（化学工艺专业论文）阿斯巴甜母液中苯丙氨酸和天冬氨酸的分离.pdf

摘要 题目：阿斯巴甜母液中苯丙氨酸和天冬氨酸的分离 硕士研究生姓名；吴国光 导师：彭奇均教授 专业；化学工艺 摘要 苯丙氨酸和天冬氨酸是阿斯巴甜母液中的二种氨基酸，其中苯丙氨酸的价格很高， 但是常规的分离方法无法实现这一部分苯丙氨酸清洁化的回收。本文通过选用了色谱法 对苯丙氨酸和天冬氨酸进行了有效的分离，得到结果如下： 1 比较研究了紫外双波长检测法和紫外旋光混合检测法两种方法，选择了紫外双波长 检测法作为苯丙氨酸和天冬氨酸的定量方法，在 - - - - 2 5 7 n m 和 = 2 3 0 r i m 波长下苯 丙氨酸和天冬氨酸能准确定量，其中苯丙氨酸浓度的标准偏差 中极性树 脂 极性树脂；天冬氨酸的保留时间随树脂极性的增加逐步增加。在以交联聚苯乙烯 为骨架的弱极性吸附树脂上，天冬氨酸的保留时间随孔容的增加逐步增加，随树脂 的比表面积增加而减小，苯丙氨酸的保留时间随着树脂比表面积和孔容的改变，出 现小范围内的波动。 3 苯丙氨酸和a b 8 树脂之间同时存在疏水作用氢键作用，天冬氨酸与a b - 8 树脂之间 存在氢键作用。氢键作用是实现苯丙氨酸和天冬氨酸在a b 一8 树脂上分离的关键，在 整个色谱分离过程中占主导。以水为流动相，疏水作用拉近了苯丙氨酸分子疏水部 分与树脂表面的氢键作用位点的距离，促进氢键作用形成。 洗脱剂中盐的存在，减弱了水分子对苯丙氨酸疏水基团的保护作用，使得苯丙氨酸 分子与a b 一8 树脂间疏水作用增强。在较低盐浓度条件下，苯丙氨酸的保留时间几乎 成线性增加。在极低盐浓度下，疏水作用的增强必须克服某一个阀值才能使得氢键 作用增强，这种增强作用随离子强度增加瞬时完成，体现为苯丙氨酸保留时间的陡 然增加。当盐的离子强度进一步增加时，氢键作用的增强幅度不再发生变化。 4 论文采用示踪剂法，测得分析柱的总空隙率和外空隙率分别为0 7 9 0 和0 3 1 0 。然 后选用了前沿分析法测定了苯丙氨酸和天冬氨酸吸附等温线。研究a s p 存在的情况 下p h e 在a b 一8 上的吸附行为，结果显示a b 一8 树脂上存在2 个吸附位点，a s p 的存 在不会对p h e 所占据的吸附位点形成竞争。 关键词：苯丙氨酸天冬氨酸色谱分离树脂疏水作用氢键作用吸附等温线 i a b s t r a c t t i t l e ：s e p a r a t i o no fp h e n y l a i a n i n ea n da s p a r t i ca c i di na s p a r t a m e m o t h e rl i q u o r g r a d u a t es t u d e n t ：g u og u a n gw u t u t o r ：p r o f q ij u np e n g m a j o r ：c h e m i c a le n g i n e e r i n g a b s t r a c t t h e r ea r et w ok i n d so fa m i n oa c i d s ( p h e n y l a l a n i n ea n da s p a r t i c a c i d ) e x i s t i n gi n t h e a s p a r t a m em o t h e rl i q u o r , p h e n y l a l a n i n ec o u l d n tb er e c l a i m e db yt h er o u t i n es e p a r a t i o n m e t h o d s ，w h i c hi sv e r ye x p e n s i v ei nt h em a r k e t c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nm e t h o dw a s s e l e c t e di nt h es e p a r a t i o np r o c e s so fp h e n y l a l a n i n ea n da s p a r t i ca c i dw h i c hc o u l ds e p a r a t e t h e mf r o me a c ho t h e r t h er e s u l t so f t h i st h e s i sw e r el i s t e da sf o l l o w ： 1 c o m p a r e dw i i t h eo t h e re x a m i n a t i o nm e t h o d s t h ed o u b l e - w a v e l e n g t hu l t r a v i o l e t e x a m i n a t i o nw i l l sa p p l i e d ，w h i c ht h ec o n c e n t r a t i o no ft h i st w oa m i n oa c i d sc a nb ee a s i l ya n