（光学工程专业论文）dna分析仪荧光信号采集与处理系统的研究.pdf

浙江大学博士学位论文 摘要 d n a 序列分析在现代生物学和生命科学中扮演着重要的角色。d n a 分析仪是d n a 序列分析的重要科学仪器，可广泛应用于医疗、农业及司法鉴定等领域。d n a 序列分 析及配套技术的研究不仅是一门科学，更是一项高科技产业，它涉及微细加工、高分子 科学、分析化学、生物工程、光学工程等多个学科领域。我国在相关技术及其应用的研 究中虽然已有长足的发展，某些方面已达到或接近国际先进水平，但在相关科学仪器关 键技术的研究方面，如快速、高通量、高灵敏度检测等，仍明显落后于世界先进水平。 本论文研究具有自主知识产权、高性能的d n a 分析仪荧光信号采集和处理系统： 1 、采用振镜与自行设计的大数值孔径远心f - t h e m 物镜相结合的方法实现多通道 d n a 荧光信号的并行检测，并在此基础上研究设计了光机扫描装置配套的控制系统， 实现d n a 电泳荧光信号的低噪声、高灵敏度的激光共聚焦扫描检测。 2 、在信号采集系统的光学部分，对受限衍射高斯光束的传输和激光束扫描系统的 线分辨率进行详细的理论分析。在不同孔径圆孔的限制下，对扫描物镜焦面上的衍射光 场分布进行数值计算，并利用二阶矩统计的方法对焦面上的等效光斑半径进行数值计 算，将其与不受限时的理想情况进行对比，分析孔径尺度对激光束扫描系统分辨率的影 响。结果表明：受限衍射使激光束扫描系统的分辨率下降，但随着孔径尺度的增加，这 一影响逐步变小，当圆孔半径，2 。时，可忽略高斯光束衍射对扫描分辨率的影响。得 到的这些结论对激光共焦扫描检测系统的设计具有指导意义，此外也可对激光束在全光 通信和集成光学等方面的应用提供一些有益的帮助。 3 、根据d n a 分析仪荧光信号的处理流程，系统研究d n a 荧光信号的处理，包括： 预处理( 数据段选取、基线调整、噪声滤除、峰值识别) ；四色荧光串扰校正；后处理 ( 去卷积、迁移率校正、信号强度归一化) 。在优化选择去噪方式的研究中，为了真实 构建噪声模型并准确评价去噪算法的有效性，使用实际系统电泳未出信号峰时采集到的 噪声叠加理想荧光信号的新方法来构建d n a 测序仿真信号，去噪分析的结果表明：d n a 测序信号经s y m 7 小波基函数去噪处理后，与d b 8 、c o i f s 等小波基的处理结果相比，峰 位置、峰高的误差最小，s n r 最高，r a i s e 最小，为最优的小波基函数。 在上述理论研究和创新设计的基础上，本论文完成了d n a 分析仪荧光信号采集与 处理系统的研制。多通道d n a 荧光信号的快速并行检测由远心f - t h e t a 扫描物镜与振镜 实现，四色荧光其焦检测由滤色片轮和单个光电倍增管实现，信号采集装置中集成了嵌 入式系统，图谱可在计算机中实时显示、存储和分析处理。 新型设计的d n a 荧光信号采集系统只使用单个光电倍增管，降低了系统的制造成 本；使用光学扫描方法使系统的工作噪声比机械扫描系统的噪声要低得多，且灵敏度也 浙江大学博士学位论文 很高。存此系统中采用标准双链d n a 样品：p b r 3 2 2 h a e i i i ( 使用t o 染料) 进行了毛 细管电泳实验，测得系统的检测限可达：2 3 6 8 1 0 。2 m o l l ，经d n a 图谱信号处理系统 分析处理，能够满足d n a 序列分析的单碱基分辨要求。该系统可应用于基于激光诱导 荧光的毛细管阵列和多通道微芯片的电泳检测。 关键词：d n a 分析；荧光；共聚焦；扫描；信号采集；信号处理 i i 浙江大学博士学位论文 a b s t r a c t d n a s e q u e n c ea n a l y s i sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nm o d e mb i o l o g ya n dl i f es c i e n c e d n a a n a l y s i sa p p a r a t u si st h ek e ys c i e n t i f i ci n s t r u m e n tf o rd n as e q u e n c ea n a l y s i s ，w h i c hc a nb e w i d e l yu s e di nm e d i c a l ，a g r i c u l t u r a la n df o r e n s i cf i e l d s s t u d i e so nd n as e q u e n c ea n a l y s i s a n di t sc o r r e l a t i v et e c h n o l o g i e sa r en o to n l yas c i e n t i f i cb r a n c h ，b u ta l s oah i g ht e c h n o l o g y i n d u s t r y , w h i c hc o v e r sm u l t i - d i s c i p l i n e ss u c ha sm i c r o f a b r i c