（化学工程专业论文）高效液相色谱法测定发酵液中康百汀含量.pdf

摘要 摘要 普伐他汀( p r a v a s t a t i n ) 是一种新型降血脂药，属国家二类新药，其发酵生 产是通过稀有马杜拉放线菌( a c t i n o m a d u r a ) 将康百汀( c o m p a c t i n ) 生物转化而 成。康百汀发酵液中康百汀以康百汀酸和康百汀内酯两种形式存在，准确快速的 检测分析方法直接影响到普伐他汀的质量及生产成本。缩短发酵液中康百汀含量 测定时间，减少环境污染是本论文的目的所在。 论文根据康百汀发酵生产特性，摸索出康百汀发酵液提取溶剂及提取时间等 条件特征，设计并采用高效液相色谱法对康百汀发酵液进行分析测定试验，初步 建立一种快速测定发酵液中康百汀含量的方法，实现了实验室研究与发酵工程技 术的有机结合。 论文研究结果表明，当采用高效液相色谱法h y s p e r i lo d s 2 色谱柱( 2 5 0 r a m 4 6 m m ，5 u r n ) ，流动相为乙腈：0 0 3 m o l l 。1 磷酸二氢钠缓冲液( 1 2 0 0 ：8 0 0 ， v v , p h = 4 0 ) ，流速为1 0 m ! r a i n - 1 , 检测波长为2 3 8 n m ，柱温2 5 ，进样量1 0 l jl 时， 康百汀发酵液生产中康百汀酸和康百汀内酯分别在9 7 5 4 8 7 6 8 m g l ，1 0 2 0 5 0 9 7 9 m g l 。1 内呈良好线性关系，相关系数( r ) 分别为0 9 9 9 9 4 2 和0 9 9 9 8 0 1 ， 平均加样回收率分别为9 9 6 和9 9 - 3 ，r s d 分别为0 4 2 和o 2 9 。连续6 个月 的试验测定结果表明，本研究课题所得出的方法简单，准确可靠，重现性好，可 用于发酵液中康百汀含量的测定。 关键词：普伐他汀；康百汀；康百汀酸：康百汀内酯；高效液相色谱法 兰堕堡三盔兰竺兰堡堡苎 a bs t r a c t p r o v a s t a t i ni sak i n do fn e wc h o l e s t e r o l l o w e r i n gm e d i c i n e i tb e l o n g st ot w o n e wm e d i c i n ei n n a t i o n c o m p a c t i n w i l lb ec o n v e r t e di n t o p r a v a s t a t i nb y a c t i n o m a d u r ai nf e r m e n t a t i o n c o m p a c t i ne x s i t sw i t hc o m p a c t i na c i da n dc o m p a c t i n l a c t o n ei nt h ef e r m e n t a t i o n t h eq u a l i t ya n dc o s to fp r a v a s t a t i nw i l lb ea f f e c t e db yt h e a c c u r a t ea n dr a p i dd e t e r m i n a t i o nm e t h o d t h eo b j e c ti sh o wt os h o g e nt h et i m eo f d e t e r m i n a t i o na n dr e d u c ep o l l u t a n t a c c o r d i n gt o t h ep r o d u c t i o nc h a r a c t e ro f c o m p a c t i n i n f e r m e n t a t i o n ，t h e e x t r a c t i v e s o l v e n ta n dt i m eo f c o m p a c t i nf e r m e n t a t i o nw e r ee x p l o r e d t h e d e t e r m i n a t i o no fc o m p a c t i ni nf e r m e n t a t i o nb yh p l cw a sa l s od e s i g n e da n du s e d a n dn o wak i n d o fr a p i dd e t e r m i n a t i o nm e t h o do fc o m p a c t i ni nf e r m e n t a t i o nw a s e s t a b l i s h e d t h el a b o r a t o