（固体力学专业论文）可控应变细胞加载装置的研究.pdf

塑坚查兰堡圭堂焦笙塞壁! ! 型羔! ! 垒坚4 璺 摘要 本文针对现代生物力学中的细胞力学研究新方向，通过理论推导、 计算与实验分析，在离体细胞培养的力学环境实验技术上进行了比较 深入的研究。 作者在细胞力学的研究方法与进展，特别是离体细胞培养中的力 学实验技术作了系统论述与归纳基础上，设计研制了分别对应于细胞 生理和病理状态“小变形双轴应变”和“大变形单向拉伸”两套可控 应交细胞加载新装置。为指导设计并完成应变标定，用理论计算、有 限元分析和应变电测方向分析了小变形装置的力学参数。论文期间， 协同研制成一种光力学非接触变形测量新系统( z m p d 1 型数字散 斑位移测定仪) ，解决了大变形装置中硅材料细胞培养膜力学常数测 定的难题，该技术在测定中零加强效应和高精度的特点，特别适合柔 性、传感元件不能安装对象的力学测量。同时，相关的阶段性成果已 有2 篇论文发表。 最后，根据科研样仪的初步试用，分析提出了深化研究的若干意 见。 关键词：细胞力学离体培养实验技术非接触测量零加强效应 材料力学常数 蟹藿塑姿态兰堡主兰垒笙奎塑唑 a b s t r a c t t h i sp a p e ri sc o n c e r n e da b o u to n eo ft h en e wb r a n c h e so fm o d e m b i o l o g i c a lm e c h a n i c s - - c e l l u l a rm e c h a n i c s b ya c a d e m i cc a l c u l a t i o n ，a n d e x p e r i m e n t a ls t u d y , t h ea u t h o rr e s e a r c h e dt h em e c h a n i c a le n v i r o n m e n t a n d e x p e r i m e n t a lt e c h n i q u eo f c e l l u l a ri s o l a t e dc u l t u r e f i s r to fa l lb a s i n go nt h es y s t e m i cd i s c u s s e da n di n d u c t e dt h es t u d y m e t h o d sa n d d e v e l o p m e n t o fc e l l u l a r m e c h a n i c s ，e s p e c i a l l y i nt h e e x p e r i m e n t a lt e c h n i q u e o fc e l l u l a ri s o l a t e d c u l t u r e ，d e s i g n e d a n d p r o d u c e da “d u a la x e l s t r a i n d e v i c ea n da “o n e w a yt e n s i l es t r a i n d e v i c e c o r r e s p o n d i n g t oc e l l u l a r p h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a ls t a t e t h e n ，i no r d e rt og u i d i n gd e s i g na n dc a l i b r a t i n gs t r a i n ，a n a l y s i s e d m e c h a n i c a ls t a t eo ft h e “d u a la x e ls t r a i n ”d e v i c e b yu s i n gs o m et e c h n i q u e ， s u c ha st h e o r e t i c a lc a l c u l a t i o n ，f e ma n a l y s i s ，e l e c t r i c a ls t r a i n i na d d i t i o n ， j o i n t l yd e v e l o p e dan e wo p t i c a lm e a s u r es y s t e m ( z m - p d 一1 ) w h i c hh a s s o m ec h a r a c t e r ss u c ha sn o n - c o n t a c ta n dn o n r e i n f o r c em e a s u r e m e n t ，a n d u s e di tt om e a s u r et h em a t e r i a lm e c h a n i c s p a r a m e t e r o fs o f tm a t e r i a l ，a l s o ， p u b l i s h e d 2 p a p e r s i na c a d e m