a t i o n ，p o l y m e rs c i e n c e ，a n a l y t i c a l c h e m i s t r y , b i o l o g i c a le n g i n e e r i n g ，o p t i c a le n g i n e e r i n ga n ds oo n c o r r e l a t i v et e c h n o l o g i e sa n d a p p l i c a t i o n si nd n aa n a l y s i sh a v ed e v e l o p e dg r e a t l yi nc h i n a s o m er e s e a r c hr e s u l t sh a v e r e a c h e do rh a v eb e e nc l o s e dt oi n t e m a t i o n a lt o pl e v e l ，b u ti ns o m ek e yt e c h n o l o g i e ss u c ha s h i g hs p e e d ，h i g ht h r o u g h p u ta n dh i g hs e n s i t i v i t yd e t e c t i n g ，o u rr e s e a r c h e ss t i l lh a v eal a r g e g a pw i t ht h ei n t e r n a t i o n a lt o pl e v e l t h i sd i s s e r t a t i o nc a r r i e so nt h er e s e a r c ho nf l u o r e s c e n c e s i g n a la c q u i s i t i o na n dp r o c e s s i n gs y s t e m i nd n aa n a l y s i si n s t r u m e n t ，w h i c hh a sh i g h p e r f o r m a n c ea n di n d e p e n d e n ti n t e l l e c t u a lp r o p e r t yr i g h t ： 1 s c a n n i n gm i r r o ra n ds e l fd e s i g n e dl a r g en u m e r i c a la p e r t u r e ( n a ) t e l e c e n t r i cf - t h e m o b j e c t i v ew e r ea d o p t e dt o r e a l i z ep a r a l l e ld e t e c t i o no fm u l t i c h a n n e ld n af l u o r e s c e n c e s i g n a l s a n di t ss u i t a b l ec o n t r o ls y s t e mw a sa l s od e s i g n e dt oa c h i e v el o wn o i s e ，h i g h s e n s i t i v i t yc o n _ f o c a ls c a n n i n gd e t e c t i o n 2 a sr e f e r r i n gt ot h eo p t i c a lp a r to ft h es i g n a la c q u i s i t i o ns y s t e m ，t h e o r e t i c a l l y , t h e d i f f r a c t i o no fg a u s s i a nb e a ml i m i t e db ya p e r t u r ea n dt h el i n er e s o l u t i o no fl a s e rb e a m s c a n n i n gs y s t e m sw e r ea n a l y z e d i nd e t a i l t h ed i f f r a c t i o nd i s t r i b u t i o n so fg a u s s i a nb e a m l i m i t e db yt h ec i r c u l a ra p e r t u r e sw i t hd i f f e r e n ts i z e si ns c a n n i n go b j e c t i v e sf o c a lp l a n ew e r e s t u d i e d ，a n dt h e nt h ee f f e c t i v es p o tr a d i u si nf o c a lp l a n ew a sc a l c u l a t e du s i n gs e c o n dm o m e n t a n dc o m p a r e dw i t ht h ei