（动物学专业论文）辅酶q10对大鼠再生肝细胞线粒体结构与功能的影响.pdf

摘要本课题研究了辅酶q 加( c o e n z y m eq 1 0 ，c o q l o ) 对大鼠再生肝细胞线粒体结构与功能的影响，为探究c o q l o 对再生肝作用机制及线粒体在肝再生中的作用提供资料。实验选用雌性s p r a g u e - d a w l e y 大鼠，每天灌胃不同剂量的c o q i o ，分别于部分肝切除( p a r t i a l h e p a t e c t o m y , p h ) 后3 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、1 2 0 h 、1 6 8h 取再生肝组织，用常规组织学技术、透射电镜技术、氧电极法、分光光度计法分别研究了c o q i o对再生肝组织结构、再生肝细胞线粒体超微结构、再生肝细胞线粒体氧化磷酸化功能和再生肝细胞线粒体膜通透性转换( m i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n , m t ) 的影响。结果发现：1 ) 6 0 m g l 【g c 0 0 1 0 处理组比对照组的再生肝组织增生旺盛，尤其在p h 后6 h 、1 2 h 、2 4h 、4 8h 时与对照组相比有明显变化，而其它时间点变化不明显。2 ) 与对照组相比，c 0 0 1 0 处理组再生肝线粒体结构完整性强，主要体现在肝再生早期和中期。c o q l o 处理在p h 后6h 、1 2h ，2 4 h 、4 8h 对线粒体作用明显，尤其是6 0 m g k gc o q l o 处理在p h 后2 4h 、4 8h 作用最显著。p h 7 2h 以后线粒体结构逐渐恢复正常，各组之间无明显差异。3 ) p h 后不同时间，各组线粒体氧化磷酸化功能变化趋势基本类似；在6h 、1 2h 、2 4h 、4 8h ，c o q l o 处理组的线粒体氧化磷酸化功能高于对照组，且随剂量增加而增高，但6 m g k g c o q l o 处理组仅在4 8 h 与对照组相比有极显著差异( p 0 0 1 ) ；而6 0 m g k gc o o l o 处理组分别在6h 、1 2h 、4 8h 与对照组相比有极显著差异( p 0 0 1 ) ，2 4h 时有显著性差异( p 0 0 5 ) 。4 ) c o q l o 处理组和对照组的线粒体m p t 在p h 后不同时间的变化趋势也基本一致；在肝再生中期，c o q l o 处理组再生肝m p t 明显低于对照组，其中6 m g k g c o q l 0 处理组在4 8h 与对照组比较明显变小，有显著性差异( p 0 0 5 ) ，而6 0m g k gc o q l 0 处理组分别在6h 、1 2h 、2 4h 、4 8h 与对照组相比均有极显著差异( p 0 0 5 ) 。加入5 0 mc a c | 2 后，在p h 后1 2h 、2 4h 、4 8h 时6 0m g k g c o q l 0 处理组与对照组比较，m p t 下降幅度明显变小，但是6 m g k g c o o l 0 处理组与对照组相比变化不大。结论：一定剂量的c o q l o 可以促进大鼠再生肝细胞增殖，促进线粒体结构完整性的恢复，对线粒体氧化磷酸化功能有增强作用，并可以减少m p t 的发生，该作用主要体现在肝再生中期( 再生肝细胞增殖期) 。关键词：辅酶q 1 0 ，肝再生，线粒体，氧化磷酸化，线粒体膜通透性转换i ia b s t ra c te f f e c t so fc o e n z y m eq l o ( c o q l 0 ) o nm i t o c h o n d r i n ls t r u c t u r ea n dm i t u c h o n d r i a lf u n c t i o no fr e g e n e r a t i n gh e p a t o c y t e sj nr a t sw e r es t u d i e di nt h i sp a p e r , i no r d e rt op r o v i d ee x p e r i m e n t a lb a s i sf o rc l a r i f y i n g t h e m e c h a n i s m o f c - o q i o o n f i v e rr e g e n e r a t i o n a n d t h er o l e o f m i t u c h o n d r i a i n l i v e rr e g e n e r a t i o n -s p r a g n e - d a w l e yr a t sw e r fa d m i n i s t e r e dc o o l o d a i l yv i ag a s t r i ci n f u s i o n t h el i v e r sw e r eo b t a i n e d3k6h ，1 2h ，2 4h ，4 8h ，7 2h ，1 2 0h ，1 6 8ha f t e r7 0 p a r d a lh e p a t e c t o m y ( p h ) t i s