（应用化学专业论文）多色荧光稀土纳米颗粒的制备与应用.pdf

大连理t 大学硕士学位论文 摘要 基于稀土荧光生物标记探针长寿命荧光特性而发展起来的高灵敏度时间分辨荧光 生化分析技术已经在临床检测与生物技术领域得到了广泛的应用。由于稀土荧光化合物 中只有e u ( i i i ) 与t b ( i i i ) 的某些化合物具有强的荧光发光性能，其荧光发光的颜色分别为 红色( 铕化合物，约6 1 5 n m ) 和绿色( 铽化合物，约5 4 5 n m ) ，限制了这类化合物在多色荧 光标记生化分析中的应用。 本研究通过将e u ( i i i ) 及t b ( i i i ) 与配体4 苯基2 ，2 ：6 ”，2 ”联三吡啶- 6 ，6 - 二甲胺四乙 酸的荧光配合物同时共价键合到纳米硅胶颗粒中，通过调节e u ( i i i ) t b ( i i i ) 配合物摩尔比 的方法，制备出了可发出红、橙、黄、绿系列颜色荧光的纳米稀土荧光颗粒。所制备的 荧光纳米粒子具有形状规则，表面光滑，尺寸均匀( 5 0 6 0 h m ) ，荧光寿命大于l m s ， s t o k e s 位移大于2 0 0 n m ，激发光与发射光之间没有干扰，抗光漂白性能强优点。 将纳米荧光颗粒与链霉亲和素( s a ) 共价键合后用于人前列腺特异抗原的时间分辨 荧光免疫测定，最低检测下限为0 2 1n g m l ，表明s a 经纳米颗粒标记后仍保持了良好 的生物反应活性。将纳米颗粒标记的s a 进一步用于水样品中病原微生物蓝氏贾地鞭毛 虫的时间分辨荧光成像测定，结果表明新型纳米稀土荧光颗粒可作为多色荧光标记探针 用于时间分辨荧光生化测定。 关键词：稀土；纳米荧光颗粒；生物标记；时间分辨荧光；生物成像。 多色荧光纳米稀土颗桩的制备与应用 p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no f m u l t i c o l o rl u m i n e s c e n tl a n t h a n i d e n a n o p a r t i c l e s a b s t r a c t t i m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c e ( t r f ) b i o a s s a yt e c h n i q u eb a s e do nl o n g - l i v e df l u o r e s c e n c e o fl a n t h a n i d ep r o b e si sa nu l t r a s e n s t i v eb i o a n a l y t i c a lm e t h o d ，a n dh a sb e e nw i d e l yu s e di n c l i n i c a ld i a g n o s t i c sa n db i o t e c h n o l o g y b e c a u s es t r o n g l yf l u o r e s c e n tl a n t h a n i d ec o m p o u n d s a l em a i n l yl i m i t e dt oe u s 十a n dt b ”c o m p o u n d sw i t hr e d ( e u ，“15n m ) a n dg r e e n ( t b ，5 4 5 n m ) e m i s s i o n s ，t h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no ff l u o r e s c e n c eb i o a s s a yt e c h n i q u eu s i n g l a n t h a n i d e - b a s e dm u l t i c o l o rf l u o r e s c e n tb i o l a b e l sa r er a r e l yi n v e s t i g a t e d i nt h i sw o r k , as e r i e so fl a n t h a n i d ec o m p l e x e s - b o u n ds i l i c an a n o p a r t i c l e sw i t hr e d ， o r a n g e ，y e l l o wa n dg r e e nf l u o r e s c e n c ec o l o r sw a sp r e p a r e db yc o - b i n d i n gd i f f e r e n tr a t i o so f e u 3 十厂r b f l u o r e s c e n tc o m p l e x e sw i t ht h el i g a n d ( 4 - p h e n y l - 2 ，2 ：6 ，2 - t e r p y r i d i n e - 6 ，6 - d i y l ) b i s ( m e t