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丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 摘要 蛋白质在生物体新陈代谢和自我复制过程中具有重要作用，对一切生 命过程，水起着极为重要的作用，蛋白质呈现其生物功能，主要是在水溶 液中进行的，但是大多数蛋白质的天然环境并不是单纯的水溶液，而是含 有许多有机和无机物质的复杂介质，因此，探索蛋白质在混合溶剂的构象 变化对了解蛋白质的结构和功能具有重要的理论和现实意义。 丙三醇和尿素分别是常见的蛋白质的稳定剂和变性剂，研究丙三醇、 尿素在水溶液中与蛋白质的相互作用及其对蛋白质构象的影响有助于深入 理解蛋白质结构和功能在不同微环境中的变化规律。论文利用荧光猝灭法 和动态光散射法测定丙三醇水、尿素水、丙三醇尿素水混合溶剂中血红 蛋白( m ) 与一种常见的生物染料联苯胺( b z ) 的相互作用距离和流体动力学 半径，并结合l i b 荧光光谱、紫外可见吸收光谱和循环伏安曲线的变化，探 讨丙三醇、尿素与蛋白质分子在水溶液中相互作用的机理及其对蛋白质构 象的影响，为了解复杂介质中蛋白质的结构和功能提供进一步的信息。 研究结果表明：( 1 ) h b 在丙三醇水混合溶剂中主要通过优先水化作用 形成更紧密的构象，溶剂体系的氢键形成能力下降导致丙三醇浓度较高的 混合溶剂中氢键网络坍塌，蛋白质构象进一步折叠，尽管h b 在丙三醇水混 合溶剂中保持较完整的血红素疏水空穴结构，但是血红素疏水空穴以外肽 段的构象发生了显著变化，对h b 的聚集状态造成一定影响。( 2 ) 在尿素水 混合溶剂中，尿素分子取代水分子而积聚在蛋白质分子表面，尿素与蛋白 质之间的直接相互作用对蛋白质的构象具有复杂的影响，低浓度的尿素水 混合溶剂有利于h b 形成紧密构象，具有稳定蛋白质的作用，而高浓度的尿 素水混合溶剂使得h b 血红素疏水空穴失去原有的三级结构后形成一个与 熔球态相似的结构。( 3 ) 在丙三醇一尿素一水混合溶剂中，丙三醇分子与尿素 分子在h b 分子表面形成竞争，削弱了尿素与蛋白质之间的相互作用，致使 蛋白质在尿素浓度更低的混合溶剂中发生去折叠；而h b 只有在更高的尿素 浓度下才能脱落出游离血红素，表明丙三醇有助于稳定h b 血红素疏水空穴 的构象。 关键词：血红蛋白丙三醇尿素荧光猝灭法动态光散射结合距离 流体动力学半径紫外可见吸收光谱 i i d 吓l u e n c e so fg l y c e r o la n du r e ao nt h e c o n f o r m a t i o no fp r o t e i ni na q u e o u sso l u t i o n a bs t r a c t p r o t e i np l a y sav i t a lr o l ei nt h eb i o l o g i c a lm e t a b o l i s ma n ds e l f - r e p l i c a t i n g f o ra l ll i f ep r o c e s s ，w a t e rp l a y sa ne x t r e m e l yi m p o r t a n tr o l ea n dt h eb i o l o g i c a l f u n c t i o n p r o p e r t i e s o fp r o t e i na r e p r i m a r i l yp r e s e n t i n a q u e o u s s o l u t i o n h o w e v e r , m o s tp r o t e i n se x i s ti nt h ec o m p l i c a t e de n v i r o n m e n tc o n t a i n i n gm a n y o r g a n i c a n d i n o r g a n i cs u b s t a n c e s ，r a t h e r t h a n p u r ew a t e r t h e r e f o r e ，t h e i n v e s t i g a t i o no fc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so fp r o t e i n si nt h em i x e ds o l v e n th a s t h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c et ou n d e r s t a n dt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no f p r o t e i n s g l y c e r o la n du r e a ，r e s p e c t i v e l y , i s ac o m m o np r o t e i ns t a b i l i z e ra n d d e n a t u r a n ta g e n t t h es t u d yo ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ng l y c e r o l ，u r e aa n dt h e p r o t e i na n di t s i n f l u e n c eo nt h ec o n f o r m a t i o no fp r o t e i ni na q u e o u ss o l u t i o n c o n d u c e st ou n d e r s t a n d i n gt h ec h a n g eo ft h es t r u c t u r ea n df u n c t i o np r o p e r t i e so f p r o t e i ni n d i f f e r e n tm i c r o e n v i r o n m e n t t h eb i n d i n gd i s t a n c eo fb e n z i d i n et o h e m o g l o b i n ( h b ) a n dt h eh y d r o d y n a m i cr a d i u s o fh bi ng l y c e r o l - w a t e r ， u r e a - w a t e ra n dg l y c e r o l u r e a - w a t e rm i x t u r e sw e r ed e t e r m i n e db yaf l u o r e s c e n c e q u e n c h i n gt e c h n i q u ea n dd y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n gm e a s u r e m e n t s ，r e s p e c t i v e l y , i i i t o g e t h e rw i t ht h ea n a l y s i so ft h ef l u o r e s c e n c es p e c t r a ，a b s o r p t i o ns p e c t r aa n d c y c l i cv o l t a m m e t r yc u r v eo fi - t b ，a n du t i l i z e dt oi n v e s t i g a t et h e i n t e r a c t i o n b e t w e e ng l y c e r o la n dt h ep r o t e i na n di t si n f l u e n c eo nt h ec o n f o r m a t i o no ft h e p r o t e i n i n a q u e o u ss o l u t i o n ，w h i c hp r o v i d e s f u r t h e ri n f o r m a t i o nf o r u n d e r s t a n d i n gt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o np r o p e r t i e so fp r o t e i ni nc o m p l e x m e d i u m t h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a t ( 1 ) g l y c e r o lp r o m o t e am o r e c o m p a c t c o n f o r m a t i o no fp r o t e i ni na q u e o u ss o l u t i o nt h r o u g hp r e f e r e n t i a lh y d r a t i o n i t w a sf o u n dt h a tt h eb r e a k i n gd o w no ft h eh y d r o g e nb o n dn e t w o r kw a sa t t r i b u t e d t ot h ef u r t h e r f o l d i n go fp r o t e i n a t h i g hg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o n h e m e m i c r o e n v i r o n m e n tw a sr e t a i n e di ng l y c e r o lm i x t u r e s ，h o w e v e r , as i g n i f i c a n t c o n f o r m a t i o n a lc h a n g ew a so b s e r v e di nt h ep e p t i d es e g m e n t so u t s i d eo fh e m e c a v i t yw i t hac o n s e q u e n tp e r t u r b a t i o nt oa g g r