（应用化学专业论文）荧光稀土纳米二氧化硅探针的制备及应用.pdf

哈尔滨下程大学硕十学位论文 摘要 近年来，随着生命科学的不断发展，生物化学分析的应用也越来越广泛。 由于荧光光谱的灵敏度高、选择性好，荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、 细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用，其中各种荧光稀土纳米颗粒探 针则是荧光分析的有力工具。 本文采用反相微乳液法制备了掺杂型荧光( e u 、t b ) 纳米二氧化硅颗粒， 及共价型荧光纳米二氧化硅b h h c t - e u s i 0 2 ，通过x 射线衍射、红外光谱、 荧光光谱等手段对制备物的结构、形态、性质进行了表征。并将 b h h c t - e u s i 0 2 与氯霉素抗体相连作为荧光探针应用于氯霉素的免疫层析试 纸条分析。 本文所制备的掺杂型荧光( e u 、t b ) 纳米二氧化硅颗粒均为非晶态或极小 晶体，e d t a 中的羰基与e u 3 + ( t b 3 + ) 以双齿配位的形式配位，当掺杂元素为e u 时，荧光光谱分析表明，在3 9 6 n m 处没有出现e u 3 + 的本征激发峰，而在3 1 0 n m 处出现一较强激发峰，表明配合物的激发光谱由配体e d t a 吸收能量引起， 并将能量传递给e u 3 十使之发出特征荧光，在3 1 0 n m 光激发下，发射波长位于 6 1 5 n m 处，对应于e u j + 离子电偶极跃迁5 d o _ 1 f 2 ，发射光谱中没有出现磁偶极 跃迁5 d o _ 7 f l 表l 蓼j e u 3 + 的配合物中稀土离子处于不对称中心；当掺杂元素为t b 时，荧光光谱分析表明，在2 7 7 3 9 6 n m 之间有一宽而强的t b 3 + 离子的激发谱带， 2 4 0 n m 处的最强激发峰是由配体e d t a 吸收能量，并将能量传递给憎+ 使之发 出特征荧光所引起，在2 4 0 n m 光激发下，发射波长位- 于4 8 6 n m ( 5 d 4 7 f 6 ) 、 5 4 4 n m ( 5 d 4 7 f 5 ) 、5 8 2 n m ( 5 d 4 _ 7 f 4 ) 、6 2 0 n m ( 5 d 4 7 f 3 ) 。掺杂的e d t a e u ( t b ) 与s i 0 2 摩尔比在1 ：1 2 0 1 ：1 5 之间时，随着e d t a e u ( n ) 的掺杂量的增加荧光粒 子在各发射波长下的最大发射荧光强度均成指数函数增长。 荧光粒子b h h c t - e u s i 0 2 ，激发峰分别位于2 3l n m 、2 7 4 n m 、318 n m 、 3 4 0 n m 处，其中2 3 1 、2 7 4 和3 4 0 n m 处的激发峰由配体的n ( g ) - - * x * 跃迁引起， 最大激发峰3 1 8 n m 是由配体吸收能量，通过分子间能量传递给e u 3 + ，使之发 哈尔滨t 稃大学硕七学何论文 出荧光所致，发射光谱中最强发射峰位于6 1 5 n m ( 5 d o _ 7 f 2 ) 处b ，另外两个弱发 射峰位于5 9 2 n m ( 5 d o 一7 f 1 ) 和6 4 9 n m ( 5 d o 一7 f 3 ) 处，6 1 5 n m 处发射峰强度远远 强于5 9 2 n m 处发射峰，说明荧光探针中e u 3 + 处于非反演中心。 b h h c t e u s i 0 2 a b 作为荧光探针进行免疫层析试纸条法检测氯霉素时，对 氯霉素检测限为1 0 n g m l ，氯霉素琥珀酸盐检测限为l n g m l ，重复性良好， 特异性良好，与甲砜霉素、卡娜霉素、磺胺二甲基嘧间无交叉反应。 关键词：荧光；纳米s i 0 2 ；免疫层析试纸条；氯霉素 哈尔滨t 程火学硕十学位论文 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h ec o n s t a n td e v e l o p m e n to fl i f es c i e n c e ，b i o c h e m i c a l a n a l y s i sw a su e s e dm o r ea n dm o r ew i d e l y f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yh a sh i g h s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y , s of l u o r e s c e n c ep r o b et e c h n o l o g yh a sp l a y e da n i m p o r t a n tr o l ei nt h ep r o t e i n s ，n u c l e i ca c i d s ，c e l l sa n di m m u n ed e t e c t i o na n a l y s i s a m o n gt h e m ，l a n t h a n i d e - c o a t e dn a n o p