（生物物理学专业论文）大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究 摘要 大豆蛋白质营养价值高，氨基酸组成比例适宜，必需氨基酸平衡良好。我国大豆 资源丰富，原料成本低，所以，大豆及其深加工产品开发具有广阔的应用和市场前景。 因大豆蛋白水解物中富含肽，故称“肽基大豆蛋白水解物”，一般简称为“大豆多 肽”。大豆多肽与大豆蛋白相比，往往具有更良好的理化性质。它能有效改善原料蛋白 质的不足，达到无豆腥咪，具有无蛋白质变性、加热不凝固、酸性不沉淀、易溶于水、 流动性好等特点，而且吸收速度快，蛋白质利用率高。大豆多肽还具有许多生物活性， 如抗氧化、降血压、降胆固醇、抗疲劳等。这些特性有利于大豆多肽在食品、医药、 化妆品等领域的开发和利用，因此大豆多肽的研制与应用倍受关注。 目前，我国大豆多肽处于研制的高潮阶段，然而多肽的工业化生产尚处于起步时 期。影响大豆多肽广泛生产应用的主要问题是缺乏综合性生产指导方案，在酶解过程 中会生成苦味物质影响终端产品的口味，且其分离纯化技术还不够成熟。 本试验利用二次回归旋转组合设计的统计方法，分析并建立了p r o t a m e x 复合蛋白 酶水解大豆分离蛋白水解度与5 个影响因素的数学模型，筛选出高产工艺综合方案和 最优化的生产条件：p h 值为6 , 5 ，温度4 00 | c ，水解时间1 0 h ，底物浓度1 4 ，酶与底 物比4 5 。数学模型的建立，为实现预计水平的主要工艺技术指标定量化、规范化生 产、宏观指导和科学管理提供依据。 试验采用双酶水解大豆分离蛋白的方法去除肽基大豆蛋白水解液的苦味。在 p r o t a m e x 复合蛋白酶水解的基础上，加入f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶，其适宜的水 解条件为：p h 7 0 ，温度5 0 ，时间5 h ，用量为大豆分离蛋白的2 。此时氨基氮含 量为0 1 7 8 ，苦味较p r o t a m e x 酶水解液的苦味降低3 5 7 。 采用上述双酶分步水解方式生产的大豆多肽具有水解度高、澄清透明、低苦味、 酸性条件下不沉淀等特点。通过试验的测定和分析，大豆多肽具有良好的营养价值， 且具有高溶解度，低粘度，良好的吸湿、保湿性，较强的抗氧化效果及抗疲劳等特性。 利用切向流超滤膜技术将大豆多肽进行分离、纯化，通过超滤膜处理，大豆多肽 浓缩液的除盐率达到9 8 1 2 ，氮回收率达9 6 4 3 ，截留分子量在3 0 0 0 。 试验对浓缩肽液进行应用性研究，研制出3 种大豆多肽产品。期望奉项研究能够 为推动该领域的产业化进程提供理论基础和应用方案。 关键词：大豆多肽双酶水解生物活性回归旋转设计 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肽生产t - 艺的优化及其生物活性研究 a b s t r a c t t h es o y b e a n p r o t e i nh a sm a n yg o o dc h a r a c t e r s ，s u c ha sh i g hn u t r i t i o n a lv a l u e ，s u i t a b l e a m i n oa c i dc o n s t i t u t i o na n dg o o de q u i l i b r i u mo ft h ee s s e n t i a la m i n oa c i d ，i nc h i n at h e s o y b e a nr e s o u r c e sa r ea b u n d a n ta n d t h ep r i c ei sl o w t h e r e f o r e ，t h e r ea r eb r o a da p p l i c a b l e p r o s p e c t si ne x p l o i t a t i o no fs o y b e a na n d i t sf o l l o w p r o d u c e s t h es o y b e a np r o t e i nh y d r o l y s a t e ，a l s oc a l l e d “p e p t i d eb a s e dp r o t e i nh y d r o l y s a t e o r “s o y b e a r lp o l y p e p t i d e s ”h a sg o o dc h a r a c t e r s a n db i o a c t i v i t y c o m p a r e dw i t h s o y b e a n p r o t e i n ，s o y b e a np o l y p e p t i d e sc o u l di m p r o v em a t e r i a lp r o t e i nc h a r a c t e r s f o re x a m p l e ，i t h a sn o ts p e c i a ls m e l lo fs o y b e a n ，n od e n a t u r a t i o n ，n o td e p