（化学工艺专业论文）羧甲基甲壳素的合成及其凝胶材料的制备与应用.pdf

中文摘要 再生资源高分子来自太阳能所产生的生物量，它们取之不尽，用之不竭，具 有可再生性，对它们的研究与利用实质就是生态资源和能量的转化、利用与研究。 甲壳素是一种( 1 4 ) 一糖苷键一n 一乙酰基一2 一脱氧一b _ d - 葡萄糖，自然赛存量丰 富，大多数由甲壳纲动物的表皮制得。由于甲壳素的良好生物相容性、可降解和 低毒性，因而在医学上被广泛应用。本文概述了甲壳素及其衍生物的结构、化学 修饰和甲壳素高分子新材料的研究进展、发展动态及其应用概况。 6 - - 羧甲基甲壳素( 6 一c m c h ) 是甲壳素经羧甲基化后的衍生物。它既保留 了甲壳素的优良生物特性，同时具备水溶性和p h 敏感性，是制备生物凝胶材料 优良原料。本文利用羧甲基化、铁离子交联、海藻酸钠共混、丙烯酸接枝等方法 成功地制备出一系列甲壳素衍生物的凝胶材料，并以其为载体，对其药物缓释性 能作了研究，发现制备的凝胶材料有一定的药物缓释性能。主要研究内容和结论 如下： 1 、以甲壳素为原料制得了不同取代度的羧甲基甲壳素，分析了反应原料、 反应时间、反应温度对产物的影响，发现最佳的制备条件为：反应时间4 h ，氯 乙酸与氢氧化钠质量比9 ：1 0 ，并加入2 十二烷基硫酸钠及少量硼氢化钠；然 后以三氯化铁一氯化钙混合溶液为交联剂制备了羧甲基甲壳素凝胶微球，考查了 其在不同p h 缓冲溶液中的溶胀行为并以牛血清白蛋白( b s a ) 为模型药物研究了 其药物缓释性能，发现在p h 3 0 时出现了最高溶胀度；且随p h 值的降低、交联 浓度、交联时间增加，溶胀及释放速率都增大。 2 、以羧甲基甲壳素和海藻酸钠为原料、以三氯化铁为交联剂制备了复合微 球；通过考查其溶胀行为和释放5 一氨基水杨酸，表明该微球在酸性和中性环境下 均能稳定存在，缓释效果明显并可以对交联浓度和原料配比的变化作出响应，当 羧甲基甲壳素与海藻酸钠配比为1 ：1 至1 ：2 时效果最好。 3 、以硝酸铈铵为引发剂，将丙烯酸接枝到羧甲基甲壳素分子链上，再以 n n 二贬甲基一双丙烯酰胺为交联剂制得水凝胶。实验结果表明该水凝胶的溶 胀行为、载药量和释药效果受交联剂用量的影响非常明显，而接枝原料丙烯酸的 用量影响却不大。在模拟体外释放5 一氨基水杨酸的实验中前6 个小时只有不过 2 0 的累积释放，2 4 小时后则接近6 0 ，如果考虑结肠中的口葡萄苷酶对凝胶 材料的降解作用，最终累积释放率还将提高。 关键词：甲壳素，羧甲基甲壳素，凝胶，微球，离子交联，接枝 n ) s t r a c t r e n e w a b l el e s o 嗽p o l y m e r sc o m ef r o mt h eb i o m a s so r i g i n a t e df r o ms o l a r e n e r g y t h e y a r ci n e x h a u s t i b l ea n dr e n e w a b l e ；t h ee s s e n t i a lo ft h er e s e a r c ha n d e x p l o i t a t i o no nn a t l n a lp o l y m e r sa c t u a l l yi st h er e s e a r c h ，e x p l o i t a t i o na n dc o n v e r s i o n o fe c o l o g i cr e s o u r c ea n de n e r g y c h i t i n ，a ( 1 4 ) - l i n k e dn - a c e t a m i d o - 2 d e o x y - b - d - g l u c a n ，o n eo ft h en a t u r a la b u n d a n tp o l y s a c c h a r i d e sp r e s e n ti nt h ec u t i c l e so f c r u s t a c e a , h a sb e e nr e p o r t e dt oh a v es o m eb e n e f i c i a lm e d i c i n a la n dp h a r m a c e u t i c a l a p p l i c a t i o n sa si t sg o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n dl o wt o x i c i t y t h er e c e n tp r o g r e s so nt h e s t r u c t u r ea n dc h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fc h i t i na n di t sd e r i v a t i v ea n dt h e i rn 州 m a t e r i a l sw e r er e v