a r t i c a l sp r o b ei sap o w e r f u lt 0 0 1 i nt h i s p a p e r ，f l u o r e s c e n td o p e de ua n dt bn a n o - s i l i c ap a r t i c l e sw e r e p r e p a r e db y r e v e r s e m i c r o e m u l s i o n , f l u o r e s c e n tc o v a l e n tn a n o s i l i c a b h h c t - e u s i 0 2w a sp r e p a r e db yr e v e r s em i c r o e m u l s i o n ，t o o t h es t r u c t u r e ， m o r p h o l o g ya n dt h en a t u r eo fp r e p a r i n gp r o d u c t sw e r ec h a r a c t e r i z e db yx r a y d i f f r a c t i o n , i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y , f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y a n d b h h c t - e u - s i 0 2 w a s u s e di n d e t e c t i n gc h l o r a m p h e n i c o lb y i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cs t r i pm e t h o d i nt h i s p a p e r ，f l u o r e s c e n td o p e de ua n dt bn a n o s i l i c a p a r t i c l e s a r e a m o r p h o u so rv e r ys m a l lc r y s t a l s ，t h ec o o r d i n a t i o nf o r m so fc a r b o n y li ne d t a w i t he u 3 十( t b 3 + ) i sd o u b l ec o o r d i n a t i o n w h e nt h e d o p i n ge l e m e n t i se u , f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p ya n a l y s i ss h o w st h a tt h ef e a t u r e se x c i t a t i o np e a ka t 3 9 6 n mw a sn o to b s e r v e d ，a n dt h ee x c i t a t i o np e a ka p p e a r e da t310 n m ，i ts h o w s t h a tt h ee x c i t a t i o ns p e c t r u mo ft h ec o m p l e xw a sc a u s e db ye d t aa b s o r b i n g e n e r g ya n dt h ee n e r g yw a st r a n s f e r e dt oe u 3 + w h i c hm a k ei ti s s u ef e a t u r e s f l u o r e s c e n t w i t ht h e310 n mo fl i g h te x c i t a t i o n , t h ee m i s s i o nw a v e l e n g t hi s 615 n m t h es t r o n ge m i s s i o nb a n do fe u 3 + a t615 n m b e l o n g st oe l e c t r i cd i p o l e t r a n s i t i o n5 d o _ 7 f 2 ，a sm a g n e t i c d i p o l et r a n s i t i o n5 d o 一7 f lo fe u 3 + 嘶n o t o b s e r v e d ，t h ee u 十i nt h ec o m p l e xw a sa tt h ea s y m m e t r i cc e n t e r w h e nt h ed o p i n g e l e m e n ti st h ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n a l y s i ss h o w st h a tb e t w e e n2 7 7a n d 3 9 6 n m ，t h e r ei sa s t r o n ga n dw i d e b a n