e g a t i o no fs u b u n i t so fh b ( 2 ) i n t h eu r e a - w a t e rm i x t u r e ，u r e am o l e c u l ea c c u m u l a t e so nt h es u r f a c eo fp r o t e i nd u e t oi t sa b i l i t yt od i s p l a c ew a t e ri nt h es o l u t i o ns h e l la n dh y d r o g e n b o n dt ot h e p e p t i d e sa n dh y d r o p h i l i cs i d ec h a i n s ，w h i c he x h i b i t sac o m p l e xi n f l u e n c eo nt h e c o n f o r m a t i o no fp r o t e i n i ti se v i d e n t t h a tu r e a w a t e rm i x t u r e sa t h i g h c o n c e n t r a t i o nd e s t a b i l i z et h ec o n f o r m a t i o no fp r o t e i n ，w h e r e a st h o s ea tl o w c o n c e n t r a t i o np r o m o t eam o r ec o m p a c to n e i nt h em i x t u r e so fh i g hu r e a c o n c e n t r a t i o n ，t h eh e m ec a v i t yo fh bw a sf o u n dt ob eo fu n f o l d e ds t r u c t u r e ， h o w e v e rw i t hac o m p a c th y d r o p h o b i cc o r e ( 3 ) i ng l y c e r o l u r e a - w a t e rm i x t u r e s ， g l y c e r o lm o l e c u l e sa n d u r e am o l e c u l e sf o r m e dc o m p e t i t i o no nt h es u r f a c eo ft h e i v h bm o l e c u l e ，w h i c hw e a k e n e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nu r e aa n dp r o t e i na n dl e d t op r o t e i n sf o l d i n gi nm i x e ds o l v e n ta tal o w e ru r e ac o n c e n t r a t i o n o n l ya ta h i g h e rc o n c e n t r a t i o no fu r e ac a nh e m em o n o m e rb ed e t a c h e df r o mh b t h e s t u d ym a d ei tc l e a rt h a tg l y c e r o lc a nh e l pt os t a b i l i z et h ec o n f o r m a t i o no fh b h e i n eh y d r o p h o b i cc a v i t y k e y w o r d s ：h e m o g l o b i n ；g l y c e r o l ；u r e a ；f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g ；d y n a m i c l i g h ts c a t t e r i n g ；b i n d i n gd i s t a n c e ；h y d r o d y n a m i cr a d i u s ；u v - v i sa b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y v 符号说明 意义 摩尔浓度 能量转移效率 表观标准电动势 氧化还原峰位差 加入猝灭剂的荧光强度 不加猝灭剂的荧光强度 荧光给体在波鼬处的荧光强度 给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱之 间的光谱重叠积分 偶极空间取向因子 介质的折光指数 能量给体与能量受体之间的结合距离 流体动力学半径 能量转移效率为5 0 时的i 临界距离 摩尔分率 给体的荧光量子产率 受体在波翔处的摩尔吸收系数 激发光波长 发射光波长 同步荧光波长差 v i i i 单位或量纲 m 0 1 l 1 m v n 咖 衄 衄 砌 衄 姗 船 c e 衄 f 凡 删 霞 r 凰 凰 x 9 柳 k k 从 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 巍磁驰鼋年6 只斟b 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 嘶时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名d 塑已曩鹚导师签名：团莎铆声歹月冲日 广西大掌硕士学位论文 丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 1 1 引言 第一章绪论 生命最基本的特征是能够进行新陈代谢和自我复制，在这一过程中，蛋白质具有极 其重要的作用。