i e w e di nt h i sp a p e r 6 - c a r b o x y m e t h y ic h i t i n ( 6 - c m c l 0 ，t h ed e r i v a t i v eo fc a r b o x y m e t h y l a t e dc h i t i n ， i ti saw a t e r - s o l u b l ea n dp hs e n s i t i v em a t e r i a lw h i l er e t a i n e dt h ee x c e l l e n t b i o - c h a r a c t e r i s t i c , s oi ti sas u p e r e x c e l l e n tm a t e r i a lt op r e p a r eb i o g e l a t i n as e r i e so f g e l a t i n m a t e r i a l sb a s e d o nc h i t i n sd e r i v a t i v ew h i c hw e r eo b t a i n e d b y c a r b o x y m e t h y l a t i o n ，c r o s s l i n k i n gd u et of e r r i ci r o n s ，b l e n d i n gw i t ha l g i n a t ea n d g r a f t i n ga c r y l i ca c i d ( a a ) t h em a t e r i a l sw h i c hh a ds u s t a i n e dr e l e a s ec h a r a c t e r i s t i c h a db e e ns t u d i e da sac a r r i e rf o r t h ed r a gr e l e a s e t h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： f i r s t l y , 6 - c m c hw i t hd i f f e r e n td e g r e eo fs u b s t i t u t i o nf r o mc h i t i nw a sp r e p a r e d m e a n w h i l e ，t h ei n f l u e n c eo fr e a c t i o nm a t e r i a l s ，t i m e s ，a n dt e m p e r a t u r eo np r o d u c t i o n a l s oh a sb e e nc o n s i d e r e d ，t h eb e s tr e a c t i o nc o n d i t i o nw a sf o u n dw h e nt h ew e i g h tr a t i o o fc h l o r o a c e t i ca c i da n ds o d i u mh y d r o x i d ew a s9 ：1 0 , a n da d d i n g2 ( 叭) s o d i u m d o d e c y ls u l f a t ea n dl i t t l es o d i u mb o r o h y d r i d e t h e nt h e6 - c m c hg e l a t i nm i c r o s p h e r e i sp r e p a r e dw i t ht h ec r o s s - l i n kr e a g e n to ff e r r i cc h l o r i d em i x e dw i t hc a l c i u mc h l o r i d e a tl a s tt h es w e l l i n gb e h a v i o ri nb u f f e rs o l u t i o nw i t hd i f f e r e n tp hv a l u ea n dd r u g s u s t a i n e dr e l e a s ei nv i t r ow i t ht h em o d e ld m gb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s n ) w e r e b o t hb e e ne x a m i n e dc a r e f u l l y t h em i c r o s p h e r ew a sf o u n dr e a c h i n gt h em a x s w e l l i n g d e g r e e ( s d ) a tp h 3 0 ，f o rt h em o r e ，s da n dr e l e a s er a t ei n c r e a s