de x c i t a t i o n , t h e s t r o n g e s te x c i t a t i o n 哈尔滨t 程人学硕十学位论文 o c c u r r e da t2 4 0 n m ，i tw a sc a u s e db ye d t a a b s o r b i n ge n e r g ya n dt h ee n e r g yw a s t r a n s f e r e dt ot b 3 + t om a k ei tt oi s s u ef e a t u r e sf l u o r e s c e n t w i t ht h e2 4 0 n mo fl i g h t e x c i t a t i o n , t h e e m i s s i o n w a v e l e n g t ha p p e a r e d a t 4 8 6 n m ( 5 d 4 7 f 6 ) 、 5 4 4 n m ( 5 d 4 7 f 5 ) 、5 8 2 n m ( 5 d 4 _ 7 f 4 ) 、6 2 0 n m ( 5 d 4 7 f 3 ) w h e nt h em o l a rr a t i oo f e d t a - e u ( t b ) a n ds i 0 2w a sb e t w e e n1 ：12 0t o1 ：15 ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi n e v e r ye m i s s i o nw a v e l e n g t hw i l li n c r e a s e 、析t 1 1t h ec o n c e n t r a t i o no fe u ( t b ) a n dt h e g r o w t hi se x p o n e n t i a lg r o w t h t h ee x c i t a t i o np e a k so fb h h c t - e u - s i 0 2a p p e a r e da t2 31n m ，2 7 4 n m ，318 n m ， 3 4 0 n m ，a m o n gt h e mt h ee x c i t a t i o np e a k sa t2 31n m ，2 7 4 n m ，3 4 0 n m a r ec a u s e db y n ( 兀) _ 矿t r a n s i t i o no fs o m eg r o u p si nb h h c t t h es t r o n g e s te x c i t a t i o no c c u r r e d a t318 n m ，i tw a sc a u s e db yl i g a n da b s o r b i n ge n e r g ya n dt h ee n e r g yw a st r a n s f e r e d t oe u 3 + t om a k ei tt oi s s u ef e a t u r e sf l u o r e s c e n t w i t ht h e318 n mo fl i g h te x c i t a t i o n ， t h ee m i s s i o nw a v e l e n g t ha p p e a r e da t6 15 n m ( 5 d o _ 7 f 2 ) 、5 9 2 n m ( 5 d o 一7 f 1 ) 、 6 4 9 n m ( 5 d o 一7 f 3 ) ，a n d5 d o _ 7 f 2t r a n s i t i o ni sm u c hs t r o n g e rt h a n5 d o _ 7 f l ，w h i c h i n d i c a t e st h a tt h ee u 3 + i nt h ec o m p l e xi sa tt h ea s y m m e t r i cc e n t e r w h e n b h h c t - e u - s i 0 2 a b a saf l u o r e s c e n t p r o b e w a su s e d i n d e t e c t i n g c h l o r a m p h e n i c o lb yi m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cs t r i pm e t h o d ，t h em e t h o dd e t e c t i o n l i m i to fc h l o r a m p h e n i c o li slo n g m l ，w h i l ec h l o r a m p h e n i c o ls u c c i n a t es a l ti s ln g m l t h i sm e t h o dh a sg o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n ds p e c i f i c i t y , i th a sn oc