在生物体内，蛋白质分布广、含量高、功能多样性，所以早在二百多年 前，人们就开始注意到这类物质。但是直到1 8 3 9 年，荷兰生理化学家m u l d e r 才正式提出 蛋白质的概念，他认为【l 】：一切生物体都具有生命，其中含有一类必要的物质，若没有 这类物质，地球上的生物体都不能存在。因此，这类物质可称为蛋白质( p r o t e i n ) ，p r o t e i n 来源于希腊字p r o t e i o s ，是首要、第一的意思。 1 8 7 8 年，恩格斯在反杜林论中指出“生命是蛋白体存在的形式 ，对蛋白质与 生命的关系作出科学论断。近代分子生物学发现【2 】，从细菌和病毒这样的简单单细胞原 核生物，到脊椎动物及高等哺乳动物如人类，一切生命体的繁衍、代谢、生存、发展都 离不开蛋白质。因此，蛋白质一直是化学生物学，分子生物学和生命科学研究的一个重 要领域。 蛋白质的功能是由特定的三维空间结构决定的，天然态蛋白质是各个氨基酸残基按 照细胞机制聚集而成的线性多肽链，由于多肽链的肽键具有部分双键性质，其侧链r 基 团之间有弱相互作用( 次级键) ，限制了肽链的旋转，使其折叠成独特的三维结构，形成 确定的构象【3 】。蛋白质构象的稳定主要受各种专一性和非专一性作用力( 如静电力、范德 华力、盐键、氢键和疏水键等) 及其协同作用的影响【4 】。除蛋白质一级结构外，影响蛋白 质构象的因素还涉及蛋白质的二级、三级等蛋白质分子的空间结构排布，对于寡聚蛋白， 各亚基内所有原子的空间排列、各个亚基的排布和亚基之间的相互作用都可以引起蛋白 质结构的变化。 蛋白质的三维结构非常复杂并且影响因素众多，限制了对蛋白质功能和性质的直接 研究。因此人们努力寻求一种建立在简单分子体系基础上的规则，并希望该规则对复杂 生物体系的行为研究具有指导意义。利用化学的理论和方法研究模型蛋白质在溶液中折 叠和去折叠过程的构象变化、化学变化、能量变化和相互作用情况，可以深入了解蛋白 质的三维空间性质，并有助于对蛋白质分子结构和功能的本质认识。 蛋白质分子呈现其生物功能，主要是在水溶液中进行的，蛋白质的水化作用是稳 定水溶液中蛋白质天然结构的重要因素，水与蛋白质的各种基团之间的相互作用以及 1 广西大学硕士掌位论文丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 其他相关的溶剂化效应，有助于水溶液中蛋白质形成稳定的折叠结构。但是大多数蛋 白质的天然环境是含有许多有机和无机物质的复杂溶剂，而不是单纯的水溶液，蛋白质 的结构和性质如蛋白质的溶解度、变性行为和酶的活性等受天然环境中存在的众多物质 的影响，因此探索介质的变化对蛋白质的结构和功能的影响具有重要意义。 1 2 溶液中蛋白质分子构象的主要研究方法和现状 研究蛋白质分子在溶液中的构象变化对阐明蛋白质结构和功能的关系，特别是酶 催化机理具有重要意义。因此，用多种实验方法来表征溶液中蛋白质分子构象及其变 化过程是必要的。近年来，荧光光谱和同步荧光光谱法、紫外可见吸收光谱法、光化 学方法和电化学方法等越来越多地应用于溶液中蛋白质的结构性能研究。 1 2 1 荧光光谱法和同步荧光光谱法 荧光是物质吸收一定波长的入射光，经过l o 母1 0 。8 秒后，发射出的波长较长的光。 能产生荧光的物质叫做荧光物质。其实质是荧光物质分子吸收电磁波能量，由基态跃迁 到激发态后，经过内转换过程，损耗一部分能量，回到第一激发态的最低振动能级，以 光子形式发射出能量。荧光物质分子在吸收不同波长的入射光后能发射出不同波长的荧 光，从而产生荧光光谱。通过对荧光光谱的特征峰及其在不同条件下的位移情况、荧光 偏振、同步荧光、能量转移效率、荧光寿命、荧光猝灭、荧光增强等的研究，可以获得 蛋白质、核酸等生物大分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况、 蛋白质分子构象变化等有用信息，同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的相 关数据。 蛋白质具有的天然荧光主要由色氨酸( t r y p t o p h a n ，简称t r p ) 残基、酪氨酸( t y r o s i n e ， 简称t ) ，r ) 残基和苯丙氨酸( p h e n y l a l a n i n e ，简称p h e ) 残基贡献【5 1 。如果蛋白质中不含t r p 残 基，只含p h e 残基和t y r 残基，则荧光光谱主要表现t y r 残基的特征，最大发射波长约为 3 0 4 r i m ，含有t r p 残基的蛋白质，荧光光谱则主要表现t r p 残基的特征，最大荧光发射波 长位- 于3 2 0 3 5 0 n m 之间【6 1 。