e dw i t l lt h er i s i n go f t i m ea n dc o n c e n t r a t i o no fc r o s s l i n kr e a g e n t ，a n dw i t ht h er e d u c i n go fp hv a l u e s s e c o n d l y ，t h ec o m p l e xm i c r o s p h e r ew i t hm a t e r i a l so f6 - c m c h ，s o d i u ma l g i n a t e ( a u g ) a n dc r o s s - l i n kr e a g e n to ff e r r i cc h l o r i d ew a sp r e p a r e d a f t e re x a m i n i n gi t s s w e l l i n gb e h a v i o ra n dt h er e l e a s eo f5 一a m i n o s a l i c y l i ca c i d ( 5 一a s a ) ，i tw a sp r o v e d t h a tt h em i c r o s p h e r ec o u l db ee x i s t e ds t a b l e l yb o t hi na c i da n dm e d i u mb u f f e rs o l u t i o n n t h cr e s u l to fs u s t a i n e dr e l e a s ew a sd i s t i n g u i s h e da n dr e v e a l e dt h a ti tc o u l dr e s p o n dt o t h ec h a n g eo fc o n c e n t r a t i o no fg r o s s l i n kr e a g e n ta n dm a t e r i a lc o m p o n c n t , w h i l et h e o p t i m i z e dp r o p o r t i o ni sf r o m1 ：1t o1 ：2 f i n a l l yt h e 寥l a t i nw a sp 唧觚c dw i t ht h ec 瞄s - l i n kr e a g e n to fn , n - m e t h y l e n e - b i s - a c r y l a m i d ea f t e rt h ea c r y l i ca c i d ( a a ) w a sg r a f t e do n t om o l e c u l ec h a i n so f 6 - c m c hw i t ht h ei n i t i a t i n ga g e n to fc e r i ca m m o n i u m n i t r a t e ( c a n ) 1 h ce x p e r i m e n t r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ed o s a g eo fc r o s s - l i n kr e a g e n th a sal a r g ei n f l u e n c eo ng e l a t i n s s w e l l i n gb e h a v i o r , d r u gl o a da n ds u s t a i n e dr e l e a s er a t h e rt h a n 从i nt h ei nv i t r o e x p e r i m e n tw i t ht h em o d e ld r u go f5 - a s a , n om o r et h a n2 0 d r u gw a sr e l e a s e di n t h ef n s t6h o u r s b u tn e a r l y6 0 a f t e r1 8h o u r s i na d d i t i o n , t a k ea c c o u n ti n t ot h e g e l a t i nd e g r a d a t i o nb e h a v i o ro f 户- m a n n a s ei nc o l o n , a c t u a l l y , t h ea c c u m u l a t i v er e l e a s e w o u l dr i s ei nt h ep r e s e n to f j m a n n a s c k e yw o r d s ：c h i t i n , 6 - c a r b o x y m e t h y lc h i t i n ，g e l a t i n , m i c r o s p h e r e ，i o n i cc h e l a t i n g , g r a f t 1 i i - 此页若属实，请申请人及导师签名。 