d e a lo n e t h ei n f l u e n c eo fa p e r t u r e sw i t hd i f f e r e n ts i z e so nr e s o l u t i o n w a sa n a l y z e d t h er e s u l t ss h o wt h a td i f f r a c t i o nl i m i t e db yt h es m a l la p e r t u r e sw i l ll o w e rt h e s y s t e m sr e s o l u t i o n b u tw i t ht h ei n c r e a s i n go fa p e r t u r e sr a d i u s ，t h ei n f l u e n c eb e c o m e s s m a l l e r , w h e nt h er a d i u sz 2d t h ei n f l u e n c ec a n b ei g n o r e d t h e s er e s u l t sa r eh e l p f u lf o rt h e d e s i g no fc o n f o c a ls c a n n i n gd e t e c t i o ns y s t e m ，a n dm a yb eh e l p f u lf o rl a s e rb e a m sa p p l i c a t i o n ba l lo p t i c a lc o m m u n i c a t i o n s ，i n t e g r a t e do p t i c sa n ds oo n 3 a c c o r d i n gt oi t sf l o wc h a r ti nd n aa n a l y s i ss y s t e m ，t h es i g n a l sp r o c e s s i n gw e r e s t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y , i n c l u d i n gp r e p r o c e s s i n g ( d a t as e ts e l e c t i o n ，b a s e l i n ea d j u s t m e n t ， d e n o i s i n g ，p e a ki d e n t i f i c a t i o n ) ；f o u r - c o l o r f l u o r e s c e n c e s i g n a l s c r o s s t a l k c o r r e c t i o n ； p o s t p r o c e s s i n g ( d e c o n v o l u t i o n ，m o b i l i t ys h i f t i n gc o r r e c t i o n ，s i g n a l si n t e n s i t yn o r m a l i z a t i o n ) a sr e f e r r i n gt ot h er e s e a r c ho fo p t i m i z i n go fd e n o i s i n gm e t h o d ，i no r d e rt oc o n s t r u c tt h es a m e 1 1 1 浙江大学博士学位论文 n o i s em o d e la st h a ti ne x p e r i m e n ta n de v a l u a t et h ed e n o i s i n ga l g o r i t h mp r e c i s e l y , an o v e l m e t h o dw a sp r e s e n t e d ：r e a ln o i s ed a t aa c q u i r e df r o mt h ee x p e r i m e n t a ls y s t e mw e r ea d d e dt o a ni d e a ls i g n a lt os i m u l a t ean o i s yd n as e q u e n c i n gs i g n a l ，t h u st h ed e n o i s i n ge f f i c i e n c yc o u l d b ee v a l u a t e da c c u r a t e l y t h ed e n o i s i n gr e s u l t si n d i c a t et h a ts y m 7i st h eo p t i m a lw a v e l e tb a s e ， i tc a ne f f e c t i v e l yr e d u c et h en o i s eo fd n as e q u e n c i n gs i g n a l a f t e rp r o c e s s e d ，t h