（应用化学专业论文）IIB族离子荧光探针的研究与细胞成像的应用.pdf

大连理工大学博士学位论文 摘要 生命活动是由许多生物活性物质参加的各种化学反应的结果，金属离子就是其中重 要的一种。i i b 族元素中，锌是生物体内必需的微量金属元素，直接参与机体内很多重 要的生理过程，在维持蛋白质，核酸，肽类和激素等生物大分子的基本结构和实现其正 常功能方面起着重要的作用。而i i b 族元素中的镉和汞在较低浓度时就会对生物体产生 较大的毒性和破坏性。因此，i i b 族金属离子的研究和检测特别是对细胞内金属离子的 成像检测具有重要的意义。与传统的金属离子检测方法相比，荧光探针检测因其兼备便 捷、专一和灵敏的优点，并能对环境体系和生命体系中的分析对象进行实时原位检测而 具有广泛的应用前景。因此设计合成金属离子荧光探针，在化学体系中试验其性质，结 合荧光成像技术，检测细胞内某种金属离子的浓度变化及其分布。这将对探讨金属离子 在生命活动中所发挥的作用以及对某种离子缺陷时出现的病理研究提供重要的帮助。因 而用荧光探针检测金属离子成为了超分子化学以及生物医学等领域中重要的研究课题 之一。 本论文基于p c t 原理设计合成了b o d i p y 类镉离子比率型荧光探针b c d l 。在识别 过程中，镉离子的配位作用减弱了共轭氮原子对荧光团的供电能力，从而引起了荧光波 长近6 0n m 的蓝移，荧光量子产率增大约4 倍。b c d l 具有很强的抗干扰能力，同时具 有较低的p k a ( 4 1 ) 。b c d l 可以完全区分c d 2 + 和z n 2 + ，并实现了在h e l a 细胞中镉离子 的比率荧光成像。 基于p e t 原理设计合成了一系列以b o d i p y 为荧光团，以开链硫醚作为识别基团 的汞离子荧光探针b h 9 1 3 。通过对醚链末端基团的修饰来调整探针分子的油水溶性以 及对汞离子的识别能力。研究表明，探针分子对目标离子的识别能力对探针分子的抗阴 阳离子干扰以及细胞内汞离子成像具有重要的影响。 设计合成了一系列基于汞离子促进水解反应的罗丹明类h 9 2 + 荧光探针r h g l - 3 ，并 对该机理进行了详细阐述和验证。r h 9 1 3 能够专一性地识别h 9 2 + ，并具有很高的灵敏 度。r h g l 一3 实现了在海水等水体系中p p b 级h 9 2 + 的检测，以及在h e l a 细胞内h 9 2 + 的 荧光显微成像。 基于去质子和p c t 原理设计合成了喹啉类锌离子比率荧光分子探针q z n l 。在识别 过程中，锌离子的配位作用导致荧光波长红移约9 0n m ，显示了典型的双波长比率荧光 探针的光谱特征。 关键词：荧光探针；i i b 族离子；氟硼荧类染料；罗丹明类染料；喹啉类染料 l i b 族离子荧光探针的研究和细胞成像的应用 t h e s t u d ya n da p p l i c a t i o ni nc e l l - i m a g i n go ff l u o r e s c e n tp r o b e sf o ri i b i o n s a b s t r a c t t h ea c t i v i t yo fl i f ei sa ne f f e c to fd i f f e r e n tc h e m i c a lr e a c t i o n sb yl o t so fb i o l o g i c a la c t i v e s u b s t a n c e s a n dm e t a li o ni so n ei m p o r t a n tk i n do ft h e m e s s e n t i a lt r a c ez i n cp a r t i c i p a t e si n m a n yi m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s f o re x a m p l e ，i tp l a y sc r i t i c a lr o l e si nm a i n t a i n i n gt h e s t r u c t u r ea n dr e a l i z i n gt h en o r m a lf u n c t i o no f p r o t e i n ，n u c l e i ca c i d ，p e p t i d e s ，i n c r e t i o na n do t h e r b i gb i o l o g ym o l e c u l e s h o w e v e r ，c a d m i u ma n dm e r c u r ya r et o x i ca n dh a r m f u lt oo r g a n i s m e v e na tv e r yl o wc o n c e n t r a t i o n s s ot h ed e t e c t i o no ft h e me s p e c i a l l yt h ed e t e c t