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅； 学校可以公布论文的全部内容，：可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生签名： 7 0 的环境中溶解，引起药物释 放，所以e u d r a g i ts 1 0 0 可以作为o c d d s 的载体材料。r o d r i g u e z 等【舯铡用疏水性 材料醋酸丁酸纤维素和布地奈德一起形成疏水性内核，外e u d r a g i t ( r ) s 进行包衣形 成多核系统。体外实验表明在p h 7 的条件下药物不释放。 e u d r a g i t0 t ) s 是一类无毒、价廉及p h 敏感的聚合物，作为o c d d s 有很好的应 用前景。有学者对壳聚糖进行人工改造，半合成琥珀酸- 壳聚糖及邻苯二甲酸壳聚糖， 体外实验表明两种材料均可阻止药物在胃的酸性环境中释放，改善药物在碱性环境 中的释放，可作为o c d d s 材料。包埋胰岛素并进行动物实验( 小白鼠) ，结果表明 灌胃7 h 后可观察到胰岛素的峰浓度，生物利用度为5 7 3 ，在口服6 2 4 h 内可观 察到低血糖现象，由于胰岛素在胃和小肠不能被吸收，这就表明胰岛素胶囊能够到 达结肠并释放出胰岛索。l o r e n z ol a m o s a l 4 1 i 等将壳聚糖和双氯芬酸钠( s d ) 通过喷雾 干燥法制成微球，再通过溶剂挥发法在微球外表包以e u d r a g i tl 1 0 0 或e u d r a g i ts 1 0 0 的衣层，形成大小为1 8 2 9 m m 的小丸，在酸性环境中无药物释放，当达到e u d r a g i t 溶解的p h 时，壳聚糖开始溶胀，药物s d 开始释放。 武汉理工大学硕士学位论文 1 4 2 3 利用结肠独特的酶系设计自调式o c d d s 由于结肠有许多独特的细菌产生独特的酶系，以及结肠的疾病形成许多独特的 细胞株，可成为o c d d s 的独特手段。 结肠细菌能产生许多独特的酶系，许多高分子材料在结肠被这些酶降解，而这 些高分子材料作为药物载体在胃、小肠由于相应酶的缺乏不能被降解，这就保证药 物在胃和小肠不释放。如瓜耳胶、果胶、偶氮类聚合物和口，j ，环糊精均可成 为结肠给药体系的载体材料。w a k e f l y 等用果胶和乙基纤维素的混合物对乙酰氨基 酚片进行包衣，体外实验表明，在无结肠酶的情况下眈药物释放2 0 ，当在结肠 酶的作用下8 h 药物可释放5 0 。f e r n a n d e zh e n ，a s 【4 2 】等以果胶( 壳聚糖) 分别对难溶 性药物吲哚美辛和水溶性药物对乙酰氨基酚片进行包衣，在p m 1 的人工液中2 h 均不释放药物，在p h 7 4 的人工肠液中2 h 均释放约3 0 ，在p h 7 4 的人工结肠液 中药物释放明显。r u b i n s t e i n l 4 3 j 等以水不溶性果胶钙和吲哚美辛一起压片，体外实验 表明，在有结肠液或盲肠液中药物释放比对照组明显加快。果胶为一种酸性多糖， 在结肠口葡萄苷酶的作用下降解而显示出结肠定位释放的功能。 利用结肠酶系所设计的o c d d s 具有自调式的优点，但是所用载体材料在结肠 降解速度一般较慢，可能导致药物生物利用度较低的问题。 1 4 2 4 利用压力依赖效应设计的0 c d d s 人体胃肠道蠕动产生压力，但在胃和小肠中，因为有大量消化酶液的存在缓冲 了物体受到的压力。在结肠中水分被大量吸收，肠蠕动对物体产生直接的压力容易 使物体破裂。这就是m u r a o k 】等开发压力依赖型结肠靶向释药的基础。他们制各 了一种胶囊，内部装p e g 与主药的混合物，胶囊核为内包一定厚度的乙基纤维素的 明胶。当制剂进入体内后p e g 在体内溶化，胶囊核破裂形成e g 膜，整个制剂就象 一个大气球在胃肠道中转运。到达结肠后由于所受的压力增大e g 膜破裂制剂开始 释放药物。这种释药系统通过控制e g 膜厚度到达结肠部位，但受食物和胶囊大小 的影响，因而选择一定厚度的e g 膜是该给药系统的关键。 1 5 本课题的意义、创新点 1 5 1 选题意义 天然多糖是自然界中一类比较重要的生物高分子，种类繁多，其中一部分因具 有优良的特性如生物相容性、可降解性较好而有着潜在的工业和商业应用价值。对 多糖进行化学改性，其衍生物被应用于应用于很多领域。通过共混、接枝、交联等 武汉理工大学硕士学位论文 方法获得性能优良的新型功能材料，这些环境友好材料可望逐步替代现有对环境有 害材料，以适应可持续发展战略的要求 1 5 2 - r 作的创新点 甲壳素及其衍生物具有生物相容性好；生物活性优异；生物降解性好等 特点。它们在酶的作用下会分解为低分子物质。因此，其制品用于一般的有机组织 均能被生物降解而被肌体完全吸收。 甲壳素分子中的氨基、羟基可与粘液中的糖蛋白形成氢键产生粘附作用。甲壳 素与粘膜之问相互吸引能延长药物在体内特定区域的滞留时间，促进药物渗透，从 而提高药效。