转运底物包括t e a 、奎纳定、吡拉明、戊脉安和肉毒碱( y a b u u c h i e ta 1 ，1 9 9 9 ) ， 此外还与甲氰咪胍、氯压定、烟碱、奎宁、中性离子头孢菌素i i 和某些阴离子相 互作用。 人的o c t n l 是一种h + 有机阳离子的逆向转运体，介导有机阳离子的细胞外 流。小鼠的o a 限1 介导的肉毒碱的摄取是依赖于n a + 的，但大鼠的o c t n l 转运肉 毒碱时是不依赖于n a + ( t a m a ie ta 1 ，2 0 0 0 ；y a b u u c h ie ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 o c t n l 存在于不同物种的肾近端小管的刷状缘膜上( i n u i e ta 1 ，1 9 8 5 ；j u n ge t a 1 ，1 9 8 9 ；k i n s e l l ae ta 1 ，1 9 7 9 ；m c k i n n e y k u n n e m a n n ，1 9 8 5 ；o t te ta 1 ，1 9 9 1 ； t a k a n oe ta 1 ，1 9 8 4 ；w r i g h t ，1 9 8 5 ) ，参与了肾近端小管的有机阳离子的分泌。不同 7 中山大学硕士学位论文 的物种，o c t n l 的定位并不相同，例如，o c t n l 在大鼠的肝脏中有很强的表达， 但在成年人的肝脏中却没有表达。 已经发现o c t n 2 存在于人、小鼠和大鼠中( b r o o k s k r i h e n b t l h l ，2 0 0 1 ；n e z u e la 1 ，1 9 9 9 ；s c h o m i ge ta 1 ，1 9 9 8 ；s e k i n ee ta 1 ，1 9 9 8 ；t a m a ie ta 1 ，1 9 9 8 ，2 0 0 0 ) ， o c t n 2 在人的许多组织中都有表达，例如骨骼肌、血管、肾脏、前列腺、精子、 睾丸、附睾、肺、胰腺、心脏、小肠、肾上腺、甲状腺、脉络丛和脑的某些部位 ( d u r a ne la 1 ，2 0 0 2 ；s l i t te ta 1 ，2 0 0 2 ；s c h o m i ge ta 1 ，1 9 9 8 ；s e k i n ee ta 1 ，1 9 9 8 ；t a m a i e ta 1 ，19 9 8 ；w ue ta 1 ，1 9 9 8 ；x u a ne la 1 ，2 0 0 3 ；a u g u s t i n ee ta 1 ，2 0 0 5 ；s w e e te ta 1 ， 2 0 0 1 ；r o d r i g n e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 。o c t n 2 位于在小鼠和大鼠的肾小管上皮细胞的顶 膜面上( t a m a ie t a l 2 0 0 1 ) ，o c t n 2 可能介导了小肠和肾脏中的有机阳离子的重吸 收和分泌。o c t n 2 是一种n a * 肉毒碱的共转运体，对肉毒碱有很高的亲和力。但 是电可以是一种多特异性的、不依赖n a + 的有机阳离子的转运体( t a m a ie t a 1 ， 1 9 9 8 ，2 0 0 1 ；w a g n e re ta 1 ，2 0 0 0 ；w ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 。o c t n 2 介导的n a + 依赖的l 一肉毒 碱转运是生电性的( o h a s h ie ta 1 ，1 9 9 9 ；w a g n e re la 1 ，2 0 0 0 ) 。 在n a + 存在的时候，h o c t n 2 还可以转运l 乙酰肉毒碱( o h a s h ie ta 1 ，1 9 9 9 ) ， l 广乙酰肉毒碱可以防止由铵、m p p 等引起的神经毒效应( m a t s u o k a & i g i s u ，1 9 9 3 ) 。 此外，在n a + 存在的情况下，h o c t n 2 还可以转运头孢菌素i l 、b 内酰胺抗生素 ( g a n a p a t h ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 、l - 赖氨酸、l 一甲硫氨酸( w a g n e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 在不依赖于n a + 的情况下，人、大鼠和小鼠的o c t n 2 可以转运许多有机阳离 子( o h a s h ie t a l ，2 0 0 1 ；w ue t a l ，1 9 9 9 ) 。h o c t n 2 可以转运t e a 、吡拉明、奎纳定、 异搏定等( o h a s h ie ta 1 ，1 9 9 9 ；w a g n e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。