er e l a t i v e e r r o r so ft h es i g n a l s p c a kh e i g h ta n dp e a kp o s i t i o na r es m a l l e s t ，t h es n ri st h eh i g h e s t ，a n d t h er m s ei sa l s ot h es m a l l e s t ，c o m p a r i s o nt ot h a to fd b 8 ，c o i f 5e t c b a s e do nt h ea b o v et h e o r e t i c a lr e s e a r c h e sa n di n n o v a t i o nd e s i g n ，t h i sd i s s e r t a t i o n f i n i s h e dt h er e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to ft h ed n aa n a l y s i si n s t r u m e n t sf l u o r e s c e n c es i g n a l a c q u i s i t i o na n dp r o c e s s i n gs y s t e m t h ef a s tp a r a l l e ld e t e c t i o no fm u l t i c h a n n e l d n a f l u o r e s c e n c es i g n a lw a sr e a l i z e db yat e l e c e n t r i cf - t h e t ao b j e c t i v ea n das c a n n i n gm i r r o r ；t h e f o u r - c o l o rf l u o r e s c e n c es i g n a l sc o n f o c a ld e t e c t i o nw a sr e a l i z e db yaf i l t e rs e ta n da p h o t o m u l t i p l i e rt u b e ( p m t ) t h es i g n a la c q u i s i t i o na p p a r a t u si n t e g r a t e da ne m b e d d e ds y s t e m ， t h ec h r o m a t o g r a m sc o u l db ed i s p l a y e di nal i v em o d e ，a n dt h ed a t ac o u l db es t o r e da n d p r o c e s s e di nac o m p u t e r n o v e ld e s i g n e dd n af l u o r e s c e n c es i g n a la c q u i s i t i o ns y s t e mo n l yu s e so n ep m t ，w h i c h l o w e r st h em a n u f a c t u r ec o s to ft h es y s t e m ；t h es y s t e m sw o r k i n gn o i s eb yu s i n go p t i c a l s c a n n i n gm e t h o di sm u c hl o w e rt h a nt h a tb ym e c h a n i c a ls c a n n i n g ，a n dt h ed e t e c t i n g s e n s i t i v i t yi sh i g ha sw e l l c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i se x p e r i m e n t sw e r e e x e c u t e di nt h es y s t e m u s i n gd n am a r k e rp b r 3 2 2 h a ei i i t h es y s t e m sl i m i to fd e t e c t i o nw a se v a l u a t e dt ob e 2 3 6 8 10 - 1 2 m o l lr d s d n aw i t ht h i a z o l eo r a n g e ) c o o p e r a t i n gw i t ht h ec h r o m a t o g r a m p r o c e s s i n gs o f t w a r e ，t h es y s t e mc a nm e e tt h er e q u i r e m e n to fs i n g l eb a s ep a i rr e s o l u t i o ni n d n a a n a l y s