（动物学专业论文）几种免疫促进剂对刺参幼参体腔液免疫活性的影响.pdf

摘要 刺参( a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u s ) 体腔细胞是其免疫防御的主要效应细胞。近年来， 通过免疫促进剂来激活水产动物的免疫功能，提高其免疫力以抵抗疾病成为研究的热点 之一。本文采用先进的流式细胞术结合显微形态观察技术对刺参体腔细胞的分类进行了 研究，并结合生化测定的方法对酵母聚糖( z y m o s a n ，z y m ) 、脂多糖( l i p o p o l y s a c c h a d d e s ， l p s ) 和自行提取的香菇多糖( l e n t i n a n ，l n t ) 粗品三种常见多糖类免疫促进剂及二氢 吡啶( d i l u d i n ，d i l ) 合成类免疫促进剂对刺参幼参体腔液免疫活性的影响进行了研究。 运用两种形态学方法包括活体细胞直接观察法和瑞氏染色法对刺参体腔细胞进行 分类。活体细胞直接观察法依据细胞的大小和形态特征将刺参的体腔细胞分为六类，包 括颗粒细胞、透明细胞、圆形细胞、晶体细胞、变形吞噬细胞和拟淋巴细胞，其中颗粒 细胞依据细胞和颗粒的大小可以分为小颗粒细胞和大颗粒细胞；瑞氏染色法依据体腔细 胞的染色情况，除发现上述六种体腔细胞外，还进一步发现了球形细胞和变核细胞，依 据染色情况的不同颗粒细胞可以分为嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。同 直接观察法对比分析，我们推测小颗粒细胞可能为嗜酸性粒细胞，大颗粒细胞可能为嗜 碱性粒细胞和嗜中性粒细胞。 运用流式细胞术依据细胞的前向角散射光( f o r w a r dl i g h t s c a t t e r , f s c ) 和侧向角散射 光( s i d el i g h t - s c a t t e r , f s c ) 特性的不同对刺参体腔细胞进行分群。f s c 和s s c 二维图分 析发现：刺参的体腔细胞可以分为四个类群，即r 1 、r 2 、r 3 和r 4 ；各类群细胞的组 成比例依次为：2 5 1 2 2 0 6 0 ，3 1 8 4 1 2 7 5 ，3 2 3 5 1 3 8 1 9 6 和9 1 2 6 3 6 ，但各 群细胞所占的比例存在很大的波动性。结合组织学分类结果推测r l 群细胞可能是拟淋 巴细胞和透明细胞，r 2 群细胞可能主要为变形吞噬细胞和嗜酸性粒细胞；r 3 群细胞可 能主要为嗜中性粒细胞；r 4 群细胞可能主要为嗜碱性粒细胞。 不同浓度的免疫促进剂体外孵育刺参幼参体腔液1 h 后，测定其体腔细胞的组成、吞 噬率、死亡率及体腔液中几种免疫相关酶的活力。结果显示：一定浓度的z y m 、l n t 粗品和d i l - - - 种免疫促进剂均能提高刺参幼参体腔细胞的吞噬率，降低其死亡率，同时 还能增强体腔液中过氧化物酶( m y e l o p e r o x i d a s e ，m p o ) 、碱性磷酸酶( a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ，a k p ) 和酸性磷酸酶( a c i dp h o s p h a t a s e ，a c p ) 的活力，从而提高了刺参 幼参体腔液的免疫活性，但对过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 活力起抑制作用。 给刺参幼参投喂含免疫促进剂的饲料3 ，6 ，9 ，1 2 ，1 8 和2 4 d 后，采用流式细胞术测 定其体腔细胞的吞噬率和死亡率。结果显示：投喂含一定剂量的z y m 、l n t 粗品或d i l 任一种免疫促进剂的饲料一段时间后，均能提高刺参幼参体腔细胞的吞噬率，降低其死 亡率，从而增强了刺参幼参体腔细胞的吞噬活性和生存能力。 此外，采用正交实验设计研究了不同剂量的l n t 、脂多糖( l i p o p o l y s a c c h a r i d e s ， l p s ) 和d i l 作为饲料添加剂投喂刺参幼参4 ，8 和1 2 d 后，其体腔细胞的吞噬率和死 亡率的变化。结果显示：投喂一段时间后，三种免疫促进剂也均能增强刺参幼参体腔细 胞的吞噬活性和生存能力。本研究所用三种物质的最适添加剂量分别为：l n t 为 2 0 0 5 0 0 m g k g ，l p s 为5 0 l o o m g 1 5 0 9 ，d i l 为2 0 0 - - - 3 0 0 m g k g ，但d i l 和l p s 的添加 剂量还可以在此剂量范围的基础上，进行更低剂量的探讨。 以上结果表明本研究中所用的z y m 、l n t 粗品、l p s 和d i l 四种免疫促进剂在某种 程度上均能增强刺参幼参体腔液的免疫活性，且作用效果与时间和剂量有关，但均不表 现明显的时间和剂量效应增强关系。本研究既丰富了棘皮动物免疫的研究资料，同时又 为刺参饲料的生产及养殖过程中病害的防治提供新的思路和方法。 