i o ni nv i v oi s i m p o r t a n tt ot h er e s e a r c ho fb i o l o g y ，m e d i c i n ea n de n v i r o n m e n ts c i e n c e c o m p a r e dw i t h t r a n d i t i o n a lm e t h o d sf o rt h ed e t e c t i o no fm e t a li o n s t h ef l u o r e s c e n tp r o b e sh a v ea t t r a c t e dm u c h a t t e n t i o no v e rt h ey e a r sf o ri t sm a n yi n h e r e n tm e r i t si n c l u d i n gh i g hs p e c i f i t ya n dh i g h s e n s i t i v i t y t h i st e c h n o l o g yh a sb e e nw i d e l yu s e df o rt h er e a l t i m ed e t e c t i o no ft h em o l e c u l a r e v e n t sb o t hi nt h ec h e m i c a la n db i o l o g i c a ls y s t e m s w ec a nd e s i g na n ds y n t h e s i z em e t a li o n s f l u o r e s c e n tp r o b e s ，a n ds t u d yt h ep r o p e r t yo ft h ep r o b e si nc h e m i c a ls y s t e m ，a n dt h e nd e t e c tt h e c o n c e n t r a t i o nc h a n g e sa n dd i s t r i b u t i o no fm e t a li o n si nc e l l so nl i n ea c c o r d i n gt oc o n f o c a l f l u o r e s c e n c ei m a g i n gt e c h n o l o g y t h i sw i l lb eh e l p f u lt oe x p l o r et h ef u n c t i o no fm e t a li o n si n l i f ea c t i v i t ya n dp a t h o l o g yo ft h es h o r t n e s so fm e t a li o n sa n da f f o r de s s e n t i a lb a s i si nt h e c h e m i c a la n dt h eb i o l o g i c a ls y s t e m s t h e r e f o r et h eb o d i p yr a t i o f l u o r e s c e n tc d z + p r o b eb c d lb a s e do np c tm e c h a n i s mh a s b e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h ef o r m a t i o no fc o m p l e xb c d l c d 什w e a k e n e dt h e e l e c t r o n d o n a t i n gc h a r a c t e r ，l e a d i n gt oab l u es h i f to f6 0n i ni nf l u o r e s c e n c ee m i s s i o na n da n i n c r e a s eo fq u a n t u my i e l df o ra b o u t4f o l d b c d ls h o w ss t r o n ga n t i - j a m m i n ga n dl o wp k a i t c a nd i s t i n g u i s hc d 2 + f r o mz n 2 + a n de s p e c i a l l yc a nb eu s e di nr a t i o m e t r i cf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p yi nh e l ac e l l s t h eb o d i p yf l u o r e s c e n th g z + p r o b eb h g l - 3b a s e do np e tm e c h a n i s mh a v eb e e n d e s