i c j o u r n a l a tl a s t ，s u g g e s t e ds o m ei d e a st o i m p r o v et h er e s e a r c ho fs t r a i n e d c e l l u l a ri s o l a t e dc u l t u r ed e v i c e k e y w o r d c e l l u l a rm e c h a n i c s i s o l a t e dc u l t u r e e x p e r i m e n t a lt e c h n i q u e n o n c o n t a c tm e a s u r e m e n tn o n r e i n f o r c em e a s u r e m e n t m a t e r i a lm e c h a n i c a l p a r a m e t e r i i 盟塑堡盔兰璺主兰垒丝壅堡! 唑 第一章绪论 细胞是生命的实体和生命的基本单位。几乎所有的有机体都是由细胞和细胞 的产物所组成。随着细胞工程学的发展，产生了培养植物细胞进行次生代谢物的 分离和提取技术，以及动物细胞的杂交瘤技术等等，这些研究部对人类的科学进 步产生了巨大影口向【”。联合国科教文组织8 0 年代中期曾经选择细胞和大脑这两 项课题作为生命科学中要特别注意发展的领域，足见其重要性。 细胞力学是现代生物力学近几年来发展十分迅速度一个前沿领域，也是组织 工程学的一个重要组成部分，它涉及到细胞在载荷作用下，细胞、细胞膜、细胞 骨架的变形、弹性常数、粘弹性、粘附力等力学性能的研究。目前的热点是应力 ( 主要指机械应力) 作用下细胞的种种响应问题，特别是与细胞生长和再建有关 的问题。这些研究正不断向纵深发展，已逐渐从黑箱式的研究过渡到仔细研究应 力一细胞响应的各个中间环节，包括：环境应力如何造就单个细胞应力，这个应 力信号如何被细胞感受，这个信号如何转换到d n a 水平的基因调节并最后导致 代谢、分泌、粘附状况的变化。这些是生物力学尚未完全明了的基础性内容，同 时也是组织工程( 主要内容是人工再造活的生物组织) 的重要基础。生物物理新进 展无疑将为生物力学在这方面的研究提供新思路、方法和更好的观测手段【2 j 。 1 1 细胞与细胞力学 细胞力学的研究过去几十年集中于红细胞，近几年研究重点转向白细胞、骨 细胞、内皮细胞、癌细胞及多种细胞的相互作用；随着细胞分离技术和培养技术 的成熟，实验手段不断更新，理论上也有了新的发展【3 】o l ：1 1 细胞信号 美国h o t r o d h u g h e s 医学研究所t s i e r l r y 【4 l 对利用光子和设定分子的相互作 用获取细胞信号的方法作了系统的研究，指出细胞间信号传递为分子设计和合成 堂垩查堂堡主堂焦丝塞垡唑2 在许多重要生物学问题研究中的应用提供了机会：利用绿色荧光蛋白( g f p ) 可 对蛋白质作在体荧光标记。突变产生新的颜色，借助于荧光共振，能量转换( f r e t l 可揭示蛋白质一蛋白质相互作用规律。利用部内酰胺酶作报道酶，可使活的单 个细胞中基因表达视觉化。它使f r e t 中断，裂解出新的透膜物质，使荧光从绿 到蓝。这一灵敏变化的数据输出有助于实现候选药的高通量筛选。快速、灵敏 的腊电压光学数据输出也可由在荧光闸电荷和连接在脂另一边的另一个荧光团 之间的f r e t 来得到。 德国m a x p l a n c k 研究所m a 血d i 【5 l 概括了生物信息的来源问题，认为一个活 体可以描述为一个复杂的自适应系统，它区别于任何复杂化学结构的是具有建立 在信息加工基础上的自组织能力。信息通过复制和选择，在负反馈的闭环中生成 自身。他探讨了针对分子的不同层次实验研究，并以病毒为例，描述了自然界靠 分子演化生成信息的战略。它们的实验在一个计算机控制的生物反应器中完成， 称之为“进化机”，并认为这可以成为一种新的“进化生物技术”的基础。 荷兰t w e n t e 大学的g r e v ej 1 6 j 指出生物系统的运行归结为大分子相互作用， 有必要发展检测方法使之在无干扰系统中得到这些分子图像。分子特征可用拉曼 和荧光法来获得，但这些技术空间分辨率尚不够。目前正尝试结合a f m ，n s o n 和光散射等技术来分析细胞、染色体和分子，但各方法都只能成功地解决部分问 题：拉曼灵敏度低且要求有高浓度；a f m 只用于染色体、细胞表面和分子连结 边界研究；用报道菌与单个细胞混合才能得到的散射光可获纳米级分辨率去研究 分子位移。 1 1 2 d n a 的力学模型 美国m i tw h i t e h h e a d 生物医学研究所和芝加哥大学分子癌症研究中心的 g r a h a mj 、k r o ns 和m a t s u d a i r are 7 】的研究表明：把d n a 分子的一端化学交联 在玻璃涂层表面，用荧光染色，另一端( 自由端) 联接上荧光乳胶珠，样品为嗜菌 体d n a ，作d n a 的伸缩位置跟踪观察。用简单指数关系拟合这种松弛现象，得 到表观弹性( 弹簧1 常数为o 5 p n ld n a 分子。