d e x t r e m e l ya c c u r a t eq u a n t i f i e da tt h ew a v e l e n g t h2 5 7 n ma n d2 3 0 n m i ta l s oc a l c u l a t e dt h e s t a n d a r dd e v i a t i o no ft h i sm e t h o dw h e ni tw a sa p p l i e di ni n d u s t r y ，t h es t a n d a r dd e v i a t i o no f p h e n y l a l a n i n ea n da s p a r t i ca c i dw e l el e s st h a n1 a n d3 r e s p e c t i v e l y 2 t h ec h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o nw a ss e l e c t e di nt h i st h e s i s s e v e r a ld i f f e r e n tk i n d so f r e p r e s e n t a t i v es t a t i o n a r yp h a s ea n dm o b i l ep h a s e w e l es e l e c t e di nt h e s e p a r a t i o no f p h e n y l a l a n i n ea n da s p a r t i ca c i d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ea d s o r p t i o nr e s i n sw e r ew e l l b e h a v e dw h e nw a t e rw a su s e d 舔t h em o b i l ep h a s e t h e nt h et h r e ei m p o r t a n tc h a r a c t e r so f a d s o r p t i o nr e s i n sw e r es t u d i e di nf u r t h e ra tt h e 锄- l l ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s i tw a s r e v e a l e dt h a tp o l a r i t yo ft h ea d s o r p t i o nr e s i n sw a st h ek e yi n g r e d i e n ti nt h ew h o l ep r o c e s s p h e n y l a l a n i n ea n da s p a r t i ca c i dc o u l db ee f f e c t i v es e p a r a t e do nt h en o n - p o l a ra n dw e a k p o l a r r e s i n s t h es e p a r a t i o nd e g r e eo na b 一8c a nr e a c ht o6 8 8 7 t h er e t e n t i o nt i m eo r d e ro f p h e n y l a l a n i n e o n a d s o r p t i o n r e s i n sw e r ea sf o l l o w ： w e a k p o l a r i t y n o n - p o l a r i t y m i d d l e - p o l a r i t y p o l a r i t yr e s i n s ；t h er e t e n t i o nt i m eo fa s p a r t i c a c i dw e i n c r e a s e dw i t ht h ep o l a r i t yi n c r e a s e a n di ta l s oi n c r e a s e dw i t l lt h ep r o v ev o l u m e i n c r e a s e , b u tn o tf o rt h es n r f a c ea r e ac h a n g eo nt h ew e a k - p o l a r i t ya d s o r p t i o nr e s i n s t h e r e t e n t i o nt i m eo fp h e n y l a l a n i n ew e r ef l u c t u a t e di nas m a l lr a n g ew i t ht h ec h a n g eo fs u r f a c e a r e aa n dp r o v ev o l u m eo f w e a k - p o l a r i t ya