i s t h es y s t e mi se x p e c t e dt ob ea p p l i e dt ob o t hc a p i l l a r ya r r a ya n dm u l t i c h a n n e l m i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i sd e t e c t i o nb a s e d o nl a s e r - i n d u c e df l u o r e s c e n c e k e y w o r d s ：d n a a n a l y s i s ；f l u o r e s c e n c e ；c o n f o c a l ；s c a n n i n g ；s i g n a l a c q u i s i t i o n ；s i g n a l p r o c e s s i n g i v 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 光学技术在生物学中的应用历史悠久，显微镜的发明，观察生物组织细胞是其重要 用途之一。二十世纪五十年代，年仅2 5 岁的詹姆斯沃森和3 7 岁的弗朗西斯- 克里克共 同完成了一项伟业：他们从d n a ( 脱氧核糖核酸) 的x 光衍射图上解读了它的双螺旋 结构，从此揭开了人类探索生命奥秘的新纪元。二十世纪下半叶以来，科学技术的进步 日新月异，促进了分子生物学、分子遗传学和生物化学的迅猛发展，使人类对生命的认 识逐步从器官、细胞水平深入到分子水平。此时，如何清楚地了解基因的结构、序列和 功能成为科学研究人员的重要课题。1 9 8 6 年由美国能源部提出的人类基因组计划 ( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，h g p ) 1 “，为d n a 序列的分析和研究提供了更加有利的物质条件 和技术保障。刚刚迈入二十一世纪，人类基因组计划就已初步完成，蛋白质组计划已经 启动，基因序列数据及蛋白序列数据正以前所未有的速度增长。进入后基因组时代，人 们对基因检测的需求越来越大，各种检测技术和装置也应运而生。自二十世纪九十年代 初开始，陆续出现了几种快速d n a 检测技术，其中包括固态平板生物芯片技术【2 “、毛 细管电泳技术瓯6 】，微：签片电泳技术7 。9 1 ，其中毛细管电泳技术和微：卷片电泳技术是在微 米级的通道中分离d n a 样品片段，在固定的检测窗口对样品进行荧光检测。由于激光 诱导荧光检测的灵敏度高、选择性好，因此被广泛应用于d n a 序列的分析。 本章首先简述d n a 的结构、功能以及d n a 序列的检测技术，进而引出全文的立 论依据、研究内容和主要创新点，最后介绍论文的整体结构及主要内容。 第一章绪论 1 1 论文的选题背景 d n a 携带了生物体的基因信息，基因信息的提取即d n a 测序，是现代分子生物学 研究中的重要分支。“人类基因组研究计划”【1 1 是本世纪三大科学研究计划之一，这项计 划使得人类对遗传信息进行译码，进而对疾病的发病原因有更深入的认识以便于疾病的 预防和治疗，不仅可以提高人们的生活质量，甚至可以延长人的寿命。d n a 测序技术 是这项研究计划中关键的组成部分之一，它为生命科学研究提供了最有效、最便捷的技 术和手段。因此，d n a 分析仪器的研究显得十分重要，它是获取信息的源头和基础。 基于毛细管电泳及微型全分析仪器系统( m i c r ot o t a la n a l y t i c a ls y s t e m ，l a t a s ) 【1 0 】之上的现 代检测技术，是目前d n a 分析仪器发展的重要前沿领域。 1 1 1d n a 分析的生物学基础 每一个生物均由细胞组成，细胞是生命的最小单位，细胞核是细胞内最重要的细胞 器，核内包含有由d n a 和蛋白质构成的染色体。图1 1 为人类的d n a ，染色体和细胞 的关系图1 1 1 1 。 3 d n ai n t h ec e l l 2 2p a i r s + x xo rx y ， ， ) ，t 图1 1d n a ，染色体和细胞的关系 f i g 1 1t h er e l a t i o n s h i po f d n a ，c h r o m o s o m e a n dt h ec e l l 人类的二倍体细胞含有2 3 对( 4 6 条) 染色体，这4 6 条染色体相互配对，配对的2 条染色体称为同源染色体，在2 3 对染色体中，2 2 对为常染色体，另外一对与性别有关， 2 浙江大学博士学位论文 称为性染色体，女性的性染色体为x x ，男性的性染色体为x y 。除性染色体x 和y 外， 所有配对的2 个染色体形状和大小均相同，y 染色体比x 染色体小很多。人类的染色体 根据他们的大小进行编号，1 号染色体最大，2 2 号染色体最小，性染色体不编号。每一 条染色体含有一个d n a 分子，人的一切遗传信息都包含在这2 3 对d n a 分子中1 1 列。