由于松弛过程中d n a 曲率变化忽 略不计，故推论：回缩态贮存熵( 因熵弹簧所致) 而非焓( 因焓弹簧所致) ，伸展的 d n a 回缩采取的是偏无规行走方式。 塑至盔兰婴主兰垒堡壅堡! 竺! 美国b e t h e s d a 国家健康研究院g r o n e n b o ma m 8 1 研究了蛋白质d n a 复合物 的结构，指出生物学转录的控制和调节与蛋白质使d n a 结构诱变作用有关，诱 变结构增加了蛋白质补充到其特异d n a 靶位的量。该功能的实现常常需要那些 d n a 特异地和局部地弯曲或扭结的结合序列的辅助因子。近来几种蛋白质 _ d n a 复合物三维结构的确定，给侧链插入趋使d n a 螺旋变形机制研究带来了 希望。插人发生在未堆积在一起的一个或多个相邻碱基对处和d n a 解旋处( 用 d n a 螺旋的一个完整螺距以考察) 。此外b 型d n a 中一般出现在相邻两条d n a 链的半圈范围之内。 1 1 3 细胞粘附 h a r v a r d 医学院美国波士顿血液研究中心s p r i n g e rt a 【9 i 在细胞粘附方向作了 大量的研究工作，探讨了( 血管内) 剪切流中s e l e c t i n 介导粘附的动力学和生物物 理学，s e l e c t i n 介导血管剪切流中自细胞与血管壁的粘结并维持滚动式粘附。他 们用流动腔研究了该过程的动力学和生物物理学特性，该流动腔底部裱衬有纯化 的s e l e c t i n ： ( 1 ) 当s e l e c t i n 的密度低于约2 0 个位点，“m 2 ，它们不维持滚动而维持短暂的粘 结。这一短暂粘结的时间间隔可被用来计算一个细胞的1 0 肿该值反映了粘结或 者受体的磁f f 值。s e l e c t i n 有快的k o e 值( p s e l e c t i n 为0 , 9 5 s ，l - s e l e c t i n 为6 6 s ) ， 而且据推测也有快的k f f ，它们使得细胞充分地粘结和滚动。l s e l e c f i n 较快的 k 0 行与其较快的滚动有关，即使p - s e l e c t i n 和l s e l e c t i n 介导的细胞与底板的粘附 强度一样。 ( 2 ) 当流动逆转测得细胞在其粘结情况下摆动的运动距离为6 9 i n ，这表明粘缩 为1 儿m 长，配体粘结键是力学稳定的。2 0 0 山 q 的力使k o f f 只增加3 倍，而且该 键合有7 2 n m 的弹性系数。这一结果与氢键的相应值类似并且与s e l e c t i n 区域 的弹性牵拉所预测的结果相近。用少量的过碘酸盐对l s e l e c t i n 碱水化合物率分 进行化学修饰使弹性常数增加，这表明粘结是组成细胞与流动腔壁结合面的非共 价键的功能。 ( 3 ) l s e l e c t i n 介导的粘附发现有剪切依赖，将抵消其他方式的粘附，在低剪切 时有最大的效应，并防止4 5 灌注时不适当的粘附。对l - s e l e c t i n 配体的化学修饰 鱼塑坚查堂堡圭兰焦笙塞! 垫塑! 能增加相互作用强度，但使剪切阀值效应消失，即使其降低配体密度以产生强度 类似的滚动式粘附。这显示出粘结键动力学和力学稳定性的精细调节作用。 1 2 组织工程中的应力与生长 组织工程中，特别是骨组织中的成骨及软骨细胞的结构和功能受温度、p h 值、 化学、生物、应力等多种因素影响。j e e 等【l0 j 的研究证实，成骨细胞、骨细胞等 是骨骼组织内的力学敏感细胞，力学微环境是成骨细胞所处的重要微环境之一。 i 临床上人们已将应力用于治疗骨折、骨不连等骨科病症，并已取得满意的效果， 表明应力可以促进骨的再生；应力对细胞和骨组织作用的研究也表明机械载荷对 骨结构和骨质量起重要的调节作用，它能引起与骨生成有关的成骨、软骨及骨细 胞的反应，即应力可以促进细胞的增殖、增加生长因子的分泌、促进细胞外基质 的合成等。由于人体细胞是处于机体提供的微动力学环境中生长的，在体外培养 组织时，采用传统的细胞培养方式和培养条件很难满足立体组织器官的细胞生长 要求，细胞经常发生去分化现象，使细胞失去正常的形态与功能。因此，研究模 拟体内生理条件下组织生长的微动力学培养环境、应力与生长的关系对组织工程 有着非常重要的意义。 1 2 1 应力( 应变) 对细胞形态及其抗张力的影响 为揭示体外培养的细胞在机械应力作用下细胞形态的变化，g r y m e s 等【l i 】将皮 肤成纤维细胞培养在弹性膜上，对其采用周期作用方式( 6 次分) ，实施2 0 的牵 拉，结果显示原来杂乱的排列方式变得有序：细胞的密度越高，重新排列越易受 到影响。揭示牵拉所造成的排列变化更多与细胞之间的相互作用有关，而与细胞 与胞外基质之间关系较小，同时利用松胞菌素d 作用后证实，在细胞感知应力 并传导应力信号的过程中，无论是细胞间或是细胞骨架，微丝均起着非常重要的 作用。 s a d o s h i m a l l 2 1 发现用2 0 的静止牵拉2 4 h 导致新生鼠心肌成纤维细胞苯丙氨 酸与胸腺嘧啶核苷的结合增加，同时发现4 8 h 后细胞的数量明显增加。