在甲壳素分子上引入羧甲基，同时保留了甲壳素上的功能基氨基、乙 酰氮基和羟基，可以使羧甲基甲壳素凝胶由于羧基的作用在胃部酸性条件下保持收 缩状态，不释放药物，在小肠部位4 h 内释放药物极少它在胃和小肠中不易水解， 但可在结肠，葡萄苷酶的作用下降解，显示出了很好的结肠定位释放的功能。 羧甲基甲壳素凝胶材料是综合考虑了时滞效应和胃肠道p h 差异而设计的定位 释放材料，具有生物相容性好、还可提高药物的生物利用度，且在结肠口葡萄苷酶 的作用下快速降解释药，而生产价格却不到聚丙烯酸树脂( e u d r a g i ts 1 0 0 ) 的l “， 显示出了良好的利用价值。但国内现在相关方面的研究极少，是亟待加强的领域。 所以羧甲基甲壳素凝胶作为结肠部位的定位控释材料在治疗结肠局部疾病、时辰发 作性疾病及多肽蛋白类药物的口服给药方面均具有诱入的市场前景和临床意义。 武汉理工大学硕士学位论文 第2 章羧甲基甲壳素的合成及其离子交联 微球的制备 2 1 引言 甲壳素是一种蕴藏量仅次于纤维素的天然可再生资源。但由于其中乙酰氨基的 存在，甲壳素分子间存在着一o h o 一型及一0 h n 一型氢键的强烈作用，因而 在溶剂中溶解能力很差，这极大地限制了其应用范围。日前对甲壳素研究主要集中 在其衍生物方而归删。 甲壳素化学改性的衍生物，按照不同应用目的，可适当选择不同分子量范围的 甲壳素为原料。甲壳素的分子修饰有羧甲基化、酰基化、烷基化、硫酸和磷酸酯化、 接枝与交联等。通过引人各种功能基，从而改善其物化性质，形成各自不同功能， 可广泛应用于各种领域。它将有望形成甲壳素化学最具活力的产业1 4 7 l 。 其中，甲壳素在碱性条件下可与氯乙酸反应，在c 6 的o h 基中导 入- - c h 2 c o o h ( f i g z - 1 ，2 ) 。可生成0 6 羧甲基甲壳素( 6 0 c m c h ) ： + n n 棚 f i g 2 - 2r e a c t i o no fc a r b o x y m e t h y l a t i o n + n v l 2 0 水溶性的羧甲基甲壳素极大扩展了甲壳素的性能，拓宽了它在生物医药行业中 的应用。由于其良好的生物相容性和可降解性能，以及其低毒、亲水等特点，使其 成为一种潜在的改性高分子天然生物医用材料。由于在甲壳素分子链上引入了带负 武汉理工大学硬士学位论文 电荷的羧基，通过其与带正电荷的金属离子c a 2 + , f c 3 + 螯合交联形成稳定的凝胶材 料，避免了有毒化学交联剂如戊二醛、环氧氯丙烷、聚甘油醚等的使用，使得在口 服缓释药物上的作为辅料应用成为可能 2 2 实验部分 2 2 1 实验原料及仪器设备 甲壳素( 蟹壳) ( 工业级，浙江玉环海洋生物化学有限公司) ；氢氧化钠( a r ， 天津市风船化学试剂科技有限公司) ；氯乙酸( a r ，天津市光复精细化工研究所) ； 异丙醇、柠檬酸( a l l ，天津市博迪化工有限公司) ；无水乙醇、冰醋酸、硼酸、十 二烷基硫酸钠( a r ，天津市福晨化学试剂厂) ：巴比妥( a r ，天津市科密欧化学试 剂开发中心) ；丙酮( 工业级上海远大过氧化物有限公司) ；硼氢化钠( a r ，上海国 药集团) ；盐酸( a r ，湖北省化工科技开发公司华飞化学试剂厂) ；磷酸二氢钠( a r ， 上海凌峰化学试剂有限公司) ； 超滤仪( 美国p a l l 公司) ：d f - 1 0 1 s 集热式恒温加热磁力搅拌器( 巩义市英峪予 华仪器厂) ；i x 1 6 5 b 理化干燥箱( t - 海实验仪器总厂) ；d z f - 6 0 5 0 型真空干燥箱 ( 上海博迅实业有限公司) ；l gj 2 5 冷冻干燥机( 宁波新芝生物科技股份有限公 司) ；r e 5 2 a a 旋转蒸发器( 上海亚荣生化仪器厂) ；p h s 3 b 数字精密p h 计( 上 海精密科学仪器有限公司) ：f a 2 1 0 4 n 电子天平( 上海精密科学仪器有限公司) ；乌 氏毛细管粘度计( 上海申立玻璃仪器有限公司) 。 2 2 2 检测方法 产物的红外光谱采n i c o l c t1 7 0 - s x 型傅立叶变换红外光谱仪( 美国n i c o l c t 公司) 记录，k b r 压片；x 衍射采用r i g a k ud m a x - r a 型x 射线衍射仪( x r d ) ：药物释放 浓度测定采用7 2 2 型分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) ；扫描电镜( s e m ) 采用日本h i t a c h i 公司s 5 7 0 , 测试之前做喷金处理。 羧甲基甲壳素取代度的测定 取一定量产品，准确称其质量，记为w ，置于2 5 0 m l 的锥形瓶中，边搅拌边加 入1 0 0 m l 去离子水及2 5 0 0 m l0 1 m o i l 的n a o h 标准溶液，微热。