o s i ti na c i de n v i r o n m e n t ，n o c o n c e n t r a t ew h e nh e a t e d a n di ti sm o r es o l u b l ee t c m o r e o v e r ，t h es o y b e a np o l y p e p t i d e si s a b s o r b e dd i r e c t l yb y i n t e s t i n e s s c y 1 0 e a np o l y p e p t i d e sh a st h er e s i s t a n tt oo x i d a t i o n ，l o w e r e d b l o o dp r e s s u r ea n dc h o l e s t e r i na n ds oo n a l lo fc h a r a c t e r sm e n t i o n e da b o v ea r ep r o p i t i o u s f o rt h ed e v e l o p m e n t o f s o y b e a np o l y p e p t i d e si nf o o d ，m e d i c i n ea n dc o s m e t i cf i e l d n o w ，t h er e s e a r c ho fs o y b e a np o l y p e p t i d e si sb o o m i n g w h i l ep r o d u c i n gi nf a c t o r yj u s t b e g i n t h em a i np o i mw a sl a c ko fd i r e c t i n gp l a nf o rm a n u f a c t u r e o t h e r w i s e ，t h eb i t t e r s u b s t a n c e si nh y d r o l y s a t ew o u l da f f e c tt h et a s t eo ff i n a lp r o d u c t s a n dt h et e c h n i q u eo f s e p a r a t i o nw a s n o tg o o d i nt h i st h e s i s ，b ys e c o n d o r d e rr e g r e s s i o nr o t a t i o nd e s i g n i n g ，t h em a t h e m a t i c sm a t r i x w a se s t a b l i s h e db e t w e e nt h ed e g r e eo f h y d r o l y s i s ( d h ) b yp r o t a m e xp r o t e a s ea n df i v ef a c t o l t h eh i 曲l y - p r o d u c es c h e m ea n dt h e o p t i m i z a t i o nd e s i g n w e r ea l s od e t e r m i n e d ，w h i c h p r o v i d e db a s e sf o rm a n u f a c t u r ea n dm a n a g e m e n t t h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n ：h y d r o l y s i s t i m e1 0 h ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na t1 4 ，t h er a t i oo f e n z y m ea n ds u b s t r a t ea t4 5 p h 6 5 a n d4 0 s p i ( s o y b e a np e p t i d ei s o l a t e ) w a sh y d r o l y z e db yd o u b l ee n z y m e si no r d e rt or e d u c e p o l y p e p t i d e s 7b i t t e r - t a s t i n gi nt h i se x p e r i m e n t a t i o n t h ef l a v o u r z y m ep r o t e a s ew a s a p p l i e d i i 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肤生产工艺的优化及其生物活性研究 t op r o t a m e xp r o t e a s eh y d r o l y s a t e t h er e s u l t ss h o w st h a tt h ef l a v o u r z y m ep r o t e a s eo p t i m a l c o n d i t i o n i sa tp h 7 0 t 5 0 。