d s o r p t i o nr e s i n s 3 t h e r ew e r et w ok i n d so f a c t i n gf o r c ee x i s t i n gi nt h ea d s o r p t i o n p r o c e s s ，h y d r o p h o b i c 垩堕盔兰堡主兰竺丝奎 i n t e r a c t i o na n dh y d r o g e nb o n d i n gi n t e r a c t i o n , w h i l eo n l yh y d r o g e nb o n d i n gi n t e r a c t i o n e x i s t e di nt h ea d s o r p t i o no f a s p a r t i ca c i do na b - 8r e s i n t h eh y d r o g e nb o n d i n g p l a y e da p r e d o m i n a n tr o l ei nt h es e p a r a t i o np r o c e s s ，a n dt h eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nw o u l ds h o r t e nt h e d i s t a n c eb e t w e e nt h et w oh y d r o p h o b i cg r o u p so f a b - 8r e s i na n dp h e n y l a l a n i n e ，w h i c hw o u l d s n e n g t h e nt h eh y d r o g e nb o n d i n gi n t e r a c t i o nc o n s e q u e n t l yi nw a t e r t h e h y d r o g e nb o n d i n gi n t e r a c t i o nw o u l d b es t r e n g t h e n e db ya d d i n gs o m es a l ti nw a t e r b e c a u s et h es u r f a c et e n s i o no f t h ew a t e rc o u l db ed e c r e a s e d ，w h i c hw e a k e nt h ep r o t e c t i o no f t h eh y d r o p h o b i cg r o u p sb yw a t e ra n dp r o m o t e dt ot h ei n t e g r a t i o no f t h eh y d r o p h o b i cg r o u p s w h e nt h ei o ns t r e n g t hc o n t u n l u et od e c r e a s e ，t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h er e t e n t i o nt i m eo f p h e n y l a l a n i n ei n c r e a s e di nl i n e a r 、i t l lt h ei o n i cs t r e n g t h , a n di ta l s or e v e a l e dt h a tt h e s t r e n g t h e no f t h eh y d r o g e nb o n d i n gi n t e r a c t i o nd i d n ta p p e a ru n t i lc o n q u e ra f i x e dv a l u e ，t h e n i tw i l lc o m p l e t ei n s t a n t a n e o u s l y 4 t h ev a l u eo f t b et o t a la n de x t e r n a lv o i d a g ew e r eo 7 9 0a n d0 3 1 0r e s p e c t i v e l y , w h i c hw e r e i n v e s t i g a t e db yr a d i o t r a c e rm e t h o d t h ea d s o r p t i o ni s o t h e r mo fp h e n y l a l a n i n ea n da s p a r t i c a c i d sw e r ei n v e s t a l g a t e db yt h ef r o n t a la n a l y s i s t h e nt h ea d s o r p t i o nb e h a v i o ro f p h e n y l a l a n i n ew a s s t u d i e