关键词：刺参；免疫促进剂；流式细胞术；体腔液；免疫活性 2 a b s t r a c t i ne c h i n o d e r m , t h ec i r c u l a t i n gc o l e m o c y t e sw e r et h em a i ne f f e c t i v ec e l l sw h i c hh a v eb e e n p o s t u l a t e d t o p l a y a r t i m p o r t a n t r o l ei nh u m o r a la n dc e l l u l a r i m m u n e r e s p o n s e s i m m u n o s t i m u l a n t sc o u l da c t i v a t et h ei m m u n ef u n c t i o no fa q u a t i ca n i m a l sf o ri n c r e a s i n gt h e i r i m m u n i t y ，t h e r e b yp r e v e n t i n gi n f e c t i o u sd i s e a s e s i nr e c e n ty e a r s ，t h i st e r mh a db e c o m eah o t s p o to fr e s e a r c h i nt h i ss t u d y , t h ec l a s s i f i c a t i o no fc o e l o m o c y t e so fa p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s w a ss t u d i e d 、析n la d v a n c e df l o wc y t o m e t r ym e t h o d s ( f c m ) c o m b i n e dw i t hm o r p h o l o g i c a l m e t h o d ，a n dt h ee f f e c t so ft w oc o m m o np o l y s a c c h a r i d ei m m u n o s t i m u l a n t si n c l u d i n gz y m o s a n ( z y m ) a n ds e l f - e x t r a c t e dc r u d el e n t i n a n ( l n t ) ，a n dd i l u d i n ( d i l ) ，ak i n do fs y n t h e t i c i m m u n o s t i m u l a n t , o nt h ec o e l o m i cf l u i di m m u n i t yo ft h ea p o s t i c h o p u sj a p o n i c u sj u v e n i l e s w e r es t u d i e db yf c mc o m b i n e d 、衙mb i o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o nm e t h o d t w om o r p h o l o g i c a lc l a s s i f i c a t i o nm e t h o d s i n c l u d i n gd i r e c to b s e r v a t i o nm e t h o da n d w r i g h t s t a i n e dm e t h o dw e r eu s e dt oi d e n t i f yt h ec o e l o m o c y t e so ft h ea p o s t i c h o p u s j a p o n i c u s a l t o g e t h e rs i xt y p e so fc e l l sh a db e e nr e c o g n i z e da n dd e s c r i b e db yt h e i rs i z ea n d m o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n ：g r a n u l o c y t e s ，h y a l i n o c y t e s ，r o u n dc e l l s ，c r y s t a lc e l l s ， p h a g o c y t e sa n dl y m p h o c y t e s - l i k e ，a n d 、) l ，i 廿lt h ed i r e c to b s e r v a t i o nm e t h o dt h eg r a n u l o c y t e s c o u l db ed i v i d e di n t os m a l lg r a n u l o c y t e sa n d l a r g eg r a n u l o c y t e sb a s e do nt h es i z eo fc e l l sa n d g r a n u l o s ai n s i d et h