c h y d r o l y s i s t i m e5 h ，e n z y m ec o n c e n t r a t i o n 2 o f s p i i n t h i s c o n d i t i o n t h e n i t r o g e n c o n t e n t si s0 17 8 ，t h eb i t t e rt a s t e i sl o w e rt h a np r o t a m e x h y d r o l y s a t eb y3 5 7 d o u b l ee n z y m e sm e t h o dc o u l d a c h i e v eh i g h e rd ha n dl o w e r b i t t e r t a s t i n g a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i s ，s o y b e a np o l y p e p t i d e s h a sm a n yc h a r a c t e r s ，s u c ha s g o o dn u t r i t i o nv a l u e ，l o wv i s c i d i t y , g o o dm o i s t u r ea b s o r p t i o na n ds t r o n g a n t i o x i d a t i o n a b i l i t y e t c b yt a n g e n t i a l f l o wu l t r a f i l t r a t i o n ( u f ) t e c b a t i q u e ，t h es c h e m eo fs e p a r a t e ds o y b e a n p o l y p e p t i d e sa n dc o n c e n t r a t e dp o l y p e p t i d e sc o u l db ea c h i e v e d b yu f , t h e r a t i oo fd e s a l ti s a t9 8 1 t h er e c l a i mr a t i oo f n i t r o g e ni sa t9 4 4 a n dt h em o l e c u l a rw e i g h tc u t o f fa t3 0 0 0 d a l t o n a tl a s t ，3k i n d so fp o l y p e p t i d e sp r o d u c t sw e r ep r o d u c e d t h er e s e a r c hi sh o p e dt o b e c o m et h eb a s i so f t h e o r e t i c a lp a r ta n dt h es c h e m eo f a p p l i c a t i o n k e y w o r d s ：s o y b e a r lp o l y p e p t i d e s b i o - a c t i v i t y d o u b l ee n z y m e s h y d r o l y s i s r e g r e s s i o n r o t a t i o nd e s i g n i n g 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名签字日期：占掣年名月多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 一妊刮糨名：妇 签字日期：o 卯v - 年g 月纠日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 签字日期： d r ，丫年月王，日 电话：口牟弓7 4 j ，夕r 厂 邮编：月驴孑 移 雅 、拶 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究 1 前言 1 1 肽的研究 1 1 1 基本概述 蛋白的加工在我国具有悠久历史，其制品已成为人们r 常生活中的必需品。 所有生物的蛋白质都是由2 0 种蛋白质氨基酸组成，氨基酸彼此以酰胺键( 也称肽 键) 相互连接成为“肽”，它们与氨基酸一起构成了千姿百态的蛋白质世界。一般少于 1 0 个氨基酸的肽被称为寡肽，超过1 0 个氨基酸的称为多肽，但两者术语的介定并不 严格。氨基酸为5 0 多个以上的多肽称为蛋白质。多肽和蛋白质只有肽链长短之别，二 者间没有严格区分。 肽基蛋白水解物，因蛋白水解物中富含肽，故称肽基蛋白水解物( p e p t i d e - b a s e d p r o t e i n h y d r o l y s a t e ) 或简称“肽”。较之相同组成氨基酸及其母本蛋白( p a r e m p r o t e i n ) ， 具有许多独特的理化特性与生物活性，如起泡性、粘度、胶凝性、乳化性等功能。随 着新型加工技术的应用及人们对“肽”的认识进一步加深，肽的研究成为近十年来的 热点眦 。 