dw h e na s p a r t i ca c i d se x i s t i n gi nt h em i x t u r e ，i tw a si n d i c a t e dt h a t t h e r ew e r et w oa d s o r p t i o np o i n t so na b - 8r e s i n , a n dt h e r ew a sn oc o m p e t i t i o nb e t w e e n p h e n y l a l a n i n ea n da s p a r f i c i d so na b - 8 r e s i n k e yw o r d s ：p h e n y l a l a n l n e , a s p a r t i ca c i d , c h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n , r e s i n , h y d r o p h o b i ei n t e r a c t i o n , h y d r o g e nb o n d i n gi n t e r a c t i o n ，a d s o r p t i o ni s o t h e r m i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：鬈园整 日期：如辫6 月廖日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：墨凰垫导师签 e t 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 氨基酸在各领域中的应用及其生产方法 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是人类摄取的最重要营养素之一，人类食品的营 养价值不仅仅取决于食品中所含有的热量，同时还取决于氨基酸的质量、种类和数量； 它也是合成人体激素、酶及抗体的必需原料，是生命机体之营养、生存和发展极为重要 的物质，并且在生命体内物质代谢调控、信息传递方面起着重要的作用。 氨基酸工业是自2 0 世纪5 0 年代发展的新兴工业体系。近几年来，在研究、开发和 应用氨基酸方面均取得重大进展，发现的新氨基酸种类和数量已由6 0 年代5 0 种左右， 发展到8 0 年代的4 0 0 种，目前已达l 0 0 0 多种。世界氨基酸产量的年增长率约为8 ， 2 0 0 0 年已超过2 0 0 万吨。氨基酸作为人类营养添加剂、调味剂、饲料添加剂、医药、 农药等在食品工业、农业、畜牧业及人类健康、保健等诸多方面有着广泛的应用。氨基 酸在医药上主要用作氨基酸输液和口服氨基酸制剂，此外还用作治疗药物、短肽药物和 医药合成原料，例如2 0 0 0 年氨基酸输液产量约为1 亿瓶。食品工业中应用氨基酸量约 占氨基酸总产量的6 0 。氨基酸对防止食物变质、消除异臭、提高食品风味及增加营养 价值等方面有很大作用。氨基酸作为饲料添加剂，主要有四个方面的功效：促进动物生 长发育；改善肉质，提高产奶、产蛋量；节省蛋白质饲料，使饲料得到充分利用：降低 成本，提高饲料利用率。在农业方面，氨基酸农药不仅是无害农药，其易被微生物分解， 而且无毒性、不污染环境，可增强植物抗菌能力。主要品种有：杀虫剂、杀菌剂、除草 剂、农药稳定剂、植物生长促进剂、脱叶剂等。在化工方面，氨基酸可用来合成人造皮 革和制造日用化妆品等。 目前，氨基酸的生产方法有四种：化学合成法、酶法、发酵法和蛋白质水解法( 提 取法) 1 2 一。其中：( 1 ) 化学合成法是借助有机合成和化学工程相结合的技术生产氨基酸， 但该法需对外消旋体进行拆分才能得到光学纯产物，其工业生产价值不高。( 2 ) 酶法是 用微生物菌体或从菌体中提取的酶，把有机物转变成所需要的l 一氨基酸，此方法存在生 物工程菌的生产、酶的提取及酶、菌体的固定化等现代生物工程技术的许多问题。( 3 ) 发酵法是由微生物利用糖类、氨等廉价碳氮源，借助微生物具有合成自身所需各种氨基 酸的能力直接生产l 一氨基酸，但发酵法中菌种的选育相当麻烦，不好控制，并且所要产 品纯度不高，伴有其他氨基酸的产生。( 4 ) 提取法( 蛋白质水解法) 是以动物蛋白质为原 料，经强酸水解后，得到各种氨基酸。提取法原料廉价，所需的原料种类少，且在中 国内陆原料资源相当丰富。工业生产时可同时得到十多种氨基酸产品，生产规模易扩大， 容易实现工业化生产，利用蛋白质为资源，进行氨基酸的工业化生产，在中国已成为发 展氨基酸工业的重要途径。 1 1 2 阿斯巴甜母液的介绍 阿斯巴甜( 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯) 是一种氨基酸二肽衍生物【5 l ，它是一种白色结晶 性粉末，具有清爽的甜味，其甜度为蔗糖的1 8 0 2 0 0 倍，和其它甜味剂相比具有味质 佳，安全性高，热量低等优点，因而风靡欧美市场。