h i r o s h i 等【1 3 1 于2 0 0 0 年设计并制造了种微量吸引应力作用模型并将其作用于兔的骸骨 塑坚查兰璺主竺垡堡壅堡! ! 竺 肌脏成纤维细胞上，利用两个非常精细的微量吸管吸住细胞的两头，通过对单个 成纤维细胞的牵拉实验发现：成纤维细胞能紧密附着在吸管上并显示不一致的变 形，最大的负载( 导致细胞破裂) 可达0 9 4 - 0 2 “n ，而最大的延长度可达8 6 + 2 4 t m 。 1 2 2 应力( 应变) 对细胞活性及结构的影响 b u c k l e y 等人曾在实验中对鸡的颅盖骨细胞施加频率为o 0 5 h z 的周期性载 荷。结果发现，在载荷作用下，除促进细胞分裂外，细胞还沿与载荷相垂直的方 向列为一线；同时，由于应力的作用，细胞外基质可以在通常不能矿化的条件下 矿化。a k h o u a y r i 等人在实验中发现，在动态载荷作用下，细胞校对照组变大、 变圆；而在静态载荷作用下，细胞被拉伸并沿拉伸轴排列；扫描电镜显示，拉伸 使胶原纤维发生重排，从丽改变了细胞的空间构象和形态。毛勇等n 4 1 在研究两 种不同应力对体外培养的成骨细胞的实验中，测出一定的外力可以引起成骨细胞 骨架的重排及细胞形态的变化。静压力作为一种类似于生理状态的外力与剪应力 相比，对成骨细胞的形态及细胞骨架的影响较轻。 b r i s h t o n 用高分子材料作为纂底膜对成骨细胞加载。结果表明，拉伸应变可 以使成骨细胞的d n a 含量增加，细胞增殖加快。b u c k e l y 等人通过基底材料的 拉伸或者弯曲变形对细胞加载，发现基底应变可以增加细胞的有丝分裂率和细胞 外基质的合成率，增加胶原蛋白和非胶原蛋白的合成。力学刺激对调控软骨代谢 和维持其胞外基质的正常表型起重要作用，其中静压力刺激减少了b 型胶原和 蛋白多糖的合成而正常动压力刺激则促进b 型胶原和蛋白多糖的合成。 1 2 3 应力( 应变) 对细胞功能状态的影响 载荷对细胞功能的影响与载荷的作用方式、持续时间及大小密切相关。p a v l i n 等对鼠牙周组织成骨细胞施加载荷后发现，加载2 4 h 后，成骨细胞中骨钙蛋 白水平轻度下降，但在加载后1 2 d ，其表达增长了约4 6 倍，到第4 d 则增长了 7 倍，达到其增长的最高峰。i 型胶原基因的表达在加载后第1 d 不明显，但在第 2 d 其表达增长了3 倍，并在其后6 d 维持这一水平。碱性磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a 【。p 1 基因的表达在施加载荷的1 周内增长了1 8 2 。2 倍。c a r l 对取自 鼠颅盖骨的骨细胞进行两向交变加载，在基底应变为17 0 0 9 e 时，细胞增殖显蔫 国塑坚查堂堡主堂垡笙壅垡! 竺2 增加。 有学者提出力学载荷是使离体的软骨细胞生长成自体软骨的必要条件。静态 压缩加载抑制了s g a g 的合成，短时间( 少于4 8 h ) 的周期性加载抑制了细胞分化， 并促进了s g a g 的合成和整个( 离体培养的) 软骨产物的合成。由于人体内流体近 似于不可压缩的，纯压缩力不会产生明显的流体运动。间歇流体流动力可影响到 养分的运输，能产生压力梯度而使组织变形，也可以提示细胞对应力有某种特异 程度的特异响应。无论有无压缩，流体剪应力使培养中的细胞产生了较大的生长 速度。杨红梅【1 6 】等在实验中发现，在一定时间、一定力值范围内，随着载衙的 增大，受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性有逐渐增高的趋势；当持续压力作用超 过一定的范围，细胞增殖活性则出现下降趋势。 机械刺激早期可促进成骨细胞合成骨钙蛋白，随着时间推移蛋白分泌量下降。 y a m a m o t o 、s m i t h 、l a m m i 等的实验表明，在适当的时间范围内施加适当的压力， 均可以促进单层培养的软骨细胞增殖和基质的分泌，而超过一定的限度则会产生 抑制作用。b u s h m a n 的研究则提示加载方式不同可产生不同的效应，软骨受持续 力作用时很难矿化成骨；k i m 、t o i z i l l i 、t a k a h a s h i 、b a c h r a c h 等的研究提示， 一定载荷强度及时间范围内的作用力可以促进软骨内细胞的合成代谢活动，时间 过长、载荷强度过大则会引起抑制效应。s h i m s h o n i 等对培养的下颇深突软骨细 胞施加短暂张力后发现，细胞的d n a 含量增高，c a m p 分泌增加。n o r t o n 等人 对筋板软骨细胞受压后的研究得到了相似的结果。w r i g h t 等对体外培养的人长骨 关节软骨细胞施加拉伸力后发现，细胞c 灿心及蛋白多糖合成增加，l e e 也得到 了相似的结果。低频率、载荷强度小的拉伸力可促进软骨细胞合成分泌蛋白多糖， 而高频率、载荷强度大的拉伸力则相反。王红兵等 1 通过用四点弯曲梁实验装 置对离体培养的大鼠成骨细胞施加拉伸应变，得出了机械拉伸有利于成骨细胞生 长，并可通过粘附、铺展调整削减应变影响。 1 2 4 应力( 应变) 对骨代谢激素及细胞因子的调节 载荷对细胞代谢及激素分泌的影响亦与载荷的作用方式、持续时间及大小有 关。