ec e i l s ，b u t 谢mt h ew r i g h t s t a i n e dm e t h o dt h e yc o u l db ed i v i d e di n t o e o s i n o p h i l i cg r a n u l o c y t e s ，b a s o p h i l i cg r a n u l o c y t e sa n dn e u t r o p h i l i cg r a n u l o c y t e sa c c o r d i n gt o t h ed i f f e r e n ts t a i n i n go fg r a n u l o s ai n s i d et h ec e l l s i na d d i t i o n , 、析吐lw r i g h t - s t a i n e dm e t h o d s p h e r i c a lc e l l sa n dn u c l e u s - c h a n g e dc e l l sc o u l da l s ob er e c o g n i z e d c o m p a r e d 、 ，i t l lt h ed i r e c t o b s e r v a t i o nm e t h o d ，w es p e c u l a t e dt h a tt h es m a l l g r a n u l e c e l l sm a yb ee o s i n o p h i l i c g r a n u l o c y t e sa n dl a r g eg r a n u l o c y t e sc e l l sm a yb eb a s o p h i l i cg r a n u l o c y t e sa n dn e u t r o p h i l i c g r a n u l o c y t e s w i t ht h ef l o wc y t o m e t r y 伊o u p i n gm e t h o dt h ec o e l o m o c y t e sh a v eb e e nc l a s s i f i e di n t of o u r d i s t i n c ts u b p o p u l a t i o n sa c c o r d i n gt ot h ep r o t o c o l sf o rf l o w - c y t o m e t r i cc h a r a c t e r i z a t i o n , t h e f o r w a r dl i g h t - s c a t t e r ( f s c ) a n ds i d el i g h t s c a t t e r ( s s c ) s i g n a l sf r o me a c hi n d i v i d u a l ， i n c l u d i n gr 1 ，r 2 ，r 3a n dr 4 t h ef o u rs u b p o p u l a t i o n sa c c o u n t e df o r2 5 12 士2 0 6 0 ， 3 1 8 4 + 1 2 7 5 ，3 2 3 5 + 1 3 8 1 ，9 1 2 - q = 6 3 6 o ft h et o t a lc o e l o m o c y t e s ，r e s p e c t i v e l y , b u tt h e p r o p o r t i o no fc e l l sw e r en o ts t a b l e c o m b i n i n gt h er e s u l t so fh i s t o l o g i cc l a s s i f i c a t i o nw e 3 s p e c u l a t e dt h a tr 1g r o u pc e l l sm a yb el y m p h o c y t e sa n dh y a l i n o c y t e s ，r 2g r o u pm a i n l ym a y b ep h a g o c y t e sa n de o s i n o p h i l i eg r a n u l o c y t e s ，m o s to fr 3g r o u pc e i l sm a yb en e u t r o p h i l i c g r a n u l o c y t e sa n dt h em a i no fr 4g r o u pc e l l sm a yb eb a s o p h i l i cg r a n u l o c y t e s t h ec o e l o m i cf l u i do fa p o s t i c h o p u sj a p o n i c u sj u v e n i l e sw e r ei n c u b a t e d 、析md i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so