i g n e da n ds y n t h e s i z e dw i t has e r i e so fn s 2 x 2 c a t e n u l a t eg r o u pa sr e c o g n i a t i o ng r o u p t h e c o o r d i n a t i o na b i l i t ya n do i l w a t e rs o l u b i l i t yo ft h ep r o b e sc a nb ea d j u s t e d b yd i f f e r e n t r e c o g n i t i o nm o i e t yo fc a t e n u l a t en s 2 x 2 t h er e s u l t si n d i c a t et h a tc o m l e x a t i o na b i l i t yb e t w e e n p r o b e sa n di o n si so n eo fm o s ti m p o r t a n tf a c t o r sf o ri n t e r f e r e n c ea n dc e l l i m a g i n ge x p e r i m e n t t h er h o d a m i n ed e r i v a t i v e so fh 9 2 + f l u o r e s c e n tp r o b e sr h g l - 3b a s e do nh 9 2 + - p r o m p t e d h y d r o l y s i sm e c h a n i s mh a v eb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d 。t h em e c h a n i s mw a ss t u d i e da n d i i 大连理工大学博士学位论文 c o n f i r m e dc a r e f u l l y r h g l - 3e x h i b i th 9 2 + s e l e c t i v ea m o n gm e t a li o n s r h gs e r i e sh a v e e x t r e m e l yh i g h l ys e n s i t i v i t yf o rh 9 2 + r h g l - 3h a v ee n a b l e dt h e d e t e c t i o no fp p bl e v e lo fh g z + i nn a t u r a lw a t e rs a m p l e sl i k es e a w a t e r m o r ei m p o r t a n t l y ，t h e yh a v ab e e na l s op r o v e do fh g z + f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yi nh e l ac e l l s t h eq u i n o l i n ed e r i v a t i v eo fr a t i o f l u o r e s c e n tz n 2 + p r o b eq z n lb a s e do i lm e c h a n i s mo fp c t a n dd e p r o t o n a t i o nh a sb e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d t h ef o r m a t i o no fc o m p l e xq z n l z n l e a d st oa9 0 如皿r e ds h i f ti nf l u o r e s c e n c ee m i s s i o n ，w h i c hs h o w st y p i c a lr a t i oc h a n g e si n s p e c t r a k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n tp r o b e ；l i bi o n s ；b o d i p yd e r i v a t i v e s ；r h o d a m i n ed e r i v a t i v e s ； q u i n o l i n ed e r i v a t i v e s i i i 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：! ! 堡蓝直至夔当拯盐盟珏壅复垫堕盛堡鲍廑周 作者签名：血_ j 叠二墨一日期：址年l 月丝日 大连理工大学博士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目： 作者签名： 导师签名： 日期：鲨坦年l 月j l 日 日期：丝丝年乙月日 大连理工大学博士学位论文 1 绪论 金属离子的研究在生命科学研究中占有重要地位。