r yr e s e a r c ha n df e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n gw a sc o m b i n e dt o a l lo r g a n i s m t h er e s e a r c hi n d i c a t et h a tt h eh p l cm e t h o dc o u l db eu s e dt o d e t e r m i n e c o m p a c t i na c i d a n dc o m p a c t i nl a c t o n ea tt h es a m et i m e t h e c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n si n c l u d e d h y s p e r s i l o d s 2 c o l u m n ( 4 6 m m 2 5 0 m m ，5 u r n ) ， a c e t o n i t r i l e 一0 0 3 m o l l n a h 2 p 0 4b u f f e r ( 1 2 0 0 ：8 0 0 ，v v , p h 4 0 ) a st h em o b i l e p h a s e ，f l o wr a t ew a s1 0m l m i n - 1t h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s2 3 8 n m t h ec o l u m n t e m p e r a t u r ew a s2 5 t h ei n j e c t i o nv o l u m ew a s10 儿】t h er e s u l t sj n d i c a t et h a tt h e s t a n d a r dc u r v eo fc o m p a c t i na c i dw a sl i n e a ro v e rt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f9 7 5 4 8 7 6 8 m g l - l , t h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a s0 9 9 9 9 4 2 t h ea v e r a g er e c o v e r yw a s 9 9 6 w i t hr s d0 4 2 t h es t a n d a r dc u r v eo fc o m p a v t i nl a c t o n ew a sl i n e a ro v e rt h e c o n c e n t r a t i o nr a n g eo f 1 0 2 0 5 0 9 7 9 m g l - l , t h ec o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n tw a s 0 9 9 9 8 0 1 ，t h ea v e r a g er e c o v e r yw a s9 9 3 w i t hr s do 2 9 s i xm o n t h sc o n t i n u a l l y d e t e r m i n a t i o ns h o w st h a tt h i sh p l cm e t h o di ss i m p l ea n da c c u r a t ef o rd e t e r m i n a t i o n o fc o m p a c t i na c i da n dc o m p a c t i nl a c t o n ei nf e r m e n t a t i o ns i m u l t a n e o u s l y k e yw o r d s ：p r a v a s t a t i n ；c o m p a c t i n ：c o m p a c t i na c i d ：c o m p a c t i nl a c t o n e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i i 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是木人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：荔q 厶 易 日期：7 酊年。