目前，阿斯巴甜已在1 0 0 多个国家 垩塑盔兰堡主兰垡丝奎 和地区获准使用，应用于6 0 0 0 多种饮料、食品和医药等产品中，是高效、安全的营养 型甜味剂，国际市场需求量以年均1 5 2 0 的速度增长，远远高于其他人工甜味剂年 均5 的增长速度| 6 j 。 阿斯巴甜的合成方法主要为化学合成法和酶法两种f 7 9 】。酶法成本较高，工艺不很 成熟，所以目前国内外的工业生产方法仍以化学合成法为主，纵观阿斯巴甜的化学合成 法，具有工业化价值的合成路线均以l 一天门冬氨酸( a s p ) 和l 一苯丙氨酸( p h e ) 为主要 原料，通过氨基保护、缩合、水解、酯化、中和等反应步骤来合成。最终通过等电点结 晶得到阿斯巴甜产品，结晶后的料液称为阿斯巴甜母液。母液主要含有一定量未参与反 应的氨基酸原料，以及合成过程中所添加的盐等。 现在阿斯巴甜的世界市场以美国所占份额最大【，有8 0 0 0 吨之多；其次是欧盟各 国，市场交易量达6 0 0 0 吨：南美地区和亚洲地区市场分别为1 0 0 0 吨。各主要生产公司 的生产能力大致如下：最大的生产公司日本味之素公司，产量为6 0 0 0 吨、纽特拉斯易 特公司次之，为5 0 0 0 吨；以下是霍兰特斯易特娜公司，产量3 0 0 0 吨，以江苏常州牛塘 为中心的中国公司产量是2 5 0 0 吨，目前国内阿斯巴甜产量约为4 0 0 0 吨。 1 1 3 苯丙氨酸和天冬氨酸的性质 苯丙氨酸是无色至白色片状晶体或白色结晶性粉末，略有特殊气味和苦味，熔点： 2 8 3 c ，在受热、光照、空气中稳定，与葡萄糖一起加热则着色，碱性下不稳定，溶于 水( 3 9 1 0 0 m l ，2 5 ) ，微溶于乙醇、乙醚等。是人体必需氨基酸之一，其生理作用与 酪氨酸有关，可影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素，d - 型与l 一型的生理效果相同， 市场价格为1 0 万吨l 。 天冬氨酸是白色片状晶体或白色结晶性粉末，无臭，稍有酸味，熔点：2 8 3 。c ，溶 解酸和碱，不溶于乙醇、乙醚等，市场价格为6 0 0 0 吨1 1 2 , 1 3 。 苯丙氨酸和天冬氨酸分子结构式见图l 一1 。 一岂：一堇h 2 c 洲啪c 一岂：二占n h h 2 一c 。h 图卜lp h e 和a s p 的分子结构 1 1 4 苯丙氨酸和天冬氨酸的用途 p h e 是一种重要的医药和食用化学品中间体，市场价格1 0 万吨近年来。氨基酸类 抗癌药物、营养保健品的开发应用促进了l _ p h e 生产的发展。卜p h e 在医药行业主要用 于氨基酸输液和氨基酸类药物，如抗肿瘤药物对氟p h e 等，供应十分紧俏。预计2 0 0 8 年我国医药行业年需消耗l p h e 约4 0 0 吨【1 4 j 。 p h e 的另一个主要用途是合成甜味剂阿斯巴甜。2 0 0 8 年市场需求量将达到2 0 0 0 吨， 产品呈供不应求之势，价格还会进一步攀升。 a s p 主要用途是合成甜味剂阿斯巴甜，同时在医药上主要作为心脏病类药物、肝功 能促进剂、氨解毒剂、疲劳消除剂和氨基酸输液的成分。还可以作为生化试剂、培养基 第一苹绪论 和有机合成中间体。在食品工业上可作为显鲜剂，是合成高效低热营养甜味剂一天冬氨 精( a p m ) 的重要原料，亦可作为营养增补剂，添加到各种清凉饮料中，市场价格为6 0 0 0 元吨。 1 1 5 现阶段氨基酸分离纯化的研究简介 氨基酸是化学结构上非常相似的一类小分子有机物，但它们在两性电学性质、金属 离子结合能力、侧链基团极性和疏水性及不同溶剂中溶解度等方面均存在不同程度的差 别，为它们之间的相互分离创造了某些有利的条件。由文献可知，国内外已先后在锌盐 沉淀法1 1 6 】、有机溶剂萃取法【”1 、液膜分离法和离子交换法1 1 6 之q 等方面进行了一定的探索 和研究。 主要对于p h e 质量浓度较低( 小于l o g l ) 、盐质量浓度较低的体系，回收率较低( 小 于8 5 ) 。有机溶剂萃取法虽有其优越性，但缺乏合适的萃取剂1 2 琨引，目前人们采用了 两种形式的离子交换反应萃取，一种是在高p h 下萃取氨基酸阴离子，另一种是在低p h 下萃取氨基酸阳离子。季氨盐( 如甲基三辛基氯化铰t o m a c ) 和酸性磷氧类萃取剂( 如二 ( 2 - 乙基己基) 磷酸d 2 e h p a ) 是典型的阴离子萃取剂和阳离子萃取剂，这些价格较贵且有 毒，所以限制了有机溶剂萃取法在工业中应用1 2 9 1 。液膜分离法可以同时对产品进行浓缩 和回收、实现放大和连续操作，但对于其工业应用尚需解决液膜稳定性与高效破乳回收 产品的方法例。活性炭吸附尽管吸附容量比较大，但活性炭预处理和再生较为困难。 ，离子交换法由于所用的离子交换树脂为高分子产品，结构中高分子聚合物骨架十分 稳定，可逆交换反应在树脂上可以反复进行，使用寿命长，因此离子交换法已经在工业 中得到广泛的采用【3 1 0 3 1 ，在这一过程中往往需要耗费大量的酸和碱，这不仅增加了生产 成本，而且造成很大的环境污染，越来越不适应现代清洁化生产的需要。 色谱法则显示了良好的发展和应用前景，并且符合了现代清洁化生产的需要。它采 用优质廉价的高效填料，设计合理的色谱柱，及正确选择流程和工艺参数是色谱分离纯 化过程达到低投入、高产出的关键因素，相应的理论研究可深化对制备色谱的认识，指 导实际应用。 