设计合成对某些金属离子有高选 择性和灵敏度，具有合适光谱性质的荧光探针，在化学环境下试验其性能，并结合荧光 成像技术，实时检测细胞内的金属离子，将为生物学以及医学的研究提供必要的依据。 1 1i ib 族元素对生物体的作用 随着科学技术的突飞猛进，人类已能在分子水平上研究生物体的化学本质及其在生 命活动中的化学变化规律。金属元素在整个生命体系中起着重要的作用。金属离子与核 酸、蛋白质等生物大分子的作用以及对神经系统不正常的影响可以直接或间接地损伤 d n a ，从而引起细胞的变异，进而导致各种疾病。探讨各种金属离子在生命活动中所发 挥的作用以及对某种离子导致出现的病理进行研究，建立有效而实用的原位实时检测系 统，将为生物学以及医学的研究提供必要的依据。 锌，镉和汞虽然同为l i b 族元素，但是他们对生命体的作用完全不同。一方面，锌 离子作为组成人体的微量金属元素，虽然含量甚微，但却是机体生命过程中具有重要作 用的激素。它们不仅存在于人体中，而且还必须在恰当的位置，以恰当的量和氧化态， 同恰当的化学组分相结合。过量或缺乏，都会对人体产生危害，甚至有致命的危险。另 一方面，汞和镉等金属离子对生物体有着致命的毒害作用，甚至微量的摄入都会导致生 物体中毒。因此研究金属离子对生物体的作用，以及利用这些作用进行人工模拟一直是 生物和化学领域内的研究热点。 1 1 1 锌在生物体中的作用 我们可以将人体内的金属元素根据其在人体内的相对含量分为宏量元素和微量元 素。宏量元素主要参与构成机体，而微量元素参与人体各项生理功能的发挥。宏量元素 包括c a 、k 、n a 、m g 等。微量元素包括f e 、z n 、c u 、m n 、c r 、s n ，m o ，c o 等。【1 2 】 锌离子作为一种微量金属元素，在人体中的作用举足轻重。锌离子是生物体中的一 种二价金属，也是生物体中继铁之后第二富集的过渡金属。例如，成年人体中共含有2 3g 锌，而铜仅有2 5 0m g i 引。更有趣的是，大量的锌( i i ) 都集中在神经组织中，如在脑组 织中的浓度是0 。l o 5m m l 4 j 。尽管生物体中大部分的锌离子都与蛋白质紧紧结合【5 1 ，但 在某些细胞中仍然存在着“游离锌池 。游离锌的浓度在各种哺乳细胞内可低至纳摩尔 级，而在海马( 海马是大脑中负责情节记忆的脑神经结构) 的神经末梢则可高达3 0 0 g m t6 。迄今为止，人们已经认识到锌在生命过程中起着许多不同的作用。例如其中最重 要的作用就是在金属蛋白中作为一种构造因子。同时，z n 2 + 通过金属调整蛋白直接参与 i i b 族离子荧光探针的研究和细胞成像的应用 调整基因表达【7 1 。另外，锌离子也存在于大部分的d n a 和r n a 聚合酶中【8 1 。z n 2 + 也能 够从突触囊中释放出来并通过电位调控c a 2 + 进入细胞，表明游离锌离子还具有神经调节 的功能【9 1 。 i n e u r a ls i g n a lt r a n s m i s s i o n z n 2 十 c a t a l y t i cc e n t r e s 图1 1 锌离子在生物体中的主要作用 f i g 1 1 m a i nr o l e so f z n 2 + i no r g a n i s m 以蛋白质结合形式存在的z n 2 + 在生物体中的作用已广为报道，但“游离锌”( 未配位结 合或弱键结合锌) 的作用还有待解释【l 。所以，需要发展一种敏感并且非扩散性技术来 完成这种实时局部成像。有别于其它过渡金属( 如f e 2 + ，m n 2 + ，c u 2 + 等) ，由于最外层电子 分布是3 d 旧4 s o ，z n 2 + 不能表现出任何波谱或磁信号。普通的分析方法，如紫外可见光 谱，核磁共振光谱，电子顺磁共振光谱等都不能用于这种生物体系中特殊的金属离子的 检测。因此，应用荧光探针体系在一个比较宽的浓度范围内定量检测和反映z n 2 + 的流量 和水平对进一步了解z n 2 + 在生物体系的作用具有重要意义【1 1 】。荧光探针分子的设计涉及 各个学科的知识，如配位化学、光物理学、有机合成、分析技术、细胞生物学、组织学、 神经生物学和临床成像等【l 引。 1 1 2 重金属元素镉和汞 镉、汞是公认的对生物体毒害作用最大的金属元素，即使摄入微量也会引起严重的 后果。 1 3 - 1 4 】 镉广泛存在于自然界，不仅是一种对环境最有威胁的工业污染物，而且也是一种半 衰期长达数十年的对人体最有毒害作用的重金属元素之一【1 5 1 。镉广泛用于如电镀、冶金、 一2 一 大连理工大学博士学位论文 军工等工业生产过程，甚至在磷酸肥料中也有发现【l6 1 。这些因素以及镉镍电池的广泛应 用导致镉大量流失到环境中，并且可进一步通过食物链富积于人体中【l7 1 。镉对人的健康 有极大损害，主要蓄积在人体内的肝脏和肾脏内【l8 1 。它进入人体的途径除消化道和呼吸 道之外，还有皮肤的直接接触吸收等。镉对人体的危害主要是造成肾和肝的病变，导致 贫血和神经痛。