s u es t r u c t u r eo fr e g e n e r a t i n gl i v e r sw e r eo b s e r v e dw i t hr o u t i n eh i s t o l o g i c a lm e t h o d ；t h em i t o c h o n d r a lu l t r a s t r n c t u r eo fr e g e n e r a t i n gh e p a t o c y t e sw e r es t u d i e db yu s m gt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yt e c h n i q u e ；t h em i t o c h o n d r i s lo x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o no fr e g e n e r a t i n gh e p a t o c y t e sw e r ed e t e r m i n e db yp o l a r o g r a p h i co x y g e ne l e c t r o d e ；t h em i t u c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n ( m p t ) o fr e g e n e r a t i n gh e p a t o c y t e sw e r ed e t e r m i n e db yu s i n gs p e c t r o p h o m m e t r y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：1 、t h er e g e n e r a t i n gh e p a t o c y t e sw e r em o r ep r o l i f e r a t i v ei l l6 0 m g k gc o q l o - t r e a t e dg r o u pc o m p a r e dt oc o n t r o lg r o u p 。e s p e c i a l l ya t6h ，1 2l i ，2 4h ，4 8ha f t e rp h ，w h i l ew a sn oo b v i o u sc h a n g ea to t h e rt i m e s 2 1t h ei n t e g r i t yo fm i t o c h o n d r i a ls t r u c t u r ew e r ee n h a n c e di nt h eg r o u pt r e a t e dw i t hc o q l 0 , w h i c hw a sm a i n l ye x p r e s s e da te a r l ys t a g ea n di n t e r m e d i a t es t a g ed u r i n gl i v e rr e g e n e r a t i o n o b v i o u se f f e c to fc o q t oo nr e g e n e r a t i n gh e p a t o c y t e sw a sf o u n da t6h ，1 2h ，2 4 h ，4 8ha f t e rp h ，a n dt h eg r o u pt r e a t e dw i t hc o q m a tad o s eo f6 0 m g k gc h a n g e dm o s to b v i o u s l ya t2 4 h ，4 8hp o s t p h m o s tm i t o c h o n d r i ar e c o v e r e dg r a d u a l l ya t7 2ha f t e rp ha n dl a t e r , w h e nt h e r ew a sn os i g n i f i c a n c ed i f f e r e n c ea m o n gt h eg r o u p s 3 、1 1 站v a r i a t i o nt r e n do fm i t o c h o n d r i a lo x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o ni ne v e r yg r o u pr a ns i m i l a ra ta l lt i m e sa f t e rp i lt h em i t n e h o n d r i a lo x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o no f r e g e n e r a t i n gh e p a t o c y t e sw e r eh i g h e ra t6h ，1 2h ，2 4h ，4 8ha f t e rp hi nc o o i ot r e a t e dg r o u pt h a ni nt h