h y l e n e n i t r i l o ) t e t r a k i s ( a c e t i ca c i d ) i n s i d et h es i l i c an a n o p a r t i c l e s c h a r a c t e r i z a t i o n sb y t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p ya n df l u o r o m e t r i cm e t h o d si n d i c a t et h a tt h en a n o p a r t i c l e sa r e s p h e r i c a la n du n i f o r mi n s i z ew i ml o n gf l u o r e s c e n c el i f e t i m e s ( 1 0m s ) a n dh i g l l p h o t o s t a b i l i t i e s t h en a n o p a r t i c l e l a b e l e d s t r e p t a v i d i n w a sp r e p a r e da n du s e df o rt i m e - r e s o l v e d f l u o r o i m m u n o a s s a yo fh u m a np r o s t a t e s p e c i f i ca n t i g e n ( p s a ) t h em e t h o dg i v e sad e t e c t i o n l i m i to f0 21n g m lf o rh u m a np s a , s h o w i n gt h a tt h en a n o p a r t i c l e l a b e l e ds t r e p t a v i d i ns t i l l h a sag o o db i o r e a c t i v i t y t h en a n o p a r t i c l e l a b e l e d s t r e p t a v i d i nw a s f u r t h e ru s e df o r t i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c ei m a g i n gd e t e c t i o no fa ne n v i r o n m e n t a lp a t h o g e n ，g i a r d i al a m b l i a ， i nt h ew a t e rs a m p l e s t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h en e wn a n o p a r t i c l e sa r eu s e f u lm u l t i c o l o r f l u o r e s c e n tb i o l a b e l sf o rt i m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c eb i o a s s a y s k e yw o r d s ：l a n t h a n i d e ；f l u o r e s c e n tn a n o p a r t i c l e ；b i o l a b e l i n g ；t i m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c e ； b i o i m a g i n g 一i i 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目：垒鱼苤左叠纳苤题擅的剑备皇廑恿 作者签名： 蕊趁喀礁日期：珥年1 月占一日 多色荧光纳米稀十颗粒的制备与应用 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：玺鱼夔羞叠纳苤苤造题撞的剑釜皇应用 作者签名： 兹旌堡芝 日期：坦艺年王月二日 导师签名： 日期：珥年上月卫日 人连理1 = 大学硕士学位论文 引言 经过2 0 余年的发展，以稀土荧光化合物( 主要为e u 3 + 及t b 3 + 的配合物) 作为荧光 标记物的时间分辨荧光生化分析技术( 免疫分析技术、核酸杂交分析技术等) 已经取得 了显著的进步，在医学临床诊断及生命科学等领域中发挥着越来越重要的作用【l 捌。基于 稀土荧光生物标记物超长荧光寿命( 是通常生物背景荧光的1 0 5 1 0 6 倍) 的时间分辨荧 光生化分析技术可有效消除各种来自样品及仪器的背景信号对荧光测定的干扰，使得测 定的灵敏度得以极大地提高。 多色荧光标记技术一般采用两种或两种以上具有不同荧光发光波长的化合物用于 生物分子的标记，以同时测定样品中不同的生物组分或官能团，已在d n a 序列测定、 多组分荧光生物成像等生命科学领域取得了许多成功的应用，其最大的优点是可有效减 少分析测定所用的时间、费用及样品的消耗量。