另外，还可通过影响钙的代谢，危及骨骼系统，典型症状表现为运动能 力减退，骨盆、脊柱、四肢关节刺痛，甚至出现贫血。镉对环境的污染主要来自工业生 产和使用镉及其化合物、含镉废水灌溉及含镉农药的使用。植物对镉有很强的富集作用， 因而形成含镉粮食，如“镉米 ( 含镉水稻) 。早年日本流行的“骨痛病”就是长期食用 “镉米”和饮用含镉水引起的。因而，在1 9 7 1 年的一次国际环境会议上镉被列为环境 污染中最为危险物质之一；在世界卫生组织确定的1 7 个优先研究的食品污染物中，镉 仅次于黄曲霉毒素和砷而被列为第三位；1 9 8 4 年联合国环境规划署提出的1 2 种具有全 球意义的危险化学物质中，镉居首位。所以对于镉离子尤其是细胞或组织内的镉离子的 检测以及生物学研究已经成为近年来的研究热点。 汞也是对人体和环境最有威胁和毒害作用的金属之一 1 9 - 2 0 。汞在自然界主要以元素 汞、无机汞和有机汞三种形式存在。有机汞的毒性大于金属汞和无机汞化合物，因而更 容易发生中毒。汞及其污染物可以通过火山喷发、采矿、固体废弃物焚化等各种各样的 自然的以及人为的过程而广泛分布，从而污染大量的水、空气和土壤。并且通过环境中 细菌的作用，汞元素和汞离子都可以被转化成甲基汞，即使是在很低的浓度也可以进一 步通过食物链富积于人体中 2 1 - 2 3 】。有机汞和甲基汞均可通过呼吸道、消化道、皮肤侵入 人体。无机汞在人体内蓄积部位主要是肾脏，其次是肝脏和脾脏；甲基汞除蓄积在肝、 肾等脏器之外，还可通过血脑屏障蓄积于脑组织内。汞中毒能损伤中枢神经系统，轻者 表现为口腔炎、震颤、急躁、易怒和情绪不稳定，重者则精神紊乱、行为支配能力降低、 四肢瘫痪等。此外，大量使用有机汞农药，通过生物富集作用进而危害人体，也是汞中 毒的主要原因之一。各种形态的汞及其化合物都具有高度的化学反应活性，它能与体内 蛋白质、酶和核酸等生物分子中的羧基和磷酸基等官能团发生强烈缔合，进而扰乱细胞 分裂和神经子传递等生命过程，对人的健康有极大的损害1 2 4 啪j 。同时它对大脑、骨骼、 肾脏以及中枢神经，免疫以及内分泌等系统都有不同程度的毒害作用。1 9 5 3 年发生在日 本的“水俣病 便是典型的例子。环境中的汞污染主要来源于工业使用的汞，如化学工 业中用汞作催化剂，各种汞制仪表等。大气中的汞来自汞矿开采冶炼、煤和石油燃料燃 烧等。但是在分子水平上汞的毒性机理仍然没有研究清楚。所以对于环境中汞离子的检 测以及生物学研究已经成为近年来的研究热点。 一3 一 l i b 族离子荧光探针的研究和细胞成像的应用 1 2 金属离子的检测方法以及细胞内金属离子荧光成像 目前已经建立的测定金属离子的方法，主要有原子吸收( a a s ) 【2 7 j 发射光谱法 ( a e s ) t 2 8 1 ，分光光度法【2 9 。2 1 ，高效液相色谱法【3 3 】，电感耦合等离子体质谱法( i c p m s ) 【3 4 】， 化学发光法【3 5 1 ，电化学法( 极谱法和伏安法) 【3 6 。3 7 1 ，荧光分析法【3 8 4 5 1 等。原子吸收分光光 度法具有灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、应用范围广等优点，目前已经成为各个 部门、教学科研单位普遍使用的一种分析测试方法。其缺点是测定难熔元素的灵敏度不 高；而且，测定每种元素都需要一个特定元素的空心阴极灯，这对同时测定试样中多种 元素颇为不便。此外，该方法不能反映所测元素的价态。分光光度法是基于物质对光的 选择性吸收而建立的分析方法，此方法具有灵敏度高、操作简单、仪器价格便宜等优点。 但是，由于过渡金属离子结构和离子半径差别不大，在光度分析中常彼此干扰，导致测 定方法的选择性不理想。i c p m s 法和h p l c 法所需仪器昂贵，样品预处理复杂，操作 也比较繁琐。化学发光法选择性较差，不适于低浓度的生物样品的测定。电化学方法测 定金属离子主要有极谱法和伏安法，具有灵敏、快速和简单的优点，应用较为广泛。 与上述检测方法相比，荧光检测法不仅方法简便，而且在灵敏度、选择性、响应时 间、现场测定( 如荧光成像技术) 及生物应用等方面均有其突出优点。近年来，荧光分析 法在金属元素的分析中的应用越来越广泛，从天然水，饮用水到废水污水，从土壤大气 到动植物，从人体的头发骨骼血液到内脏等各个器官涉及到的样品等几乎是无所不有。 荧光分析法具有很高的灵敏度，还具有选择性好、重现性好、取样量少、简洁快速的优 点。荧光检测的方法主要有荧光生成、荧光猝灭、催化荧光等。随着一些新科学技术的 引入还产生了诸如同步荧光、导数荧光、三位荧光等新技术，使荧光分析法不断朝着高 效、痕量、微观和自动化的方向发展。荧光分析法的灵敏度准确度和选择性不断提高。 而且，最近荧光成像技术得到了快速的发展，主要是在生物分析领域中广泛应用。 近年来，关于金属离子荧光探针的研究发展迅速，多种荧光探针己被设计合成用于 测定金属离子。其中仿生过渡和重金属离子荧光探针更是成为科技工作者研究的热点。 