r o s s r e a c t i o nw i t ht h i a m p h e n i c o lk a n a m y c i ns u l f a m e t h a z i n e k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c e ；n a n o - s i 0 2 ； i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cs t r i p ； c h l o r a m p h e n i c o l 哈尔滨工程大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本论文的所有工作，是在导师的指导下，由 作者本人独立完成的。有关观点、方法、数据和文献的引用已在 文中指出，并与参考文献相对应。除文中已注明引用的内容外， 本论文不包含任何其他个人或集体已经公开发表的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式 标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者( 签字) ：夕移趴 日期：力彬年石月l 汐日 哈尔滨工程大学 学位论文授权使用声明 本人完全了解学校保护知识产权的有关规定，即研究生在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于哈尔滨工程大学。哈尔滨 工程大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件。 本人允许哈尔滨工程大学将论文的部分或全部内容编入有关数据 库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文，可以公布论文的全部内容。同时本人保证毕业后结合 学位论文研究课题再撰写的论文一律注明作者第一署名单位为哈 尔滨工程大学。涉密学位论文待解密后适用本声明。 本论文( 删在授予学位后即可口在授予学位1 2 个月后口 解密后) 由哈尔滨工程大学送交有关部门进行保存、汇编等，以 作者( 签字) ：善眵导师( 签字) ：孚约 日期： 彻j 7 年6 月节日矽莎，年月卜日 哈尔滨丁稗人学硕十学位论文 第1 章绪论 1 1 研究背景 具有各种结构及荧光性质的荧光生物标记探针在基因组学、蛋白质组学 及生物芯片等现代生命科学与生物技术中正发挥着不可替代的重要作用，而 现代生命科学与生物检测技术的发展与进步也在很大程度上依赖着荧光生物 标记探针的使用及荧光测定方法学的发展与进步。美国分子探针公司所销售 的绝大多数生物标记物也是荧光化合物。近年来，以半导体纳米荧光材料“量 子点”、荧光染料掺杂硅胶纳米微球( 核壳型纳米荧光微粒) 等为代表的纳米 荧光生物标记探针在生物标记与生物测定领域取得了令人注目的成就与进 展，在荧光生物成像检测如细胞及组织抗原的原位测定1 1 、核酸测定【2 】、癌组 织的活体原位荧光成像测定3 1 、癌细胞的转移与示踪1 4 1 、食品及环境样品中强 致病性病原体的快速荧光成像测定【5 】等方面表现出经典荧光生物标记探针无 法比拟的优越性。与经典荧光生物标记探针相比，“量子点 等纳米荧光生物 标记探针的优点主要表现在其优良的光稳定性( 强抗光漂白性能) 和强的荧 光发光性质上( 荧光信号放大) ，但由于使用“量子点等纳米荧光生物标记 探针的测定方法无法解决复杂样品背景荧光对测定的干扰问题，导致这类荧 光材料较难用于复杂生物或环境样品的高灵敏度定量测定。但是，以量子点、 核壳型纳米荧光微粒等为代表的纳米荧光生物标记探针在荧光生物成像分析 方面所取得的令人注目的成就与进展为纳米荧光生物标记材料及纳米生化检 测技术指明了一个非常有前景的发展方向。 近年来长春应化所和大连理工大学在国内外率先开展了纳米稀土荧光生 物标记探针的制备与应用研究工作，初步建立了几种粒径在2 5 5 5 纳米的稀 土荧光生物标记探针的制备技术及其在生物标记与时间分辨荧光免疫分析法 中的应用技术。稀土元素主要是铕、铽、钐和镝等，它们能与某些特定的配 合物形成强荧光的络合物。稀土络合物具有以下优异的的荧光性质：( 1 ) 荧光 寿命长。一般荧光物质以及背景荧光的寿命约为1 1 0 n s ，而稀土络合物的荧 1 哈尔滨丁程人学硕十学位论文 光寿命一般为1 0 1 0 0 0 1 x s ，两者相差5 - 6 个数量级。因此，采用时间分辨荧光 检测技术，可以有效克服非特异性荧光的干扰，使测量的灵敏度大大提高。 ( 2 ) 激发光谱带较宽。这有利于增加激发能，提高标记物的比活性。( 3 ) 发射 光谱带窄。半峰宽小于1 5 n m ，有利于提高分辨率。( 4 ) s t o k e s 位移大。稀土 络合物的最大激发光波长通常在3 0 0 3 8 0 n m 的紫外区，最大发射光波长在 5 0 0 n m 以上，s t o k e s 位移达2 5 0 3 5 0 n m ，有利于排除各种背景荧光的干扰， 增强检测的特异性。( 5 ) 激发波长具有配体的特性，即随配体的变化而变化， 发射波长则具有稀土离子的性质，即不随配体的变化而变化。这样就可能采 用单一激发光，获得不同发射波长，从而实现多组分同时检测。