d n a 的基本结构单元是脱氧核苷酸( d e o x y n u c l e o t i d e ) ，它由碱基( b a s e ) 、脱氧核糖 ( d e o x y r i b o s e ) 和磷酸( p h o s p h o r i ca c i d ) 三部分构成。生物的遗传信息被编码在d n a 的a ( a d e n i n e ，腺嘌呤) 、t ( t h y m i n e ，胸腺嘧啶) 、g ( g u a n i n e ，鸟嘌呤) 、c ( c y t o s i n e ， 胞嘧啶) 四种碱基中，四种碱摹的结构如图1 2 所示i l ”。脱氧核糖的结构如图1 3 所示 【1 3 】。碱基和脱氧核糖组成脱氧核糖核苷( d e o x y n u c l e o s i d e ) 。碱基杂环和脱氧核糖环骨 架上的每个原子均已编号，前者为1 ，2 ，3 ，后者为1 ，2 ，3 ，以表示区分【1 ”。 脱氧核糖核苷的戊糖羟基与磷酸形成酯键，即形成脱氧核苷酸，多个脱氧核苷酸通 过3 ，5 磷酸二酯键连接形成脱氧多核营酸链( d e o x y p o l y n u e l e o t i d ec h a i n ) ，即d n a 链。 图1 4 为脱氧多核苷酸链的结构图”，注意3 ，5 磷酸二酯键链及不对称的两个末端， 即在上方末端有一个5 端的磷酸基，另一端为未结合的3 o h 基，因此脱氧多核苷酸 链的两端分别称为5 端和3 端，且习惯上将5 端放在左侧，3 端放在右侧【1 4 j 。 ! h 22 胃! 心 h 一! 乏舞一。2 h 二! 奉睁一w= 匿? 。一! 争： h a d e n i n e ( a ) g u a n i n e ( g ) hh t h y m i n e ( t ) 图1 2d n a 分子中四种碱基的结构 f i g 1 2t h es t r u c t u r e so f f o u rb a s e si nd n am o l e c u l e s 图1 3d n a 分子中的脱氧核糖结构 f i g 1 3t h es t r u c t u r eo f d e o x y r i b o s ei nd n a m o l e c u l e s h c y t o s i n e ( c ) 第一章绪论 图1 4 脱氧多核苷酸链的结构图 f i g 1 4t h es t r u c t u r eo f d e o x y p o l y n u c l e o t i d e sc h a l i i d n a 的结构可以分为一级结构、二级结构及三级结构1 2 l 。一级结构是指d n a 分子 中脱氧核苷酸的连接方式和排列顺序，因为各种d n a 分子中脱氧核糖和磷酸的组成都 是相同的，因此脱氧核苷酸中a 、t 、g 、c 四种碱基的排列顺序( 即d n a 序列) ，包 含了生物体特定的遗传信息。碱基的排列顺序稍有变化，就会引起遗传信息的巨大改变， 可见清楚地掌握碱基的排列顺序对于了解d n a 的结构和功能有着重大意义。因此d n a 一级结构的测定成为d n a 分析研究的一项重要内容，而d n a 序列分析仪是这项研究 的重要工具。 d n a 二级结构指d n a 分子的立体空间结构，即詹姆斯沃森( w a t s o n ) 和弗朗西 斯克里( c r i c k ) 建立的d n a 双螺旋结构。它的基本特征包括主链：d n a 主链由脱氧 核糖和磷酸相互问隔连接而成，2 条主链反向平行，处于螺旋的外侧，碱基处于螺旋的 内侧，2 条主链形成右手螺旋，有共同的螺旋轴，螺旋的直径是2 r i m ，每1 0 对碱基绕轴 旋转一圈组成一节螺旋，螺距3 4 n m ，如图1 5 所示【1 3 , 1 5 ；碱基配对特性：d n a 双螺旋 结构中碱基之间总是a 与t 配对，g 与c 配对。a 与t 通过2 个氢键配对，g 与c 通 过3 个氢键配对，如图1 6 所示f 1 3 】。因为多了一对氢键，所以g 与c 之间的连接较为稳 定。由于两条链上的碱基是互补的，因此，当一条链上的碱基顺序固定，按照碱基互补 的原则即可确定另一条链上的碱基排列顺序。碱基互补原则具有十分重要的生物学意 4 浙江大学博士学位论文 义，它不仅与d n a 的结构有关，而且还与d n a 的复制、转录和遗传信息的传递有着 密切的关系。在生物体内，d n a 转录成r n a ，然后翻译成蛋白质，以这种方式来传递 生命的基因信息。d n a 的复制过程为：在d n a 解旋酶的作用下，打开双链螺旋d n a 的氢键，成为两条单链；以单链为模板，脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则合 成一条新的子链。d n a 分子的复制，使得基因信息得以遗传下来，保证了物种的连续 性。 2n m 图1 5d n a 的双螺旋结构 f i g 1 5t h ed o u b l eh e l i xs t r u c t u r eo fd n a c y t o s i n e g u a n i n e 谤，”。谚渗9 ，； 谚谚。毯”9 。 * q ”，蓼一象 参谚谚一彩 i ： 誊 国 国 图1 6d n a 分子中的碱基配对 f i g 1 6t h eb a s ep a i r i n gi nd n a m o l e c u l e s ”o 。