1 1 6 混合氨基酸的色谱分离纯化 1 1 6 1 色谱法研究简介 色谱分离是基于混和物在色谱的固定相和流动相之间的分配差异来实现分离的。色 谱柱内填充吸附剂( 固定相) ，在填充状况良好的情况下，当含有溶质的流动相流过床 层并和固定相接触时，相互作用，溶质在两相内在一定时间内，达到动态平衡。对于液 固色谱，溶质在两相内的分配取决于吸附等温模型中的吸附平衡常数，此平衡常数表征 了溶质在一定的温度和浓度下，与固定相( 以及流动相) 的亲和力大小，反映各组分在 固定相中的保留能力。流动相在床层内不断流动，溶质组分在床层固定相内不断地达到 平衡，这种动态的平衡过程，使色谱峰( 或流出曲线) 不断的移动。移动速度除需考虑 流动相的流速外，相平衡常数( 表征亲和力的大小的常数) 是决定性的因素，可以说溶 质组分在床层内滞留时间的长短与亲和力有关，亲和力小的组分，保留时间短，反之亦 然，从而使亲和力不同的溶质组分得到分离。 江南丈学硕士学位论文 1 1 6 2 色谱法分离混合氨基酸的应用 现阶段混合氨基酸的色谱法分离往往仅限于离子色谱，常用的色谱填料绝大多数都 是离子交换树脂【3 4 - 3 6 1 。几乎所有的氨基酸都能与离子交换树脂起交换反应，但因氨基酸 性质如酸碱度、极性和分子量等的不同，离子交换树脂对各种氨基酸的交换吸附能力也 不同。根据所结合的离子选择性的差别，对离子状态的物质进行分离，根据这一原理， 使用各种阳离子和阴离子树脂分离离子状态的氨基酸。 本世纪四十年代初国外就有不少科学工作者进行研究，到现在已取得了不少成果 m “i ，例如：英国曾经成功地利用离子交换层析柱从胱氨酸母液中分离精氨酸、组氨酸 和赖氨酸：前苏联也有以离子交换层析法从胱氨酸母液中提取精氨酸、组氨酸、赖氨酸、 苯丙氨酸和亮氨酸的报道；s m o o r e 以强酸性苯乙烯钠型树脂作为介质，用多种缓冲溶 液( 柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠盐等) 调节p h 值，分离出1 7 种氨基酸，但是洗脱液中 含有盐类物质。y u k i oy o k o y a m a 利用二维梯度离子对色谱分离氨基酸，采用丁基硅胶反 向柱吸附，用包含了不同浓度的十二烷基磺酸盐和高氯酸的水一乙腈系统进行梯度洗 脱，成功地将部分混合氨基酸分开；g a b o rs i m o n 利用温度梯度色谱，用t s l 系统成功地 分离了h i s 、a r g 、l y s 三种氨基酸，并预测利用这个体系能分离大部分氨基酸 j l c a s i l l a s 利用改进的苯乙烯一二乙烯苯树脂通过h p l c 分离氨基酸，并能基本上分离 部分中性氨基酸；n i p p o ni o nk o k a ng a k k a i s h i 上报道了利用离子交换树脂从生物发酵 液中回收氨基酸的研究；s e n om 利用多级流动离子交换床分离氨基酸等。他们的研究较 深，分离的效果也相当好，但他们所用的仪器设备昂贵，对国内生产的直接指导意义不 大。 国内对此报道也不少，刘菊湘等f 4 卵以一系列不同交换容量的聚苯乙烯型强酸性阳离 子交换树脂为色谱填料，研究了丙氨酸和缬氨酸及缬氨酸和亮氨酸在这些树脂柱上的色 谱分离，结果表明树脂的交换容量较低时对中性氨基酸有更好的分离性能。徐宇平等湖 采用0 0 1 x7 ( n h ，) 树脂为色谱填料，实现了味精废液中氨基酸的良好分离。甘林火等【4 7 1 采用国产7 3 2 型阳离子交换树脂为色谱填料，研究了精氨酸的在氯化钠和氯化铵溶液中 的色谱行为，结果表明当盐浓度大于1 o m o l l 时，不适宜采用离子交换色谱来提取精 氨酸。 现有的报道中采用离子交换树脂为色谱填料分离氨基酸的例子很多，但是对分离原 理的研究很少，包括色谱分离机理、色谱作用力等理论性的研究，论文以苯丙氨酸和天 冬氨酸为例，初步研究了二者的分离机理。 ， 1 2 立题依据和研究内容 1 2 1 立压依据与意义 国内阿斯巴甜的生产企业很多，阿斯巴甜是以p h e 和a s p 为原料，通过化学反应而 合成的二肽衍生物，最终通过等电点结晶得到阿斯巴甜产品，结晶后的料液称为阿斯巴 甜母液。母液中含有很大一部分是未参与反应的p h e 和a s p 原料，工业上往往无法完全 提取母液中的p h e 和a s p 。现阶段大部分厂家的处理方法：每吨母液加3 0 k g 盐酸，调节 p h 1 ，通过1 5 0 强酸树脂吸附p h e ( 2 吨母液吨树脂) ，用3 碱洗脱，进行回收，p h e 回收率小于5 0 ，而a s p 则无法利用。另一部分厂家则直接将母液直接排放到环境中， 4 第一覃绪论 造成了很严重污染。以每吨阿斯巴甜产品产生8 吨母液，p h e 回收率5 0 计算，国内每 年损失约7 0 0 0 万元，其中不包括处理过程中造成环境污染的间接损失。 所以采用生产成本低，清洁化的生产工艺提取价格昂贵的p h e 显得十分有意义，这 一生产工艺一旦在工业中得到广泛的应用，会产生良好的社会和经济效益。本课题针对 的是江苏汉光生物工程有限公司2 0 吨天精制阿斯巴甜母液无法利用这一困境展开的， 希望找到一种生产成本低，清洁化的生产工艺提取母液中的p h e 。 