ft h r e ek i n d so fi m m u n o s t i m u l a n t si n c l u d i n gz y m ，c r u d el n ta n dd i li n v i t r of o ro n eh o u ra n dt h ep a r a m e t e r so fn o n - s p e c i f i cd e f e n c em e c h a n i s m s ，i n c l u d i n g p h a g o c y t i cr a t e a n dm o r t a l i t yr a t eo ft h ec o l e m o c y t e sa n dt h ea c t i v i t i e so fs e v e r a l i m m u n e - r e l a t e de n z y m e si nt h ec o e l o r n i cf l u i df r o ma p o s t i c h o p u sj a p o n i c u sj u v e n i l e sw e r e p e r f o r m e di m m e d i a t e d l ya f t e ra d m i n i s t r a t i o n n l er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt 1 1 a tz y m ，c r u d el n t a n dd i l ，t h r e ei m m u n o s t i m u l a n t sa l lc o u l dn o to n l yi n c r e a s et h ep h a g o c y t i cr a t ea n dr e d u c e t h em o r t a l i t yr a t e ，b u ta l s oi n c r e a s et h ea c t i v i t i e so ft h em y e l o p e r o x i d a s e ( m p o ) ，a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( a k p ) a n da c i dp h o s p h a t a s e ( a c p ) i nt h ec o e l o m i cf l u i do fa p o s t i c h o p u s j a p o n i c u s ，s ot h ei m m u n i t yo ft h e c o e l o m i ef l u i do fa p o s t i c h o p u sj a p o n i c u se o u l eb e i n c r e a s e d ，b u tt h ea c t i v i t i e so fc a t a l a s e ( c a t ) w e r ei n h i b i t e d t h ej u v e n i l e so f a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u sw e r ef e d 、i t ht h ef o o dc o n t a i n e dac e r t a i nd o s eo f o n ek i n do fa b o v e - m e n t i o n e di m m u n o s t i m u l a n t sa n dt h ep a r a m e t e r so ft h ec o m p o s i t i o n , p h a g o c y t i cr a t ea n dm o r t a l i t yr a t eo ft h ec o l e m o c y t e sw e r ep e r f o r m e da f t e rf e d3 ，6 ，9 ，1 2 ，18 a n d2 4d a y s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tz y m ，c r u d el n ta n dd i l ，t h r e ei m m u n o s t i m u l a n t sa s ak i n do ff e e da d d i t i v ea f t e rap e r i o do ft i m ec o u l da l li n c r e a s et h ep h a g o c y t i cr a t ea n dr e d u c e t h em o r t a l i t yr a t e ，s ot h ep h a g o c y t i ca c t i v i t ya n ds u r v i v a lo ft h ec o e l o m o c y t e sj u v e n i l e s e n h a n c e d ，t h e r e f o r et h ei m m u n i t