g 月c 泪 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将木学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密回。 ( 请在以j _ 相应方框内打“4 ”) 作者签名：瓣 导帅签名：毒钍胁 r 期：刀年。苦月tp 日 日期：砑年。占月。p 日 前言 月i j昌 进入二十一世纪，随着经济的发展，人类的生活素质虽然有了很大的提高， 饮食习惯，饮食结构较以往有了较大变化，但是，一系列不良的膳食习惯，亦对 人类身体健康产生严重后果。近年，高脂肪、高蛋白的饮食行为，导致全球肥胖 人数急剧增加，一系列严重危害人类身体健康的疾病亦随之而来，其中心血管疾 病尤为普遍、严重。现全球高血压，高脂血症患者有6 亿人，中国有1 1 亿患此 类疾病，且每年以3 0 0 万速度递增。关爱生命，科学生活，合理膳食的理念相信 已经深入人心。高血压，高脂血症是继爱滋病，癌症之后的人类第三号杀手，据 报道，全球降血压，血脂药每年的销售占各类药物销售额的前三位，各国政府每 年为了对付该类疾病所花费的资金都数以亿计。 1 降血脂药物简介 一t l , 血管疾病是严重危害人类健康的常见病，多发病，心血管系统药物是指主 要作用于心脏或血管系统的药物。根据用于治疗疾病的类型，心血管系统药物分 为降血脂药，抗心律失常药，抗心绞痛药，抗高血压药和强心药五类。高脂血 症常根据血浆脂质水平的异常增高分为高胆固醇血症和高三酰甘油血症，实际上 是血浆蛋白异常的结果。对高脂血症的治疗首先是饮食治疗，限制高胆固醇及高 脂肪的摄入，若仍不能控制则应考虑药物治疗。 降血脂药主要有苯氧乙酸类，烟酸类，羟甲戊二酰辅酶a 还原酶抑制齐i j ( h m g c o a ) 等，羟甲戊二酰辅酶a 还原酶抑制剂是7 0 年代末发展起来的类新型降 血脂药物，其最早是从霉菌培养液中提取【2 l ，它对多种类型的高胆固醇血症患着 有效。这类药物选择性强，疗效确切，能显著降低l d l ( 低密度脂蛋白) 中胆固醇 水平，还能轻度升高h d l ( 高密度脂蛋白) 中胆固醇水平。已上市的几个品种有洛 伐他汀，西伐他汀，普伐他汀和氟伐他汀等，此类药是目前临床应用有效的一类 重要调血脂药。 2 普伐他汀与康百汀的关系 普伐他汀是一类新型降血脂药，它能通过抑制胆固醇合成途径中羟甲基戊二 酰辅酶a 还原酶的活性抑制胆固醇的合成，从而达到降低血液中胆固醇的目的。 康百汀是普伐他汀生产的前体，普伐他汀的发酵生产是通过稀有马杜拉放线菌将 康百汀生物转化而成的，康百汀发酵水平及其质量直接影响到普伐他汀的质量及 生产成本。而准确、快速、合理的检测方法对康百汀发酵生产有着重要的调节监 控作用。 3 康百汀检测技术 华南理i ：人学硕士学位论文 康百汀可以以康百汀酸和康百汀内酯二种形式存在，有些发酵产物中只会有 酸型，另一些则两种都有，因此，要了解发酵液中康百汀的总量，就需要对康百 汀酸和康百汀内酯分别检测。美国药典和中国药典中普伐他汀的检测方法仍欠缺， 其生产中问产物一一康百汀的检测分析方法更难以寻找。欧洲药典有普伐他汀的 检验方法，而其中间产物一一康百汀的检测分析方法也没有在欧洲药典上出现。 色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，它作为一种分离技术与 方法，自上世纪初发表第一篇有关色谱分析论文起，已有1 0 0 年历史，二十世纪 四十年代以后，色谱方法逐渐得到发展与完善，而且其势头越来越猛，从技术到 理论，到各种分离模式，以及在各个科学领域内的应用，得到了突飞猛进的发展， 现己成为分析化学学科中的一个重要分支，是分析化学工作者必不可少的有力工 具之一，它为许多重要学科的发展作出了极大的贡献。色谱分析方法具有分离效 率高，成本较低和易于与其他仪器或装置联用的特点，特别是现代计算机技术和 网络技术在色谱上的应用，使色谱方法及其技术在有效和快速测定各种类型的复 杂多组分样品方面得到了进一步的发展。目前，色谱分析方法已经广泛地应用于 石化过程分析，环境保护监测，生物样品分析，材料性能测定，工业卫生调查和 评价，药物动力学和毒理学研究，法庭取证分析，制药过程的监测，商品质量检 验等领域。在2 0 0 5 年版中华人民共和国药典一部中，高效液相色谱法用于含 量测定的品种达4 9 7 种，药典二部品种中采用高效液相色谱法的品种有8 4 8 种 ( 次) ，较2 0 0 0 年版增加5 6 6 种( 次) ，其中复方制剂，杂质或辅料干扰因素多的 品种多采用高效液相色谱法，采用高效液相色谱法作含量测定的品种增订2 2 3 种。 由此可看出高效液相色谱法在现代分析技术中得到进一步扩大应用，其在药物分 析中有着举足轻重的地位。 据检索资料及信息交流显示，目前，韩国、日本、加拿大、美国等国家都有 制药公司进行康百汀发酵生产。而国内亦有海j 下药业、蓝宝制药、四川抗生素研 究所等几家制药公司及科研单位正在开发研究康百汀。