直接测定蛋白质自身发射的荧光称为“内源荧光”，而通过 加入某些试剂( 如荧光染料) 与蛋白质结合，形成发射荧光的配合物进行测定则称为“外 源荧光”，或“荧光探针”技术。探针试剂的荧光变化实际反映的是蛋白质分子构象的 变化引起的探针试剂所处微环境的变化，故利用这种方法可以间接得到蛋白质分子构象 的变化信息。 2 广西大掌硕士掌位论文丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用量少、方法简便、信息多样等优点，因此， 近年来被广泛应用于化学生物学、分子生物学、生命化学和环境科学等领域。王彦卿3 1 等研究了单宁酸、吡虫灵、咖啡因、联苯胺及茶碱等有机小分子与h b 的相互作用，并通 过计算与h b 作用的表观结合常数、猝灭常数、结合位点数和结合反应的热力学参数探讨 有机小分子对h b 构象的影响。对h b 与药物小分子【1 4 】、表面活性剂 1 5 , 1 6 1 、金属离子【1 7 】和 有机溶剂【i s 等相互作用的研究也离不开荧光光谱，荧光光谱已经成为研究溶液中蛋白质 分子构象比较成熟的分析方法。 蛋白质的荧光主要l 土l t r p 残基和t y r 残基贡献，但由于这两种内源性生色团之间存在 能量共振转移【l 引，通常对同时含有t r p 残基和t y r 残基的蛋白质进行普通的荧光光谱检测 时，只能检测到t r p 残基的荧光，t y r 残基的荧光掩盖其中，普通荧光光谱法不能区分两 种氨基酸残基重叠的荧光峰，而同步荧光光谱可以弥补普通荧光光谱的不足。同步荧光 技术是在同时扫描激发和发射波长的情况下来测绘荧光光谱图，由测得的荧光强度信号 对发射或激发波长作图，即为同步荧光光谱。它包括固定波长和固定能量的两种同步荧 光光谱。固定波长的同步荧光光谱是指在同步扫描中，使激发波长和发射波长保持固定 的波长差( a = a 锄巩x = 常数) 的情况下进行扫描，以同步荧光信号( 相对强度) 对发射或激发 波长测绘荧光光谱图。在利用同步荧光测试样品前，龇值必须慎重选择，只有当从哈好 为某吸收带和其发射带之间的波长差时，才能观察到同步信号。一般情况下，从1 5n n l 所得到的同步荧光光谱, 显示t y r 残基的光谱特征，敞6 0a m 的同步荧光光谱显示t r p 残 基的光谱特征【2 0 1 。陆天虹等【2 1 2 2 】应用同步荧光光谱法研究了细胞色素c 和h b 在水溶液中 浓度对其构象的影响，发现在低浓度细胞色素c 主要以单体形式存在，h b 以二聚体形式 存在，随浓度的升高，细胞色素c 集聚为二聚体，而m 集聚为四聚体。r a o 2 3 1 研究了眼 晶体蛋白的同步荧光光谱，结果表明在出t = 3 0 衄1 条件下0 【、b 、丫眼晶体蛋白的同步荧光 光谱可以清楚地分开，为分析a 、1 3 、丫眼晶体蛋白提供特定的信号信息。而许金钩【2 4 】等 认为出t = 5 5m n 时进行的同步荧光扫描，可以同时测定m 残基、t y r 残基和p h e 残基的发 射光谱。 三维荧光光谱法【2 5 】是由激发波长( y 轴) 发射波长( x 轴) 荧光强度( z 轴) - - 维坐标所 表征的矩阵光谱，有等角三维投影图、激发发射矩阵与等高线光谱图三种主要表现方式。 由于比二维的平面图多了一个坐标，所得的总荧光数据比普通荧光光谱多得多，故其具 有高选择性。国内鄢远等2 6 1 将三维荧光光谱法用于测定溶液状态下的蛋白质构象，发现 该方法是一种研究蛋白质分子构象的有效方法，能直观的观察蛋白质分子在不同介质中 1 g - 西大掌硕士学位论文丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 的构象变化。 1 2 2 紫外可见吸收光谱法 紫外可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子、离子对紫外和可见光谱区辐射能 的吸收对物质进行定性、定量和结构分析的方法。待测物质分子中的电子处于一定能级 的分子轨道，受到光能激发后电子吸收能量跃迁到另一能级，各种物质由于具有不同的 分子能级和内部结构而对光的吸收具有选择性，故其产生的吸收光谱为特征谱图。由于 具有高的灵敏度和准确度，相对于其它光谱分析方法，紫外可见吸收光谱法具有仪器 设备和操作比较简单、费用低、分析速度快等优点，该方法已成为研究溶剂中蛋白质与 有机小分子相互作用中最方便、最常用的一种技术。溶剂中有机小分子与蛋白质结合后 分子结构发生变化，相应出现紫外可见吸收峰位移或谱峰宽度变化，据此可以探讨蛋 白质与有机小分子间的结合强弱和结合机理。 蛋白质分子主要是t r y 残基、t y r 残基、p h e 残基、多肽基团和一些蛋白质特殊结构产 生紫外。可见吸收光谱【2 7 1 ，其中h b 的紫外可见吸收谱图主要反映血红素、t r y 残基、t y r 残基和肽链的吸收，研究发现，血红素在4 0 5n i n 附近有s o r e t 带特征吸收峰，其单体的特 征吸收峰在6 0 0n n l 附近【2 8 1 ，h b 在5 7 5n r n 附近的吸收峰为h b 的q 链吸收谱带峰，4 9 9n m 处 为p 链吸收谱带峰【2 9 1 。