i ”霭= 国够缈? 参穆 d n a 的三级结构是指在一、二级结构的基础上，核苷酸链的进一步折叠、扭曲和 压缩，也称为高级结构。 人体细胞中所有的d n a 构成人类基因组( g e n o m e ) ，它由两类不同的组分构成： 5 、，；k厂，一、 宣 渗谚爹谚謦 第一章绪论 核基因组和线粒体基因组，前者由大约3 0 亿个碱基对( b p ) 组成，后者是一个长为 1 6 5 6 9 b p 的环状d n a 分子”6 1 。染色体上的d n a 分子由编码区和非编码区组成，编码区 域称为基因，一个基因的大小为几个k b 到几十个k b ”1 。人类基因组大约有8 0 0 0 个基 因，其包括的信息仅占核基因组的3 。人类基因组计划的完成，使人们认识到，人与 人之间9 9 的基因是相同的，仅存在l 的基因差异。科学家认为，正是这些极小的差 异，导致了生命的多样性不同的种族、肤色、相貌，对各类疾病不同的敏感性，以 及对药物的不同反应，这些差异称为d n a 的多态性( p o l y m o r p h i s m ) ，分析这些多态性 信息称为基因分型( g e n o t y p i n g ) 【1 2 1 。 因此，无论是对分子生物学和分子遗传学的发展，还是对生物化学、细胞生物学、 生理学和法医科学的发展，基因组序列的测定和分析都是至关重要的，而这些研究都离 不开d n a 序列分析仪。 1 1 2d n a 测序技术 d n a 测序，即对d n a 的一级结构碱基序列进行测定。2 0 世纪7 0 年代中期， 两种快速有效的d n a 测序技术几乎同时建立：化学降解测序法( c h e m i c a lc l e a v a g e s e q u e n c i n gm e t h o d ) 和链终止测序法( c h m nt e r m i n a t i o ns e q u e n c i n gm e t h o d ) ，两种技术开 始时都很受欢迎，但是链终止法近年来成为主要的测序方法，特别是在基因组测序中。 这一方面是因为化学降解法中的化学试剂是有毒性的，但主要原因是链终止法更易自动 化测序”6 1 。 1 1 2 1 化学降解测序法 化学降解测序法是由m a x a m 和g i l b e r t 于1 9 7 7 年创立的【1 7 1 。此法利用在特定核苷 酸位置特异切割的化学试剂处理d n a 分子，得到a 、g 、c 、t 四个系列不同长度的 d n a 片段。起始样品可以是双链d n a ，但开始测序前，必须转变为单链，并且每一个 待测分子都必须在一端标记。 以“g ”系列反应为例阐明该法的原理，如图1 7 所示。首先，用硫酸二甲酯处理 d n a 分子，在鸟嘌呤的嘌呤环上添加甲基基团。只加少量的硫酸二甲酯，以使平均每 条多核苷酸链上只有一个鸟嘌呤被修饰。在添加第二种化学试剂之前，多核苷酸链仍然 完整，并没有被切割。加入哌啶后可以去除修饰后的嘌呤环，并在无碱基位点上游的磷 6 浙江大学博士学位论文 酸二酯键处立即切割d n a 分子，这样就得到一系列切开的d n a 分子片段，其中一些 是标记的，另一些是未标记的。所有标记的分子都有一端是相同的，另一端即鸟嘌呤被 切割的位置因切割位点而异，长度各不相同，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，获得d n a 的序列信息。 l a b e l d n a m o l e c u l t o b e m e a s u r e d ( m u l t i - c o p y ) 、卜g g g g m e m y l 细n上d 岫t h y l 砌觚 卜一g g g g m e t h y l a l i o n i h 一g g g o m 。l y l 8 t i “ 卜一g g g g m e t h v l a t i o n l ， 卜一o g g g p i p e r i d i n e 卜一g g g g 卜一g g g g 卜一o g g g 卜一g g g g u n l a b e l e d 丘a 田n e n 拓啪n o tv i s i b l e l a b e l e df i a g m e n t smv i s i b l ea f t e rs e l f - d e v e l o p e d a n e r s c l ；a d c d 图1 7 化学降解测序法的原理 f i g 1 7t h ep r i n c i p l eo f c h e m i c a lc l e a v a g em e t h o df o rs e q u e n c i n g 虽然采用化学降解无法特异切割a 或t 碱基，通常所做的4 个反应是“g ”、“a + g ”、 “c ”和“c + t ”，但这并不影响从凝胶上读取序列的准确性，因为可以比较“g ”和“a + g ” 两个电泳条带，二者重复的部分为“g ”不同的部分为“a ”：同理可以识别“c ”和“t ”。 