c i l l o 等在研究机械载荷对成骨样细胞生长因子及细胞因子表达的实验中 发现，拉伸应力可增加骨生长因子的表达：施加载荷8 h 后，t g f - bm r n a 、胰 盟堂垩盔堂堡主兰焦笙壅堡唑2 岛素样生长因子一i i ( i n s u l i n 1 i k eg r o w t h f a c t o ri i ，i g f i i ) m r n a 表达增加，碱性 成纤维细胞生长因子( b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ；b f g f ) 减少，而细胞因子i l 一1 、 i l 一6 无明显变化，加载1 6 h 后，t g p 一8m r n a 、i g f 1 、b f g f 的m r n a 表达均 增加i l 6 水平亦轻度上升。加载2 4 h 后，t g f - - 1 3m r n a 、i g f 一1 、b f g f 、i l 一6 的m r n a 表达均显著增加。k l e t s a s 等1 9 】对h p d l 成骨样细胞施加持续应力后发 现，应力使c l o s 、c - j l m 基因的表达增加，同时出现了蛋白质水平的磷酸化，从 而增强了c - j u n 的活性。p e v e r a l i 等发现，机械拉伸能活化促分裂原活化蛋白 激酶( i n i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，m a p k ) ，而m a p k 能促进c l o s 、c - j u n 的 磷酸化，从而促进成骨细胞的分化。i k e g a m e 等【2 1 】在给乳鼠头盖骨骨缝施加机械 拉伸的实验中发现，拉伸后6 h ，骨形成蛋白4 ( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n 4 ， b m p 4 ) 基因表达增加，并在此后继续升高，c b f a i o s f - 2 ，也随着b m p 4 基因的 表达而开始表达。 g r a n e t 还用r t - p c r 结合免疫组化方法，对加载5 、l o 、2 0 、3 0 、6 0 、1 2 0 m i n 的细胞分别进行测定发现，载荷对所有a p 一1 家族的成员都有诱导作用，其中 c 1 0 s 、c - j u n 、f x a - 2 为早期瞬时诱导( 其表达在载荷作用下1 0 r a i n 即达到顶峰) ；而 l o s b 、f r a - 1 、 u n b 、i h a d 等的m r n a 在加载l h 后仍有表达。a p 1 家族成员的 蛋白质核转运则在加载后3 0 m i n 后出现；此外，载荷还促进了转录因子e g r - 1 的 瞬时表达。体内实验证明，高强度的载荷能促进生长激素的释放，增加胰岛素样 生长因子1 ( i n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o ri ，i g f 1 ) 的量。 载荷对骨细胞最常见的作用就是能促进前列腺索( p r o s t a g l a n di n ，p g ) 的合成。 s m a l t 等认为，剪切力诱导p g e 2 的产生。n g a n 等发现，机械拉伸和i l 1 b 对成 骨细胞合成p g e 2 和c a m p 有协同作用。体外实验中，o 5 p a 的流体剪切应力作 用5 m i n ，骨筋细胞的p g e 2 分泌就可以升高5 倍；o 7 p a 的流体剪切应力作用的 l h 过程中及作用停止后的l h 内，骨筋细胞内的p o e 2 、p g l 2 、p g f 2 。的分泌可持 续上调。s m a l t 等发现o 1 p a 的剪切应变力可使n o 合成升高，h e l f r i c h 等的研究 表明，n o 是机械拉伸引起骨反应的重要媒介。刘大为等利用p e t r i p e r m 弹性膜拉 伸施力装置经实验得出：机械拉伸可明显影响成骨细胞o p nm r n a 和 t g f 1 3 1 m r n a 的表达水平，机械拉伸可以使t g f 1 3 1 m r n a 的表达水平显著增 强，其中低频率、低强度拉伸可最大程度地促进t g f 一 3 l m r n a 的表达，从而促 蛰堕塑坚盔堂堡主堂焦搀奎! ! ! 坚2 进骨代谢过程。s o d e k 亦认为，机械拉伸可提高o p n m r n a 的表达。r o e l o f s e n 等得出间断性流体静压力可提高末分化骨细胞和类成骨细胞的a l p 活性、胶原 合成和肌动蛋白表达。但持续性压力对成骨细胞有抑制作用。k o a r n i n n t a 实验表 明，持续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了整合素m r n a 的表 达，改变了高尔基氏器的形态和抑锩4 微丝的组成。 