现康百汀发酵液中康百汀 酸和康百汀内酯的检测分析方法大都以高效液相色谱法测定。 4 研究目的和意义 关于康百汀酸和康百汀内酯检测分析方法，国内报道较少，国外相关分析方 法有些只注重康百汀内酯型的分析而忽视酸型的检测，有些高效液相色谱分析方 法涉及到的发酵产物所需提取条件，分析时间，提取试剂的运用等不是很合理， 检测成本较高，存在检验废弃物污染环境卫生等问题。有鉴于此，研究一种既可 快速测定又经济环保检测发酵液中康百汀总量的分析方法在实际生产控制过程中 具有十分重要的意义。 本研究课题目的在于通过在合适条件下，采用高效液相色谱法同时测定发酵 生产过程中康百汀酸和康百汀内酯含量，解决实际发酵产物检测分析时间长，测 前言 定误差大的问题，建立一种准确快速测定发酵液中康百汀含量的方法。 5 论文研究内容 ( 1 ) 色谱分离条件的摸索。通过方法对比试验，找出最佳色谱分析条件。 ( 2 ) 通过对比试验比较不同厂家，不同品牌的色谱柱对康百汀发酵液测定的影 响，确定较理想的h p l c 分析用柱。 ( 3 ) 标准品溶液的稳定性试验。通过对康百汀酸和康百汀内酯标准品溶液在不 同的贮存温度，贮存时间的考察，确定其贮存条件及使用期限。 f 4 1 考察康百汀发酵液提取方法，提取溶剂，提取时间。通过采用不同提取方 法，溶剂在不同提取时间提取发酵液，确定最优发酵液提取方法，溶剂及提取时 间l 。 华南理工大学硕士学位论文 第一章国内外测定发酵液中康百汀含量方法简介 1 1 医药发酵工业的现状与发展趋势 1 1 1 发酵工业与技术简介 发酵( f e r m e n t a t i o n ) 最初是来自拉丁语f e r v e r e 这个词，是指酵母作用于果 汁或发芽谷物时产生二氧化碳( c 0 2 ) 的现象。发酵对不同的对象具有不同的意 义。对生物化学家来说，它是指有机化合物进行分解或代谢释放能量的过程，工 业微生物学家则把发酵扩展到利用培养微生物来制得产物的需氧或厌氧的任何过 程，包括培养生物细胞( 含动，植物细胞和微生物) 来制得产物的所有过程。 发酵工业就产品的类型而言，有下列几种主要类型：以微生物菌体为产物的 微生物菌体发酵，以微生物酶( 含蛋白) 为产物的酶发酵，以菌体代谢产物( 含 初级代谢产物和次级代谢产物) 为目的产物发酵和利用微生物修饰作用的微生物 转化发酵等。 发酵技术涉及到各式各样的发酵产品的生产，其产品繁多，如传统食品和饮 料中的啤酒，葡萄酒，面包，酱油，医药产品中的青霉素，维生素，头孢菌素c ， 酶制剂中的蛋白酶，糖化酶等。发酵技术是一门具有悠久历史，又含有现代科学 和工程的科学技术，现广泛用于工农业生产和卫生保健事业，它不仅可利用天然 微生物，也可利用基因重组技术和细胞融合技术得到的新菌种或动植物细胞的产 品，也是生产酶的一种必要手段。 1 1 2 医药工业中的发酵生产现状与趋势 发酵工程在近代医药发展中占有重要地位。随着现代生物技术的发展，越来 越多的生物细胞被人类发现，而这些生物细胞又必须通过发酵过程才能取得有效 的商业化的产品，生物技术产品的开发，以医药医疗领域的市场为最大，在先进 国家中的产值年增长率高达2 5 左右。一些发达国家中，医用抗生素的用量约占 临床用药的5 0 ，而多数抗生素又都是发酵产品，我国抗生素的产值也占医药品 总产值的2 0 左右。 今天的发酵工业与过去相比，具有范围更广，技术更复杂，要求更高等特点。 医药发酵工业已经发展成为规模庞大的现代化企业，发酵生产过程采用传感器和 电子计算机来自动测定和控制发酵参数，生产流程实现连续化，自动化，生产水 平得到明显提高，随着分子生物学，量子生物学，遗传学和生化工程学等学科和 技术的发展，新的生物反应器的研究与应用，医药发酵工业将会得到跨跃式的发 第一章国内外测定发酵液中康百汀含量方法简介 展。 1 2 原料药生产中发酵液检测技术进展 1 2 1 发酵过程的基本任务 发酵是微生物合成大量产物的过程，是整个发酵工程的中心环节。发酵的好 坏，影响以后的各个环节，无论是产物的产量或质量都与此有关。 发酵过程的基本任务是要对菌体所具有的内在生产能力实现高效表达，从而 以较低的能量和物料消耗生产更多的发酵产品。原料药生产整个生产中必需不断 通入无菌空气，搅拌，维持一定的发酵罐压罐温，并每隔一定时间取样进行生化 分析和无菌试验，观察代谢变化，菌丝产生情况和菌丝形态，有无杂菌污染。在 发酵过程中主要加入消沫剂控制泡沫以免逃液，染菌，或加入酸碱控制发酵液的 p h 值，多数品种的发酵液内的碳源和氮源，或补入其他料液和前体以促进抗生 素的产生，如普伐他汀发酵中需补入康百汀做前体，以促进美伐他汀的羟基化衍 生物的产生。 1 2 2 发酵过程的检测目的 发酵过程检测是为了取得给定发酵过程及其菌株的生理化特征数据，以便对 过程实施有效的控制。检测的具体目的包括( 1 ) 了解过程变量的变化是否与预期 的目标值相符。