yo ft h ec o e l o m i cf l u i do fa p o s t i c h o p u sj a p o n i c u sc o u l db e i n c r e a s e d i na d d i t i o n , t h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n td e s i g nt h ej u v e n i l e so f a p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s w e r ef e d 、7 i ，i lt h es p e c i a lf 0 0 dc o n t a i n e dd i f f e r e n td o s e so ft h el n t , l i p o p o l y s a c c h a r i d e s ( l p s ) a n dd i la sf e e da d d i t i v e sa n dt h ep a r a m e t e r so ft h ec o m p o s i t i o n , p h a g o c y t i cr a t ea n d m o r t a l i 够r a t eo f t h ec o l e m o c y t e sw e r ed e t e r m i n e da t4 ，8a n d12d a y sa f t e rt h es p e c i a lf o o d a d m i n i s t r a t i o n t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tc r u d el n t ，d i la n d l p s ，t h r e e i m r n u n o s t i m u l a n t sa sf e e da d d i t i v e sa f t e rf e dap e r i o do ft i m ec o u l da l le n h a n c et h e p h a g o c y t i ca c t i v i t ya n ds u r v i v a lo ft h ec o e l o m o c y t e so f a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u sj u v e n i l e s ，t o o ； i nt h i ss t u d yt h eo p t i m a ld o s e so ft h ec r u d el n tw a sf r o m2 0 0 m g k gt o5 0 0 m g k g ，t h ed i l w a sf r o m2 0 0 m g k gt o3 0 0 m g k ga n dl p sw a sf r o m5 0 m g 15 0 9t olo o m g 15 0 9 ，b u tt h e 4 o p t i m a ld o s e so ft h ed i la n dl p st e n dt of u r t h e rl o w e r , w h i c hw o u l db en e c e s s a r yt os t u d y m 0 i e 舢li na l l ，t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ei m m u n o s t i m u l a n t su s e di nt h i ss t u d yi n c l u d i n g z y m ，c r u d el n t , l p sa n dd i l ，c o u l da l le n h a n c et h ei m m u n i t yo ft h ec o e l o m i cf l u i do f a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u st oac e r t a i ne x t e n t , a n dt h ee f f e c to fi m m u n o s t i m u l a n t sw a sr e l a t e dt o t h et i m ea n dd o s e so fa d m i n i s t r a t i o n , b u td i d n ts h o wac l e a rc o r r e l a t e t h i ss t u d yn o to n l y e n r i c h e dt h er e s e a r c hi n f o r m a t i o no fi m m u n i t y , b u ta l s op r o v i d en e wi d e a sa n dm e t h o d st o a q u a c u l t u r ep r o d u c t i o nf o rd i s e a s ep