用0 1 m o l l 的 h c i 标准溶液，以酚酞为指示剂进行滴定，记下消耗h c i 标准溶液的体积v 则羧甲基甲壳素的取代度( d s ) 用以下公式( 2 1 ，2 2 ) 来计算： 彳= ( 2 5 c l p 2 ) w ( 2 1 ) 武汉理工大学硕士学位论文 n s = 0 2 0 m ，( 1 o 0 5 明) g - 2 ) 公式中： 2 5 一所用的n a o h 标准溶液的体积m l o 所用的n a o h 标准溶液的浓度m o f l v 二一所用的h a 标准溶液的体积m l c 2 一所用的h c ! 标准溶液的浓度m o l l w 羧甲基甲壳素的质量g 羧甲基甲壳素脱乙酰度的测定 羧甲基甲壳素的脱乙酰度就是甲壳素分子链上自由氨基的含量，是甲壳素类化 合物的一个重要质量指标，甲壳素脱乙酰度的高低，直接关系到它的溶解能力、粘 度、离子交换能力、富集离子的能力、甲壳素膜的抗张机械强度、絮凝性能、选 择性酰化能力和众多的生理功能，已成为甲壳素类化合物质量的一个不可缺少的数 据。甲壳素的脱乙酰度( d e g r e e o f d e a c e t y l a t i o n ，缩写为d d ) ，可定义为甲壳素分 子中脱除乙酰基的糖残基数占甲壳素分子中总的糖残基数的百分数，这个百分数包 括质量百分数和摩尔百分数，通常所涉及的是质量百分数。与此相反，甲壳素的乙 酰度= 1 0 0 一甲壳素的脱乙酰度，乙酰度常用于描述完全脱除乙酰基的壳聚糖重新 乙酰化的程度。 本文测定羧甲基甲壳素的方法是酸碱指示剂滴定法，这是最简单的一种测定甲 壳素中自由氨基含量的方法，不需要特殊的仪器设备，重复性好。 酸碱滴定法的原理是利用甲壳素分子中的自由氨基呈碱性，能与游离的质子氢 离子结合发生质子化反应，形成甲壳素的胶体溶液，溶液中游离的氢离子用碱反滴 定，从用于溶解甲壳素的酸量与滴定用去的碱量之差即可推算出壳聚糖自由氨基结 合酸的量，从而计算出甲壳素中自由氨基的含量。滴定过程中使用单一指示剂一 甲基橙判断终点。其具体方法如下： 取一定量产品，准确称其质量，记为w ，置于2 5 0 m l 的锥形瓶中，保持其p h = 7 ， 边搅拌边加入1 0 0 m l 去离子水及2 5 0 0 m 1 0 1 m o l l 的h c i 标准溶液，微热。用0 1 m o l l 的n a o h 标准溶液，以甲基橙为指示剂进行滴定，记下消耗的n a o h 标准溶液的体 积v 。 则羧甲基甲壳素的脱乙酰度( d s ) 用公式( 2 3 ) 来计算： d s = ( c n c t v n c t c n o o h v s 。o h ) + 1 6 1 1 0 3 g + ( 1 0 0 一w ) r 1 0 0 ( 2 - 3 ) 式中：c l h c l 、n a o h 标准溶液的浓度，t o o l l ： v 一溶液的体积，m h g 样品的质量，g 、一样品的水分含量，m 。 武汉理工大学硕士学位论文 羧甲基甲壳素分子量测定方法 羧甲基甲壳素分子量的测定是研究羧甲基甲壳素性质的一项较为重要的工作， 羧甲基甲壳素的性质往往与它的分子量大小有关其溶液的粘度不但随浓度的增大 而升高，而且与分子量大小有关。一般说来，分子量增大粘度增高。在生物学研究 中，发现某些多糖由于分子量大小方面差别，所产生的某些效应有一定的差别。因 此，在测定羧甲基甲壳素分子量时，为了避免因存在杂质影响测定结果，需要把检 测的样品适当提纯。用于分子量测定的样品，纯度要求虽然不十分高，但至少要去 处杂质和水分，并把不同化学结构、不同分子量大小的组分相互分开，使它们在测 定分子量中不相互干扰。 常用于多糖分子量测定的方法有渗透压法、蒸汽压法、端基分析法、粘度法、 光散射法、凝胶渗透色谱法、超滤法、超离心法等。由于人为加工的高分子聚合物， 一般来说分子量是不均一的，多糖的分子量分布一般比较分散，所以一般所称的分 子量是样品分子量的平均数，即平均分子量。采用不同方法测得的分子量数值是不 同的，一般有数均分子量，重均分子量，粘均分子量。本文中所用方法为粘度法。 粘度法测定分子量，所需设备较简单，操作较易掌握，因此常用于多糖的分子 量测定。通常的做法是，测定样品在多个( 通常为5 个) 不同浓度( c ) 下的相对粘度n r ) 和增比粘度( 啮) ，作。 l c ( 比浓粘度卜c 和h 州c - - c 作图外摊至c 为0 时得到特 性粘度啪。分别测定己知分子量( m ) 标准品的特性粘度，则由经验公式 【叩】= 7 9 2 1 0 7 如”，计算出粘均分子量。则测定羧甲基甲壳素粘均分子量的关键是 测定羧甲基甲壳素分子的相对粘度( n r ) ，其增比粘度穆，= 咖1 1 ，则可得到羧甲基甲 壳素的特性粘度，进而得到粘均分子量。 本文是用乌氏粘度计来测定羧甲基甲壳素分子的相对粘度，下面是羧甲基甲壳 素分子的相对粘度的测定方法。 取一定量羧甲基甲壳素样品，准确称取其质量，加入蒸馏水，分别配制l ( w ，v ) ， 0 5 ( w ) ，0 2 5 ( w v ) 三种不同浓度的羧甲基甲壳素溶液，放置2 4 h ，使 之完全溶解。 取乌氏毛细管粘度计一支，用蒸馏水清洗干净，烘干。