a j l o o - - 等t 3 0 * j紫外可见吸收光谱确定t h b - - - 种组分：氧基 h b ( o x y h e m o g l o b i n ，简称o x y - h b ) 、去氧基h b ( d e o x y h e m o g l o b i n ，简称d e o x y h b ) 和高铁 h b ( m e t h e m o g l o b i n ，简称m e t - h b ) 。进一步研究发现，没有变性剂存在时，氧基h b 的血 红素f e 3 + 为五配位化合物，溶液中的水分子或o h - 与f e ”形成第六个配位键，当有变性剂 如尿素存在时，f e 3 + 则与肽链的远位组氨酸形成第六个配位键，成为六配位化合物高铁 血色原1 3 l 】，在碱性媒介中，高铁血色原的特征峰位于5 3 7n l t l 附近【3 2 】。 国内，冯玉英等【3 3 3 4 利用紫外可见吸收光谱研究了竹红菌素与肌红蛋白、h b 等 血红素蛋白的相互作用，他们发现竹红菌素能够使肌红蛋白和h b 的构象发生改变， 导致蛋白质分子中t r p 残基和t y r 残基所处微环境由疏水向亲水环境转变。黄晓华等则 集中研究了稀土离子与血红素蛋白的配位情况，研究对象3 5 。3 8 1 主要包括细胞色素c 、过 氧化氢酶、肌红蛋白、h b 等。张朝平等【3 9 】认为蛋白质在配位中起着阴离子配位基的作 用。此外，梁宏等【4 0 】发现乙醇诱导蛋白质的构象变化是典型的溶剂化效应，乙醇主要通 过去折叠作用导致蛋白质肽链伸展，使得t r y 残基、t r p 残基、p h e 残基暴露在水环境中， 使得吸收谱带蓝移和吸收强度增大。 4 广西大掌硕士掌位论文丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的1 影响 1 2 3 动态光散射技术 动态光散射技术( d l s ) 4 q 是借助光子相关原理，检测因布朗运动而产生的散射光强 的涨落，从而得到散射质点动态行为的信息。该技术通过分析散射光强的自相关函数， 可以得到分子的平动扩散系数d o ，而d o 与自由运动分子的流体动力学半径是相联系的： d o = 拓t 6 x r l r ，式中知绳热力学能量，玎是溶剂的粘度系数，是流体动力学半径。所得 数据处理后可得到粒子的动态行为基本参数如流体动力学半径、粒径分布等信息。 动态光散射技术对样品的实时、无扰、快速测量，已经在生命科学、化学生物学、 分子生物学等领域得到了广泛的应用。c z u r y l o 等【4 2 】研究钙调蛋白的流体力学特性并建 立钙调蛋白的椭球模型，证明动态光散射技术对生物材料结构的无损测定功能。动态光 散射研究溶菌酶的结晶性能发现【4 3 1 ，起沉淀剂作用的盐对多色散性的影响较大，而一定 范围的蛋白质浓度不会影响蛋白质聚合性质。 动态光散射技术是一种研究宏观大分子体系的有力工具，尽管d l s 的解析能力不如 x 一射线晶体学方法和n m r 光谱法，但是它可以提供粒子在溶液中平动和转动的信息， 这些性质对分子的大小、形状以及分子间的相互作用非常敏感，因此常用于表征蛋白质、 d n a 等生物大分子整体尺寸和构象的变化4 5 1 。应用动态光散射法，t a k a y a m a l 4 6 】发现 a t p 可以使竿状的合成肌纤维蛋白变短变细，并促进纤维蛋白的解聚。我们实验室 4 7 - 4 9 应用动态光散射技术分析了牛血清白蛋白在异丙醇、正丙醇、叔丁醇与水混合溶剂中的 构象变化，结果表明，低浓度混合溶剂可以削弱蛋白质疏水基团间的疏水相互作用，而 高浓度混合溶剂形成胶束，削弱了蛋白质的变性作用，从而为了解醇类物质对水溶液中 蛋白质构象的影响提供了直接的证据。 1 2 4 电化学方法 构成生物体新陈代谢的几乎全部化学反应都是在活性蛋白质酶的催化下进行的， 生物体中最基本的运动就是电荷的运动，电化学方法是揭示生命奥秘的有力工具。采用 电化学方法研究生物大分子与小分子的相互作用，在一定程度上受电活性的限制，但对 于吸收光谱较弱，或由于其电子跃迁谱带与大分子本身的吸收发生重叠而无法用诸如紫 外可见吸收光谱等方法来研究的生物大分子，却可用电化学方法进行研究并获得其它 方法无法得到的信息。 循环伏安法具有电化学光谱的美誉，主要是通过研究蛋白质的氧化还原特性，探讨 其在混合溶剂中构象的变化。m a t h e s o n 和n i c k o l 最早应用循环伏安法，随后k e m u l a 和 5 广西大学硕士掌位论文 丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 k u b l i 发展了这种方法，并将其应用于有机化合物的研究。早期的电化学方法研究蛋白质 主要是加入媒介剂和促进剂加速电子交换速率，研究表明【5 0 。5 2 1 ，媒介剂和促进剂与蛋白 质相互作用形成复合物使蛋白质肽链舒张，疏水结构被打开，使电活性中心暴露在电极 表面。近年来，众多学者运用循环伏安法研究了蛋白质的构象，主要方式是研究蛋白质 与有机小分子相互作用，间接分析蛋白质构象的变化。研究对象5 3 。5 9 l 主要为l i b 、辣根过 氧化酶、细胞色素、肌红蛋白等氧化还原蛋白质，研究内容主要是分子间的非共价相互 作用。