现有的荧光 稀土络合物标记物，稀土离子主要是e u 3 + 、t b 3 + 、s m 3 + 和d y 3 + 等同一些b 一 二酮化合物、邻菲罗啉类化合物、水杨酸类化合物、联吡啶类化合物等所形 成的络合物，目前已得到不同程度的应用【6 。3 1 。这些研究工作的结果表明， 纳米稀土荧光生物标记材料无论在荧光强度还是在光稳定性上都具有远优于 稀土配合物荧光标记物的良好性能，预示了其在高灵敏度荧光标记生物分析 技术中的良好应用前景。 1 2 研究目的和意义 基于纳米稀土荧光生物标记探针的时间分辨荧光技术是将纳米稀土荧光 生物标记探针的高荧光强度及高光稳定性、时间分辨荧光测定的高灵敏性有 效结合起来的一种新型生物学测定方法。稀土荧光标记物的荧光寿命可达数 百到数千微秒，是通常生物样品背景荧光的1 0 5 1 0 6 倍。时间分辨荧光测定法 的特点是以脉冲光为激发光源，在脉冲光源激发后引入一个足够长的延迟时 间，待非特异背景荧光完全淬灭后，再测量稀土荧光探针发出的长寿命特征 荧光信号，从而有效消除了生物样品中背景荧光对测定的干扰，获得很高的 信噪比【潍1 6 】。 本研究以纳米稀土荧光生物标记探针的制备与时间分辨荧光免疫测定新 方法的建立为研究目标，通过功能性纳米稀土荧光生物标记探针的制备、表 2 哈尔滨t 程大学硕十学位论文 征、荧光性质分析及在生命科学分析中的应用等研究，解决已有荧光生物标 记探针在生化测定时存在强背景光干扰的难题，为时间分辨荧光生化分析技 术、纳米生物检测技术等的发展提供具有一定基础性及前瞻性的方法与技术 平台，解决影响现有技术发展和应用的某些关键科学与技术问题。 1 3 纳米s i 0 2 颗粒的制备技术 纳米s i 0 2 颗粒制备方法分为物理法和化学法。物理法一般指机械粉碎法， 利用超气流粉碎机或高能球磨机对s i 0 2 的聚集体进行粉碎，可获得粒径为 1 - 5 t m 的超细粉体。化学法包括化学气相法( c v d ) 、化学沉淀法、溶胶凝胶 法( s 0 1 g e l ) 和微乳液法等，但目前主要的生产方法是以硅烷卤化物为原料的 气相法，以硅酸钠和无机酸为原料的化学沉淀法和以硅酸酯为原料的溶胶 凝胶法等方法【1 7 1 。 1 3 1 气相法 1 9 4 5 年，德 蛋d g e u s a s 公司利用气相法成功的制备出了白碳黑，随着气相 法技术的不断改进，目前已发展到世界各国，利用此技术生产出的s i 0 2 颗粒 已被广泛应用于各个领域。气相法的生产工艺主要为化学气相沉淀法，又称 为热解法、干法。按制备方式又大体分为：气体蒸发法、化学气相反应法、 化学气相凝聚法、溅射法【1 8 1 和激光激活化学气相沉积法等一些方法【1 9 1 。其原 理是直接利用气体或通过各种手段将物质变成气体，使之在气体状态下发生 物理、化学变化，在冷却过程中凝聚长大形成纳米颗粒【l g 。具体过程为：以 硅烷卤化物为原料( 目前主要为s i c l 4 和c h 3 s i c l 3 两种) ，在氢氧焰中发生高温 水解反应，反应温度一般高达1 2 0 0 1 6 0 0 。c 2 0 - 2 1 ，生成颗粒极细的气相二氧化 硅，与气体形成溶胶，不易捕集，须在聚集器中集成较大颗粒，经旋风分离 器收集，再送入脱酸炉中，用含氨的空气进行吹洗，使之至p h 值变为4 6 为止， 再脱酸，即得到成品的纳米s i 0 2 颗粒。反应方程式如下： s i c h + 2 h 2 + 0 2 一s i 0 2 + 4 h c l ( 1 1 ) c h 3 s i c l 3 + 2 h 2 + 3 0 2 s i 0 2 + 3 h c l + c 0 2 + 2 h 2 0( 1 2 ) 3 哈尔滨t 稗人学硕十学位论文 成品的质量( 粒径、表面积、纯度等) 与原料( 包括氢气和氧气) 的纯度和配比、 进料温度、氢气和氧气的流量、合成炉和分离器的结构等因素有关。 1 3 2 化学沉淀法 化学沉淀法是硅酸盐通过酸化获得疏松、细分散的、絮状结构的s i 0 2 颗 粒。该法为目前主要的生产方法瞄】。其反应方程式如下： n a 2 s i 0 3 + h c l _ h 2 s i 0 3 + n a c l( 1 3 ) h 2 s i 0 3 _ s i 0 2 + h 2 0( 1 - 4 ) 由于沉淀法制备工艺简单，产品价格便宜，因而被很多学者所研究，如 郑典模等人【2 3 】利用水玻璃和硫酸作为原料，利用沉淀法成功的制备出了纳米 s i 0 2 颗粒，平均粒径为7 6 n m 。近几年以沉淀法为基础派生出了多种制备方法， 如胡庆福等人1 2 4 1 利用c 0 2 沉淀法成功的制备出了具有高补强性的白碳黑，平 均粒径为2 0 n m 。 1 3 3 溶胶一凝胶法 溶胶凝胶法最早源于十九世纪中叶，e b e l m n a 和g r h a a m 发现正硅酸四乙 酯( t e o s ) 在酸性条件下会产生玻璃态的s i 0 2 【2 5 1 。溶胶凝胶法就是将金属醇盐 溶解在有机溶剂中，通过水解聚合反应形成均匀的溶胶( s 0 1 ) ，进一步反应并 失去大部分有机溶剂转化成凝胶( g e l ) ，再通过热处理，制备成膜的化学方法。 