ec o n t r o lg r o u p , a n dm o r eo b v i o u sw i t ht h ed o s ei n c r e a s i n g t h e r ew a sh i g h l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c ea t4 8ha f t e rp hb e t w e e nt h eg r o u pt r e a t e dw i t hc o q l 0a tad o s eo f6 m g k ga n dt h ec o n t r o lg r o u p ( p 0 0 1 ) ；h 运叫ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a sf o u n db e t w e e nt h et h e6 0 m g k gc o q l 0t r e a t e dg r o u pa n dt h ec o n t r o lg r o u pa t6h ，1 2h ，4 8hp e s t - p h 伊o 0 1 ) ，w h i l et h e r ew a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h e ma t2 4ha f t e rp h ( p ( o 0 5 x4 ) t h ev a r i a t i o nt r e n do fm i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n ( m p t ) i ne v e r yg r o u pr a ns i m i l a ra l s oa ta l lt i m e sa f t e rp h t h em i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n ( m p t ) o fr e g e n e r a t i n gh e p a t o c y t e sw e r ei l lp ip 1 rr c rr o ss m a cs o du c p l2v b 3v b 61 2v c v d a cp h o s p h o r i ca c i dp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o nr e s p i r a t o r yc o n t r o lr a t i or e a c t i v eo x y g e ns p e c i e ss e c o n dm i t o c h o n d r i a ld e r i v e da c t i v a t o ro fc a s p a s es u p e r o x i d ed i s m u t a s eu n c o u # i n gp r o t e i n1v i t m i nb ev i t m i n1 3 3v i t m i nb 6v i t m i nb 1 2v i t m i n cv o l t a g e d e p e n d e n ta n i o nc h a n n e l磷酸膜通透性转换呼吸控制比活性氧第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂超氧化物歧化酶解耦联蛋白1维生素b 2维生素b 3维生素b 6维生素b 1 2维生素c电压依赖阴离子通道独创性声明独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究乍及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河币范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作司志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢签名：呈珐篓日期：! z ：墨生关于论文使用授权的说明本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有仪保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)签名：童主刍垡导师签名：餮丛墼日期：生z 。丞! !1 前言辅酶q 。o 对大鼠再生肝细胞线粒体结构与功能的影响1 前言1 1 辅酶q 1 0 研究概况辅酶q 1 0 ( y m eq l o ，c o q , o ) 别名癸烯醌、泛醌( u b i q u i n o n e ) ，化学名称为：2 , 3 二甲氧基5 甲基6 癸异戊烯基苯醌，分子式c 5 9 h 9 0 0 4 ，分子质量8 6 3 3 6 ，其结构式为【1 , 2 1 ：a 嚆i( 陋c a r ) 柏hc o q 。o 是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，具有促进氧化磷酸化反应和保护生物膜结构完整性的功能，在体内呼吸链中质子移位及电子传递中起重要作用，是细胞呼吸和细胞代谢的激活剂，也是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂p j 。