由于稀土荧光化合物中只有e u 3 + 及t b 3 + 的某些化合物具有强的荧光发光性能，其荧光发光的最大波长分别在约6 1 5r i m ( 铕化合 物，红色荧光) 和5 4 5n m ( 铽化合物，绿色荧光) ，限制了这类化合物在多色荧光标记时间 分辨荧光生化分析中的应用。最近，z h a n g 等人通过将e u 3 + 及t b ”配合物键合在纳米硅 胶颗粒中的方式制备出了具有多色荧光发光的纳米稀土荧光颗粒，并探讨了纳米颗粒在 时间分辨荧光免疫分析中的应用【3 1 。但由于该研究制备的纳米稀土荧光颗粒的最大激发 波长在2 8 0a m ，激发波长太短，限制了其在生化分析中的有效应用。 本研究采用将两种具有较长最大激发波长及荧光量子产率的e u 3 + 及t b 3 + 荧光配合物同 时键合在硅胶纳米颗粒中并调控颗粒中两种发光物种比例的方法，制备出最大激发波长 在3 3 5n n ，可分别发出红、橙、黄、绿等多种颜色荧光的系列纳米稀土荧光颗粒，并探 讨了其在生物标记及时间分辨荧光生化分析中的应用。由于这些纳米颗粒的荧光发光均 具有长寿命荧光特性且激发波长与现用稀土荧光生物标记物相同，预计其在多色荧光标 记时间分辨荧光生化分析领域具有很好的应用前景。 多色荧光纳米稀土颗粒的制备与应用 1 文献综述 1 1时间分辨荧光分析技术 1 1 1 稀土配合物的发光机理及荧光性质 国际纯粹与应用化学联合会把从5 7 号元素镧l a 到7 1 号元素镥l u ，以及同属i i i b 族的钪s c 和钇y 共1 7 种元素统称为稀土元素。其中镧系元素的外层电子结构为4 f0 。1 4 5 d o 。0 6 sm ，由于5 s 和5 p 电子对4 f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分 相似。 大多稀土离子本身不发光，只有s m 3 + 、e u 3 + 、t b 3 + 和d y 3 + 的水合离子吸收紫外光或 可见光时可以发出微弱的荧光，图1 1 给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能 级图【4 1 。 暑 u n o _ 扣 。 宙 瞄 z 回 = 二_ 5 d 3 图1 1 部分三价稀土离子的电子能级图 f i g u r e1 1e l e c t r o n i ce n e r g yl e v e l so fc e r t a i nl a n t h a n i d e ( i i i ) i o n s 当s m 3 + 、e u 3 + 、t b 3 + 和d y 3 + 与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强， 这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的。以铕( i i i ) 配合 物为例，其荧光发光机理可用图1 2 来表示5 1 ，当铕( i i i ) 配合物受光照射时配体分子吸收 2 s ： 耻 釜； 三三r 圭王 巧 如 巧 加 搭 m 5 o 大连理工大学硕士学位论文 激发光后由基态跃迁至激发单线态s ，这个过程进行极快，所吸收的光子能量，等于跃 迁所涉及的两个能级间的能量差。处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁 和非辐射跃迁等分子内的去活化过程丧失多余的能量而返回基态。当然，激发态分子的 去活化，也可能经由分子问的作用过程。辐射跃迁的去活化过程，发生光子的发射，伴 随着配位体的荧光或磷光现象；非辐射跃迁的去活化过程，其结果是电子激发能转化为 振动能或转动能。非辐射跃迁包括内转化( i n t e r n a lc o n v e r s i o n ，简写为i c ) 和系间窜跃 ( i n t e r s y s t e mc r o s s i n g ，简写为i s c ) ，前一种过程指的是相同多重态的两个电子态间的非 辐射跃迁；后一种过程指的是不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁。配位体吸收的 能量通过系间窜跃传递至配体的激发三线态t l 。此时三线态的激发能级高于铕( i i i ) 离子 所处的能级时，能量就会进一步传递给铕( i i i ) 离子。当铕离子接受传递来的能量后被激 发至共振能级，并在由共振能级跃迁回基态过程中发出荧光，表现为铕( i i i ) 离子的特征 荧光。 图1 2 铕配合物发光机理示意图 f i g u r e1 2s c h e m a t i cd i a g r a mo ft h er a d i a t i v ep r o c e s so ft h ec h e l a t el e a d i n gt oe u 3 + f l u o r e s c e n c e 与有机荧光化合物不同，稀土配合物的荧光性质，一方面取决于有机配位体的三重 态能级t l 的位置，另一方面取决于配位体与稀土离子处于激发态时的能量匹配程度。 