1 3 本文的主要工作 本文的工作是基于浙江大学医学院机械应变作用下鼠骨髓基质细胞影响破 骨细胞分化的研究这一国家自然科学基金项目进展需求展开的，在可控应变的 离体细胞培养加力实验装置研制方面进行了比较深入的预研，主要工作为： 一从学科交叉角度，充分调研了国内外细胞力学实验研究的动态和进展，并 对主要方法作了论述和分析。 二研究设计了两套分别对应于人体正常生理水平和病理水平应力( 应变) 环 境的离体细胞培养加力新装置，并制成科研样仪。 三采用理论计算、有限元计算和应变电测相结合，标定了小应变双轴应变装 置的加载应变曲线及，、s 。r r 分布规律。 四论文期间，协同参与研制成一种可以进行非接触式变形测量的光力学实验 新装置( z m p d i 型) ，并在柔性包装材料力学性能测定中完成了应用 考核，该技术的零加强效应和高精度自动采集特性十分适于测量变形范围 大、对象刚度小的特殊条件下使用。典型成果已有两篇论文发表。 五设计了用于细胞培养基底的柔性大变形硅橡胶膜的力学参数测定的方案， 精确测得其弹性模量和泊松比，并完成了大变形单向拉伸培养装置的标定。 六根据论文期间的实践和科研样仪的初步试用，提出了离体细胞培养加力装 置深入研究的若干意见。 塑堑查兰堡圭兰垡兰壅坚! 竺2 第二章细胞力学基本理论 细胞，用最简单的术语表示，可以把它看成是由一层膜包着的流变体。细胞 膜使细胞内部与环境隔开，同时也是细胞与环境进行物质、能量、信息转换的通 道，是细胞表面结构中层重要的组分。细胞膜的受力和变形对膜的功能和结构有 直接影响。此外，细胞与细胞的连接也是相邻的细胞膜特殊生化过程形成的连结 装置。在细胞内部，存在着极其复杂的蛋白质纤维的网络结构系统，称之为细胞 骨架，它主要包括了微管( m i c r o t u b l e s ) 、微丝( m i c r o f i l a r n e n t ) 、中丝( i n t e h n e d i a t e f i l a m e n t s ) 、微梁网络( m i c r o t r a b e c u l a c ) 。遍布细胞内的这种网络系统对于细胞形 态构造、细胞运动、物质运输、能量交换、信息传递，细胞的分化和转化等一系 列方面起着重要作用。 当我们采用连续介质力学的方法研究细胞的力学行为时，常把细胞看作是均 匀的连续体。 2 1 1 张力理论 2 1 张力理论及张力完整性 细胞膜很薄，所以非常容易屈曲，因而在膜平面内几乎不能承受压应力。我 们假设：膜非常薄，完全不能承受面内的任何压应力，在膜平面内，沿一个 方向的主应变为正时，其正交方向的主应变为负或可以忽略。 满足以上两个假设的称之为张力理论。需要指出的是，当膜沿两个正交方向 的应变均为正时，张力理论的第二个假设不成立，因而张力理论失效。在此情况 下，可按式2 - 1 连续介质力学的平衡方程直接求解。 亟塑垩查堂璺圭堂垒丝苎i ! ! 竖2 ( 2 1 ) e v a n s 和s k a l a k l 2 2 1 采用张力理论分析了粘附于壁上红细胞的变形行为，f u n g 2 3 】 研究了血流剪力作用下血管内皮细胞膜的受力情况。根据张力理论，正交于血流 方向的应力可以忽略。假设细胞是流体状的( f l u i dl i k e ) ，因而细胞内部不能承受 剪力( 稳态条件下) ，这时，作用在细胞表面膜上的最大应力可以表示为 叽= 吐h( 2 2 ) 其中r 为流场剪力，三是细胞的长度，h 为细胞膜的厚度。根据血流理论，f 介 于1 2 n m 2 之间，内皮细胞的长度三约为1 0 6 0 岬，厚度h 约为1 0 n m 。于是 发现膜内的应力高出血流剪力3 4 卜量级。过去的研究常常集中细胞受到的流 场外力的大小上，现在通过对细胞膜本身受力的研究，可以建立细胞膜的受力与 细胞形态及功能的直接关系。此外，膜内的高应力分布有可能导致细胞的损伤和 坏死，因为从力学观点看，任何一种材料都有其极限应力。 p a p p e n h e i m e r t 【2 4 1 关于细胞膜物质传递的“多孔概念”在理论上是非常完美的， 如果采用这一概念，从弹性力学的观点看，受张力作用的孔，在它周围的变形要 远大于膜的平均应变，因而将允许大分子流入膜内，从而引起一系列的生理生化 变化及细胞形态的变化。f u n g 进一步讨论了细胞与细胞的连接，同时考虑了细 胞核的影响，发现相邻两个细胞的膜张力跟血液及细胞内的渗透压与静压之差有 关。如果静压差为o ，细胞的上表面膜的张力将在上游积累增加：否则，根据细 胞侧壁倾角的变化，膜内张力将沿血管增加、减少或出现波动。为了确定侧壁的 倾角，需要补充最小余能原理求解。 张力理论没有涉及细胞的本构方程，只研究了细胞膜的受力情况及细胞与细 胞的连接，因而这一理论被认为是细胞的基础理论。 0 0 0 i i l l = y z + + + 鳖钯i 峨i 魄一砂堕砂一砂 峨i 卜苦魄i q 塑鋈查兰堡主兰垒兰奎! ! ! 竺2 2 1 2 张力完整性 张力完整性最初是一个建筑学概念，由f u l l e r l 2 5 首先提出，s n e l s o n 完成了第 一个张力完整性结构模型 2 “。在这种结构中，承受压力的刚性支杆将承受拉力 的柔性构件( 弹性绳) 拉直或拉紧，同时弹性绳又将剐性杆压紧。张力被连续地传 递到所有结构构件，局部力的增加可被整个结构分散，从而达到了结构的稳定。 