1 9 5 7 年，英国m o r t o n 教授从患有维生素a 缺乏症的大鼠肝脏中分离得至u c o q l 0 ，并称之为泛醌，意即广泛存在的醌。1 9 5 8 年，f o l k e r s 等不仅阐明t c o q l o 的化学结构，还进行了c o q l o 的化学全合成，并首次通过发酵手段获得了c o q l o 。1 9 7 2 年，意大利l i t t a r r u等发表了心脏病患者缺乏c o q l o 的研究报告。到了7 0 年代中期，m i t c h e l l 用化学渗透假说理论，揭示了生物体内能量的转换以及c o q 。o 在能量转换体系中重要的质子传递作用。8 0 年代初，随着瑞典e r n s t e r 揭示出c o q l o 的抗氧化作用和自由基清除作用，特别是日本实现了批量生产纯品c o q l o 的工业技术，极大地满足了大量临床试验对c o q i o 的需求，有力地促进了c o q l o 临床研究的进展。同时由于色谱分析手段的应用，实现了用高效液相色谱仪直接检测血液和组织中的c o q l o 含量，使得c o q l o 的临床试验在数量和规模上都得到了迅猛发展。c o q l o 至少是3 种线粒体酶( 复合体l 、i i 和1 1 1 ) 的辅酶，生物活性主要来自于其醌【基金项h 】河南省科技厅科技攻关项k ( 0 6 2 4 4 1 0 1 0 9 )m 。啦。同n1 前言环的氧化还原特性和其侧链的理化性质。其醌环在氧化呼吸链中起传递电子和质子的重要作用。这种作用不仅是所有生命形式必不可少的，而且还是形成a t p 的关键。而a t p是机体能量的主要储存形式，也是所有细胞功能赖以正常发挥的重要基础。c o q i o 最显著的特点是没有毒副作用。w a n g 笔：【4 】做过c o q l o 急性、亚急性和慢性毒性试验，对被检查的一般症状、血液学、血液生化等1 4 项指标进行检测，解剖观察心、肝、肺、脾、肾等器官组织学变化，均未发现c o q l o 引起的病理变化和毒性反应。在国内外多年的临床研究报告中，尚未发现因使用c o q 。o 而出现明显毒副反应的病例。c o q l o 不是异体物质，它是细胞自身产生的天然抗氧化剂和细胞代谢激活剂，对人体无害 5 1 。1 2g o q l o 缺乏及其原因研究表明：无论是人还是动物，大多数疾病都会使体 = i j c o q 。o 的含量显著下降f 甜1 1 。c o q 。o 缺乏主要由于摄入量不足、体内生物合成受阻、身体消耗过度等三个因素。处于过度疲劳、代谢亢奋、急性休克等状态时，体内c 0 0 1 0 加速消耗将导致血c o q l o 水平下降。研究发现，减少c o q 。o 摄入，会引发慢性营养不良或萎靡消瘦。此外，当c 0 0 1 0被机体用作自由基清除剂时，也会导致体内c o q l o 缺乏。研究表明，机体内c o q l o 主要来源于自身生物合成1 1 2 a 3 1 。这是一个复杂的1 7 步生物合成反应，至少需要7 种维生素( v b 2 、v b 3 、v b 6 、叶酸、v b l 2 、v c 和泛酸) 和若干种微量元素的参与，易受各种因素的影响。而日常生活中人们普遍存在营养摄入不尽合理的情况，这也间接妨碍了c o q l o 的生物合成。分析认为。通常所说的体内c o q l o 正常含量水平，实际上未达最佳标准。c o q l o 和胆固醇的生物合成途径有一部分是相同的，用于治疗血胆固醇偏高的b 一羟- b 甲戊二酰c 0 a j 丕原酶抑制剂( b h y d r o x y 一目一m e t h y l g l u t a r y l - c o ar e d u c t a s el n h i b i t o r s ，h m g c o a r i ) ，在阻断胆固醇生物合成的同时，也阻断了c o o l o 的生物合成。在使用h m g c o a r i 的过程中，不仅降低了血胆固醇，同时也降低了血c o q l o 水平。在临床治疗心脏病患者时这种现象尤其明显。据报道，h m g c o a r i 这一严重的副作用可以通过口服补给c o o l o 加以解决。目前研究表明，外源补充c o q l o 可以增加体内c o q l o 含量【1 4 】，补充c o q l 0 有益于治疗心绞痛、充血性心力衰竭、脑血管疾病、口腔疾病等各种疾病降1 1 j 。一股认为，凡代谢旺盛的器官组织，均对c o q 。o 缺乏高度敏感，c o q - o 是所有类型细胞发挥j 下常功能不可或1 前言缺的基础。1 3c o q l o 作用机制研究研究表明，外源c 0 0 1 0 在体内的主要作用靶点是线粒体，能明显降低线粒体氧耗，维持线粒体结构的稳定性，防止线粒体溶解；具有直接保护细胞膜，稳定细胞内外环境的作用，维持钙离子通道完整f 4 j ：能补充病变组织所缺乏的c o q t 0 1 1 4 1 5 l 。外源c o q l o 可以促进线粒体a t i 合成1 1 6 1 。线粒体a t p 合成依赖于电子传递建立的跨膜电化学势能。c o q l o 是线粒体电子传递所必需的载体，c o o i o 传递电子同时泵出质子。