荧光发光的波长和强度，均随稀土离子的不同而异。s m 3 + 、e u 3 + 、t b 3 + 、d y 3 + 等稀土离 子的配合物属于镧系元素荧光配合物中的强荧光物质。激发这些离子所需能量较低，同 3 多色荧光纳米稀十颗粒的制备与应用 时由于这些离子的激发态和基态能量相差较大，非放射迁移较小，因此它们的荧光量子 产率相对较高。稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质比较f 6 】见表1 1 。 由于稀土荧光配合物特殊的发光机理，使其相对于荧光素和罗丹明等常规有机荧光 化合物而言具有以下特点： ( 1 ) 荧光发射的特征峰波长主要与中心离子有关，而与配位体结构关联不大。稀土 配合物发光是基于配合物内由配位体到中心金属离子的能量转移所产生的，配位体吸收 激发光能量后转移到中心稀土离子，然后再通过中心稀土离子的4 f 轨道能量跃迁而发 出荧光，即接受激发光能量和发射荧光是由不同的部分所完成的，因此同一种稀土离子 与不同配位体形成的配合物的荧光发射峰波长基本不变。 ( 2 ) 荧光寿命非常长，通常在1 0l x s ( s m ”、d + ) 或1 0 0 l s ( e u 3 + 、t b 3 + ) 以上。 这是由于稀土配合物的发光是经过配位体的三重态的能量转移所致，所产生的荧光是延 迟荧光，其寿命比配位体的磷光寿命还要长。从表1 1 可以看出，e u 3 + 配合物的荧光寿 命比普通荧光化合物的荧光寿命要长大约1 0 5 倍。利用这种长荧光寿命，就可进行百微 秒级的时间分辨荧光测定。 ( 3 ) 稀土配合物所发荧光的s t o k e s 位移( 最大发射峰与最大吸收峰之间的波长差) 非常大，大部分在2 0 0n n l 以上，对克服因激发光而导致的散乱光对测定的干扰非常有 利。 ( 4 ) 荧光激发谱带较宽，有利于增高激发能，而发射峰非常尖锐，半峰宽通常在 1 叽1 5r i m ，为类线性光谱，有利于降低本底，提高分辨率。 表1 1 稀土荧光配合物与常规荧光化合物的性质 t a b l e1 1f l u o r e s c e n c ep r o p e r t i e so fc o n v e n t i o n a lf l u o r e s c e n c ec o m p o u n d s c o m p o u n d l i f e t i m e 九骼，j 懈入弧蛳s t o k e ss h i f tq u a n t u m ( n s )( n m ) m )( 彻吣y i e l d s ( q ) ( m o l 。1l c m 1 ) f i t c r b i t c c y 5 里旦堡塑箜z 圣! q ：! 兰q鱼! !兰z ! q ：呈q 竺 三：鱼圣! 垡 f i t c ：f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ；r b i t c ：r h o d a m i n e - b 2 0 0 - i s o t h i o c y a n a t e ；c y 5 ：c y a n i n ed y e ；p - n t a ： 2 - n a p h t h o y l t r i f l u o r o b u t a n e d i o n e 4 铲妒舻 x x x o 2 5 7 1 2 5 o 7 8 7 2 0 o o 6 5 7 2 3 1 8 5 7 1 8 6 5 5 6 2 o o 9 5 5 4 5 6 5 一 钲3 一 大连理工大学硕+ 学位论文 1 1 2 时间分辨荧光测定原理 时间分辨荧光测定技术是利用稀土配合物具有长寿命荧光这一特点，在样品被脉冲 光激发后、荧光信号采集前，根据样品中所包含的荧光物质荧光寿命的不同引入一定的 延迟时间( d e l a yt i m e ) ，待短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的特异性荧光信 号进行测定，原理如图1 3 所示。采用时间分辨荧光测定技术可以有效消除来自样品、 试剂、仪器等的短寿命非特异性荧光的干扰，从而极大地提高荧光检测的灵敏度。 卜一c y c k h m e ( o o o 呻) 叫 6 0 0 t i m e ( 呻) 图1 3 时间分辨荧光测定的原理 f i g u r e1 3p r i n c i p l eo ft i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c em e a s u r e n l 豇l t 1 1 3 时间分辨荧光免疫分析技术 1 9 7 8 年提出了用稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光生化分析技术【9 】，时间 分辨荧光免疫分析( t i m e r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ，t r f t h ) 法开始进入生物分析科学 研究领域。