在n a + 存在的情况下，h o c t n 2 对肉毒碱的转运可以被t e a 、烟碱、m p p 、奎宁、吐根碱、甲氰咪胍、两性离子 头孢菌素i i 等抑制，表明肉毒碱和这些阳离子在o c t n 2 上有同一个结合位点。 o c t n 3 也是s l c 2 2 a 家族的成员之一，是一种高亲和力的转运体，小鼠的 o c t n 3 对肉毒碱的亲和力是小鼠o c t n 2 的七倍，而且o c t n 3 可以在没有n a + 存 在的情况下介导的肉毒碱的转运。但是只在少数的组织中有表达，o c r n 3 在睾 丸中有很强的表达，在肾脏中有弱表达，在精子中也有表达，在肝脏、肺、脾脏、 脑和心脏没有表达( x u a n e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 中山大学硕士学位论文 1 4 研究目的和意义 目前尚无文献报道大鼠输卵管上皮细胞原代培养的方法。本实验初步建立大 鼠输卵管上皮细胞原代培养的方法。大鼠输卵管上皮细胞的原代培养可以为输卵 管上皮细胞的研究提供很好的实验材料。 并用分子生物学和形态学技术对大鼠输卵管上皮细胞的有机阳离子转运体 进行鉴定。有机阳离子转运体首先在肾脏中被发现，它主要负责机体内源性有机 阳离子的循环利用和外源性有机阳离子的解毒。在许多组织中都发现有它的表 达，目前尚未有报道o c t 在输卵管中有无表达，但根据前人对精子的研究，发现 o c t n 可能会影响精子的成熟、活力以及受精，而输卵管是受精和早期胚胎发育 的场所，雌激素对o c t 有一定的调节作用，如果输卵管中有o c t 的表达，o c t 可能对输卵管中有机阳离子的转运起着非常重要的作用，并有可能影响受精以及 早期胚胎发育。因此，研究o c t 在输卵管中的表达是很有意义的。 中山夫学砸i 学位论文 1 5 研究技术路线 一、大鼠输卵管上皮细胞原代培养 二、大鼠输卵管上皮细胞有机阳离子转运体的鉴定 大鼠输9 目琶上皮细胞原代培养 汐8 毡 提取憩, r n a提取膜蛋白4 多聚甲醛固定大鼠心脏灌流 0凸凸8 r n a 质量检测w e a e mb l o t 间接免疫荧光法染色大鼠输卯管组织冰冻切片 8808 r t - p c r 曝光检测激光共聚焦显微镜检测间接免疫荧光法染色 0 8 电泳 激光共聚焦显微镜检测 0 凝胶成相系统检测 中山大学硕士学位论文 第2 章大鼠输卵管上皮细胞原代培养方法的建立 2 1 材料 2 1 1 实验动物 清洁级s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠( 8 0 1 0 0 9 ) ，由中山大学医学院实验动物中 心提供，随机分组，每组7 只。 2 1 2 试剂和药品 h a n k sb a l a n c e ds a l i n es o l u t i o n ( h b s s ) 、p e n i c i l l i n s t r e p t o m y c i n 、d u l b e c c o s m o d i f i e de a g l em e d i u r n f 1 2 ( d m e m f 1 2 ) 、o 2 5 t r y p s i n 购自i n v i t r o g e n 和g i b c o ； 小鼠抗大鼠角蛋白单克隆抗体( b m 0 0 3 0 购自博士德生物工程有限公司；f i t c 标 汜山羊抗小鼠免疫球蛋白试剂盒购自博士德生物工程有限公司：n a c i 、 n a i l 2 p 0 4 2 h 2 0 、n a 2 h p 0 4 等购自广州化学试剂公司；f e t a l b o v i n es e i u m ( f b s ) 购 白h y c l o n e 公司；c o l l a g e n a s e 购自s i g m a ；p a r a f o r m a l d e h y d e 购自广州化学试剂 公司；t r i t o nx 一1 0 0 购自a m r e s c o 0 6 9 4 ；叠氮化钠购自中山医分子试剂部： v e c t a s h i e l d 购自中山医分子试剂部。 2 1 3 实验仪器及设备 不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅( y x o s g 4 6 2 8 0 s 型1 、二氧化碳恒温培养箱 ( t h e r m o 公司产品) 、h s z - - h 恒温摇床( 哈尔滨东联电子技术有限公司产品) 、 水平风超净台和垂直风超净台( 苏州净化设备公司产品) 、倒置相差显微镜( 尼康 t s l 0 0 型) 、解剖镜( l e i c az o o m 2 0 0 0 型) 、数码相机( n j l 【o nc o o l p i x 4 5 0 0 型) 、激 光共聚焦显微镜( l e i c a 公司产品1 、精密