c o q l o 传递电子和泵出质子的过程是一个循环过程，即q 循环【切。在循环过程中，每传递一个电子就跨膜输进两个质子。根据动力学原理，代谢通路中的一种可扩散的中间介质可能构成一个限速步骤。氧化呼吸链中的限速步骤是细胞色素b c l 埘，c o q l o 作为底物可能与限速步骤有关。l e n a x等【1 9 j 利用重新构建的六种不同c o q l o 水平的线粒体膜，分别计算出n a d h 细胞色素c 还原酶的平均k m 为2 4n m o l m g ，琥珀酸细胞色素c 还原酶的平均k 。是0 2 4n m o l m g 。在n a d h氧化中c o o 。o 高k 。值，提示线粒体内膜上结合外源性c o q l o 可以增强电子传递的能力。线粒体c o o l o 水平低下，补充后线粒体功能会恢复到正常水平；线粒体c o q l o 水平正常，补充后线粒体电子传递能力可能会超出正常生理水平。研究发现，线粒体结合外源性c o q l 0 会增加呼吸速率，无论由于c o o l 0 含量减少造成的，还是由于其它酶活性降低造成的电子传递速率降低均可得到改善f 2 0 , 2 n 。因此，在一个能量需求增加、能量供应相对不足的状态，或二者同时存在的状态都将会增加线粒体对c o q 。o 的需求。这是外源c o q l o 改善组织功能和抗损伤理论基础之一。辅酶o l o 有氧化型( c o o l o ) 和还原型( c o q l 0 1 1 2 ) 两种存在状态。研究发现，只有c o q l o h 2 具有抗氧化作用【2 2 1 。c o q 。o 啦在体内可以清除多种氧化诱导剂( 如高亚氯酸盐、脂质氧化酶、过渡金属等) 诱导产生的自由基，如氧中心自由基( o x y g e nc e n t e r e dr a d i c a l s ) 、碳中心自由基( c a r b o nc e n t e r e dr a d i c a l s ) 、单线态氧等。c o q l o h 2 在体内能减少硫巴比妥反应底物( t b r a s ) 和共轭双烯等氧化产物的产生。实验证明，人血浆c o o l o h 2 浓度增高可以提高血清s o d 水平。c 0 0 1 0 的抗氧化作用，再次验证了自由基理论，并清楚地揭示了慢性衰老及相关的退行性病变的机制。流行病学的研究表明，人体在2 0岁以后，体内c o q ，o 的水平呈逐渐下降趋势。31 前言c o q t 避抗氧化作用的机制尚不很明确。目前大部分的研究结果认为其存在两种可能方式【2 3 侧。c d q l 0 h 2 的抗氧化作用是通过终止自由基链式反应，从而减少自由基对脂质、蛋白质等的氧化损伤。f r e i 掣卅利用脂溶性自由基启动剂在脂质体膜上的实验，推断c o q l o h 2 终止酰基自由基链式反应的机制如下：q l o h 2 + l o o 。q 1 0 + h + + l o o h( 1 )2 q l o - + 2 h + q l o h 24 - 0 1 0( 2 )0 1 0 + h4 - l 0 0 叶o 1 0 4 - l o o h 。( 3 )反应( 1 ) - ( 3 ) 是自由基俘获，但随后c o q l 0 h 2 和半泛醌q 1 0 咱由基也可能发生下反应：q 1 0 + 0 2 q 1 0 。+ 2h + + q 2 。( 4 )q 1 0 4 - 0 2 q 1 0 + q 2 ( 5 )然后超氧自由基0 1 0 可进一步氧化c o q l o h 2q 1 0 h 2 + 0 2 。斗q 2 。+ h 2 0 2( 6 )反应( 4 ) ( 6 ) 虽然不能俘获自由基链式反应中产生的自由基，但能通过被动消耗c o o l o h 2 降低0 2 。的量，减少其攻击脂质引发新的氧自由基爆发。通过计算延滞时间( 1 e n g t ho f l a gt i m e ) ( t m i n ) 推断每分子c o o l o h 2 可以清除1 1 1 8 个自由基。c o q l o 抗氧化作用的第二种可能机制是c o q l o h 2 通过与维生素e 协同抗氧化而起作用。有学者认为，c o o ，o h 2 可能是通过还原维生素e 在清除自由基时产生的a 生育酚酰基自由基，节约和再生维生素e 而起抗氧化作用四, 2 9 1 。l a s s 掣删在研究骨骼肌线粒体c o q l o和a t o h ：浓度与q 2 产生的关系时发现，q 2 1 的产生速率与a - t o h 浓度有关，而与c o q l o含量无关，但c o q l o 浓度增加可以导致线粒体a - t o h 含量的升高。而且研究发现1 2 5 1 ，小鼠补充c o q l o 可显著提高血浆a t o h 含量，线粒体a - t o h 浓度也显著提高。这间接证明c o q - o 是通过维生素e 起作用的观点。也有学者认为，c o q l o h 2 能单独发挥抗氧化作用。c o q l o h 2 在维生素e 和硒缺乏状态下仍有很强的抗氧化能力1 2 6 1 ，体内通过诱导表达有关内源性c o q l o 产生的酶和增加酶的活性而提高内源性c o q l o 的产生。另外，研究发现补充维生素e 而不补充c o q l 0 并不能降低l d l 在体外的氧化易感性f 3 l l 。