该技术是在荧光免疫分析技术基础上发展起来的一种新型免疫分析技术，其 原理和方法与常规的荧光免疫分析法不同。它采用长荧光寿命的稀土配合物作为标记物 进行抗原或抗体的标记，在荧光激发后引入一个适当的延迟时间，然后再采集稀土荧光 配合物的长寿命荧光信号，从而有效地克服短寿命的背景荧光和散乱光对测定的干扰， 使非特异性本底信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比。该方法具有标记物 稳定、有效期长、不污染环境、操作流程短、标准曲线量程宽、应用范围广等许多优点， 其最小检出下限可达1 0 - i s 1 0 。1 9 m o l l - 1 ，远远超过r i a 、e i a ，甚至是c l i a 方法。所以 5 皇一u置o-目帽qu置oo器io昌一函 多色荧光纳米稀土颗粒的制备与应用 t r f i a 技术虽然问世时间短，但是近2 0 年来发展却十分迅速，在生命科学研究中具有 重要意义，成为目前超微量生物物质分析中最有发展前途的技术之一【1 0 - 1 7 。 1 1 3 1 免疫分析法的原理 免疫分析法是一种利用免疫反应即使用抗体一抗原反应来对抗原( 或抗体) 进行定 性和定量测定的分析方法。抗体抗原免疫反应具有两个特点：( 1 ) 高特异性； ( 2 ) 高亲和性( 亲和常数：1 0 1 0 1 0 1 2 m o l - 1 l ) 。高特异性使免疫分析能从组成十分复杂的生 物体系中选择性地检出特定待测物，而高亲和性使引入适当的信号标记物成为可能。由 于免疫反应的生成物不能直接进行高灵敏度检测，因此需要使用可实现高灵敏度检测的 标记物对抗体或抗原进行标记，从而进行免疫分析测定。 按标记物种类的不同，免疫分析法主要可分为以下几种：放射性免疫分析法、酶免 疫分析法、荧光免疫分析法、发光免疫分析法、时间分辨荧光免疫分析法。 1 1 3 1 1 抗体的结构与抗体抗原反应 抗体是一种称为免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，简称i g ) 的糖蛋白质。多数情况下， 抗体由2 条h 链( 重链) 和2 条l 链( 轻链) 以过硫键相结合，形成y 字型的对称结 构。根据h 链的不同可分为i g g 、i g a 、i g m 、i g d 、i g e 五类。免疫分析中最常使用的 是i g g 类，它是人工动物免疫产生的抗体的主要成分，其结构如图1 4 所示。 l l h 抗原结合部位 hl l 抗原结合部位 图1 4i g g 的结构 f i g u r e1 4s t r u c t u r eo fl g g 6 f c f a b 、lrj、0户lj，01，疆 删榔 侧一 d 淀 v 阿 大连理t 大学硕士学位论文 i g g 免疫球蛋白中存在许多过硫键( 1 6 2 4 个) ，十分稳定。如果用木瓜酶限定分 解的话，i g g 可被分解成3 部分，即2 片f a b 和一片f c 。如果用胃朊酶分解的话，则分 解成2 部分，即一片f c 和一片f ( a b ) 2 。其中f a b 和f ( a b ) 2 可代替i g g 用于免疫分析。 i g g 分子中的n 末端一侧的半部分由于所结合的抗原不同而结构明显不同，因而称之为 可变部分或v 领域；c 末端一侧的半部分则比较稳定，通常称之为定常部分或c 领域。 当种诱导免疫应答的物质即抗原( 生体异物) 进入生物体内后，根据其结构的不 同，由免疫应答产生的抗体v 领域的氨基酸排列顺序随之改变，两者成一对一的关系， 这就使得抗体抗原反应具有高选择性。对于大分子量抗原来说，通过免疫应答产生的 抗体并不和整个分子的所有部分都结合，而是和抗原的特定位置相结合，这个具有独特 结构，可以和一个抗体结合的抗原的最小单位被称为抗原决定簇。通常一个大分子量抗 原具有若干个不同的抗原决定簇，因此在直接动物免疫所得的细胞分泌物中，抗体分子 的活性与种类也大不相同，称之为多克隆抗体；而由单一抗体产生细胞培养而得的，具 有均一反应活性和种类的抗体称之为单克隆抗体。 1 1 3 1 2 抗体( 或抗原) 的标记方法 几种常用蛋白质标记反应的原理如图1 5 所示【1 8 圳1 。 2o 寸”+ h s - p t o l e i n 一9 ”n 丁8 。，一 6d 9 旷s 0 2 0 2 - p r o t e i n 一9 一- n h - h o t e i n 0 n o 0 阶n 骂。以。妇+ 攀口蝴 。 占 口沪峨+ c 殉_ 州n 2 - p m 曲一争州督c 一p t o t e m 争m h 删 叩奇s 0 2 c 1 话卵。竺竺- 砭争砷一呱岫 争川h ：瞿9 旷n c s 当寸”科一抓s ，触 o = - 捌聊一d c c = d k y c - 她y h 删i 础 图1 5 蛋白质的标记反应 图1 5l a b e l i n gr e a c t i o n so f p r o t e i n s 7 多色荧光纳米稀土颗粒的制螽与应用 蛋白质的标记反应大致可以分为以下三种：( 1 ) 标记物本身具有能与蛋白质直接 反应的活性基团，如异硫氰基、活性酯基、氯磺酰基等； ( 2 ) 标记物本身不能直接与 蛋白质反应( 如带胺基的标记物) ，但可借助偶联试剂，使之与蛋白质问接结合； ( 3 ) 标记物本身不能直接与蛋白质反应，但标记物的某些官能团经过改变之后便能够与蛋白 质结合，如带有羧基、胺基和羟基的标记物即可用此法标记蛋白质。 