1 2 2 主要研究内容 本论文从以下几个方面展开研究： 1 母液中成分的测定以及苯丙氨酸和天冬氨酸分析方法研究和确定； 2 分离方法的选择以及色谱固定相的选择； 3 苯丙氨酸和天冬氨酸色谱分离过程的研究； 4 苯丙氨酸和天冬氨酸吸附等温线的测定。 江南人学硕十学位论文 第二章阿斯巴甜母液成分分析和氨基酸分析方法的确定 2 1 引言 阿斯巴甜( 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯) 是一种以苯丙氨酸( p h e ) 和天冬氨酸( a s p ) 为 原料，通过化学反应而合成的二肽衍生物，最终通过等电点结晶得到阿斯巴甜产品，结 晶后的料液称为阿斯巴甜母液。其中主要含有一定量未参与反应的氨基酸原料，以及合 成过程中所添加的盐等。 氨基酸含量分析有多种方法1 4 8 a 9 ，如茚三酮比色测定法、旋光法、甲醛滴定法、纸 层析法、紫外分光光度法、氨基酸自动分析仪法和高效液相色谱法等。其中氨基酸自动 分析仪和高效液相色谱分析法较为准确，但是前者仅能用于氨基酸的分析，且仪器价格 昂贵。近2 0 年来，随着键合反相色谱的应用及柱前衍生化技术的发展，虽然氨基酸的 分析可以采用高效液相色谱法 5 0 - 5 2 j ，但是柱i j i 衍生化所用的试剂普遍较贵，而且操作非 常麻烦。其中茚三酮比色法、旋光法、甲醛滴定法和纸层析法测量氨基酸的准确度虽然 没有氨基酸自动分析仪法和高效液相色谱分析法高，但操作简便，为广大研究人员所采 用。 为获得快速而简便的氨基酸分析方法，论文研究了紫外分光光度法、紫外和旋光混 合检测两种分析法。 2 2 实验材料 苯丙氨酸生化试剂 天冬氨酸生化试剂 盐酸分析纯 氨水分析纯 电子天平j a l 0 3 精密数显酸度计 p h s 一3 紫外可见分光光度计 7 5 2 n 数字式自动旋光仪 w z z 一1 s 烘箱hs02a 氨基酸分析仪h 8 3 5 - 5 0 2 3 实验部分 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海振兴化工二厂 无锡龙吉利化学试剂有限公司 上海精科天平厂 上海天达仪器有限公司 上海精密仪器有限公司 上海精密仪器有限公司 吴江同里华盛烘箱厂 日本日立公司 2 3 1 阿斯巴甜母液的成分分析 2 3 1 1 母液中固形物含量测定 采用干燥称重法，取干燥坩锅，恒重后称重m ，加入一定量的母液后称重m 。，置于 烘箱中1 0 0 。c 下烘干成粉末，称量至恒重m 2 ，固形物含量计算采用公式2 1 ，计算结果 见表2 - 1 ，得到固形物含量9 9 5 4 ，则水分含量为9 0 0 6 4 。 固形物含量= 娑1 0 0 ( 2 一1 ) 朋一朋 6 第二章阿斯巴甜母液成分分析和氨摹酸分析方法的确定 表2 - 1 固形物含量的测定 2 3 1 2 灰分含量的分析 采用干燥称重法，取干燥坩锅，恒重后称重m ，加入一定量的母液后称重m 。，置于 马福炉中6 0 0 c 下灰化1 0 小时至灰白色，称量至恒重m 2 ，灰分计算采用公式2 - 2 ，计 算结果见表2 - 2 ，得到灰份含量0 2 4 2 。 灰艚量= 等l o 。 沿2 ) 表2 - 2 灰份含量的测定 2 3 1 3 无机盐含量分析 阿斯巴甜合成过程添加了大量的氯化铵，现通过加碱蒸馏法来测定n h 。+ 。 试剂配制： ( 1 ) 甲基红一亚甲基蓝混合指示液称取2 0 0 r a g 甲基红溶于1 0 0 m l 9 5 乙醇；称取1 0 0 m g 亚甲基蓝溶于5 0 m l 9 5 乙醇，两份甲基红溶液与一份亚甲基蓝溶液混合后供用。配 制之后贮入棕色玻璃瓶内。 ( 2 ) 硼酸溶液：称取2 0 9 硼酸溶于水，稀释至1 l 。 ( 3 ) 0 1 m o l l 盐酸标准溶液、4 0 0 9 l 氢氧化钠溶液。 实验方法： 加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸溶液吸收后用盐酸标准溶液滴定至溶液颜色至淡紫色 为终点，记下盐酸标准溶液消耗的体积，根据公式2 3 计算n h 4 + 含量，计算结果见表2 3 。 行m + = c 们f ( 巧一) ( 2 3 ) 其中，：盐酸标准溶液的浓度，m o l l ； v 。：滴定样品吸收液时消耗盐酸的体积，n l l ； v 2 ：滴定空白吸收液时消耗盐酸的体积，i n l 。 表2 - 3 阿斯巴甜母液中n i 。+ 的含量 氯化铵回收率实验： 取阿斯巴甜母液1 0 0 m l ，在母液中添加不同含量的氯化铵，分别进行加碱蒸馏( 方 法同上) ，测定其回收率，结采见表2 - 4 。 7 江南大学硕士学位论文 表2 4 氯化铵网收率实验 2 3 1 4 氨基酸含量的分析 通过氨基酸分析仪精确测定阿斯巴甜母液中氨基酸的种类和含量，为接下来的分离 提供依据。现采用h 8 3 5 5 0 氨基酸分析仪( 日本日立公司) 对母液进行氨基酸的分析。 经测定阿斯巴甜母液中含有两种氨基酸，分别为苯丙氨酸( p h e ) 和天冬氨酸( a s p ) ， 其含量分别为2 2 3 和1 2 8 。 