测定蒸馏水的流过乌氏毛 细管粘度计的时间，记为t 0 ，再次烘干乌氏粘度管后测定配制好的羧甲基甲壳素溶 液流过乌氏粘度管的时间，记为t ，则样品的特性粘度为q r = t t o ，依照此法次测 定出下九组样品的特性粘度t 1 r 1 1 1 t 9 ，进而计算出九组样品的粘均分子量。 2 2 3 合成路线 1 、由甲壳素经碱化、冻胀、羧甲基化，制得羧甲基甲壳素： 2 、制得的羧甲基甲壳素溶解在蒸馏水中经过滤、调节p h 值中和过量的碱、过滤、 武汉理工大学硕士学位论文 透析除去盐等小分子，最后丙酮反沉淀，产物冷冻干燥。 3 、将羧甲基甲壳素溶液滴到配制的交联剂溶液中，静置一段时问得到羧甲基甲壳素 凝胶微球 2 2 4 羧甲基甲壳素的制备 羧甲基甲壳素的制备主要是由甲壳素羧甲基化反应，在其分子上引入具有水溶 性的羧甲基基团，得到羧甲基化产物，再进一步精制得羧甲基甲壳素。以下是几个 制备实例： 制备实例1 嘲：将甲壳素4 9 与2 0 m l 的二甲基亚砜混合2 4 h ，捣碎，过滤除去 溶剂，将滤饼用乙醇粉碎后，再加入到5 0 m l 6 5 n a o h 溶液中处理，过滤，加入到 含有6 9 氯乙酸的5 0 m l 异丙醇中，反应1 h ，过滤，将固体物加入到2 0 0 m l 水中加 盐酸调p h 至中性，搅拌1 h ，再用丙酮、乙醇反复洗涤萃取，离心，烘干后可得1 8 9 羧甲基甲壳素产品 制备实例2 嗍：1 0 9 甲壳素悬浮于4 0 m l 6 0 ( w v ) 的n a o h 溶液中，加入2 的 十二烷基硫酸钠搅拌，冷冻1 2 h 。悬浮于2 5 的2 0 0 m l 的异丙醇中，搅拌下分批加 入氯乙酸，直到混合液呈中性后，再反应数小时。过滤，乙醇洗涤，后溶于2 l 的 水中，5 l 丙酮沉淀析出过滤，烘干即得o - 羧甲基甲壳素产品。 制备实例3 冈：将不溶性甲壳素粉碎，取5 9 加入1 5 l4 2 w t 的氢氧化钠溶液 中搅匀，充分混合碱化，室温保持4 h 。过滤，4 2 的氢氧化钠溶液洗涤，抽滤得到 碱性甲壳素。加入3 0 m l 异丙醇充分搅拌。然后滴加3 5 9 氯乙酸，常温反应2 h ，升 温至6 5 ( 2 ，反应2 h ，停止加热冷却至室温，用冰醋酸调p h 至中性，用8 5 甲醇洗 涤多次，烘干产品即可制得羧甲基甲壳素产品 综合以上实验方案，镧定以下步骤： 羧甲基甲壳素及其微球的崩备 准确量取5 9 甲壳素( c m ) ，置于5 0 m l 塑料小烧杯中，加入3 6 98 0 ( w v ) n a o h 溶液和0 0 2 9 十二烷基硫酸钠( s d s ) ，用玻璃棒充分搅拌均匀，在4 1 2 环境下放置 1 h ，使之充分碱化；后将混合物放置在2 0 环境下，冷冻过夜； 碱化后的甲壳素样品加入1 0 0 m l 异丙醇( i p a ) 及1 5 9 一氯乙酸( m c a ) ，微量 硼氢化钠，机械搅拌，恒温水浴2 5 ，反应一定时间； 反应完毕后产物抽滤，8 0 ( v v ) 乙醇洗涤；后溶于蒸馏水中，调节所得溶 液的p h 值至7 0 ，抽滤得清液超滤( 膜5 0 0 0 d ) ；丙酮沉淀，离心分离后得到白色 固体，冷冻干燥，即得所需产品羧甲基甲壳素，用i f 交实验设计考查反应条件及投 料比对产物的影响。 取一定量上述方法制得的羧甲基甲壳素配制5 ( w v ) 溶液，滴到配制的离 武汉理工大学硕士学位论文 子交联剂溶液中，静置1 5 6 0 r a i n 。得到微球。用蒸馏水冲洗2 - 3 次，置于4 0 c 环境 下，真空干燥。 取一定量上述方法制得的羧甲基甲壳素，准确称取其质量，加入蒸馏水，使之 完全溶解，配成5 ( w ) 溶液。 称取一定量的f e c l 3 固体，加入蒸馏水，配制浓度为3 ( w ) 的f e c l 3 溶液。 称取一定量的c a c l 2 固体，加入蒸馏水，配制浓度为3 ( w ) 的c a c l 2 溶液 将两种溶液按比例混合，配制以下几组溶液： f c a 3 3 f c c 3 2 4 - c a c l 21 f e c b1 + c a c l 2 2 f e c l 31 5 + c a c l 21 5 c a c l 2 3 将上述的五种溶液分别取一定量倒入烧杯中，将制得的羧甲基甲壳素溶液用6 号标准针头滴到配制的五种溶液中，静置1 5 6 0 r a i n 。得到微球。用蒸馏水冲洗2 - 3 次，置于加环境下，真空干燥2 4 h 以上。 2 3 结果与讨论 2 3 1 红外光谱( f t ir ) 将样品磨碎，k b r 压片，用n i c o l e t1 7 0 - s x 型傅立叶变换红外光谱仪记录甲壳 素、羧甲基甲壳素的红外光谱图。 c 油 c - c h 3 4 0 0 03 5 3 0 0 02 5 0 0 2 0 0 01 5 0 01 0 0 05 0 0 w a v e n u m b _ i c m “ c m c h 3a n dc m c h 8a r ct h es a m p l e si no n h o g o n a le x p e r i m e n tr e f e t e di n2 3 3 1 f g 2 - 3n 1 rs p e c t r ao fc h i t i na n dc m c hw i t hd i f f e r e n ts d 1 8 霉s暑嚣一善，# 武汉理工大学硕士学位论文 由目标物质的红外光谱图n g 2 - 3 可知，3 2 5 0 - 3 6 0 0 伽4 处的吸收峰归属于羟基 伸缩振动( y o n ) ，并由于分子中的羟基间的氢键而形成了包括若干小肩峰组成的强 宽峰肛l j ：又因为羧甲基化破坏了甲壳素的由结晶结构所产生的氢键，因而肩峰现象 消失。