( 2 ) 决定种子罐移种和发酵放罐的时间。( 3 ) 对不可测变量进行 间接估计。( 4 ) 对过程变量按给定值进行手动控制或自动控制f 3 l 。检测的方法有 物理测量( 如温度，压力，体积，流量等) ，物理化学测量( p h ，溶0 2 ，溶c 0 2 ， 氧化还原电位，气相成分等) ，化学测量( 基质，前体，产物等的浓度) ，以及生 物学和生物化学测量( 生物量，细胞形态，酶活性，胞内成分等) 。这些测量，可 提供反映环境变化和细胞代谢生理变化的许多重要信息1 4 1 。作为研究和控制发酵 过程的基础，发酵液中可供分析的参数主要有菌丝浓度和形态，残糖含量，氨基 氮，溶解氧浓度，p h 和发酵液中有效成份的含量等。 1 3 康百汀原料药发酵生产特性 影响发酵的因素是错综复杂的，各种因素相互影响，相互制约，原料药发酵 生产要得到预期的效果，需要各方面密切配合和严格操作。由于普伐他汀的发酵 生产是通过马杜拉放线菌将康百汀生物转化而成的，康百汀的转化率与稀有马杜 拉放线菌的培养时间存在着一定的相关性，具体见图1 1 。 华南理工大学硕士学位论文 图1 1 康百汀转化趋势图 由图1 - 1 可知，康百汀对马杜拉放线菌有明显的毒性，一旦发酵液中康百汀 含量达到一定浓度，超过马杜拉放线菌的耐受限度时，将会影响菌丝的正常代谢， 从而影响到康百汀的转化，甚至导致菌丝自溶。 因此，康百汀的快速准确的检测，对于指导普伐他汀发酵生产过程中康百汀 前体的补给，提高康百汀的转化率，促进普伐他汀的生产有着举足轻重的意义。 1 4 康百汀酸和康百汀内酯的化学性质 康百汀酸( c o m p a c t i na c i d ) 化学名为( 3 r ， 5 r ) 3 ， 5 - d i h y d r o x y - 7 - 【( 1 s ，2 s ，8 s ，8 a r ) - 2 一m e t h y l - 8 - ( s ) 一2 m e t h y l b u t y r y l o x y 一l ，2 ，6 ，7 ，8 ，8 a - - h e x a h y d r o l n a p h t h y l h e p t a n o i ca c i d 。 康 百汀 内酯( c o m p a c t i n l a c t o n e ) 的化学名为 ( 1 s ，7 s ，8 s ，8 a r ) 一l ，2 ，3 ，7 ，8 ，8 a - h e x a h y d r o 一7 - m e t h y l - 8 - 【2 - 【( 2 r ，4 r ) 一t e t r a h y d r o 一4 h y d r o x y - 6 - o x 0 2 h - p y r a n - 2 - y 1 e t h y l 】1 - n a p h t h a l e n y l ( s ) 2 - m e t h y i b u t y r a t e 。 康百汀酸和康百汀内酯的分子量分别为：4 0 8 5 4 和3 9 0 5 2 ，均在2 0 0 - - 2 0 0 0 范围内，且康百汀酸和康百汀内酯均能溶于甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂，2 3 0 n m ， 2 3 8 n m 波长下具有可见紫外吸收蜂。 6 第一章国内外测定发酵液中康百汀含量方法简介 康百汀酸和康百汀内酯的结构式为： 1 5 发酵液中康百汀含量测定分析方法 进入二十一世纪，人类面临着在信息科学，生命科学，材料科学，环境科学 等领域的快速发展的挑战，色谱技术是生命科学，材料科学，环境科学必不可少 7 华南理j 二人学硕十学位论文 的手段和工具，它是个具有强大生命力的分离分析技术。由于高效液相色谱仪 具有分离效能高，选择性高，检测灵敏度高，分析速度快，测量范围广及系统特 异性等优点，目前已成为实验室分析的主导方法，它在生命科学研究中具有独特 的优势i5 1 。可以毫不夸张地说，如果没有色谱技术的应用，自然科学和生命科学 能发展到今天的规模是很难想象的。 由于高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发的，受热不稳定易分解的， 分子量火，不i 司极性的有机化合物，生物活性物质和多种天然产物，合成的和天 然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品，食品合成药物，生物化工产品及 环境污染物等，约占全部有机化合物的8 0 i 。依据样品分子量和极性推荐各种 高效液相色谱法分离方法的应用范围如图1 2 所示【“。 