由于该结构体系的稳定性取决于张力的完整性的保持，故称为张力完整性 ( t e n s e g r i t y ) 。此外，该结构在受到外力作用之前所有的结构构件都已处于张拉或 受压状态，即被预加应力。 为了研究机械力对细胞形状及功能的影响，i n g b e r t 2 7 1 按照张力完整性结构用 刚性杆和弹性绳制作了一个三维细胞模型以模拟细胞的行为。在大的张力完整性 模型中放入一个小的张力完整性模型以代表细胞核，称为分级细胞模型，改变该 体系内不同构件的长度和数景即可构造不同的细胞形状。在分级模型的粘附实验 中发现，在未粘附的状态下，细胞和细胞核的模型都呈圆球状，而附着在刚性平 面上之后，细胞和细胞核模型的形状以协调的方式展平，细胞模型在展平的过程 中，核模型逐渐向细胞模型的底部运动，这类似于细胞和细胞核的极化情况。 人们用计算机进行培养细胞的形态测定，分析它们的形状变化过程，证明了 张力完整性结构与活细胞的已知状态极为相似j 。 2 2 小变形理论 当采用微管吸吮技术时，如果管径远小于细胞的直径，而且吸压不大时，小 变形理论成立。 2 2 i 半无限体模型( h a l f - s p a c em o d e l ) 如果吸管的内径非常小，此时细胞的变形阻力主要来自细胞骨架的皮质层， 故可将细胞看作是具有皮质层厚度的平板。进一步，如果应力沿厚度衰减很快时， 作为近似，可以看作是半平面问题。s a t o 采用k e l v i n 模型，将该问题归结为求 解方程 塑坚盔堂堡圭兰壁垒塞! ! ! 竺2 d i v s = 0 ，e = g r a du + ( g r a du ) 1 2 、 d i v u = 0 , 冉帮= 争彬) ( 2 - 3 ) s = j l p ，j 其边界条件可以表示为 j 。( ，0 ，r ) = 0 r o ，f 0 ( 2 - 4 ) 以邶力= 掣霉翼 p s ， “，( r ，0 ，r ) = 0口r 6 ，t 0( 2 - 6 ) 其中口，b 表示吸管道内外半径，如图2 - 1 所示，s 是应力张量，p 是应变张量，“ 是位移矢量，p 为吸压的变化量，f 。、e 、f 。为细胞常数， ( f ) 是单位阶梯函数。 初始条件可以假定为 _ 肜醛 譬 k 螂 黝黝獭矽 “= 吱= o ，t = 0 ( 2 - 7 ) 通过l a p l a c e 变换，可以得到细胞吸入管内的长度l 与时间t 具有指数关系 加m 。 去e x 删呻) 1p 。， 铲百2 a a pj 耽，l 鱼塑坚查堂堡主堂垡望塞坚! 竺2 ( 2 - 9 ) 七。，如和为k e l v i n 模型的参量，f ，可由实验数据用统计平均方法求得。如果本 构方程为其他类型时，可通过类似的方法解答。 半无限体模型尽管简单，但它提供了一种简单的分析实验数据的方法，易于 使用。 2 2 2 常张力皮质- - m a x w e l l 液滴模型( m a x w e l ll i q u i d - d r o pm o d e l w i t hac o n s t a n tc o r t i c a ll a y e r ) 许多研究表明，球状白细胞的膜表面是高度皱状的，因而它允许白细胞易于 变形而膜表面几乎不承受张力。基于这种认识，b a g g e 等2 9 】提出了用k e l v i n 模 型描述白细胞的力学性能。之后，e v a n s 和k u k a n 3 0 1 认为白细胞之所以易于保持 球状是因为存在一个承受张力的“皮质层”( c o r t i c a ll a y e r ) ，因而e v a n s 和y e u n g t 提出了具有常张力皮质层一牛顿流体液滴模型。但是，n e e d h a m 和h o c h m u t h 的 研究表明细胞骨架的流动行为属非牛顿流体，进而d o n g 等p 1 1 提出了具有常张力 皮质层的m a x w e l l 液滴模型。假设细胞骨架皮质层始终处于常预张力瓦状态， 变形后瓦的控制方程( 球坐标系下) 可以表示为 z 瓦一鲁等一扣矿等吧铲。 p 其中，q ，是整体径向载荷，a 。为细胞的半径，“，是径向位移。 细胞内部m a x w e l l 流体的本构方程可以写为 f 口+ 丝k f f = 2 凡( 2 - 1 1 ) 其中，k 和z 分别是弹性模量和粘性系数，办和而分别是应变率张量和应力偏 量，可表示为 、， 白一屯 + ，h、 一h | 1 旦屯k： = 一一 0 e q 塑堡查兰壁主堂垒丝奎堡! 唑 f 2 1 2 ) 其中，占。为k r o n e c k e r 算子，p 为细胞内部静水压力，v 。为流体速度张量。 根据平衡方程和连续性方程 堕：0 1 ，：(2-13) 盟：ol 孤；j 最后可将问题化为 z v 2 y = 跏+ 譬v 詈 ( 2 1 4 ) 根据加载条件及皮质层与流体的连续性条件，就可以联立求解方程( 2 1o ) 和 ( 2 1 4 ) ，然后由实验确定参数。d o n g 采用这一模型研究了白细胞吸入微管及其恢 复时的变形特征，显示了当变形不大时，实验结果和理论分析吻合。 前面提到，将上述模型用于微管吸吮以外的其他实验技术( 如探压法) 时， 有可能得到完全不同的细胞力学特性参数。