1 1 3 1 3 标记物的结构和特征 抗体抗原反应具有很高的亲和性和选择性，然而要实现对微量及超微量物质的定 性、定量分析，标记物的选择也是至关重要的。免疫分析中标记物的选择要满足三个条 件【2 2 】：( 1 ) 与抗体或抗原的结合要简单，最好有活性基团；( 2 ) 结合后标记物的化学 性质不变；( 3 ) 标记后被标记物的物理和化学性质不能发生重大改变，水溶性及免疫 活性最好不受影响。因此，通常标记物的设计多由信号发生基团，间隔基团和活性基团 三部分组成，如图1 6 所示。 s i g n a l - g r o u ps p a c e r r e a c t i v eg r o u p s i g n a l - g r o u ps p a c e rr e a c t i v eg r o u p ，_ - - - _ 、， - - - - 、，_ _ 一l - 、，l 、，_ 一、，- l - _ 、 s 0 2 c i a b 图1 6 标记物的结构示意图( a ) 和一种代表性荧光标记物b h h c t - e u 3 + 的结构式( b ) f i g u r e1 6s c h e m eo fl a b e ls t r u c t u r e ( a ) a n dt h es t r u c t u r eo far e p r e s e n t a t i v ef l u o r e s c e n c el a b e l b h h c t e u 3 + ( b ) 信号发生基团的作用是能够发出稳定的放射线、颜色、光等信号，以便使用相应的 仪器进行高灵敏度检测；间隔基团主要用于增加信号发生基团和被标记抗体或抗原之间 的距离，以避免在标记后信号发生基团对生物分子的活性或生物分子对检测信号产生影 响：活性基团是标记物与生物分子结合的关键，在标记物的设计时就需要考虑引入可与 生物分子结合的活性基团，而且要求反应比较温和，不会对被标记的生物分子产生不良 影响。 1 1 3 2 免疫分析法的种类 免疫分析法分为多相免疫分析法和均相免疫分析法。多相免疫分析法又包括标记抗 原( 或抗体) 的竞争型免疫分析法和标记抗体的非竞争型( 夹心型) 免疫分析法，前者 一般适用于小分子抗原或半抗原的测定，而后者则适用于分子量较大的抗原的测定。 大连理工大学硕士学位论文 ( 1 ) 竞争型免疫分析法 标记抗原的竞争型免疫分析法的原理如图1 7 所示。这种分析法是利用待测目标抗 原和标记抗原与固定在固相上的抗体的竞争反应的一种分析方法。该法中抗体和标记抗 原的浓度固定，改变待测目标抗原的浓度，则反应生成物中与标记抗原反应生成的免疫 复合物的量发生改变，据此可得到待测目标抗原的测定工作曲线，其形状如图1 8 所示。 蜂 擘刊飞丁一 a n t m o d yc o a t e d l 。a b e l e d i m m u n e separationons o h a- p h a s e a n n l j c nr e a c t i o n 图1 7 使用标记抗原的竞争型免疫分析法的原理 f i g u r e1 7p r i n c i p l eo fc o m p e t i t i v ei n m a u n o a s s a yb yu s i n gl a b e l e da n t i g e n 叠 掣 l o g ( c o n e o fa n t i g e n ) 图1 8 竞争型免疫分析法的工作曲线形状 f i g u r e1 8c a l i b r a t i o nc u r v es h a p eo fc o m p e t i t i v ei m m u n o a s s a y 同样，可以利用标记抗体进行竞争型免疫分析，其原理如图1 9 所示。 f+ t 矿t 图1 9 使用标记抗体的竞争型免疫分析法的原理 f i g u r e1 9p r i n c i p l eo fc o m p e t i t i v ei m m u n o a s s a yb yu s i n gl a b e l e da n t i b o d y 9 多色荧光纳米稀十颗粒的制各与应用 这一方法中，标记抗体和固相化抗原及待测目标抗原发生竞争反应，当标记抗体和 固相化抗原浓度一定时，增加待测目标抗原的浓度，则标记抗体和固相化抗原反应的比 例减少，这一比例与待测目标抗原浓度成反比，其工作曲线形状与图1 8 相同。 ( 2 ) 非竞争型( 夹心型) 免疫分析法 分子量大于5k d 的抗原一般都有两个或两个以上的抗原决定簇，因每个抗原决定 簇都能与不同的抗体分子结合，所以可以通过使用固定化抗体与待测抗原及标记抗体形 成夹心型的免疫复合物来测定抗原的浓度。夹心型免疫分析法的固定化抗体通常多采用 单克隆抗体，标记抗体为多克隆抗体，其原理见图1 1 0 。