研究发现，扩散系数对结合反应很灵敏，因此这一参数对测定结合参数非常重要， 同时，氧化还原峰位的改变也有助于估算结合强度，特别是表观标准电动势的改变与氧 化态和还原态分子的相对结合强度密切相关。 电化学方法研究混合溶剂中蛋白质的结构功能变化主要受蛋白质电化学活性的限 制，为了获得更好的电活性，各种生物传感器在生物、医学、环境检测、食品、医药等 领域被广泛研究和应用。 1 3 选题思路 蛋白质是生物体中必不可少的基本物质，是构成原生质的主要成分和生命现象的物 质基础，在生物体的生命活动中起着重要的作用。有关蛋白质的各种研究是当前生命科 学、化学生物学、药学及临床医学等领域所共同感兴趣的课题。 生物体内的环境主要是水，蛋白质的水化作用是稳定水溶液中球形蛋白质天然结构 的一个重要因素，水和蛋白质的各种官能团之间的特殊相互作用及其它相关的溶剂效 应，有助于蛋白质在水溶液中形成稳定的折叠结构，因此水作为生物分子的介质其意 义是不言而喻的。但是大多数蛋白质的天然环境并不是单纯的水溶液，而是含有许多 有机和无机物质的复杂介质，蛋白质分子在混合溶剂中的结构和性质与其在水溶液中 的性质是大不相同的，因此探索溶剂介质变化对蛋白质分子构象的影响具有重要意 义。 醇类物质同时具有极性和非极性双功能基团，与蛋白质的相互作用包含了亲水相互 作用和疏水相互作用的平衡，可用作研究亲水相互作用和疏水相互作用的模型分子。研 究显示 6 0 石2 1 ，典型的一元醇，如甲醇、乙醇、丙醇总体上破坏蛋白质的天然结构和增加 仅一螺旋结构的稳定性，但低浓度的醇水混合溶剂对蛋白质的结构具有轻微的稳定作用； 多元醇则对球蛋白起稳定作用。醇类物质与蛋白质的相互作用已有大量报道，但到目前 为止，人们对其相互作用机理的认识还存在分歧【6 3 。6 5 1 。 6 广西大掌硕士掌位论文 丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 尿素则是一种特殊的蛋白质的变性剂，许多研究者发现尿素在低浓度对蛋白质具有 稳定作用，在高浓度对蛋白质具有去折叠作用。近年来，通过大量试验和理论研究，科 研工作者对尿素诱导蛋白质去折叠的机理有了一定了解，但至今仍未达成共识。主要观 点可分为间接作用和直接作用两类。间接作用【6 6 1 认为尿素在蛋白质水化层富集并结合到 蛋白质表面疏水空穴中，破坏了蛋白质周围水分子的网状结构，削弱了蛋白质分子内疏 水相互作用而导致蛋白质去折叠。直接机理【6 7 1 贝i j 认为尿素与蛋白质的非极性氨基酸残基 形成氢键可以将水分子排开而削弱蛋白质分子内疏水相互作用，尿素与蛋白质的极性氨 基酸残基形成氢键要强于水分子，这些因素均可导致蛋白质去折叠。这两种观点分别得 到实验和理论研究的支持1 6 8 , 6 9 。 血红蛋白( h e m o g l o b i n 简称h b ) 是血液中红细胞的主要成分，在生物体内具有氧载 体功能、电子传递功能、生物催化功能以及生物传感功能，参与与氧和能量代谢有关的 重要活动，在人及各种生物体的代谢中起着关键作用。h b 是最早获得结晶的蛋白质之一， 是第一个被精确测量分子量的蛋白质，又是第一个用x 射线分析法阐明完整的空间结构 的蛋白质。近几十年来，科研工作者通过各种试验方法研究t h b 的结构和功能【7 0 7 2 1 ，并 积累了丰富的信息，使得h b 成为研究蛋白质构象和功能关系常用的模型分子【7 3 , 7 4 j 。 论文选取h b 丙三醇水、h b 尿素水与h b 丙三醇尿素水三个体系作为研究对 象，利用电化学工作站、激光粒度仪、荧光分光光度计和紫外可见分光光度计，多手 段、多参数研究表征h b 在丙三醇水、尿素水、丙三醇尿素水混合溶剂中的构象变化。 主要的研究内容包括以下几个方面： ( 1 ) h b 在丙三醇水混合溶剂中的构象变化 运用动态光散射技术测定h b 在丙三醇水混合溶剂中的流体动力学半径，并利用电 化学工作站记录h b 的循环伏安曲线，计算其氧化还原峰位差与表观标准电动势，同时测 定h b 在丙三醇水混合溶剂中的发射荧光光谱和同步荧光光谱，并以常见的生物染料联 苯胺为猝灭剂，考察h b 与联苯胺之间的共振能量转移，结合紫外可见吸收光谱计算联 苯胺与h b 的结合距离，探讨水溶液中丙三醇与h b 的相互作用及其对h b 构象的影响。 f 2 ) h b 在尿素水混合溶剂中的构象变化 运用电化学工作站记录h b 在尿素水混合溶剂中的循环伏安曲线，计算其氧化还原 峰位差与表观标准电动势，测定h b 在尿素一水混合溶剂中的发射荧光光谱和同步荧光光 谱和同步荧光光谱、同步荧光光谱和紫外可见吸收光谱，并以常见的生物染料- 联苯胺 为猝灭剂，考察h b 与联苯胺之间的共振能量转移，计算联苯胺与h b 的结合距离，并结 7 广西大掌硕士学位论文 丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 合动态光散射技术测定的h b 在尿素水混合溶剂中的流体动力学半径，分析水溶液中尿 素与h b 的相互作用及其对h b 构象的影响。 ( 3 ) h b 在尿素丙三醇水混合溶剂中的构象变化 运用动态光散射技术测定h b 在丙三醇尿素水混合溶剂中的流体动力学半径，结合 h b 在丙三醇尿素水混合溶剂中的发射荧光光谱、同步荧光光谱和紫外可见吸收光谱， 研究水溶液中丙三醇、尿素与h b 的相互作用及其对h b 构象的影响。 