r e v e n t i o na n dc o n t r 0 1 k e yw o r d s ：a p o s t i c h o p u s j a p o n i c u s ；i m m u n o s t i m u l a n t s ；f l o wc y t o m e t r y ：c o e l o m i cf l u i d ； i m m u n i t y 5 英文缩写 d i l z y m l n t l p s h 2 0 2 c a t m p o a c p 姗 i l p b s s s f l e c f s w 符号说明 英文全称 d i l u d i n z y m o g a n l e n t i n a n l i p o p o l y s a e c h a r i d e s h y d r o g e np e r o x i d e c a t a l a s e m y e l o p e r o x i d a s e a c i dp h o s p h a t a s e a l k a l i n ep h o s p h a t a s e i n t e r l e u k i n p h o s p h a t eb u f f e r r i ss o l u t i o n s e as t a rf a c t o r l e c t i n f i l t e rs e aw a t e r 中文名称 二氢吡啶 酵母聚糖 香菇多糖 脂多糖 过氧化氢 过氧化氢酶 髓过氧化物酶 酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 白细胞介素 磷酸盐缓冲液 海星因子 凝集素 无菌抽滤海水 鲁东大学学位论文原创性声明和使用授权说明 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：互盈塬节 日期：) 叼罗年 ；月。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权鲁东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密曰。不保密回。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者签名：孑浩蠲p 导师签名：三龟粒 日期：p 夕年多月o 日 日期：w 7 年6 月。日 鲁东大学硕士学位论文 几种免疫促进剂对刺参幼参体腔液免疫活性的影响 引言 刺参( a p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s ) 隶属无脊椎动物中高等的类群棘皮动物门 ( e e h i n o d e r m a t a ) 、海参纲( h o l o t h u r o i d e a ) ，主要分布在日本、朝鲜及俄罗斯远东近海， 在我国主要分布在辽宁、河北及山东沿海f l , 2 1 。刺参喜生活于岩礁底或沙泥底质的浅海中， 特别喜在海藻繁茂的地方，摄取海底表层的沉积物，纯泥底很少有刺参分布。刺参生长 最适温度为l o 1 5 ，高水温期会躲在岩石下或洼处不活动，身体收缩并变硬，进行夏 眠。刺参与多数棘皮动物一样，属于狭盐性动物，最适盐度为2 6 , - - 3 2 9 6 0 。为雌雄异体， 其雌性生殖腺为橘红色，雄性为乳自色或是浅黄色【3 j 。此外，刺参的再生能力很强。如 受到刺激或因水质过混浊、温度变化过大等均可产生“排脏现象 ，以后在适宜条件下 又可长出，甚至在将身体一分为二切断的情况下，部分仍可成活【4 】。刺参因其含有丰富 的蛋白质和粘多糖等营养物质，而被列为“海产八珍之一，是一种药膳和滋补食品， 具有很高的营养保健和医用价值，也是我国有记载的2 0 余种食用海参中食用价值最大， 且唯一分布于黄渤海海域的温带品种【3 】，烟台及周边地区都有分布，但自然资源远远满 足不了人们的需求，发展入工增殖养殖有着理想的经济效益和良好的前景，因此刺参养 殖迅速发展起来。近年来，病害大规模爆发如寄生虫病和腐皮综合症等，给刺参养殖业 带来巨大的损失。目前关于刺参的研究主要集中在组织形态结构，营养成分分析，养殖 条件及腐皮综合症等常见病的致病机制等的研究上，关于其免疫学上的研究报道相对较 少。 免疫促进剂( i m r n u n o s t i m u l a n t s ) 是指具有促进或诱发宿主防御反应、增强生物机体抗 病能力的一类物质。比如：多糖类、激素、维生素类、细菌的细胞组成物质、生物活性 物质、中草药制剂类药物和人工合成类药物。这些物质不仅能增强动物的抗病毒、真菌、 细菌及寄生虫的感染能力，而且作为饲料添加剂还可提高饲料的利用率和生产性能，减 少了动物的用药量，有利于绿色产品的生产，克服了传统抗生素防治方法中出现的抗药 性，内源性毒害及药物残留等弊端1 5 8 】。因此，在国家对抗生素等这类药品的使用已作 了严格限制的情况下【9 】，近年来通过口服、注射或浸浴免疫促进剂等，激活水产养殖动 物的免疫功能，提高免疫力来抵抗疾病成为研究的热点之一。