i i 2 肽的生产 蛋白质水解物生产方式多种多样，包括化学法、生物法与合成法，其中化学法是 利用酸碱水解蛋白。但反应条件剧烈，破坏了氨基酸原有构型，产生了有毒物质【3 】， 已处于被淘汰边缘。与酸水解和碱水解比较，酶法水解蛋白质具有多种优点 4 , 5 1 ：蛋白 质的酶水解是一种不完全、不彻底的水解，其产物主要是肽而不是氨基酸。反应条件 温和，反应时间短，效率高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，产品纯度高，产物 易分离，成本低。而通过基因工程、化学合成的方法生产生物活性肽需要相当大的投 入，且其安全性还需要进行研究【6 j 。因此酶法水解蛋白质制备活性肽是目前生产活性 肽的主要方法。反应产物与原料蛋白、相同组成的氨基酸相比具有特殊的理化性能与 生理功能，所以肽基蛋白水解物成为蛋白制品的发展方向。 生物方法生产肽类制品时，底物的选择主要是基于蛋白的营养价值、成本、口感、 抗原性、溶解性和功能性，目前较常用的原料包括酪蛋白、乳清蛋白及大豆蛋白。尽 管低纯度蛋白制品价格相对便宜，但产品风味差。为提高产品转化率和底物原料利用 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究 率，底物的预处理必不可少。常_ l = j 方法包括高压和高温处理。高温处理具有方法简便、 投资少、蛋白变性不易回复的优点。 酶是决定底物利用率、产品性能的又手要因素，内肽酶可以降低产品中游离氨 基酸的千h 对含量，外肽酶能选择作用于疏水性氨基酸，去掉或减轻产物中的苦味；为 提高底物转化率，较好的方法是内肽酶和外肽酶混合使用；当然还要考虑酶的安全性、 经济性与有效性。 水解方式的选择也对水解产物得率有较大影响。蛋白水解通常使用间歇式方法【7 j 。 该法具有产量低、劳动强度大、生产效率低、生产成本高等诸多不足【8 】。连续搅拌罐 膜反应器( c s t m r ) 则克服了这些不足。与其它形式反应器相比，c s t m r 体系具有 如下优点：保持了酶的可溶性状态，利于酶的作用；产品性能均一，无批次间的差异； 产物转化率高，酶可循环使用，产品成本低：易于控制产品的分子组成；操作连续， 自动化程度高，劳动强度小。c s t m r 体系亦有不足：反应底物浓度低，产物浓度亦 相对较低。这是该体系不可避免的，否则，反应底物浓度高不利于产物转化率的提高 即体系的长时间稳定运行。 1 1 3 肽的特性及其应用 研究发现，肽与蛋白质相比，具有良好的溶解性、低粘度、抗凝胶形成性，低分 子肽不会产生过敏反应等优点。除此之外，还具有众多的生理活性，如促进发酵、抗 氧化、降血压、降胆固醇、抗疲劳、促进乙醇代谢等活性【9 ”j 。 过去，科学家一直未对利用贮藏蛋白如大豆、玉米、小麦等种子蛋白和动物营养 蛋白及乳蛋白水解制备生物活性肽给予应有的重视。随着科学的发展与进步，科学家 逐渐注意到：在营养蛋白的多肽链内部可能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水 解这些多肽，有可能将其释放出来，从而制备各种各样的生物活性肽，为能生产出更 好满足人类保健需要的食品基料提供了新的机遇i l u 。 1 2 大豆多肽的基础研究 1 2 1 大豆多肽的化学组成 大豆多肽是指大豆蛋白质经蛋白酶作用后，再经分离、精制等过程而获得的蛋白 质水解产物，它由大豆蛋白水解后的多种肽混合物共同组成，其中还含有少量游离氨 基酸、糖类和无机盐等成分。大豆多肽的蛋白质含量为8 5 左右，其氨基酸组成几乎 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肤生产工艺的优化及其生物活性研究 完全与人豆蛋白质一样，必需氨基酸的平衡良好，含量也丰富。大豆多肽分子量通常 在1 0 0 0 0 以下，一些功能性低聚肽分子量较小，由3 - 6 个氨基酸组成，其分子量分布 以低于1 0 0 0 的为主，主要出峰位置在分子量3 0 0 7 0 0 的范围州娩1 。 1 2 2 大豆多肽的理化特性 大豆多肽的水溶性很高，即使在5 0 的高浓度下仍具流动性；同时，大约1 0 浓 度的大豆蛋白质水溶液一经加热就会凝固，但对于大豆多肽的水溶液来说，不产生凝 固现象。从p h 与溶解性看，大豆蛋白质在等电点p h 4 3 附近会形成沉淀，但在非等 电点范围内，大豆多肽保持溶解状态，并具有抑制蛋白质形成凝胶、较强的吸湿性和 保湿性、调整蛋白质食品的硬度、改善口感和易消化吸收等特性。由此可见，大豆多 肽很适合于生产速溶饮品和高蛋白质食品。 大豆多肽的理化特性是影响其加工、贮存稳定性、口感质量及最终产品的营养和 生物效价的重要因素。在水解过程中肽键的降解，导致了三个主要变化：1 、可离解基 团( n h 4 + ，c o o 一) 数目的增多，导致了亲水性及净电荷数的增加；2 、分子结构的改 变，导致了包埋于内部的疏水性残基暴露于水相中；3 、多肽链长与分子量的降低，导 致了肽的许多关键性参数，如溶解性、粘度、乳化作用、起泡性、胶凝性及风味等较 之完整蛋白完全不同。而且肽链的降解与产物分子大小或d h ( 水解度) 、所用蛋白酶 特性、母本蛋白物理和化学性能及水解条件与最终产物的组成因子，如p h 、离子强度、 产物类型及产物中的其它组成成分等许多重要因子相关联。 