在应用大肠杆菌( e c o l dv b i c v 基因缺失模型的实验中发现【3 2 1 ，v b i c v 基因缺失型大肠杆菌的胞浆膜q 2 。产生的速率是野生型的2 倍，大量q 2 7在胞浆膜上聚集，h 2 0 2 也显著高于野生型。t o m a s e t t i 等p 3 l 在探讨c o q l o 是否影响由h 2 0 2诱导的淋巴细胞d n a 损伤时发现，h 2 0 2 能导致c o q l o 水平急剧下降，而维生素e 含量不41 前言交，3 0m i n 后，c o o l o 充裕组的d n a 氧化损伤率远远低于对照组，且与维生素e 浓度无关。最近研究发现氧化型c o q 是解偶联蛋白1 ( u n c o u p l i n gp r o t e i n , u c p l ) 的必需协同作用因子 2 9 1 。u c p l 可使线粒体质子回漏增加，a t p 合成减少，同时也减少了活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 的产生，而还原型c o q 则无此功能l 矧。这一发现提示c o q 状态在调控线粒体r o s 代谢中起着重要作用，线粒体r o s 产生增多，线粒体膜c o q 被氧化，启动u c p l 转运质子进入线粒体内膜，跨膜电位下降，r o s 产生减少。1 4 大鼠肝再生研究概况正常的肝组织高度分化p 5 l ，大部分处于静止期1 3 蝴，仅有0 0 0 1 2 0 0 1 细胞进行有丝分裂p s i 。当肝脏受到化学刺激、药物刺激或部分肝切除( p a r t i a lh e p a t e c t o m y ，p h ) 后，残肝细胞会迅速增殖1 3 9 】补偿丢失的肝组织，这个过程称为肝再生( 1 i v e rr e g e n e r a t i o n l r )【加1 。通常根据肝再生的生理活动将肝再生过程分为启动( p h 后0 5 4h ) 、g d g l 过渡( p h 后4 6 h ) 、细胞增殖( p h 后6 6 6 h ) 、细胞分化和结构功能重建( p h 后6 6 1 4 4h ) 等四个阶段，涉及细胞激活、去分化、增殖及其调控、再分化、组织结构和功能重建等生理生化过程【4 2 】。目前研究表明肝再生是一个复杂性的、网络化的、受到严格精细调控的过程【3 9 , 4 2 - 4 s 1 ，受包括能量代谢、细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 在内的多种因素调控 , s o s o l 。研究肝再生分子机理必将对肝脏移植、创伤、各种肝病及肝肿瘤诊治具有重要意义。在大鼠肝再生过程中，肝干细胞在肝再生中不起主要作用，并且残肝细胞在再生的同时，仍保留着肝脏解毒、血浆蛋白合成、葡萄糖调控等功能，维持身体所需的稳态刚。余留的肝细胞( 即未丢失的肝细胞和未死亡的肝细胞，其中9 9 9 9 处于静止期) 在肝损伤后3 0m i n 即被激活，启动进入细胞周期，2 4h 时肝细胞处于去分化期，到2 4h ，肝细胞的d n a 处于高峰；7 2h 时肝细胞增殖基本完成，细胞开始再分化，形成各种功能的肝细胞；从肝损伤后9 6h 起，肝脏进行结构和功能重建；直到l “h ( 6 天) ，肝再生基本完成，肝脏恢复到原来的大小和功能【5 2 - 5 9 。肝再生过程必然涉及到大量的功能基因和大量蛋白质，在肝再生中改变表达、诱导表达的基因和蛋白质将更多，因此再生肝又是进行基因组学和蛋白质组学的好材料。肝脏是人体重要器官，与肝脏有关的疾病多达数百种，其中很多与细胞分化调控异常有关，因此，研究肝细胞分化调控机理有重要的临床意义。1 前言1 5 线粒体与肝再生线粒体是细胞内最敏感的细胞器，其变化最能反映整个细胞的状态，对于观察内外界因素的作用来说是一个比较理想的研究对象。线粒体基因的高突变率引起人们探索其在细胞衰老、凋亡、转化中的作用。研究表明，肝再生时线粒体形态发生了较大的变化，表现为肿胀、增大及聚集等i 删，还有研究发现肝再生时细胞能量需求增加，线粒体氧化磷酸化功能增强【6 1 6 2 l ，而另外研究发现肝再生早期线粒体a t p 合成酶活性减低【6 3 1 ，呼吸功能下降例。线粒体在肝再生中的作用，值得深入研究。研究表明，大鼠肝再生时产生一定剂量的r o s ，对细胞产生了氧化损伤，影响了细胞的增殖、分化1 6 4 - 6 7 1 。r o s 是生物体内一种普遍存在的生物活性物质。离体细胞研究表明，r o s 在低浓度下可以作为信号分子，调节细胞的增殖、分化；高剂量时促进细胞凋亡。目前关于r o s 的研究主要集中在离体细胞，其在在体组织细胞中的作用尚不清楚。r o s 在肝再生中的作用，值得深入研究。线粒体是细胞内r o s 产生的主要场所。线粒体电子传递链( m i t o c h o n d r i a le l e c t r o nt r a n s p o r tc h a i n ，m e t c ) 是机体内r o s 的主要来源，其产生的r o s 占机体r o s 总量的9 0 以上i 嗍。研究发现，肝再生早期肝线粒体氧化磷酸化功能下降时，肝线粒体内r o s显著升高，g s h 含量下降，而当肝线粒体氧化磷酸化功能恢复上升时，r o s 则逐步下降，两者呈现明显的消长关系l 硎。