由于夹心型免疫分析法使用的 两种抗体的浓度要大于测定抗原的浓度，所以最终生成的免疫复合物的量与抗原的浓度 成正比。从测定信号的强度与抗原的浓度即可得到抗原测定工作曲线，形状如图1 1 1 所示。 堂莒型时r 一 图1 1 0 夹心型免疫分析法的原理 f i g u r e1 10p r i n c i p l eo fs a n d w i c hi m m u n o 够s a y l o g ( c o n e o fa n t i g e n ) 图1 1 1 夹心型免疫分析法的工作曲线形状 f i g u r e1 1 lc a l i b r a t i o nc b i v es h a p eo f n o n c o m p e t i t i v ei m m u n o a s s a y l o 丁一 沁 一兽) 大连理工大学硕士学位论文 在夹心型免疫分析法中，使用标记二次抗体的免疫分析法也得到了广泛应用。二次 抗体即抗免疫球蛋白的抗体，例如山羊抗家兔i g g 抗体，它可与所有源于家兔的i g g 型 抗体发生反应，而与家兔i g g 对应的抗原无关。如果将该二次抗体进行标记，则该标记 抗体可用于所有使用家兔i g g 的免疫分析法中。这种分析法的原理如图1 1 2 所示。 o l ls o l i d p h 黜 图1 1 2 使用标记二次抗体的免疫分析法的原理 f i g u r e1 1 2p r i n c i p l eo f i m m u n o a s s a yb yu s i n gs e c o n d a r ya n t i b o d y 近年来，使用生物素一链霉亲和素反应体系的免疫分析法越来越受到人们的重视 2 3 , 2 4 。它主要有下述几个方面的优势：( 1 ) 生物素与链霉亲和素之间有极强的亲和性 ( 亲和常数在1 0 ”m o l q l 数量级) ；( 2 ) 生物素可以直接标记很多蛋白质而不影响其 生物活性；( 3 ) 利用生物素化抗体标记链霉亲和素反应体系，可向形成的免疫复合物 中导入更多的标记物，因而可提高测定的灵敏度。该免疫分析法的原理如图1 1 3 所示。 0 1 1s o l i d p h a s o m e a s u r e m e n t i 擘二 f 。 图1 1 3 使用生物素化抗体标记链亲和素反应体系的免疫分析法的原理 f i g u r e1 13p r i n c i p l eo fi r n m u n o a s s a yb yu s i n gb i o t i n y l a t e da n t i b o d y - l a b e l e ds t r c p t a v i d i ns y s t e m 一 i 一 揣一+ l 黑 多色荧光纳米稀十颗粒的制备与应用 无论是在竞争型免疫分析法还是夹心型免疫分析法中，首先都是通过物理吸附将抗 体或抗原吸附在某种固相载体上，然后使之与抗原或抗体进一步发生免疫反应生成最终 的免疫复合物，再将多余的反应物洗去后进行固相测定。影响抗体或抗原在固相材料上 吸附的主要因素是温度、时间及蛋白质的浓度 2 5 - 3 0 】。这种固相免疫分析法的一个最突出 的优点是可简化分离步骤，降低背景干扰，因此灵敏度较高。 ( 3 ) 均相免疫分析法 均相免疫分析法的原理是通过测定溶液中由免疫反应生成的免疫复合物的标记信 号与未反应的标记物信号之间的差异来确定待测物的含量。这种差异可以通过光散射性 质改变、光偏振度改变以及荧光强度改变等得以表达。均相免疫分析法直接在溶液中进 行测定，不需要固化和分离过程，因此具有分析时间短，操作简便和易于自动化等优点。 缺点是背景干扰严重，灵敏度低，线性范围窄。 1 1 3 3 时间分辨荧光免疫分析法 1 1 3 3 1 时间分辨荧光免疫分析法的研究进展 时间分辨荧光免疫分析技术使用稀土配合物作为标记物同时采用时间分辨荧光测 量技术而成为全新的免疫分析技术。由于其具有灵敏度高、特异性好、动态范围宽、测 定快速、标记物稳定等优点而得到了迅速发展，已有解离增强时间分辨荧光免疫分析、 f i a g e n ( 或c y b e r f l u o r ) 时间分辨荧光免疫分析、酶增幅时间分辨荧光免疫分析和t r a c e 均相时间分辨荧光免疫分析4 种体系被先后建立。 ( 1 ) 解离增强时间分辨荧光免疫分析法( d e l f i a ) d e l f i a ( d i s s o c i a t i o ne n h a n c e dl a n t h a n i d ef l u o r o i m m u n o a s s a y ) 体系是由芬兰w a l l a c 公司( 现p e r k i ne l m e rl i f es c i e n c e s 公司) 开发的一种高灵敏时间分辨荧光免疫分析法 【3 1 1 ，原理如图1 1 4 所示。