1 2 3 大豆多肽的营养功能 功能性食品应该是具有合理营养和保健功能的营养健康食品。大豆蛋白是营养价 值很高的植物蛋白，也是目前唯一能取代动物蛋白的植物蛋白。它的酶水解产物由多 种多肽分子构成，富含人体必需氨基酸，氨基酸组成几乎和动物蛋白相同。 1 2 4 大豆多肽的生理功能 最近研究表明，作为生物活性肽在组织水平上可能引起机体的生物学效应。研究 人员发现，从一些食物蛋白的酶水解产物中分离出的多种小肽具有调节植物神经系统， 活化细胞免疫功能，改善心血管功能和抗衰老等生理活性 。最近，在医学上还发现， 饮食中的小肽( 2 3 个氨基酸) 和大肽( 1 0 5 1 个氨基酸) 能够完整地通过肠道，由肠 道直接吸收，小肽吸收速度要比相同组成的游离氨基酸快，而且蛋白质利用率高；它 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肚生产工艺的优化及其生物活性研究 还具有低抗原性，不会产生过敏反应。这些发现对开发肽类新型功能保健食品具有重 要意义。近年来人们已经发现，大豆多胍也具有许多生理功能，如降低胆固醇、抑制 血压升高、非过敏性、增强免疫功能和抗自由基损伤( 延缓衰老) 等1 1 4 】。 1 2 5 大豆多肽的制备 如前所述，酶法水解蛋白制备活性肽是目前生产活性肽的主要方法。大豆及其豆 粕均n r 作为剑备大豆多肽的原料，在酶水解过程中，正确选择使用蛋白酶是生产上的 关键。通常，可选用胰蛋白酶、胃蛋白酶等动物蛋白酶，也可使用菠萝和木瓜等植物 蛋白酶，但目前应用较广主要是枯草杆菌1 3 8 9 、放线菌1 6 6 、栖土曲霉3 9 4 2 、黑霉3 3 5 0 和地衣型芽孢杆菌2 7 0 9 等微生物蛋白酶。 大豆中的脂肪氧化酶催化氧化大豆不饱和脂肪酸后，可生成多种低分子醇、醛和 酮等挥发性成分，从而产生令人难以接受的豆腥昧。另外当大豆蛋自质被酶解成肽后， 往往产生不同速度的苦味肽，这对产品风味有很大影响。此外，大豆本身还含有少量 的胰蛋白酶抑制剂，外源凝聚索、致甲状腺肿素、抗维生素因予和金属络合物等抗营 养成分。人或动物长期摄入含有这些有害物质的大豆制品，会产生不同程度的消化不 良、甲状腺肿大、氨基酸和维生素等营养成分利用率下降以及生长停滞等系列蓄积 性中毒症状，对人体健康有一定的危害。为此，在生产大豆多肽时，可采用适当加热 处理、加入化学试剂( 除臭剂、活性炭等) 、控制蛋白质的水解度( d h ) 和特殊酶解 处理等方法将大豆多肽制品中的不良风味和抗营养物质除去，以确保从根本上改善大 最多腋的风味和提高其营荞价值。 蛋白质水解物除了上面提到的在水解中含有异味成分以外，还有一个更大的问题 就是苦味。大豆蚤自质经酶分解之后，其三四级结构被破坏，原来隐藏在分子内部的 疏水性氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等氨基酸暴露在分子表面。而苦味与疏水 性氨基酸的侧链直接相关。当疏水性氨基酸位于肽链的c 端位置时，表现出苦昧的最 大值；当位于n 端位置时，苦昧较低。以游离氨基酸形式存在时苦味最低。苦味的形 成限制了蛋白质功能性低聚肽在食品中的应用。故蕾味的防止与去除一直是研究的熟 点。一般可用以下几种方法来去除苦味【6 】。 吸附方法：活性炭为疏水性吸附剂，可吸附疏水性的苦味肽，但也不可避免地吸 附一些其它的肽和氨基酸，故会有一部分蛋白质损失。同时也改变了蛋白质水解物的 肽、氨基酸的比例，故在经济上、营养上欠妥。许多疏水交互作用色谱和酚醛树脂也 被用来消除苦昧。近年来有研究发现，2 丁醇水体系对苦昧肽有很好的分离效果。 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肤生产工艺的优化及其生物活性研究 掩埋方法：可以用环糊精、淀粉将苦昧肽包埋，从而将苦味除去。还有报道添加 苹果酸、柠檬酸、乳酸等可使苦味卜- 降。 酶处理方法：商品化的a l c a l a s e 酶对终端为疏水性的氨基酸有较好的选择性， n a k a m u r a 等用a l c a l a s e 酶处理，得到了很好的蛋白水解物。 控制水解度方法：有报道说当水解度控制在 1 0 5 时，所得的蛋白质水解物无苦 昧。 1 2 6 大豆多肽的应用 营养食品：由于火豆肽的吸收率高，对一些做过外科手术的患者，或因疾病的原 因，对蛋白质吸收或消化不良的患者以及因缺乏酶系统而不能分解和吸收蛋白质的患 者，都是很重要的蛋白质营养供应源。此外，有些人，特别是婴儿，对牛乳蛋白或大 豆蛋白有过敏反应，而分子量在3 0 0 - - 4 0 0 以下的肽不会引起过敏反应。因此肽可以满 足这些人( 婴儿) 对氨基酸的需要，保证其健康成长。 运动员食品：在体育活动中，一般消耗体内热量的4 1 0 是由破坏蛋白质提供 的。由于体内不储存蛋白质和不能合成必需氨基酸，所以必须及时地从外部补充氨基 酸，以免造成肌肉蛋白质的负平衡，小分子的肽则比蛋白质或氨基酸更容易被吸收， 因而能迅速恢复和增强体力【1 5 l 。 老年人保健食品：一般老年入由于健康或衰老的原因食欲不振，摄取的蛋白质一 般都低于需要量，这样更容易引起疾病和衰老，由于肽容易吸收，老年人用肽补充蛋 白质是最理想的办法。 蛋白饮料：上述文中谈到运动员和老年人都需要及时地补充蛋白质。