s i 0 2 的颗粒粒径易受反应物的影响，如水和n i - 1 3 h 2 0 的浓度、硅酸酯的类型( 正 硅酸四甲酯、正硅酸四乙酯、正硅酸四丙酯等) 、不同的醇( 甲醇、乙醇、丙 醇、戊醇等) 、催化剂的种类( 酸或碱) 及不同的温度等，对这些影响因素的调 控，可以获得各类结构的纳米s i 0 2 。该制备方法反应过程如下 2 6 1 ： 缩合聚合反应：s i ( o r ) n + x h 2 0 - - s i ( o h ) x ( o r ) n 略+ x r o h( 1 - 5 ) 失水缩合：一s i - o h + h o s i _ s i o s i + h 2 0( 1 6 ) 失酵缩合：s i o r + h o s i _ s i o s i + r o h( 1 7 ) 溶胶凝胶法作为制备纳米s i 0 2 的一种方法，被诸多的学者所研究，并取 得了相当大的进展。z h a o 等人【2 7 】以三嵌段共聚物( 聚乙烯氧化物聚丙烯氧化 4 哈尔滨t 程大学硕十学位论文 物聚乙烯氧化物) 且p p e o p p o p e o 为模板合成了具有有序结构的孔径可调的 s i 0 2 。郭宇等人1 2 8 j 将正硅酸四乙酯、乙醇和水混合，正硅酸四乙酯在7 0 下 发生水解，制备出纳米s i 0 2 颗粒，平均粒径为1 4 n m 。试验结果证明，p h 值和 催化剂对s i 0 2 的颗粒粒径有着重要的影响，不同的p h 值下制备出的s i 0 2 颗粒 粒径也不同，催化剂改变，也使s i 0 2 颗粒粒径发生了变化。 1 3 4 超重力制备法 在超重力环境中，传质过程和微观混合过程得到了极大的强化，大大缩 短了反应时间，加速了颗粒形成。该法以硅酸钠为液相，二氧化碳为气相， 采用超重力反应装置，使气、液两相在比地球重力场大数百倍至千倍的超重 力场条件下的复孔介质中产生流动接触，巨大的剪切力使液体撕裂成极薄的 膜和极小的丝和滴，从而产生巨大的快速更新的相界面，导致相间传质速率 比在传统塔器中大1 至3 个数量级，使微观混合速率得到极大强化，使溶液达 到过饱和且分布均匀，从而快速、高质量地生产出纳米s i 0 2 【2 9 1 。利用超重力 法制备纳米粉体材料技术是国内首创，目前己取得了较大的发展，如贾宏等 人【3 0 】利用超重力法成功的制备出了粒径小于3 0 n m 的s i 0 2 颗粒，粒径均匀。 1 3 5 非金属矿为原料制备二氧化硅 用非金属矿制取白碳黑，所用的原料有硅藻土、蛋白土、蛇纹石、膨润 土、高岭土、硅灰石、石英砂、海泡石、凹凸棒石、粉煤灰、锆英石、煤研 石、黄磷矿等。利用非金属矿制取白碳黑，在技术上是可行的，经济效益也 是好的，为非金属矿的深加工和综合利用提供了一条新路 3 1 - 3 7 】，因而近年来 被研究学者所看好，如张其春等人【3 s 】利用高岭土精矿与硫酸铵混合物在4 6 0 锻烧4 5 m i n ，制备出的s i 0 2 比表面积约为3 4 2 m 2 g 一。 1 3 6 以稻壳为原料制备纳米s i 0 2 颗粒 稻壳中制取的白碳黑的质量接近于气相法所制备的白碳黑，远高于化学 沉淀法所得到的白碳黑；制备成本却远低于气相法，也低于沉淀法。以稻壳 5 哈尔滨t 程人学硕十学位论文 原料制备纳米s i 0 2 颗粒，最常用的方法之一是热解稻壳，如侯贵华等人【3 7 】将 经盐酸预处理过的稻壳，放入马弗炉中进行热解，得到孔状结构的s i 0 2 颗粒， 纯度为9 9 以上，粒径小于5 0 9 m 的颗粒约占9 0 。也有的学者将热解制备出 的稻壳灰进一步处理，得到纳米s i 0 2 颗粒，周德风【3 9 】报道有一日本学者先将 稻壳在5 0 0 。c 下热处理2 0 h ，得到含s i 0 2 为9 1 7 的稻壳灰：向稻壳灰分中加入 氢氧化钾和碳酸二乙酯，加热样品，取得液体，再用溶胶一凝胶法制得高纯的 s i 0 2 。但是此制备工艺复杂，成本高，不利于工业化生产。稻壳热解法得到 的结果不是很理想，人们就不断的寻找新的制备方法，因此稻壳水解法也就 引起了学者的研究兴趣，如杨先和等人利用h 2 0 2 和h n 0 3 作为混合氧化剂， 与稻壳混合，放入反应釜中，经高温高压，制得的s i 0 2 颗粒比表面积在 1 5 0 m 2 g 川以上。试验使用的h 2 0 2 ，价格昂贵，使用量大，因而易受经济效益 影响。马雪垅等人【4 1 】将烈0 3 和浓h 2 s 0 4 混合，在6 0 7 0 。c 条件下水解稻壳， 成功制备出了高纯的纳米s i 0 2 颗粒。用此法制备的纳米s i 0 2 为多孔网状结构， 经扫描电镜分析，发现颗粒呈现出纤维状且盘曲折叠，平均粒度为5 0 6 0 9 m ， 经研磨后，平均粒径可达1 3 9 m 的粉体，其结构仍为多孔网状。但操作过程 中危险较大，因h n 0 3 和浓h 2 s 0 4 混合后大量n 0 2 放出，不仅污染环境，也给 研究人员带来生命危险。到目前为止，已经有了很多关于利用稻壳制备s i 0 2 的报道，但制备出的s i 0 2 颗粒发生了严重的团聚，使之变为几微米至十几微 米的大颗粒，且颗粒大小不均匀。所以利用稻壳为原料制备具有分散性好的， 颗粒均匀的纳米s i 0 2 ，需待进一步优化制备方法，改善纳米颗粒发生紧密团 聚的现象。 1 3 7 微乳法制备纳米s i 0 2 颗粒 反相微乳液即油包水( w o ) 微乳液，是指以不溶于水的非极性物质相( 油 相) 为分散介质，以极性物质相为分散相的分散体系。