m 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 0 6 图1 2 依据样品分子量和极性推荐各种h p l c 分离方法的应用范围 m 一相对分了质量；p 一极性；w 1 一水不溶； w s 一水溶；n p 非极性：n i p 非离子型极性；i 一离 型 1 吸附色谱法；2 一正相分配色谱法：3 一反相分配色谱法；4 - - 链台相色谱法：5 - - 离子色谱法；6 - - 体积排阻 色谱法；7 一凝胶渗透色谱法；8 - - 凝胶过滤色潜法；9 - - 亲和色弊法 从图1 2 可知，相对分子质量在2 0 0 2 0 0 0 范围内的化合物，可用液一固吸 附，液一液分配和离子交换色谱法，且从图1 2 中可知相对分予质量在1 0 2 1 0 3 ， 水溶性的化合物可用反相分配色谱法。 选择液相色谱方法应由样品决定【8 1 ，具体可参见表1 - 1 主要液相色谱方法特 性。 8 。卜 第一章国内外钡9 定发酵液中康百汀含量方法简介 表1 1 主要液相色谱方法特性 方法样晶特点色谱柱何时应用该方法 流动相：水有机溶剂 首选为能溶于水有机混合物的中 反相h p l c 色谱柱：c 1 8 ( o d s ) ，c 8 ，苯基，三 性或非离子化合物 甲基群烷( t m s ) ，氰基 流动相：水有机溶剂( 一种缓冲物控 离子或可电离化台物，尤其是碱性 离子对h p l c 制p h 和离子对试剂) 或阳离子化合物的良好选择 色谱柱：c 1 8 ( o d s ) ，c 8 ，氰基 当反相或离子对h p l c 无效时的第 流动相：有机溶剂混合物二个较好选择，首选为不溶于水 正相h p l c 色谱柱：氰基，_ 二醇基，氨基，硅胶有机混合液的亲脂样品，异构体混 合物和制备h p l c ( 硅胶最好) 典型的小分子混合物可用反相，离子对和正相三种h p l c 方法试验，如果有 酸性组分，首选是反相色谱法，再用离子对色谱，最后才试正相色谱。 康百汀发酵液中大都含酸性成分一一康百汀酸，符合反相液相色谱法试验条 件，目前，国内外相关资料亦显示，康百汀发酵液含量的测定多采用高效液相色 谱法测定。 综合以上情况考虑，本实验拟采用反相高效液相色谱法层析分离后检测，研 究分析发酵液中康百汀含量用高效液相色谱分析方法测定的可行性，为提高普伐 他汀产品的质量，为康百汀发酵生产过程的检测自控奠定基础。 9 华南理工大学硕士学位论文 第二章高效液相色谱法测定发酵液中康百汀含量的方 法研究 高效液相色谱法用于一个样品的分离和分析，主要采用吸附色谱，分配色谱， 离子色谱和体积排阻四种基本方法，对生物分子或生物大分子样品还可采用亲和 色谱法。一种高效液相色谱分析方法的建立，是由多种因素来决定的，除了要了 解样品的性质及实验室具备的条件外，必须解决以下问题：根据被分析样品的 特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。选择一根适用的色谱 柱，确定柱的规格( 柱内径及柱长) 和选用固定相( 粒径及孔径) 。选择适当的或优 化的分离操作条件，确定流动相的组成，流速及洗脱方法。由获得的色谱图进 行定性分析和定量分析。 建立液相色谱方法一般有以下几个步骤： 选择合适的液相色谱方法。 选择合适的色谱柱。 选择合适的k 值。 选择良好的峰位( a 值) 。 选择良好的色谱柱条件( 最佳n 值) 。 用实测样品解决出现的特殊问题。 证实方法的正确性。 本章节将遵循以上几个原则，从不同的方面阐述建立高效液相色谱法测定发 酵液中康百汀含量时必须考虑的重要因素。 2 1 色谱分析方法特点 色谱分析法是一个具有强大生命力的分离分析枝术，其中二十世纪六十年代 末发展起来的高效液相色谱法由于采用了新型高压输液泵，高灵敏度检测器和高 效微粒固定相，使得它在分析速度，分离效能检测灵敏度和操作自动化方面，都 达到了和气相媲美的程度，高效液相色谱法与气相色谱法在选择性，分离效率， 检测灵敏度，分析速度等方面有许多相似之处，气相色谱仅适于分析蒸气压低， 沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物，高分子和热稳定性差的化合物以 及生物活性物质，在全部有机化合物中仅有2 0 的样品适用于气相色谱分析。而 高效液相色谱法却可对8 0 的有机化合物进行分离分析。 与经典液相( 柱) 色谱法，气相色谱法比较，高效液相色谱法有以下表2 1 特 】o 第二章高效液相色谱法测定发酵液中康百汀含量的方法研究 点： 表2 - 1 高效液相色谱法特点 项目参数特征 色谱柱：柱长e r ai o 2 5 柱内径r a m2 1 0 周定相粒度：粒径u r n5 5 0 筛孔耳 2 5 0 0 3 0 0 色谱柱入口压力m p a 2 2 0 色谱柱柱效2 1 0 3 5 1 0 4 进样量g 1 0 - 6 1 0 2 进样方式 样品制成溶液 选择性：u v d ，p d a d ，f d ，e c d 检测器。 