1 1 2 2 双脱氧链终止测序法 1 9 7 7 年s a n g e r 创立了测定d n a 序列的双脱氧核苷酸( d d n t p ) 链终止法堋。该法 操作简便，且随着聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p e r ) 技术的出现【1 9 1 ， 易于实现自动化和规模化，已成为现代d n a 测序的主要方法【2 们2 1 。它以单链d n a 分 7 第一章绪论 子作为待测模板，并且需要与模板互补的引物d n a 链。其测序原理是对所测定的d n a 序列进行循环聚合反应，并使用2 ，3 双脱氧核苷三磷酸( d d n t p ) 作为聚合反应的链终 止剂。d d n t p 与普通d n a 的单体d n t p 之间的差别在于其脱氧核糖的3 位置少一个羟 基，因而虽可在d n a 聚合酶作用下通过其5 三磷酸基团掺入到正在增长的d n a 链中， 但因缺乏3 羟基而不能同后续的d n t p 形成磷酸二酯键。因此，当正在增长的d n a 链 末端碱基为d d n t p 时，链延伸反应就终止了。这样，在合适条件下，待测d n a 样品的 聚合反应产物便为一系列长度呈梯形分布的多核：舒酸链，其长度差别为一个核苷酸。使 用凝胶电泳分离不同长度的多核苷酸链片段，通过对其长度和标记物的共同识别，便能 依次读出所测d n a 的碱基序列，原理如图1 8 所示1 2 3 j 。 d d t t p h i g hv o l t a g eg e le l e e t r o p h o r e s i s agct 呈 2i t ti c al 爱 图1 8 链终止测序法的原理 f i g 1 8t h ep r i n c i p l eo f c h a i nt e r m i n a t i o ns e q u e n c i n gm e t h o d 链终止测序法在循环聚合反应开始时需要寡核苷酸引物，这是因为依赖模板的d n a 聚合酶不能在全部是单链的分子上开始合成，必须有一段短的双链区提供3 端，这样在 聚合酶的作用下才可添加新的核苷酸。此外，引物还在决定模板d n a 分子的测序范围 中起关键作用。 r 浙江大学博士学位论文 因为一个测序反应只能测长度在几百个b p ( b a s ep a i r ) 的d n a 链，所以需要通过 某种方法将测到的大量短d n a 序列拼接成长染色体序列。常见的序列拼接方法有： ( 1 ) 随机法【1 2 ，1 6 】 又称鸟枪测序法，它利用超声波或d n a 酶将目的d n a 随机打断成大小不同的片 段并获得亚克隆，收集这些亚克隆的d n a 序列资料，通过检测单个短序列中的重叠区 域推导出完整的d n a 序列。该方法是最直接的一种序列拼接方法，测序速度快，且不 需要遗传或物理图谱，但是从起始序列寻找重叠区域及构建序列重叠群的算法非常复 杂，现有的计算机系统难以胜任；另外，因为不连续的序列可能因为重复单位而被错误 地连接在一起，所以鸟枪法要求所研究的基因组中没有或者只有很少的重复序列。 ( 2 ) 限制性片段亚克隆法【1 2 】 对目的d n a 进行酶切分析，确定酶切图谱后，以合适的限制酶消化，制备各种长 度的限制酶片段，克隆到测序载体上建立业克隆库。然后测定亚克隆的d n a 序列，通 过排列分析，可确定目的d n a 片段的全序列。此法在实际运用中是很困难的，特别是 当目的d n a 片段中限制酶位点分别不均匀时，上述策略很难凑效。因此，仅当目的d n a 片段限制酶位点分别均匀，片段不太大的情况下才可考虑使用这一方法。 ( 3 ) 定向法旧 在定向法中，靶d n a 的测序按计划有秩序地进行。例如，利用通用引物测定两端 的目的d n a 序列，然后以已测定的序列为基础来设计新的多聚寡核苷酸作为后续一套 反应的引物，从而循序渐进地获得目的d n a 的全部序列，因此又称为渐近法。 1 1 3d n a 序列分析仪器的发展 d n a 序列分析仪器发展至今，大致经历了三个阶段【2 ”。第一阶段为非自动化的同 位素标记( 多用p 3 2 ，也可用p ”或s 3 s ) 垂直板凝胶电泳测序。测定的主要策略是用放 射性同位素掺入到所有不同长度的聚合片段，在四个聚合反应中分别加入四种碱基的双 脱氧核苷三磷酸，即d d a t p ，d d t t p ，d d c t p 和d d g t p 。反应完成后将得到四组分别在 a ，t ，c ，g 位置终止的不同长度片段。然后将四个反应的产物分别在四条凝胶电泳通 道上进行分离；经过同位素曝光后，便可对四条电泳道上的不同片段进行拼读，从而获 得所测片段的碱基序列。垂直板凝胶电泳分析仪的读长只有2 0 0 3 0 0 个碱基，并且需要 人工制备凝胶板和等待同位素曝光，与后来出现的自动化分析仪相比，显然是费时、费 9 第一章绪论 力而不能适用于对大量d n a 片段的测定，特别是全基因组的序列分析。随着自动化d n a 分析仪的迅速发展，越来越多的实验室放弃了这一方法。 d n a 序列分析仪器发展的第二阶段的产物为自动荧光垂直板凝胶电泳分析仪。2 0 世纪9 0 年代初，荧光标记和检测的技术开始被应用到d n a 序列分析中，同时诞生了 d n a 自动分析仪，使d n