其中，水相以纳米尺寸 水滴形式分布在油相中，并依靠聚集在油水界面处的表面活性剂起到稳定作 用，与油相形成彼此分离的微区。利用反相微乳法制各纳米s i 0 2 颗粒，反应 6 哈尔滨下程大学硕十学伊论文 物大多是硅酸酯，当硅酸酯透过胶团界面膜进入水核中时，会发生水解生成 金属氧化物或复合氧化物。常用的硅酸酯是正硅酸乙酉匕( t e o s ) 。也有学者将 碱金属硅酸盐的反胶束微乳液加入到无机酸中，制备出的二氧化硅球形颗粒 的粒径5 1 0 0 n m ，颗粒粒径均匀，比表面积高。所用表面活性剂很多，目前 主要集中在非离子型表面活性剂系列，如o p 、t r t i o n x 系列等。骆锋等人【4 2 】 以聚k , - - 醇辛基苯醚( o p - 孚l 化n ) 正戊醇环己烷硅酸钠溶液为反相微乳液体 系，向该体系中逐滴滴加硫酸溶液，直至l j p h 值为1 2 为止，制备出来的s i 0 2 颗粒粒径为15 3 5 n m ，且粒径分布狭窄。g n a l m 等人【4 3 毛e n p 9 n p 5 ( 质量比 3 ：2 ) 混合乳化剂环己烷正硅酸钠溶液的反相微乳液体系，在不同试验条件下 制备了纳米s i 0 2 颗粒，其比表面积在3 5 0 4 0 0 m 2 g 2 i 日- j 。 1 4 荧光稀土纳米二氧化硅颗粒在生命科学方面的应用 1 4 1 在时间分辨荧光免疫分析方面的应用 近年来，随着生命科学技术的发展，时间分辨荧光免疫分析技术取得了 重大进展。芬兰w a l l a c 生化实验室m 1 ( 现p e r k i n e l m e rl i f es c i e n c e s 公司) 合 成的( s c n p h d t t a ) e u 3 + ，y u a n 等【4 5 】的b h h c t ，s a h a 等【删的t m t ，以及 芬兰t u r k u 大学和w a l l a c 公司 4 7 1 合成的一批由含氮芳香环和多氨基多羧基组 成的配基等使荧光稀土离子配合物标记物在时间分辨荧光免疫分析方面的应 用越来越广泛。它不仅可以应用于非竞争性免疫分析，也可应用于竞争性免 疫分析。在非竞争性免疫分析方面，荧光稀土配合物标记物被用来进行 a f p 4 引，i g e 4 5 1 ，t s h t 4 9 1 ，s d f 1 1 5 0 】，人血清中细胞分裂素【5 l 】，小鼠尿液中 类胶原质1 5 2 】的分析。在竞争性免疫分析方面，荧光稀土配合物标记物被用 来进行人尿液和毛发中的m a 5 3 1 ，人血清中的p 2 1 蛋白质【5 4 】，苄黄隆【5 5 】，雌 二醇和雌三酣5 6 】的分析等。近期，又出现了将荧光稀土配合物标记物用于免 疫层析试纸条的新技术。李庆阁等1 57 j 利用反相微乳技术合成了荧光稀土铕二 氧化硅纳米粒子，并将其用于免疫层析试纸条检测。用荧光稀土络合物纳米 颗粒对待测抗原的单克隆抗体或多克隆抗体进行标记，做成标记垫。该试纸 7 哈尔滨t 秤大学硕十学位论文 条与常规胶体金试纸条相似，不同的是该试纸条的检测结果须在荧光激发下 观察。当采用双抗体夹心法检测时，阳性结果出现两条线，即检测线和控制 线，阴性结果只出现一条控制线；而采用竞争法检测时，阳性结果只出现一 条控制线，而阴性结果出现两条线。 将二氧化硅荧光稀土络合物应用于检测领域与常规技术相比具有以下优 点：( 1 ) 利用此试纸条既可以进行定性检测，也可用于定量检测。( 2 ) 操作简便， 3 0 分钟以内即可给出检测结果。( 3 ) 既适合单个样品的检测，又可用于大量样 品的筛查。可制备一项多检的快速检测试剂盒。( 4 ) 灵敏度高，线性范围宽。 y ex u 等1 5 8 1 利用此技术对h b s a g 进行了检测，其检测限可达0 0 0 9 2 n g m l ， 线性范围0 0 5 1 1 1 1 n g m l ；对h b e a g 进行检测线性范围为 1 5 0 一1 1 1 1 0 4 n c u l ；( 5 ) 应用广泛。可应用于疾病诊断、毒品检测、细菌检 测和环境检测等多种领域。 1 4 2 应用于d n a 检测和细胞识别 1 4 2 1 应用于d n a 检测 谢文刚【5 9 j 通过制备荧光稀土纳米二氧化硅探针并用于d n a 检测，灵敏 度达到4 4 x 1 0 诺的目标d n a 。 将环己烷、正己醇、表面活性剂t r i t o n - 1 0 0 按4 ：1 ：1 的比例混合，加入二 次蒸馏水，搅拌至清，分别加入联吡啶钌配合物溶液、正硅酸乙酯( t e o s ) ， 氨水，持续搅拌2 4 h ，反应结束后用丙酮、二次蒸馏水洗涤，1 2 0 0 0 r m i n 离 心分离，制得荧光二氧化硅纳米颗粒，其粒径为2 0 - 士3 n m 。用制备好的荧光 二氧化硅纳米颗粒标记一段d n a 作为检测探针，然后与目标d n a 和固定 d n a 进行夹心杂交，形成三明治结构复合体，用链酶亲和素化的玻片对复合 体进行捕获，洗涤，用激光共聚焦显微镜检测玻片上的荧光纳米颗粒的荧光 信号，并用软件( f l u o v i e w - t i e m p ot i m ec o u r s e s o f t w a r ev e r 5 ) 分析荧光强度，从 而实现对目标d n a 的检测。