通用型：e l s d r i d 1 分离机理：可依据吸附，分配，筛析，离子交换。亲和等多种 原理进行样品分离，可供选用的同定相种类繁多。 固定相 2 色谱柱：固定相粒度小，为5 1 0 u m ，填充柱内径为3 6 r a m ，柱长1 0 2 5 e m ，柱效为1 0 3 1 0 4 ；毛细管柱内径为 0 叭o 0 3 m m ，柱长5 1 0 m ，柱效为1 0 4 1 0 5 ：柱温为常温 可分析低分子低沸点样品：高沸点，中分子，商分子有机化 应用范围 台物( 包括非极性，极性) ；离子型无机化合物：热不稳定，具 有生物活性的生物分子 溶质在液相的扩散系数( 1 0 5 e m 2 s ) 很小，以减少柱外效液 仪器组成 对分离效果的影响 u v d 一紫外吸收检测器p d a d - - z 极管阵列检测器f d 一荧光检测器 e c d 一电化学检测器r i d 一折光指数检测器e l s d 一蒸发激光散射检测器 2 2 高效液相色谱法分类 高效液相色谱法可依据溶质( 样品) 在固定相和流动相分离过程的物理化学原 理分类，也可按照溶质在高效液相色谱柱中洗脱的动力学过程分类。 一按溶质在两相分离过程的物理化学原理分类5 9 】 吸附色谱( a d s o r p t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸 华南理工大学硕士学位论文 附剂上吸附性能的差别来实现分离。 分配色谱( p a r t i t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样 品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液体流动相相 对极性的差别，又可分为j 下相分配色谱和反相分配色谱。当固定相的极性大于流 动相的极性时，称为正相色谱( n o r m a lp h a s ec h r o m a t o g r a p h y ) ；反之为反相色谱 ( r e v e r s e dp h a s ec h r o m a t o g r a p h y ) 。 离子色谱( i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 用商效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定p h 值的缓冲溶液作流动相， 依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子 交换能力的差别而实现分离。 体积排阻色谱( s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 用化学惰性的多孔凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作 用的差别来实现分离。 亲和色谱( a f f i n t yc h r o m a t o g r a p h y ) 以在不同基体上，键合多种不同特性的配位体作固定相，用具有不同p h 值 的缓冲溶液作流动相，依据生物分子与基体上键联的配位体之间存在的特异性亲 和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。 二按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类 1 0 , 1 1 , 1 2 】 洗脱法( e l u t i o nm e t h o d ) 又称淋洗法，该法是将含多组分的样品注入色谱柱，流动相连续流过色谱柱， 并携带样品组分在柱内向前移动，经色谱分离后，样品中不同组分依据与固定相 和流动相相互作用的差别，而顺序流出色谱柱，此法在液相色谱分析中获得最广 泛的应用。 前沿法( f r o n t a lm e t h o d ) 又称迎头法，是将含多个等量组分的样品溶于流动相，组成混合物溶液，并 连续注入色谱柱，由于溶质的不同组分与固定相的作用力不同，则与固定相作用 最弱的第个组分首先流出，其次是第二个组分与第一个组分混合流出，最后是 与固定相作用最强的第三个组分与第二和第一个组分混合起流出。此法只有第 一个组分的纯度较高，其它流出物都是混合物。由于不能实现各个组分的完全分 离，现已较少使用。 置换法( d i s p l a c e m e n tm e t h o d ) 又称顶替法，当含多种组分的混合物样品注入色谱柱后，各组分都与固定相 有强作用力，使用一般流动相无法将它们洗脱下来，此时可使用一种比样品组分 与固定相间作用力更强的置换剂( 或称顶替剂) 作流动相，当它注入色谱柱后，可 第二章高效液相色谱法测定发酵液中康百汀含量的方法研究 迫使滞留在柱上的各个组分依其与固定相作用力的差别而依次洗脱p 来，且各谱 带都是各个组分的纯品。