补充蛋白质 的形式最好是饮料，般蛋白质不能溶于酸性饮料中，肽却能在酸性饮料( p h 3 5 4 o ) 中溶解，而且粘度低，不腻口，这给保健饮料生产开辟了一条新的途径。 减肥食品：近年来的研究证明，大豆肽有很强的促进脂肪代谢的效果。大豆肽是 + 种有效的减肥食品1 1 5 1 。 发酵食品：大豆肽能促进微生物生长发育和代谢，可被广泛地应用于发酵工业， 生产酸奶、干酪、醋、酱油和发酵火腿等发酵食品，同时还可提高生产效率、稳定品 质以及增强风味i 】。 其它应用：大豆多肽不仅在食品领域有如此广泛的应用，在其它领域也具有极大 的开发潜质。大豆多肽是吐葡萄糖苷抑制剂的有效成分，因此大豆多肽可以缓冲血液 中血糖的上升，且具有降低血压和抑制胆固醇作用、较好的抗氧化功能及很强的吸湿 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究 保湿效果，这对于人豆多肽在医药、研制新的抗氧化剂和日用化工领域的应用具有重 要的开发价值。 1 3 大豆多肽国内外研究现状 我国大豆资源丰富且廉价，大豆氨基酸组成比例合适，必需氨基酸的平衡良好， 含量丰富。大豆多肽作为一种新型大豆深加工产品是大豆蛋白经水解制成的低分子肽 混合物。在氨基酸组成上，大豆多肽几乎与大豆蛋白相同，富含人体必须氨基酸。但 与大豆蛋白相比，大豆多肽往往具有更良好的理化性质和生理活性。大豆多肽能有效 改善原料蛋白质的不足，达到无豆腥味，无蛋白质变性、酸性不沉淀、加热不凝固、 易溶于水、流动性等特点，这些特性有利于其在食品、医药等领域的丌发和应用，因 此大豆多肽的研制与应用倍受关注。 美园和只本，无论在基础理论方面，还是在应用研究方面，均处于世界领先地位。 美国7 0 年代初研究的新型大豆深加工产品大豆多肽，d e l t o v c ns p e c i a t i o n 公司建 成了年产5 0 0 0 吨食用蛋白肽的工厂。日本8 0 年代开展此方面的研究，不二制油公 司、雪印、森永等乳业公司均己成功地将大豆肽应用于食品工业领域。不二制油生产 的某系列产品，有p m ，s ，r ，d 四种，最先用的是p m ，s 类，含2 - - 3 个氨基酸残 基i l 。目前，大豆多肽已经工业化大规模生产，主要是根据所制得的大豆多肽生理活 性不同，将其制成药片、口服液或作为功能因子添加到各种食品中，发挥各种生理功 能。除具有特定的生理功能外，同时往往还具有多种功能。现己开发出婴幼儿食品、 运动食品、发酵食品、减肥食品、降压肽等一系列保健产品，取得了良好的经济效益 和社会效益。 我国大豆肽的研究十分广泛，特别是近十年有突飞猛进之势。1 9 9 3 年盛国华【1 9 l 报道了大豆多肽的功能及应用的研究。1 9 9 6 年赵新淮【2 卅利用蛋白水解酶制备大豆蛋白 水解物，并用于生产酸性饮料。1 9 9 7 年郭凯【2 l j 等发明并申请了大豆肽氨基酸口服液及 其制各方法的专利，制备方法为用完全脱腥大豆蛋白粉，用选自1 3 9 8 蛋白酶、胰蛋 白酶、菠萝蛋白酶中的一种，于3 0 5 0 。c 、p h 值为2 o 9 0 条件下处理，并静止再 提取上部清液，得到的大豆肽再与蛋白糖、氨基酸配制成口服液。1 9 9 7 年张延坤等【2 2 报道了大豆肽在食品工业中的应用研究，大豆肽的制备工艺中所用的菌种是目前应用 较广泛的，主要是枯草杆菌1 3 9 8 、放线菌1 6 6 、栖土曲霉3 9 4 2 和黑曲霉3 3 5 0 等。同 年李书国【2 3 j 报道了大豆多肽食品的开发。其生产大豆多肽的酶有胰蛋白酶、碱性蛋白 酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。开发出的食品包括饮料、恢复营养食品、老年人保健 吉林农业大学硕士学位论文大豆多肽生产工艺的优化及其生物适丝翌壅 食品、运动员食品、新型发酵类食品。2 0 0 1 年张玲华等 h i 报道了大豆多肽的制备工艺 研究，采用的水解酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。同年张日俊等研究发现经微生物降 解的大豆粉中含有1 2 种小肽，其中包括谷胱甘肽( 生物防御作用) ，g l y h i s l y s ( 促 生长，促进细胞，e 长分化) 等具有生物活性的肽类。2 0 0 2 年孔庆学等【2 5 】报道了大豆低 聚肽的功能性质及其应用，指出大豆肽可用于制作酸奶、婴幼儿食品、运动员食品、 老年食品及患者素质食品，是有效的l f 【l 管紧张素转换酶( a c e ) 抑制剂、减肥食品配 料等。 大豆多肽在饲料中的应用较少，原因可能在于大豆多肽的生产目前多采用酶水解 法，高价酶的使用提高了大豆多肽的生产成本，不适合于饲料添加剂中的应用。近几 年来，有人用微生物发酵技术制备大豆多肽。这种方法将肽的生产和应用合为一， 省去了中间步骤，不需要添加额外的肽就可以生产出大豆多肽，大大降低了成本，这 种制备技术使得大豆多肽类饲料添加剂的开发成为可能。将大豆多肽应用于畜禽类生 产中以提高畜禽生产性能，改进畜禽品质，今后在饲料工业中应该具有广阔的前景。 近几年，大豆多肽的工业化生产也已在国内出现。黑龙江省的三乐源集团研制了 “大豆蛋白活性肽”；武汉天天好生物制品有限公司在使用复合肽多级定向酶系统技术 生产大豆多肽方面处于国内领先水平，同时掌握了大豆蛋白肽的性能指标测定、检测 方法以及功能评价等技术。