这种荧光纳米颗粒可作为一种新型光稳定的 d n a 标记物进行d n a 检测，为生物荧光纳米颗粒的研究和应用开辟了新领 8 哈尔滨下程大学硕+ 学侍论文 域，为发展新型d n a 的检测技术提供了依据，在d n a 传感器以至d n a 芯 片的制作方面都有广阔的应用前景。 1 4 2 2 应用于细胞识别 利用制备好的荧光二氧化硅纳米颗粒，将生物技术、纳米技术与荧光标 记技术结合起来，可以对某些细胞进行识别。何晓唰卯】等利用这一方法成功 地对人外周血中的b 淋巴细胞进行了识别。具体方法为：在分离的b 淋巴细 胞悬浮液中，加人等体积荧光纳米颗粒悬浮液，3 7 。c 下培育1 h ，离心、洗涤， 此过程重复几次。除去与细胞非特异性吸附的生物荧光纳米颗粒，吸取细胞 悬液制片。应用单臂光纤连接荧光显微镜与荧光分光光度计，实现荧光光谱 测量和细胞实时成像二维信号同时采集。以1 0 0 w 高压汞作激发光源，在光 路上放置一滤光片，用荧光显微镜的物镜收集信号，通过单臂光纤将藕合好 的荧光信号从荧光显微镜的照相机接口传导至荧光分光光度计，记录荧光发 射光谱c c d 摄像系统与自编的图像采集软件采集细胞图像，从而实现对b 淋巴细胞的识别。 基于生物荧光纳米颗粒的新型荧光标记方法用于细胞识别，其灵敏度及 光学稳定性都较传统的荧光标记试剂( f i t c ) 显著提高，在生命体系的超痕量 分析中具有非常重要的意义。 1 4 3 用作基因载体 硅纳米颗粒是一种非常有潜力的基因载体。在一定范围内硅纳米颗粒的 数目对细胞的活性生长没有明显的影响。实验证明硅纳米颗粒可经过肾脏排 泄出体外，并且在子代动物中并未发现有硅纳米颗粒的存在【6 。同时，硅纳 米颗粒可通过血脑屏障，也具有防止d n a 降解的作用。利用明胶制成纳米颗 粒与d n a 结合转h e k 2 9 3 细胞，转染效率达5 0 。z h u 6 2 】等利用氨基化的硅纳 米颗粒携带d n a 分子转染c h o 细胞也得到了高效表达。实验中发现硅纳米颗 粒能成功结合质粒并转染成人角质形成细胞，获得绿色荧光表达，转染效率 与已知的脂质体相当。c a r s t e n 6 3 】等用二价阳离子修饰硅纳米颗粒表面后，发 9 哈尔滨t 程大学硕十学何论文 现结合在颗粒上的d n a 能抵抗d n a s e 的作用。通过不同浓度的n a c l 和n a i 修饰 硅纳米颗粒，在合适的p h 值下用s n a p 复合物转染h t l 0 8 0 细胞，d n a 的转染 效率最高达到7 0 。 1 4 4 用作酶载体 按n h e x x 等【删的方法制备氨基化的二氧化硅纳米颗粒，程凡亮等【6 5 】 以木瓜蛋白酶为对象研究了氨基化二氧化硅纳米颗粒作为酶固定化载体的可 行性，将氨基化的二氧化硅纳米颗粒经戊二醛处理后，采用共价法固定木瓜 蛋白酶，固定化最适p h 6 5 ，最佳给酶量为1 5 m g g 载体，固定化酶的最适反应 温度为7 0 。c ，最适反应p h 为6 5 ，固定化酶热稳定性，p h 耐受性，贮存稳定 性都明显高于游离酶，该颗粒作为酶固定化载体时可提供更多固定位点，表 明此颗粒可作为一种优良的酶固定化载体。石慧1 6 6 1 等以研究二氧化硅纳米颗 粒的分子生物效应为出发点，将氨基化的二氧化硅纳米颗粒作为固定化载体， 选择多聚酶牛肝过氧化氢酶( c a t ) 和单体辣根过氧化物酶( h r p ) 作为酶模型， 均以酶固定后的特性( 包括酶活回收率、热稳定性、酶促反应最适温度以及酶 在水有机溶剂混合体系中的催化能力) 变化为考察指标，酶固定在颗粒上后 对酶分子产生的生物效应差异进行了较为系统的研究，结果表明以氨基化二 氧化硅纳米颗粒作为载体所形成的固定化酶在有机相中的稳定性明显提高。 一方面是因为氨基化二氧化硅纳米颗粒能在有机相中稳定存在，从而使酶在 有机相中的稳定性得到了保证，另一方面是载体使固定于其上的酶分子形成 了一个相对亲水的高生物亲和环境，从而使其催化能力得到保证。 1 5 本论文的设想及主要内容 随着生物技术的不断发展，荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、细胞检 测及免疫分析等方面发挥了重要作用。荧光探针性能很大程度上取决于标记 物的发光强度，稳定性及光谱特性等。目前，应用最为普遍的荧光探针是有 机染料。在大多数情况下，由于它们的激发光谱都较窄，所以很难同时激发 多种组分，而荧光特征光谱又较宽，并且分布不对称，这又给区分不同探针 1 0 哈尔滨t 稃大学硕七学位论文 分子的荧光带来困难；同时，有机染料最严重的缺陷是发光强度相对较弱， 光化学稳定性差，容易产生光漂白与光解现象，无法对标记细胞进行长期的 追踪及观察标记分子的动力学过程。 由于生物体系的特殊性和复杂性，同时为了能测定更多的生物活性物质， 对激光激发生物荧光探针有很高的要求，它们应当具有较好的光稳定性，不 易被光解或光漂白，生物毒性以及对生物体本身功能的影响要小，要有良好 的激发和荧光效率，对所检测的生物活性反应敏感，光谱特征突出等。目前 常用的标记物为放射性同位素、酶或底物、化学或生物发光体系和荧光染料 物质，然而使用放射性同位素带来了污物处理的难题，不仅有可能损害操作 人员的健康，而且荧光寿命短，难以获得长期稳定的检测标准；酶联免疫