基于光诱导电子转移( p e t ) 、光诱导分子内电荷转移( p c t ) 、分子内共振能量转移( f r e t ) 等机理所设计的m 9 2 + 、z n 2 + 、c u 2 + 等荧光探针是研究最广泛的几种，其中一些探针已经 可以跨膜在细胞内对较低浓度的金属离子进行荧光成像检测。镉，汞等金属离子荧光探 针也有相关报道，但这些探针分子大都存在不同缺陷，只有少数实现细胞内荧光成像， 极大限制了在生命体中对这些痕量金属离子的实时原位检测。 一4 一 大连理工大学博士学位论文 委甏圈燮誉镬叁i 墨舀 蘸懑曩擘藩鼍圈 a f t e r c ft m 5d j ，日 l “q w i t hk 7 m 圈l2m 9 2 + 荧光探针在p c i 2 细胞山成像 f i g1 2 i m a g i n g m 6 # + i n p c i 2u s i n g f l u o r e s c e n t p r o b e 目前己报道有多种荧光探钊用于金属离子的荧光成像。m 9 2 + 在生命过程中能够促进 骨骼段细胞形成，参与体内能量代谢，并在能量的输送、储存中起着关键的作用。因此 选择合适的荧光探针分析研究m g h 具有重要的现实意义。y o s h i os u z u k i 等1 4 “设计合成 了测定细胞内m 9 2 + 浓度的荧光探针k m g - 2 0 - a m 和k m g - 2 7 - a m 。如图12 所示，利 用荧光显微镜成功地观察到了p c i 2 细胞内m 9 2 + 的浓度分布。 i 圈13z n 2 1 荧光探引在小鼠组织内成像 f i g 】3i m a g i n g z n ”i nr a t t i s s u e su s i n g f l u o r e s c e n tp r o b e 探针l 是n a g a n o 小组设计合成的典型的p c t 类锌离子荧光探针”。该探针有着良 好的水溶性，探针自身吸收在5 1 3n m ，荧光发射在5 4 3n m ：在加入锌离子后，吸收光 谱红移至5 2 4n m ，而荧光发射红移至5 5 8n m 。由于采用d p a ( 双( 2 一吡啶甲基) 氨) 作为 识别基团探针的解离常数达到了l3p m 。并且实现了细胞和小鼠海马组织内锌离子的 比率成像。通过荧光显微镜观察到了组织切片中z 一+ 的浓度分布，为比率检测锌离子提 供了良好的借鉴。 l i b 族离子荧光探针的研究和细胞戚像的麻用 斟l4h 9 2 + 荧光探针在细胞内成像 f i g i4i m a g i n gh f + i nc e l l su s i n gf l u o r e s c e n tp r o b e c h a n g 研究小组1 4 ”在2 0 0 7 年设计合成了以硫杂冠醚作为识别基酬的荧光素类汞离 子荧光分子探针2 。其特点在于苯环上甲基的引入增大了空问位阻以至于限制了苯环的 振动，减少了能量的消耗，增大了灵敏度以及在细胞实验巾的荧光增强程度。在络台了 汞离子后荧光量子产率增大到07 2 荧光强度增强约4 4 倍，使得该探针可以在p p m p p b 浓度范围内实现对水溶液，细胞阱投组织内的汞离子的检测。这是硫杂冠醚类汞离 子荧光探针中各项性能最好的例了之。 匿 图l5h 9 2 1 篓光探针在细胞内成像 f i g 1 5 i m a g i n g h 一+ i nc e l l s u s i n g f l u o r e s c e n t p r o b e x i a o 研究小组以f r e t 为机理设计合成了汞离子荧光探针3 【4 ”。3 在加入汞离子前 发出的是b o d i p y ( 4 - d i f l u o r o 一4 一b o m t a - 3 a a z o n i a - 4 a - a z a s - i n d a c e n e ) 炎特征荧光f 最大发射 在5 】2n m ) ，在加入汞离了后硫脲部分发生脱硫成环反应，同时发生f r e t 过程。最终 发出罗丹明染料的特征荧光f 屉大发射在5 8 6n m ) 。该体系对汞离子有着很好的选择性和 灵敏度，并且实现了汞离子在细胞内的比率成像，为定虽榆删汞离子的研究提供了很多 可借鉴之处。 涵 d 卜 疑 大连理工大学博士学位论文 将设计的荧光探针引入组织和细胞，在荧光显微镜下不仅可观察固定的细胞、组织 切片，还可对活细胞的结构、生物大分子等进行实时观察和检测，配合荧光光谱仪获取 荧光图像的量化信息。因此，荧光显微镜在生物分析领域中将具有广泛的应用前景。 荧光成像生物分析的迅速发展，深化了人们在分子水平上对生物化学过程的了解。 荧光显微镜与荧光光谱仪联合的系统仪器能够获取显微荧光成像及荧光强度、荧光寿命 的测定信息。选择荧光探针对被标记物进行特异性标记，荧光探针的亮度即荧光强度可 反映被标记物相对含量的多少。荧光显微镜对图像采集后，荧光光谱仪可测量图像的荧 光强度，对获取的图像进行荧光强度定量，为全面分析和研究细胞内部结构提供更加详 尽的数据信息。尤其是比率型荧光探针的出现，使得对金属离子的定量测定更加准确。 它能对完整的活细胞和组织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量和定位的测 量，功能强大，可操作性强，特别是在细胞生理过程的定量研究方面具有巨大的优势。 