国内一专利报道，运用生物工程技术研制成大豆肽氨基酸 口服液。 1 。4 大豆多肽的发展前景 随着我国社会主义市场经济的发展，国内食物结构已由温饱型向小康型过渡。加 入w t o 后，更加促进人们生活水平的提高，随之而来的肥胖、心血管疾病等“富裕 病”及由人口老龄化而致的各种“老年病”成为严重的社会问题。大豆多肽是一种多 功能保健因子，其理化特性和营养功能比大豆蛋白质和氨基酸在营养学上有许多优点， 而且它还具有降低胆固醇作用、抑制血压升高等生理活性，既满足了人们营养需求， 又满足了人们保健的需求，从而提高人们的生活水平，增进了人体健康。 我国拥有大量的大豆蛋白质资源，由于大豆蛋白质具有一定的抗原性，低溶解性， 不易消化吸收等缺点，限制了其在食品及医药领域的综合利用。因此亟待利用高新技 术加大对大豆蛋白资源的深加工，提高农副产品的附加值。并以此为突破口，加强高 新技术在大豆深加工中的研究开发。 大豆蛋白抗氧性肽具有溶解度高、粘度低及良好的稳定性等功能特性，具有十分 吉林农业大学硕士学位论文大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究 广阔的开发应用前景。大豆蛋白抗氧性肽能抑制机体内自由基的大量积累，对提高自 m 基清除机制起到一定的功效，从而能在一定程度上消除机体内多种生理功能的障碍， 延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生。因此，可以将大豆蛋白抗氧性肽开发 成抗哀老食品、化妆品和医疗保健品。目前，影响大豆蛋白抗氧性肽广泛生产应用的 主要问题是其分离纯化技术还不够成熟，在酶解过程中会生成苦昧物质影响终端产品 的门味。但随着技术的成熟，它将作为一种新的原材料，在食品、药品乃至化妆品等 诸多领域会有更加广泛的开发应用前景。 总之，随着理论和工艺条件的不断完善，大豆多肽的质量不断提高，脱臭、脱苦 技术的不断改进，其风味将得到很大的改善，大豆多肽产品必定被更多的消费者认识 和接受，成为人们日常生活中的一种优质蛋白质营养品。 1 5 本试验研究意义 综上所述，在我国大豆多肽处于研制的高潮阶段，然而多肽的工业化生产尚处于 起步时期。本试验利用二次回归旋转组合设计的统计方法，建立大豆蛋白水解度与5 个影响因素的数学模型，筛选出优质、高产、高效、低成本的工艺综合方案和最优化 的生产条件，实现预计水平的主要工艺技术指标定量化、实现规范化生产，为宏观指 导、技术决策、资源分配、科学管理提供科学依据。 试验在对大豆多肽进行制备的基础上， 基大豆蛋白水解液的苦昧，脱苦效果良好； 采用双酶水解大豆分离蛋白的方法去除肽 利用超滤膜技术将大豆多肽进行分离、纯 化，分析其生物活性，并对其进行应用性研究，制备出1 种液态辅料与2 种大豆多肽 干粉制品，期望本项研究能够为推动该领域的产业化进程提供理论基础和应用方案。 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肽生产x - e 的优化及其生物活性研究 2 试验材料和方法 2 1 试验材料 大豆分离蛋白( 金龟2 2 0 0 )吉林不二蛋白有限公司 p r o t a m e x 复合蛋白酶( 酶活力2 5 0 0 0 u )丹麦诺维信( n o v 0 ) 公司 f l a v o u r z y m e 复合风味蛋白酶( 酶活力2 6 0 0 0 u ) 丹麦诺维信( n o v 0 ) 公司 胰岛素注射液江苏万邦生化医药股份有限公司 低分子量标准蛋白质宝泰克公司 甘氨酸宝泰克公司 溴甲酚绿西德s e r v a 考马斯亮兰g 2 5 0f l u k a 进口分装 葡聚糖凝胶s e p h a d e xg 一2 5p h a r m a c i a 进口分装 w i s t e r 大鼠吉林大学动物实验站 昆明种小白鼠( 体重2 2 2 6 9 )吉林大学动物实验站 其它化学试剂均为分析纯 2 2 试验仪器 电子分析天平s a r t o r i u sb s 2 1 0 s 型 发酵罐k f 5 l ( 自制p h s t a t 装置) 水浴恒温振荡器s h z 一8 8 精密p h 计p h s 一3 c 水分快速测定仪s c 6 9 - - 0 2 c 型 蛋白质测定仪k d n - - 0 4 型 消化炉h y p i i 型 旋转蒸发器i 砸一5 2 a 旋转蒸发器b c - - r 2 0 0 1 循环水式多用真空泵 离心机t d l 5 型 低温冷冻离心机3 k 1 8 型 德国赛多利斯股份公司 韩国k o b i o t e e hc o ，l t d 江苏省金坛市医疗仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 上海精科天平厂 上海纤检仪器有限公司 上海纤检仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 上海贝凯生物化工设备有限公司 郑州长城科技有限公司 上海安亭科学仪器厂 美国s i g m a 公司 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究 高速冷冻离心机c r 2 1 g 型 电子微量泵 核酸蛋白检测仪h d2 1 c a 