这表明r o s 与肝再生时线粒体功能的变化密切相关。而肝再生早期r o s 升高，显示r o s 有可能是肝再生启动的重要因素。线粒体是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释能的场所，其主要功能是进行氧化磷酸化，合成a t p ，为细胞生命活动提供直接能量。细胞内线粒体存在的状况直接反映细胞对能量的需要。目前对肝再生的启动和终止机制还不清楚。而能量代谢调控始终是肝细胞再生过程中的重要环节 5 0 , 7 0 , 7 。研究表明，肝再生过程与细胞能量供应密切相关，用于合成细胞各种组分的能量需求增加1 7 l j 。正常情况下细胞能量主要由线粒体氧体磷酸化提供。研究发现肝细胞再生过程中尤其是再生早期，肝糖原急剧消耗，线粒体数量增多，线粒体氧化磷酸化功能发生改变。线粒体早期的变化可能是启动肝细胞进入分裂周期的一个潜在的调节因素【7 2 1 。细胞增殖与细胞凋亡是细胞周期的主流事件。在细胞周期调控中，细胞凋亡同样重要。细胞凋亡又称程序性细胞凋亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，p c d ) f 7 3 , 7 4 1 ，是受多种因素诱导、众多基因和蛋白质参与、消耗能量的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡在机体正常1 前言发育和细胞、组织平衡中起重要作用i 7 5 j 7 1 ，也与许多疾病有关，如细胞过多凋亡引起的阿尔兹海默病f 7 8 t 7 哪和帕金森氏症i 鼬l 、细胞过多凋亡或不凋亡引起的肿瘤1 8 1 捌】等。线粒体通过释放c y t c 、d i a b l o 、a i f 、e n d o g 等生物活性物质促进细胞凋亡【器踟l 。线粒体细胞凋亡通路分为依赖于c a s p a s e 和不依赖c a s p a s e 两种【9 1 1 ，其中依赖于c a s p a s e 途径又可分为通过d n a 片断化引起细胞凋亡和不通过d n a 片断化引起细胞凋亡两条途径；不依赖c a s p a s e 途径也可分为通过d n a 片断化引起细胞凋亡( e n d o g ) 和不通过d n a片断化引起细胞凋亡( a i f ) 两条途径l 酊明。研究表明，细胞凋亡调控在肝再生中发挥重要作用 4 9 , 9 2 1 。研究发现，大鼠肝再生期间，各时间点凋亡细胞所占比例均大于对照组( 有显著性差异) 。在p h 后6 1 2h ，凋亡细胞所占比例值成倍增加；2 4h 时达峰值；3 6h 又开始下降；4 8h 趋于稳定；7 2h后降至与对照组相比差异无显著性【9 3 1 。提示细胞凋亡在组织增生早期表现明显，4 8 h 后，机体己主要通过其它途径来对细胞增殖进行抑制性调控，直至肝再生结束。1 。6c 0 0 1 0 与肝再生。目前，c o q l o 已经作为药物应用于充血性心力衰竭、肿瘤、帕金森病等疾病治疗和预防中，但其对肝作用机理尚不清楚。肝脏是哺乳动物的重要器官。大鼠再生肝模型是研究细胞激活、去分化、增殖及增殖调控、再分化、组织器官结构和功能重建的分子机理、应激反应、生理生化调控的最佳模型之一。研究表明，抗氧化剂可以减轻或消除肝再生过程中r o s 的影响，促进r o s的消解 6 4 - 6 7 1 。c o q l o 是线粒体电子传递链中的重要成员，本身是一种重要的抗氧化剂，而m e t c又是r o s 产生的主要部位。理论上说外源性c o q l o 既可以促进r o s 产生，也可以降低r o s 水平。研究表明：肝再生过程中c o q l o 呈现显著下降，供应不足1 9 4 1 ；c o o l o 处理可以降低再生肝细胞受r o s 氧化损伤的程度，降低组织r o s 水平，并且显著促进d n a 合成例；c 0 0 1 0 处理对正常肝组织r o s 水平、线粒体氧化损伤程度没有明显影响1 9 5 , 9 6 1 。研究发现，外源c o o 。o 在体内的主要作用靶点是线粒体【4 6 1 5 1 。但是c o q l o 对大鼠再生肝线粒体的作用尚不清楚。线粒体的主要功能是氧化磷酸化。目前衡量线粒体结构完整与否及氧化磷酸化偶联1 前言程度的指标主要有线粒体呼吸控制比( r e s p i r a t o r yc o n t r o lr a t i o ，r c r ) 和a d p o 。r c r ，也有人称为呼吸调节比，是表征线粒体结构、功能完整性及氧化磷酸化效率的灵敏指标，其定义为：加入a d p 时( 态) 的呼吸速率与a d p 耗竭后( i v 态) 的呼吸速率之比。线粒体的呼吸耗氧偶联着a d p 与p i 合成a t p 的磷酸化反应，a d p o 值是指线粒体每吸收一克原子氧的同时，生成a t p 的克分子数的比值，它反映线粒体的能量转化效率。一般认为，r c r 比a d p o 比值更能反映线粒体功能的完整性和氧化磷酸化的效率。c o q l o 对大鼠再生肝r c r 的影响，尚未见有报道。研究表明，线粒体功能改变与细胞凋亡密切相关，包括释放促凋亡因子、活性氧过度生成、能量产生障碍、胞浆内钙失衡等。