该体系以水溶性非荧光铕配合物( s c n p h d t t a e u 3 + ) 或 ( s c n p h e d t a e u 3 + ) 为标记物对链霉亲合素或抗体进行标记，将其用于免疫反应，反应 结束后向体系中加入含b 一萘酰三氟丙酮( p - n t a ) 、三辛基氧化膦( t o p o ) 和t r i t o n x - 1 0 0 的弱酸性( p h3 2 ) 胶束溶液即解离增强溶液，这样定量反应的e u 3 + 离子可从免疫复合 体中解离出来，并形成新的b 一二酮e u 3 + t o p o 荧光配合物，该水不溶性铕配合物被包 在胶束中，可以用于进行时间分辨荧光测定。 d e l f i a 体系优点：灵敏度高、特异性好、精度高、重复性好等。 缺点：极易受到测定环境、测定样品及测定用溶液等中的e u 3 + 的污染，对操作环境 及所用试剂要求极其严格。另外，由于该体系只能进行液相荧光测定，其应用范围受到 一定限制。 1 2 大连理工大学硕士学位论文 刚- n r - 盎- x g-：-够-nntime-resolved e u 3 e u ( 1 3 - n t a ) 3 ( t o p o ) 2 m i c e l l a rs o l u t i o n s t r o n gf l u o r e s c e n c e p r o t c i n - n 芝h - c - n 敛 - 够x x c o o n 一f l u o r e s c 锄c e c o 仅0 0 0c o p i矗矿7 p - n t a + t o p o + t r i t o nx - 1 0 0 p h = 3 2 b u f f e r i m m u n ec o m p l e x 图1 1 4d e l f i a 时间分辨荧光免疫分析法的原理 f i g u r e1 1 4p r i n c i p l eo fd e l f i at i m e - r e s o l v e df l u o r o i m m u n o a s s a y ( 2 ) f l a g e n ( 或c y b e r f l u o r ) 时间分辨荧光免疫分析法 f i a g e n ( 或c y b e r f l u o r ) 体系是由加拿大d i a m a n d i s 等人开发的以铕荧光配合物 4 , 7 - b i s ( c h l o r o s u l f o p h e n y l ) 1 ，10 p h e n a n t h r o l i n e 2 ，9 d i c a r b o x y l i ca c i d e u 3 + ( b c p d a e u 3 + ) 作为标记物的时间分辨荧光免疫分析法【3 2 3 3 1 ，测定原理如图1 1 5 所示。使用b c p d a e u 3 + 作为标记物来标记抗体、抗原等物质并用于免疫反应，当免疫反应结束后不需加入荧光 增强溶液即可直接对免疫复合物进行时间分辨荧光测定。 受b c p d a e u 3 + 检出下限的限制( 1 0 q o l o j lm o l l - 1 ) ，该法的缺点是检测灵敏度较 低【3 4 3 5 1 。d i a m a n d i s 等随后又开发出一种用b c p d a e u 3 + 作为标记物的多重荧光标记方 法，将1 5 0 个荧光标记物分子键合到一个甲状腺球蛋白( t g ) 分子上，荧光信号得到 进一步放大。再通过t g 上所键合的链霉亲合素( s a ) 分子对生物素化的抗体进行识别， 实现了人血清中甲胎蛋白【3 6 】和地高辛【3 7 】的高灵敏度检测。后来他们又将 s a t g 一( b c p d a ) 1 5 0 、t g ( b c p d a ) 1 5 0 与e u 3 + 在一起孵育，制成了分子量约为3 x 1 0 6 的大 分子荧光复合体标记物【3 8 1 ，使检测灵敏度得到明显提高，已经被用于硝酸纤维素上的蛋 白质斑点的定量测定【3 9 1 。 近年来，许多荧光性能更佳的稀土荧光标记物被合成出来，并成功地用于超高灵敏 度的时间分辨荧光免疫检i 贝l j t 4 0 舶】。y u a n 等将强荧光的b h h c t e u 3 + 配合物与s a ( 链霉 亲和素) 和s a b s a ( 链霉亲和素牛血清白蛋白结合体) 相键合得到高标记率的 s a ( b h h c t ) 2 1 e u 3 + 和s a ( b s a ) o 9 ( b h h c t ) 4 6 e u 3 + 荧光交联物，已经用于人血清中的甲胎 蛋白( a f p ) 、免疫球蛋白e ( i g e ) 、促甲状腺激素( t s h ) 和基质细胞衍生因子( s d f 一1 ) 等的测定。后来，y u a n 等又开发出高荧光量子产率的b p t a t b 3 + 配合物，将其标记的 1 3 多色荧光纳米稀七颗粒的制备与应用 s a 与b h h c t e u 3 + 标记的抗a f p 单抗用于a f p 和癌胚抗原( c e a ) 的同时时间分辨荧 光免疫测定，获得了很高的检测灵敏度。 s 勺r 一：s 勺r 晰刚一s 群一。剁抖 t i m o - r e s o l v e df l u o r e s c e n c em e a s u r e m e n t p 一l r r m m n o r e a e t i o n 图