微型高速万能试样粉碎机 7 2 2 分光光度计 紫j b 可见分光光度计a g i l e n t 6 0 1 0 型 紫外可见分光光度计u v 7 5 1 - - g d 型 电泳仪e c p 一3 0 0 0 型 电热恒温水浴锅d s y - i 2 孔型 恒温磁力搅拌器 切线流超滤膜包o a 0 0 1 c 1 2 多变速蠕动泵 低温真空冷冻干燥机c h 砌s t a c p h a l 4 型 超低温冷冻机m d f - - u 4 0 8 6 高效液相色谱a g i l e n t1 1 0 0 2 3 大豆分离蛋白的酶水解反应 2 3 1 常规指标的测定 蛋白质含量的测定：半微量凯氏定氮法 2 6 】 水分含量的测定：真空干燥法 2 7 】 酶活力的测定：f o l i n 一酚法【2 8 】 灰分的测定：高温炉6 0 0 。c 灰化【2 7 】 糖分的测定：葸酮比色法 2 9 】 2 3 2 氮溶指数( n s i ) 的测定 h i t a c h l 日本只立公司 浙江新昌国康仪器厂 上海康华生化仪器制造厂 河北黄骅科学仪器厂 i l j 东高密彩虹分析仪器有限公司 a g i l e n t 北京科技有限公司 上海分析仪器厂 北京六一仪器厂出品 北京国华医疗器械厂 金坛富华仪器有限公司 美国p a l l 公司 美国m i l l i p o r e 公司 c h r i s t 公司 s a n y o 三洋公司 a g i l e n t 安捷伦科技有限公司 氮溶指数也叫可溶性氮指数，是指大豆蛋白经酶水解后，水解上清液中可溶性氮 含量与大豆蛋白质中的总氮含量的比值，用n s i 来表示。即： n s i = 水解上清液中可溶性氮大豆蛋白质中总氮1 0 0 公式( 1 ) 其中，蛋白质总氮和上清液中可溶性氮含量由半微量凯氏定氮法 2 印测得。 1 0 吉林农业大学硕士学位论文 大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究 2 3 3 水解度( d h ) 的测定 2 3 3 1t c a 法f 3 0 取1 0 m l 酶解上清液加入1 0 m l1 0 - 三氯醋酸( t c a ) 溶液，混合振荡，静止3 0 m i n 后，存4 0 0 0 r p m 离心3 0 r a i n ，取上清液，蛋白质总氮和上清液可溶性氮由凯氏定氮法 测得： d h = ( n 2 - - n 1 ) ( n o - n i ) 1 0 0 n 2 大豆分离蛋白酶解上清液中加1 0 t c a 可溶性氮( m g ) n r 一反应前大豆分离蛋白液中1 0 t c a 可溶性氮( r a g ) n o 大豆分离蛋白中总氮( r a g ) 2 , 3 3 2 p h s t a r 法1 3 1 大豆分离蛋白水解度( d h ) 以水解断裂的肽键数目( h ) 占总肽键数目( h t 。) 的 百分数来确定，即d h = h h t o t x1 0 0 。 蛋白水解度可根据水解过程中n a o h 的消耗量来进行计算，计算公式如下： d h = b n b x ( 1 o ) ( 1 f m p ) ( 1 h t , , t ) 1 0 0公式( 2 ) 式中： b 水解过程中所消耗的n a o h 溶液量 n b _ - 溶液的当量浓度 q 为氨基解离度，1 o = 1 + 1 0 n ( p k p h ) p k 为大豆蛋白质q 一氨基的p k 值 m 一一底物蛋白质的总量 h 。，- 每克蛋白质中肽键的克当量数( 取8 3 8 ) 2 3 4 大豆蛋白的酶解操作 准确称取大豆分离蛋白，加入适量水配制成为一定浓度的大豆蛋白溶液，经8 0 。c 温度下恒温水浴1 5 m i n 预处理后，调节温度至反应温度搅拌2 0 m i n ，调节p h 值至反 应p h 值，加入一定比例蛋白酶，在反应温度下进行恒温酶解，酶解过程中需要不断 进行搅拌，同时通过滴加4 n 的n a o h 溶液以保持反应体系p h 值恒定，反应偏差一般 控制在0 1 。达到反应预定时间后，调节p h 至大豆蛋白等电点( p h 4 3 ) ，之后将大 吉林农业大学硕士学位论文大豆多肽生产工艺的优化及其生物活性研究 豆蛋白酶解液加热升温至8 5 。c ，保温1 0 m i n 使酶活力丧失，然后通过低温离心机在 1 2 0 0 0 r p m ，i o 。c 下离心1 0 m i n ，除去未水解大豆蛋白和其它非溶性物质，倾倒出上清 液置于4 冷减保存。记录上清液总体积，取部分上清液测蛋白质含量，利用公式( 1 ) 测定n s i 值；记录n a o h 溶液的滴加量，利用公式( 2 ) p h s t a t 法计算水解度。 2 3 5 单因素对p r o t a m e x 复合蛋白酶水解反应的影响 2 3 5 1 p h 值对水解反应的影响 精确称取2 4 9 大豆分离蛋白，分别溶于3 0 m l p h 值为5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 、 8 0 的水溶液中，然后按照e s 为2 用量各加入0 0 4 8 9 p r o t a m e x 复合蛋白酶，5 0 o c 7 1 ( 解7 0 r a i n ，以n s i 含量为指标，研究p h 值对水解的