多糖类物质是水产动物研 究中最为常用的免疫促进剂，在贝类【10 1 、甲壳类动物【1 1 1 及鱼类中1 2 1 的一些养殖的经济 1 鲁东大学硕士学位论文 种类中都有不少报道，并取得了相当多的成果。s a n t i a g o c a r d o m 等【1 3 】的研究表明，向 海参体腔中注射一定剂量的脂多糖( l i p o p o l y s a c c h a r i d e s ，l p s ) 能增强海参体腔细胞的 吞噬活性，2 0 0 7 年刘云等【1 4 1 将海藻硫酸多糖和壳聚糖作为饲料添加剂投喂刺参，能改善 和提高刺参的非特异性免疫。目前海参中关于这方面的报道相对较少，香菇多糖 ( l e n t i n a n ，l n t ) 和酵母聚糖( z y m o s a n ，z ) 在海参中更尚未见有报道。二氢毗 啶( d i l u d i n ，d i l ) 是一种人工合成类药物，作为我国农业部批准的新兽药类绿色饲料 添加剂，在禽畜养殖上有大量的应用报道，具有广泛的生物学功能，有研究表明二氢吡 啶具有促进水产动物生长，改善产品品质，提高繁育性能以及免疫功能等多种功能，故 在水产饲料方面的应用前景也非常乐观，现仅鱼类和中华鳖【1 7 】中有相关的报道， 在刺参饲料中尚未见有添加二氢吡啶的报道。 本实验采用流式细胞术、显微观察方法和生化测定等方法研究香菇多糖、酵母聚糖、 脂多糖和二氢吡啶四种免疫促进剂对刺参幼参体腔液免疫活性的影响，并初步探讨刺参 的免疫调节机制，为水产养殖生产中应用免疫促进剂来提高养殖刺参的免疫水平和增强 其对感染性疾病的抵抗力提供参考，同时也为棘皮动物免疫学研究积累基础资料。 2 鲁东大学硬士学位论文 棘皮动物免疫机制的研究进展 棘皮动物属于无脊椎后口动物。最早对棘皮动物免疫机制进行研究的是俄国学者 m e t c h n i k o f f , 他早期首次运用比较免疫的方法对棘皮动物的受伤和炎症反应机制进行了 研究【l 引。作为当时的细胞免疫学派，他认为炎症是重要的病理学症状并于1 8 9 0 年提出 吞噬作用是机体免疫防御的主要手段【1 9 1 。为了支持他的细胞炎症理论，1 8 9 3 年 m e t c h n i k o f f 观察到在自然状态下一种海星a s t r o p e c t e np e n t a c a n t h u s 的羽腕幼虫对物理性 的伤害或被海藻侵染都会产生反应，这些最初的观察吸引着m e t c h n i k o f f 在细胞免疫学 方面进行了一系列的基准实验，通过实验他认为吞噬细胞的吞噬作用是棘皮动物机体主 要的防御手段。在1 9 0 8 年m e t c h n i k o f f 和p a u le h r l i c h 因选用棘皮动物作为模型在比较 免疫细胞学领域取得的开创性工作而分别被授予诺贝尔奖【l 引。 从7 0 年代开始，人们对棘皮动物免疫机制进行了大量的研究。1 9 7 1 年，r e i n i s c h 的研究表明海星a s t e r i a sv u l g a r & 体腔中的吞噬细胞能够吞噬注入体内的海胆a r b a c i a p u n c t u l a t a 的细胞，并迅速地将其从体腔液中清除，同时还发现二次注入后对异源细胞 的排斥速度并没有提高【2 0 】。1 9 8 3 年，y u i 通过反复多次注射的方法，也得到了同样的结 果，证实棘皮动物体内没有特异性的免疫记忆【2 1 1 。此外，很多棘皮动物的体腔液被证明 是具有杀菌活性的【l 引。已有的研究表明棘皮动物还没有特异性免疫系统，它的免疫防御 主要依赖体腔细胞的吞噬及体腔液中的一些酶和杀菌体液因子的作用。此外，已发现了 棘皮动物中也存在着类似高等动物中的补体调节系统【2 2 1 ，然而对于其具体的调节作用机 制还不是很清楚，需要进一步的研究。 近年来，随着海参、海胆养殖业的迅速发展，在带来可观经济效应的同时，出现了 一个普遍的问题养殖病害，尤其是海参养殖，近年来病害大规模爆发如寄生虫病和 腐皮综合症等，给水产养殖业带来巨大的损失。因此，对棘皮动物的免疫防御机制方面 的研究不仅具有重要的理论价值，而且对利用免疫途径提高水产养殖动物的免疫抗病能 力，维护水产养殖业的持续、健康和稳定发展也具有重要的意义。 本文将对棘皮动物免疫防御及其调节机制方面的研究进展做一简要阐述，为棘皮动 物免疫防御调节机制方面的进一步研究提供一些相关资料。 1 体表粘液免疫 已有研究表明贝类中属于双壳类的扇( c h l a m y s f a r r e r i ) t 2 3 1 、属于腹足类的皱纹盘鲍 ( h a l i o t i sd i s c u sh a n n a i ) 1 2 4 】和头足类的短蛸( 优卸姗o c e l l a t u s ) 2 5 1 的外套膜、鳃、足及消化 鲁东大学硬士学位论文 道上皮内均有大量的粘液细胞，在体表形成一层致密的保护层，在免疫防御中发挥重要 作用。棘皮动物中的刺参( a p o s t i c h o p u sj a p o n i c u s ) 体表也有大量的粘液，这些粘液也 具有免疫防御等功能。韩强【2 6 1 等采用阿新兰( a b ，p h 2 6 ) 和过碘酸雪夫氏反应( p a s ) 染色法对刺参体壁腹面和背面的粘液细胞进行了分类和分析，将粘液细胞分为i 、i i 、 、四种类型，并发现粘液细胞的分布和类型与其所在部位执行的功能有密切的联系。 