研究发现，线粒体膜通透性转换( m i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n ，m p t ) 的发生在细胞凋亡中的作用非常关剥9 7 , 9 8 | ，肝细胞m p t 是肝细胞发生凋亡或坏死的关键i 叫。m p t 的发生是由一种非特异性孔道的开放引起的，这种孔被称为：线粒体膜通透性转换孔( m i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e ，m p l e或简称为p t 孔) 。正常情况下，p t 孔容许分子量 1 5 0 0 的分子非选择性的扩散入线粒体内膜，造成了线粒体水肿，线粒体膜间隙的蛋白( 如c y t c 和其它在细胞凋亡中起重要作用的蛋白)释放，氧化磷酸化解耦联，a t p 的合成远大于分解【1 0 1 ，嗍，在这种情况下，细胞内a t p 浓度迅速下降，破坏了离子和代谢物的平衡，激活了磷脂酶、核酸酶、蛋白酶等降解酶，这足以启动细胞凋亡过程的发生。m p t p 开放的关键因素是线粒体c a 2 超载( 即线粒体基质内c a 2 + 浓度大幅度升高) ，尤其是伴随着氧化应激、腺嘌呤核苷酸耗竭、磷酸盐浓度升高和线粒体膜去极化等【1 删。这些条件恰恰在肝再生的过程中均会出现，m p t p 的开放是可能是再生肝细胞从可逆向不可逆转变的关键。大鼠大部分肝切除后，再生肝线粒体最明显的变化就是膜通透性转换( p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o n ，it ) 变化，而线粒体氧化磷酸化、r o s 产生、细胞增生和凋亡诱导等多与m p t 有关。c o q l 0 对大鼠再生肝m p t变化的影响，值得深入研究。为此，本课题以大鼠再生肝为材料，系统研究了c o q l o 对大鼠再生肝组织结构、再生肝细胞线粒体结构、再生肝细胞线粒体氧化磷酸化功能以及再生肝细胞m p t 变化规律的影响，为阐明c o o 。对再生肝作用机制、线粒体在肝再生中的作用、线粒体通透性81 前言变化的机理以及其与肝再生过程、尤其是肝再生启动和终止的关系提供实验依据。同时c o q a o 在肝功能恢复、肝病防治方面有广阔的医学应用前景，弄清其作用机制，可以为其临床应用、肝病防治药物开发等提供资料。92 材料和方法2 材料和方法2 1 实验动物成年健康s p r a g u c d a w l c y 封闭群大鼠，s p f 级。雌性，体重2 3 0 2 5 0g ，由河南师范大学实验动物繁育中心提供。笼内饲养，温度2 3 4 - 2 ，光照周期1 2h ：1 2h( 7 ：0 0 1 9 ：0 0 光照) ，自由取食饮水，定期更换垫料。2 2 主要试剂和仪器( 1 ) c o q l o上海医药( 集团) 有限公司信谊制药厂生产( 2 ) e p o n8 1 2 树脂c a r lr o t hk gc h c m i s c h cf a b r i kk a r l s r u h e 生产( 3 ) d d s ac a r lr o t hk gc h e m i s c h cf a b r i kk a r l s r u h c 生产( 4 ) m n ac a r lr o t hk gc h e m i s c h cf a b r i kk a s l s r u h e 生产( 5 ) d m p 3 0c a r lr o t hk gc h c m i s c h cf a b r i kk a r l s r u h e 生产( 6 ) 醋酸双氧铀上海市科学用品供应站( 7 ) h e p e s北京鼎国生物技术有限公司s i g m a 分装( 8 ) t r i s上海生工生物工程技术服务公司b b l 分装( 9 ) m a n n i t o l天津市科密欧化学试剂开发中心( 1 0 ) s u c r o s e上海生工生物工程技术服务公司b b i 原装( 1 1 ) e d t a北京鼎国生物技术有限公司g e n v i c w ；( 1 2 ) e g t a北京鼎国生物技术有限公司s i g m a 分装；( 1 3 ) b s a北京鼎国生物技术有限公司s i g m a 分装；( 1 4 ) 考马斯亮蓝g 2 5 0北京鼎国生物技术有限公司u s b( 1 5 ) a d p郑州宝赛公司a m r e s c o 分装( 1 6 ) 琥珀酸钠上海生工生物工程技术服务公司b b l 分装( 1 7 ) l k b 2 0 8 8 型超薄切片机l k b 公司( 1 8 ) j e m 1 0 0 s x 透射电镜日电公司( 1 9 ) b a l z e rh p o0 2 0 型烘箱( 2 0 ) l e i c a d ml b 型显微镜莱卡公司1 02 材料和方法( 2 1 ) o l y m p u sc h 2 型显微镜( 2 2 ) s a r t o r i u sb s l l o s 电子天平( 2 3 ) r e i c h e r t - j u n g 制刀机( 2 4 ) 天能细胞图像处理系统( t a n o nc i s )( 2 5 ) 蠕动泵( 2 6 ) 7 2 2 型分光光度计( 2 7 ) 恒温水浴箱( 2 8 ) 电动匀浆器( 2 9 ) 高速冷冻离心机( 3 0 ) 溶氧测定仪( 3 1 ) 分析天平( 3 2 ) p h