设计荧光探针与特定的金属离子相结合，应用荧光显微技术检测细胞内该金属离子的浓 度及分布。由于具有灵敏度高，操作便捷等优点，在细胞及组织内实时在线地检测金属 离子成为近年来地研究热点。 因此设计合成i i b 族金属离子荧光探针，在化学体系中试验其性质，结合激光共聚 焦荧光成像技术，实时在线检测细胞内某种金属离子的浓度变化及其分布。进而探讨各 种金属离子在生命活动中所发挥的作用以及对某种离子缺陷时出现的病理进行研究，将 为生物学以及医学的发展提供必要的依据。 1 3 荧光探针的设计 通常评价金属离子荧光探针的性能主要从灵敏度、选择性、实时性和原位检测性能 等方面来考虑。灵敏度方面又包括许多因素：如探针与被检测金属离子的结合强度；识 别信息的荧光信号转换效率；另外，荧光团的发射波长、量子产率、斯托克斯位移、背 景荧光干扰和仪器性能等也会影响探针的灵敏度。选择性方面主要取决于探针与被检测 金属离子的结合选择性。有时被结合的金属离子可直接影响荧光团的荧光发射性能，这 种情况下识别选择性还与被结合的金属离子性质有关，当然专一选择性是最好的。荧光 探针的实时性主要包括识别响应的速度和可逆性两方面，如果可逆响应的速度快于或与 被检测金属离子的变化速度相匹配，则可称之为实时响应探针。原位检测性能主要取决 于荧光探针分子与被检测金属离子的相容性，探针能以独立的分子状态分散于被检测体 系并发出识别信号。一般情况下，水溶性的探针比非水溶性探针好。 l i b 族离子荧光探针的研究和细胞成像的应用 典型的荧光分子探针主要是由荧光团和识别基团由连接基团( 或没有) 连接组成。荧 光团主要是作为发信号部分，负责把识别信号转化为光信号发出；由特定结构组成的识 别基团起到对客体的识别作用。 1 3 1 荧光团 有机荧光试剂分子都含有发射荧光的基团，习惯称为荧光团。 r 5 r 4 、n r 4 r 2 r 1 式1 1 两种常见荧光团 s c h e m e1 1t w of a m i l i a rf l u o r o p h o r e s 5 r 2 罗丹明类试剂属毗喃型碱性试剂( 4 ) ，这类试剂均为红紫色粉末，又称为玫瑰红染 料，易溶于水，水溶液呈鲜红色并发出强烈荧光。罗丹明类染料苯环中有“氧桥”相联， 具有刚性平面结构，容易吸收入射光的能量而发射长波，从而产生荧光。 19 6 8 年t r e i b s 等首次合成了4 d i f l u o r o 4 b o r a t a 3 a a z o n i a 4 a a z a s i n d a c e n e ( b o d i p y ) 【5 0 1 。b o d i p y 染料由硼桥键和甲川桥键把两个吡咯环固定在一个平面上，使 分子具有刚性共平面结构，在激发光的作用下能产生强烈的荧光( 5 ) 。b o d i p y 类染料 分子的高度刚性使其具有高的摩尔消光系数和荧光量子产率、良好的光稳定性、激发波 长在可见区、结构易于修饰、发射波长可调变到近红外、不易受环境和溶液p h 的影响 等优点。 其它常用的荧光团还有荧光素，丹磺酰胺，香豆素类，吖啶和菁类荧光染料等。一 般地说，几乎所有的荧光团都可以用作荧光探针的信号基团。但是，荧光团之间结构和 性能的差异有时会导致不同的识别效果。 荧光探针中信号部分的选择是探针设计中的重要内容之一。不仅要考虑荧光团应具 有良好的光化学和光物理性能，而且也必须考虑合成的合理性和简单性。 大连理工大学博士学位论文 1 3 2 识别基团 识别基团的设计是探针分子设计的重要环节，必须考虑识别基团的特性，希望在主 客体作用时荧光团的光物理和光化学性能发生明显的变化。在设计分子荧光探针时在识 别事件中，选择性是比较重要的。因此按照超分子化学的一般原理必须认真选择合适的 识别基团，尽量使识别基团和被测物的性质相匹配。也就是说，对识别基团来讲，配体 的拓扑结构、配位原子或基团的数量和性质应该和被测物特性相匹配( 如阳离子离子直 径、电荷密度、配位数、金属离子的软硬度等) 。对于金属阳离子的识别，大多数荧光 探针分子需要一个或几个可以结合客体的配位基团。 因此，受体在荧光分子探针中具有重要的作用，它决定了分子探针与被识别客体的 结合灵敏性和选择性。这种结合性能是荧光分子探针对被识别客体具有选择性和灵敏性 的前提。荧光分子探针中常用的识别基团有冠醚、开链聚醚、多乙烯多胺、多羧甲基胺、 环糊精、杯芳烃、多肽等。 ( 1 ) 吡啶及其衍生物 、n ) 6 n 大连理工大学博士学位论文 1 5 图1 7 基于马来酰亚胺的反应型荧光分子探针 f i g 1 7r e a c t i o nf l u o r e s c e n tc h e m o d o s i m e t e rb a s e do nm a l e i m i d ed e r i v a t i v e s 利用巯基和马来酰亚胺的特征性反应，实现对巯基化合物的识别是一种比较常见也 比较典型的方法。化合物1 5 嗣利用和巯基反应前后，马来酰亚胺对荧光团的p e t 淬灭 程度的差异来实现对巯基基团的识别。