粘液细胞分泌的粘液在免疫防御中应起重要作用，成为棘皮动物免疫防御的第一道屏 障，目前这方面的相关研究还比较少。 2 细胞防御 棘皮动物的血液循环器官退化，执行循环功能的主要是广阔体腔中的体腔液，有关 体腔液中自由的体腔细胞( e o e l o m y t e s ) 的形态和功能的研究较多，血淋巴细胞的研究 相对较少。仅刑坤等【2 7 】利用光镜和扫描电镜观察，根据细胞大小和形态结构将刺参血淋 巴细胞定义为四种类型：小淋巴细胞、吞噬细胞、桑葚细胞和结晶细胞，以小淋巴细胞 居多，且光镜的结果表明刺参血淋巴细胞形态上和体腔细胞类似，但是细胞较小。因此， 我们分析血淋巴细胞可能在免疫防御中也发挥作用，但关于棘皮动物血淋巴细胞的生理 功能以及与体腔细胞起源及细胞分化上的联系并不清楚，尚需要进一步的研究。因此， 本节将主要阐述体腔细胞方面的研究。 2 1 体腔细胞的来源 体腔细胞主要存在于充满体腔的体腔液中【2 引，它可以是各种形态不同的细胞的混合 物。有研究表明在刺参吐脏再生过程中，大多数细胞分裂发生在体腔上皮层及与增厚区 相邻的肠系膜，一旦再生肠的组织层形成，细胞继续分裂并数量增加，以后的细胞分裂 主要发生在肠腔上皮层【2 9 】。因此认为体腔细胞是由体腔上皮细胞产生的，这些体腔上皮 细胞覆盖体壁的内部，消化和生殖系统的外表面以及水管系统的内表面【3 0 】。因此，海参 体腔中的自由的体腔细胞被认为参与气体交换、营养物质的运输和储存、血凝的形成、 代谢废物的排泄、结缔组织某些成分的生产和免疫防御【3 1 1 。 2 2 体腔细胞的类型 体腔细胞是介导棘皮动物细胞免疫防御的效应细胞。目前主要采用形态学和组织学 的方法对棘皮动物体腔细胞进行分类研究，且主要集中在海胆和海参中。体腔液内一般 存在形态不同的六种类型的细胞：祖原细胞、变形吞噬细胞、有色和无色球形细胞、振 颤细胞、血细胞和晶体细胞1 3 2 , 3 3 】，但并不是所有的棘皮动物体腔液内都存在这六种细胞 p 引，依据种的不同而有所差异，不同学者分类的结果也有所不同。 4 鲁东大学硕士学位论文 丁君【3 5 】等观察中国主要经济海胆马粪海胆( h e m w e n 加o t u sp u l c h e r r i m u s ) 、虾夷马粪 海胆( s t r o n g y l o c e n t r o t u si n t e r m e d i u s ) 、光棘球海胆( s t r o n g y l o c e n t r o t u sn u d u s ) 、紫海胆 ( a n t h o c i d a r i sc r a s s i s p 切口) 以及几种杂交种海胆体腔液中的各类细胞，按照形态和功能将 其分为四种类型即：色素细胞、纤毛游走细胞、变形吞噬细胞和无色球形细胞，不同种 海胆中同类细胞的比例不同，但差异均不显著。与e d d s 3 6 】将紫海胆体腔液中的细胞按 密度由大到小分为：红色球形细胞、无色球形细胞、纤毛细胞和低、高密度噬菌细胞的 结论是一致的，只是命名有所差异。然而李霞 3 7 1 等的研究发现虾夷马粪海胆的体腔液内 仅有变形吞噬细胞和色素细胞两种类型的体腔液细胞，变形吞噬细胞具有吞噬酵母的功 能，色素细胞通过释放色素颗粒参与体液免疫反应。 廖玉麟( 1 】从显微水平将刺参( 么j a p o n i c u s ) 的体腔细胞分为淋巴细胞、吞噬细胞、 血浆游走细胞( 大颗粒细胞) 和血细胞；而刘晓云【3 引等应用透射电镜观察刺参体腔细胞 的超微结构，结果显示体腔细胞分为大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞和淋巴样细胞 且颗粒细胞居多，与光镜观察的结果一致，并认为大小颗粒细胞并不只是颗粒的大小不 同，其内部的超微结构也不同，是两种不同类型的细胞。e l i s e i k i n a 3 9 】等在研究刺参和瓜 参( c u c u m a r i a j a p o n i c a ) 时将体腔细胞分为祖原细胞、变形细胞、有空泡细胞、小( 或 幼) 桑椹细胞、桑椹细胞( i 、i i 和i 型) 、晶体细胞和振颤细胞，但有人认为桑葚细 胞根据颗粒大小可分为小颗粒桑葚细胞和大颗粒桑葚细胞，推测可能是同一类型细胞的 不同阶段【2 刀。此桑葚细胞如果与刘晓云所描述的颗粒细胞为同一种细胞，则这种推测将 是不成立的。此外，根据形态和超微结构特征进行分类的最新研究表明刺参的体腔细胞 可分为小淋巴细胞、桑葚细胞、阿米巴样细胞、结晶细胞、纺锤细胞和振动细胞【删。 吞噬细胞主要行使吞噬作用，是刺参体内主要的免疫防御功能细胞，也行使吸收、 消化和运输等功能。桑葚细胞可能主要与营养相关，通过释放其中的颗粒状物质，调节 体内的生理机能【4 l j 。结晶细胞的细胞质很少，整个细胞由晶体物质组成。结晶细胞与刺 参体壁中骨片的形成有关【4 2 】，也可能与刺参渗透压的调节有关【3 9 1 ，其具体功能还需进一 步研究。 有研究表明在棘皮动物中小淋巴细胞可以分化为桑葚细胞，作为体内的分化干细胞 发挥功能，并能通过增大体积和产生更多的伪足形成吞噬细胞【4 引。这可能是目前关于棘 皮动物体腔细胞分类的一些报道存在分歧的主要原因；其次由于分类标准不同，或传统 显微镜