2 3 1 5 阿斯巴甜母液成分分析结果 以上方法对母液成分分析结果见表2 5 ： 表2 - 5 阿斯巴甜母液各个成分含量 成分分析方法含量 水9 0 同形物含蟹干燥称重法 l o 灰分干燥称重法 0 2 固n i t 。c l 加碱蒸馏法 5 形 p h e 氨基酸分析仪 2 3 物 l i s p氨基酸分析仪 1 3 其它物质1 2 氨基酸分析仪测定苯丙氨酸p h e 和天冬氨酸a s p 虽然非常准确，但操作繁琐，而且 价格昂贵，所以必须找到另外的氨基酸分析方法，在测定苯丙氨酸和天冬氨酸过程中既 准确又方便。论文研究了紫外分光光度法、紫外和旋光混合检测两种分析法。 2 3 2 苯丙氩酸和天冬氨酸的紫外检测 2 3 2 1 苯丙氨酸和天冬氨酸的紫外扫描 通过紫外扫描，希望确定p h e 和a s p 最佳检测波长( 图2 - 1 ，图2 2 ) ，通过绘制p h e 和a s p 在最佳检测波长下浓度对应吸光值的标准曲线，用比色法准确定量p h e 和a s p 。 由扫描图可知：p h e 的最佳吸收波长为2 5 7 n m ，天冬氨酸的最佳吸收波长为2 0 0 h m 。 图2 1p h e 在各个波长下的紫外吸光值图2 2a s p 在各个波长下的紫外吸光值 8 第二章网斯巴甜母液成分分析和氨摹酸分析方法的确定 p h e 的最佳吸收波长为2 5 7 n m ，a s p 的最佳吸收波长为2 0 0 n m 。当采用紫外法测定氨 基酸含量时，一般选择波长大于2 1 0 n m ，由于2 1 0 h m 下，采用紫外分光光度法测得的氨 基酸结果可重复性和稳定性相对较差。所以选择2 3 0 h m 下测定a s p 浓度。 由扫描图a s p 在p h e 的最大吸收波长2 5 7 n m 下，没有紫外吸收，在选择2 5 7 n m 下能 准确定量混合氨基酸中的p h e 。将p h e 浓度换算到 = 2 3 0 n m 下p h e 的吸光值，将样品 在九= 2 3 0 n m 下所测得的总吸光值减去p h e 的吸光值，转换得到a s p 浓度。 2 3 2 2 苯丙氨酸和天冬氨酸的浓度蹶光值标准曲线 ( 1 ) 取9 个2 5 m l 的容量瓶分别配制p h e 浓度为0 0 5 、0 1 、0 2 、0 5 、0 7 5 、1 0 、 1 2 5 、1 5 、2 o g l ，摇匀，在 = 2 5 7 n m 处测定吸光值，得到的吸光值分别为：0 0 6 0 、 0 1 1 1 、0 2 1 1 、0 4 8 9 、0 7 2 8 、0 9 4 8 、1 1 8 0 、1 3 8 4 和1 7 8 0 。 ( 2 ) 用同样的方法配制浓度分别为0 2 、0 5 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、 8 0 、1 0 o g l ，在 = 2 3 0 n t o 测定其吸光值分别为：0 。0 3 5 、0 0 9 2 、0 1 8 7 、0 3 7 3 、0 5 7 4 、 0 7 6 0 、0 9 3 9 、1 1 0 4 、1 2 6 1 、1 4 4 0 和1 7 8 1 。 在以p h e 浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线( 图2 3 ，图2 - 4 ) 。 图2 - 3p h e 浓度一吸光值曲线( = 2 5 7 n m )图2 - 4p h e 浓度一吸光值曲线( = 2 3 0 n t o ) 在 = 2 5 7 m n ，p h e 浓度和吸光值在o g l 2 9 l 范围内程良好的线性关系，相关系 数r = o 9 9 8 6 ，在 = 2 3 0 n m ，p h e 浓度和吸光值在o g l l o g l 范围内程良好的线性关 系，相关系数r = o 9 9 9 ，可作为p h e 浓度检测的标准曲线。 ( 3 ) 取9 个2 5 m l 的容量瓶分别配制a s p 浓度为0 5 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、 6 o 、8 0 、1 0 o g l ，摇匀，在 = 2 3 0 n m 处测定吸光值，吸光值分别为：0 0 6 4 、0 1 1 8 、 0 2 1 2 、0 3 1 4 、0 4 2 1 、0 5 2 9 、0 8 3 2 和1 0 0 8 ，以a s p 浓度为横坐标，吸光值为纵坐 标绘制标准曲线( 图2 5 ) 。 图2 - 5a s p 浓度一吸光值曲线( = 2 3 0 m a ) 9 江南大学硕士学位论文 a s p 浓度和吸光值在o l o g l 范围内程良好的线性关系，相关系数r = o 9 9 9 2 ，可 作为a s p 浓度的检测标准曲线。 2 3 2 3 苯丙氨酸和天冬氨酸吸光值加和性研究 取2 0 个2 5 m l 的容量瓶分别配制一系列不同含量的p h e 和a s p ，摇匀，分两组进行 加和研究，比较其理论值和实测值，其结果见表2 - 6 ，2 - 7 ： 表2 6 苯丙氨酸和天冬氨酸紫外加和性研究l 由表2 6 可知： 1 a s p 和p h e 的实际