这表明，细胞的真实力学模型要复杂 得多。h o c h m u t h 建议将白细胞看作是具有两项流三层壳模型，但是由于细胞结 构上是非均匀的，因而非均匀、多相流、多层壳模型是今后发展的必然方向。 2 3 大变形理论 细胞的实际变形往往较大，因而对细胞及细胞膜进行大变形分析是十分必要 的。f u n g 3 2 1 针对红细胞膜面积变化很小但可以发生大变形的特点，建立了红细 胞膜的本构方程： n ，= 女如一1 ) + s n ：= “丑一1 ) 一j ( 2 1 5 ) 这里，n 。、n ：是主方向膜力，丑、a ：是主伸长比，s 、k 分别为剪切弹性模量和 面积弹性模量。由于j 很小，很小的剪应力就能造成很大的变形。式2 1 5 右边第 丝 一 嘞 盟叩 ，ll y 2 盯 = = 巧 华华 盟塑望查堂堡圭堂垡堕塞堡塑竺 2 项若除以置，驾，即得e v a n s 和s k a l a k 所提出的本构方程。 2 3 1 轴对称壳体模型 c h e n g 3 3 1 将细胞看作是包含不可压缩流体的轴对称壳体结构，将膜的本构方 程用广义h o o k 定律表示，即应变能函数w 为 耻煮阮一1 ) 2 + 一1 ) 2 + 2 v 阮一l 肌一1 ) 】 + 南瞬州2 + 2 吨k ) + 譬霉( 2 - 1 6 ) 其中，九、乃为膜内主伸长比，也、k e 为曲率，丑为横向剪切应变， e 、g 、h 、p 、k 分别为扬氏弹性模量、剪切弹性模量、壳的厚度、泊松比和剪 切系数。 而后，c h e n g 建立了计算细胞大变形的变分原理及有限元格式，并且考虑了 细胞主动变形的影响，其中体积约束条件采用l a g r a n g e 乘子法引入。至于接触 条件，c h e n g 建议采用罚函数法( p e n a l t ym e t h o d ) ，图2 - 2 和2 - 3 分别给出了采用 该方法对用挤压实验和探压技术得到的细胞大变形进行数值模拟的结果。 8 图2 - 2 刚性平板挤压细胞的变形数值模拟( 文献 3 1 】) 盟塑坚盔堂堡圭堂堡堡壅堡唑2 图2 - 3 挤压过程中细胞变形的数值模拟( 3 c 献p l 】) 2 3 2m a x w e l l 液滴皮质球壳模型 d o n g 3 4 1 将常张力一m a x w e l l 液滴皮质球壳模型推广到大变形情况，此时，细 胞皮质层的主膜力i ( f = 1 ，2 ) 可以表示为 f = 瓦+ 玩4 “，如) + 占，b 。“，如) ( 2 1 7 ) 其中，e 矿e ，表示面积膨胀和剪切弹性模量，a 、b ，为主伸长比的函数，瓦为 小变形时的常预张力。 细胞内部的m a x w e l l 流体的本构方程可以写为： 州归删+ 謦e x p 一扣。枇弦 倍哟 其中，o - u 为c a u d w 应力，为细胞的力学参数，g “为曲线坐标下的度量张 量，文献【3 4 在此基础上，对进入吸管的白细胞进行了大变形的有限元数值模拟 f 图2 4 ) 。 鱼塑堑查兰璺圭兰垒笙壅! 型 ；八 ；v _ 。i 。 莓 图2 4 采用皮质层- - m a x w e l l 液滴模型的大变形数值模拟( 文献 3 4 ) 2 4 活细胞的主动变形分析 前面的讨论考虑的都是细胞的被动变形( p a s s i v ed e f o r m a t i o n ) ，即外部力作用 下，细胞内部抵抗变形的能力。而活细胞本身存在着主动变形( a c t i v e d e f o r m a t i o n l ，因而，研究包含细胞主动变形在内的细胞的力学性质是细胞力学 的最终目的。目前对白细胞主动变形的研究较为集中，主要工作包括： s c h m i d - s c h o b e i n 和s k a l a k t i ”1 的肌动蛋白聚合( a c t i n p o l y m e r i z a t i o n ) 模型，o s t e r 和 p e r e l s o a t 3 8 1 的渗透压模型以及z h u 和s k a l a k l 3 7 1 的工作。对白细胞突出运动 ( p r o t r u s i v em o t i o n ) 的研究，其目的在于弄清伪足( p s e u d o p o d ) 尖端产生驱动力的生 化机制。s k a l a k 和z h u t 3 即根据热力学原理建立了方程 p = p c q 竺l ( 2 1 9 ) 其中，p 和p 。分别为增长的伪足尖端的内外压，n 为尖端处f - 肌动蛋白的表面 数密度( s u r f k en u m b e rd e n s i t y ) ，f 为微丝中一个肌动蛋白胶粒( a c t i n p r o t o m e r e ) 郇j 长度，为由于一个肌动蛋白单体聚合释放的化学能，叩是由化学能向机械能转 化的有效因子。因而式( 2 1 9 ) 表明：膜内的压力一部分由静水压p 组成，另部 分来自话细胞内部微丝网络的生化反应，正是由于这部分压力通过伪足的肌动蛋 鱼塑坚查竺堡主兰壁丝苎璺! 塑 白网络驱动了内部流体的过滤。需要指出的是，式( 2 1 9 ) 是一种最简单的形式， 因为采用热力学的方