通过实验的比对，邻位的马来酰亚胺对荧光团的 淬灭程度最好，其荧光量子产率仅为0 0 0 2 ；而在反应后荧光增强达到3 5 0 倍，荧光量 子产率为o 7 8 。 o f - l - _ _ l _ _ l _ 入 + 9 s 鹤r l 入c f 3 1 6 图1 8 基于硒氮键的反应型荧光分子探针 f i g 1 8r e a c t i o nf l u o r e s c e n tc h e m o d o s i m e t e rb a s e do ns e - n b o n d 在生物体抗氧化系统中，谷胱甘肽过氧化酶是一种主要的含硒酶。通过对它的研究 得到的启示，t a n gb o 研究组【8 6 1 设计并合成了一个含硒氮键的识别巯基化合物的荧光探 针1 6 。探针分子本身没有荧光，在硫原子的强亲核性作用下，使得硒氮键断裂，得到荧 光很强的罗丹明6 g 。 i i b 族离子荧光探针的研究和细胞成像的应用 c h o 1 7l 人c o o h 图1 9 基于醛基的反应型荧光分子探针 f i g 1 9r e a c t i o nf l u o r e s c e n tc h e m o d o s i m e t e rb a s e do na l d e h y d e 通过醛基和半光氨酸以及高半光氨酸的特定反应对其识别是目前比较有效也比较 热门的方法【8 7 】。如图，在加入高半光氨酸后探针1 7 的溶液颜色由橙色变为黄色，发光 也有深红色变为绿色，肉眼可见。吸收光谱的蓝移以及磷光的增强都是由于巯基基团选 择性的和醛基反应生成六元环结构，从而改变了识别基团对铱络合物的供电程度。 1 5 2 脱硫成环反应 hh h 1 8 图1 1 0 基于罗丹明类染料开环的反应型荧光分子探针 f i g 1 10r e a c t i o nf l u o r e s c e n tc h e m o d o s i m e t e rb a s e do no p e n r i n go fr h o d a m i n ed e r i v a t i v e t a e 研究组i s s - 8 9 报道的分子荧光探针1 8 是利用化学反应调控光物理过程从而产生 荧光信号的一个非常精彩的例子。罗丹明类探针分子1 8 在闭环时没有特征吸收以及荧 光发射，当遇到汞离子后，在汞离子作用下发生脱硫反应，并形成一个氧杂二唑的五元 环，同时原来的内脂环打开，出现罗丹明类染料的特征吸收和荧光发射。该探针的优点 在于对汞离子有着很好的灵敏性，并且反应可在常温状态下进行。相似的，化合物1 9 【9 0 】 原本几乎没有荧光，但是在发生脱硫反应后，产物在6 3 5n 1 处出现很强的荧光，从而 竖 o 大连理工大学博士学位论文 达到对汞离子的检测。而化合物2 0 9 1 j 贝0 是反应型比率荧光分子探针，初始荧光发射在 6 0 0a m ，在加入铜离子并发生脱硫反应后在5 5 0n l n 处出现新的荧光发射峰。此探针结 合了反应型探针和比率型探针的优点，是一个新的发展方向。 s u 、n 八n 7 hh h 9 2 + _ - _ - _ _ n 7 h 19 图1 1 1 基于脱硫成环的反应型荧光分子探针 f i g 1 1lr e a c t i o nf l u o r e s c e n tc h e m o d o s i m e t e rb a s e do nm e t a l - i n d u c e dd y ef o r m a n t i o n 吣s 囝 o c u ( ) 。c u s - _ _ _ _ _ _ - i _ - _ - _ o 图1 1 2 基于脱硫成环的反应型铜离子荧光分子探针 f i g 1 12r e a c t i o nf l u o r e s c e n tc h e m o d o s i m e t e rf o rc u 2 + b a s e do nm e t a l i n d u c e dd y e f o r m a n t i o n 1 5 3 水解反应 、n ) 2 1 n c u 2 + i - _ _ _ _ _ x n 一) n 广 lico_一oocmuml03一l 大连理工大学博士学位论文 别做普通以及比率荧光强度比较图。从普通比率竞争实验图中可以看出，铜离子和镍离 子在竞争实验中会对荧光强度有着约9 0 和3 0 的荧光淬灭，其它金属离子对b c d l 的竞争干扰很小。而在比率竞争实验图中可以看到，由于比率计算的原因铜离子和镍离 子的干扰大大降低，所有金属离子的荧光干扰变化都小于l o 。从这里可以看出比率探 针b c d l 的优点，同时也说明了b c d l 对镉离子具有很高的选择性和抗干扰能力。 ( a ) 5 0 0 4 0 0 33 0 0 高2 0 0 u - 1 0 0 0 m n 。+ h q 2 + c u 2 p b 2 + z r t 2 + c o 卜c pn i 2 + c d 2 + + m e t a li o n s ( b ) 1 2 1 0 m g 。”n aa o c