8 广西大掌硕士掌位论文 丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 2 1 引言 第二章丙三醇水混合溶剂对血红蛋白构象的影响 血红蛋白( h b ，相对分子质量6 4 5 0 0 d a ) ，由珠蛋白和血红素辅基组成，是动物体内 最重要的蛋白质之一，具有运输0 2 和c 0 2 、调节p h 的功能，其结构的改变与多种疾病密 切相关【7 5 1 。h b 的生物功能与其结构具有密切关系，在过去的几十年中，国内外研究者 利用各种手段对h b 的结构和功能、电化学行为、有机小分子与h b 的相互作用等方面进 行了深入的研究【7 0 - 7 9 1 ，积累了丰富的信息，使得h b 成为研究蛋白质构效关系常用的模型 分子。 醇类物质同时具有极性和非极性双功能基团，与蛋白质的相互作用包含了亲水相互 作用和疏水相互作用的平衡，研究醇类物质对蛋白质的影响有助于理解蛋白质在水溶液 中结构的专一性。丙三醇是重要的生物活性物质，具有许多独特的物理化学性质8 0 , 8 1 】， 特别需要指出的是，丙三醇是最常用的蛋白质结构稳定剂，5 0 的丙三醇水混合溶剂被 认为是保存酶和蛋白质的理想介质。尽管文献已有大量报道，但是人们对丙三醇水混 合溶剂中蛋白质构象是否发生改变这一核心问题还存在争议。电化学研究表明，丙三醇 在不改变血红素微环境的情况下影响血红蛋白的电子传递能力【8 2 】，而s a g e 7 6 l 乘l b a t e f i 7 7 】 则认为丙三醇改变了肌红蛋白血红素疏水空腔的构象并对其功能造成影响。 本章运用荧光猝灭法和动态光散射技术，结合荧光光谱分析法、紫外可见吸收光 谱分析法和循环伏安法，研究h b 在丙三醇水混合溶剂中的构象变化。h b 能与许多内源 和外源性药物分子以及生物活性小分子可逆地结合【8 3 8 5 】，并由于共振能量转移而发生荧 光猝灭。荧光共振能量转移光谱法是测量生物大分子作用位点之间的距离和研究生物大 分子构象变化的“光谱尺”，因此本文以一种常见的生物染料联苯胺( b e n z i d i n e ，简称b z ) 为猝灭剂，考察h b 与b z 之间的能量转移，计算了两者的结合距离，并结合h b 在丙三醇一 水混合溶剂中荧光光谱、吸收光谱和电化学性质，分析丙三醇- 水混合溶剂中h b 构象的 变化。动态光散射( d l s ) 是一种研究宏观大分子体系的有力工具，尽管d l s 的解析能力 不如x 一射线晶体学方法和n m r 光谱法，但是它可以提供粒子在溶液中平动和转动的信 息，这些性质对分子的大小、形状以及分子间相互作用非常敏感，因此常用于表征蛋白 质、d n a 等生物大分子整体尺寸和构象的变化m 4 5 1 。因此，论文进一步以动态光散射法 9 - 西大学硕士掌位论文丙三醇和尿素对水溶液中- x - 白质构象的影响 测定了h b 在丙三醇水混合溶剂中的流体动力学半径( h y d r o d y n a m i cr a d i u s ) ，为深入分析 丙三醇与蛋白质相互作用的机理提供更多的信息。 2 2 基本原理与基本概念 2 2 1 共振能量转移 根据f 6 r s t e r 共振能量转移理论，当两种化合物分子满足以下条件时，将会发生共振 能量转移现象：( 1 ) 能量给体能发射荧光，( 2 ) 能量给体的发射荧光光谱与能量受体的吸 收光谱有足够重叠，( 3 ) 能量给体与能量受体足够接近，最大距离不超过1 0m 【8 6 1 。 2 2 2 能量转移效率e 能量转移效率可由下式得到： e = i 一凡 ( 2 - 1 ) 式中聊丹分别为加入猝灭剂和不加猝灭剂时的荧光强度。 2 2 3 光谱重叠积分 给体的发射荧光光谱与受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分： ，_ f r 五) q ) d 硝，u ) d 2( 2 - 2 ) 砌) 为荧光给体在波长a 处的荧光强度，8 为受体在波锨处的摩尔吸光系数。 2 2 4 临界距离尺。 能量转移效率为5 0 时的临界距离，为能量给体与受体的结合距离。 r 0 6 - - 8 7 9 10 - 2 5 矿4 ( 2 3 ) 炉为偶极空间取向因子，为介质的折光指数，咖为给体的荧光量子产率，崩光谱 重叠积分。 2 2 5 结合距离r 根据f 6 r s t e r 共振能量转移理论，给体与受体的能量转移效率e 与两者的结合距离和 临界能量转移距离有关佟7 】： e 爿o 6 ( r o6 + ( 2 4 ) j j c o 为能量转移效率为5 0 时的临界距离，为能量给体与受体的结合距离。 2 2 6 溶剂化作用 在液态和固态，分子实体与环境之间存在着相互作用，即溶剂化现象。溶剂化就是 溶质分子或离子的周围存在一层与其相互作用的溶剂分子，溶剂化作用是溶剂与溶质之 间存在的分子间力【8 引，这种分子间力通常有两种类型：非专一性作用力( 分子间偶极力、 1 0 广西大掌硕士掌位论文丙三醇和尿素对水溶液中蛋白质构象的影响 偶极偶极力、偶极诱导偶极力、离子诱导偶极力) 和专一性作用力( 氢键结合力和电荷 转移作用力) 。 2 2 7 水的结构 液态水的结构和性质，一般归因于它仍然保留着晶体冰的四面体结