3 0 9 0 锄d 的吸收峰归属于c h 2 不对称伸缩振动( p c ) ；1 4 0 0 锄d 的吸收峰 归属于c h 2 弯曲振动峰；1 2 0 0 0 l i n 1 1 2 5 0 c m 。1 出现的多个吸收峰归属于c - o 键的伸 缩振动( i c o ) ；1 0 7 0 c m 4 处为甲壳素6 号碳原子( o d - k 篚j 羟基弯曲振动吸收峰( y o n ) ， 随着羧甲基化反应的进行及取代度的增加，吸收峰逐渐降低并消失；羧甲基甲壳素 的红外图谱与甲壳素分子的相比，羰基吸收峰( o c o ) 在- 1 6 5 0 c m - 1 出现，并且随着取 代度的增加，吸收峰的强度越来越大 以上现象可以表明羧甲基官能团已经按枝在了甲壳素分子链段上。 mm i 1 0 0 0 o w i v on u m b e ri c m ) 啦2 - 4 f r l rs p e c u ao fc m c ha n dc m c hb e a d sc r o s s - l i n k e dw i t hf e ( u 1 ) 由f e 3 + 交联微球和c m c h 的红外光谱图f i g 2 - 4 可知，7 1 3c m - 1 的吸收峰归属 于一c h 2 变形振动，2 1 5 0c m d 的吸收峰归属于o h 的伸缩振动，经过与f c 3 + 交联作用 后，前者由于受到铁离子正电荷的影响振动受到拟制；后者由于两者作用生成新的 化学键，使得原吸收峰消失。以上都说明，c m c h 和f c 3 + 子交联后有新的化学键生 成，形成了新的物质。 基善暑篁1u 武汉理工大学硕士学位论文 2 3 2x 一射线衍射( x r d ) i h 玎 2 - 5 x r d q , e c u a o f c h i t ma n d c m c h x - 射线衍射谱图由r i g a l md m a x - r ax 射线衍射仪( j a p a n ) 记录，扫描范围 1 0 - 8 0 。( 2 0 ，扫描速率4 。( 2 0 ) m i n ，管电压4 0 k v ，管电流3 0 m a ，c u - - k a 射线源。 从f i g 2 - 5 可以发现结晶性良好的c h i t i nx 射线衍射线尖锐，峰值处的2 0 为1 9 5 2 。， 而结晶性差的c m c h 则呈现弥漫模糊的图形，峰值处的2 0 为2 1 3 2 。，说明羧甲基 化后结晶程度下降，无规程度上升。 2 - 3 3 工艺条件对甲壳素制备的影响 2 3 3 1 实验条件的选取 t a b l e2 1l 9 ( 3 3 ) 正交实验表 为考查实验反应条件对羧甲基甲壳素性质的影响并找出最佳的反应条件，特选 取三个影响因素，即碱浓度，m c a 加入量和反应时间，分别取三水平做正交实验， t a b l e2 - - 1 为正交实验表。 武汉理工大学硕士学位论文 2 3 3 2 羧甲基甲壳素取代度的测定 由t a b l e2 1 可知，碱浓度越大，取代度越大，因为在提高碱的浓度的条件下， 更有利于形成亲电加成的质子化中心c h 2 0 n a ：而在- 2 0 下冷冻过夜是为了让 n a o h 溶液中的水渗入甲壳素分子间并结冰，同时十二烷基硫酸钠作为一种表面活 性剂，可以使水分子更好、更迅速的进入到甲壳素分子中。由于水结冰体积会增大， 因而在这个过程当中甲壳素分子致密的结晶结构被破坏，使得反应易于进行。 为了防止分子主链发生断裂，加入少量n a b h 4 以保护。不加反应也能进行，但 对于两种产品，发现没有加入n a b i - l t 的产品呈黄色片状，而加入n a b i - l t 的产品呈 白色疏松状。前者产品虽然也有良好的水溶性，但粘均分子量下降了5 0 ，这是由 于浓碱在促使甲壳素醚化的同时，易使主链发生断裂，分子量因此降低。实验还发 现，在一定温度下，延长反应时间，也会使主链发生部分降解。但加入n a b h 4 不能 过多，否则不利于醚化反应的进行。 依据t a b l e2 1 ，以d s 为试验进行数据分析并得出结论：反应时间并非越长 越好，当反应时间超过4 h 后，同等情况下取代度( d s 浍降低。最佳的反应条件为， 反应时间4 h ，m c a 与n a o h 质量比为9 ：1 0 ，而碱的浓度越高，则相应的d s 会 越大。 2 3 3 3 羧甲基甲壳素脱乙酰度的测定 i h b l e 2 2 不同的羧甲基甲壳素样品的d d 由t a b l e2 2 可知，羧甲基甲壳素制备条件对羧甲基甲壳素脱乙酰度的影响不 是很大，因为脱乙酰反应般要求在高