该法现己在大规模制备色谱中获广泛应用，在生物大分 子纯品制各中取德良好的效果。 2 3 材料与仪器设备 2 3 1 实验材料 发酵液：广东蓝宝制药有限公司发酵工程部培养的康百汀发酵液。 标准品：购自日本某制药厂康百汀标准品，含量1 0 0 。 试剂：乙腈，甲醇，8 5 磷酸，磷酸二氢钠均为色谱纯。乙酸乙酯，氯仿， 丙酮，乙醇均为分析纯。0 i m 氢氧化钠溶液。超纯水。 2 3 2 主要仪器设备 设备名称型号产地 高效液相色谱仪 5 1 5美国w a t e r s 公司 紫外检测器4 8 6美国w a t e r s 公司 自动进样器 7 1 7美国w a t e r s 公司 脱气机 在线美国w a t e r s 公司 色谱柱恒温箱z w中科院大连化物所 色谱工作站 m i l l i u m 3 2美国w a t e r s 公司 均浆器pt-da 3 0 3 0 4 t 德国艾科公司 恒温振荡器 z d 一8 5 金坛市富华电器公司 恒温磁力搅拌器8 卜2上海司乐仪厂 酸度计828奥立龙公司 超纯水器 m i l l i q m i l l i p o r e 公司 溶剂过滤器 m i l l i p o r em l l i p o r e 公司 离心机 5 4 1 5 d 德国迈特科公司 分析天平 b p 2 1 1 d 德国赛多利斯公司 超声波清洗机h n l 0 0 6华南超声波设备厂 2 4 高效液相色谱方法的建立 f t 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪自1 9 6 7 年问世以来，由于使用了高压输液泵，全多孔微粒填 充柱和高灵敏检测器，实现了对样品的快速，高效和高灵敏的分离测定。二十世 纪7 0 8 0 年代，高效液相色谱仪由于吸收了气相色谱仪的研制经验，使之获得快 华南理工大学硕士学位论文 速发展。 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型两种，虽然它们的性能及应用范围不 同，但其基本组成是相似的，分析型高效液相色谱仪可有如下两种组合方式： 完全紧凑的体化系统。其死体积小，灵敏度高，体现出高效液相色谱仪 总体实用的特点。 独立部件的组成系统。其灵活性高，可根据不同的分析目的，组装成不同 的联接方式。 1 3 , 1 4 , 1 5 1 高效液相色谱仪的组成简图如图2 - 1 所示： 图2 1 高效液相色谱仪的组成 l 贮液罐：2 一在线脱气机；3 一高压输液泵；4 一混合器；5 一自动进样器，6 一色谱柱；7 一紫外吸收检测 器；8 色谱工作站；9 一回收废液罐 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱 进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，利用供试样品中 各组分在色谱柱中固定相和流动相间分配或吸附特性的差异，各成分在柱内被分 离，并依次进入检测器进行检测，由记录仪，积分仪或数据处理系统记录色谱信 号根据组分的保留时间和响应值( 峰面积或峰高) 进行分析测定。 b h p l c 模式的选择 h p l c 模式现大都以样品分子量2 0 0 0 为分界点，分为分子量大于2 0 0 0 和小 于2 0 0 0 两大类型，具体模式选择及应用范围见图2 2 及表2 2 。 1 4 第二章高效液相色谱法测定发酵液中康百汀含量的方法研究 图2 2 选择高效液相色谱分离模式的指导图 1 6 1 l s c 一一液周色潜法；n p b p c - - 一正相键相合相色谱法：r p - - b p c - - 一反相键合相色潜法；g p c - - 凝胶溘透色谱祛；g f c - - 一凝脱过滤色谱法；i p c - - 一离子对色潜法；i c 一一离了色谱法 由上述对高效液相色谱分离模式的选择可以看出，反相键合色谱法具有最广 泛的应用，它仅使用c 1 8 色谱柱，以甲醇一水或乙腈一水为流动相，或经梯度洗 脱，往往很快就获得较满意的初步结果。它可分离多种类型的样品，并可从梯度 洗脱过程估计适用的恒定组成流动相洗脱时的洗脱强度。由于发酵液中康百汀酸 和康百汀内酯的分子量均小于2 0 0 0 ，且溶于甲醇，甲醇水，乙腈，乙腈水等 溶剂，符合键合相反相色谱，因此，本实验色谱分析首选键合相的反相高效液相 色谱分析模式。 华南理工大学硕士学位论文 表2 - 2h p l c 分离模式及应用范围 方法流动相 色谱柱应用范围 c 8 ，c 1 8 ， 能溶于水- 有机混合溶液 反相h p l c水有机溶剂 的中性或弱酸，弱碱性化 苯基，氰基 合物 水有机溶剂，缓冲 酸碱性化合物或离子化 离子对h p l c c 8 ，c 1 8 ， 溶液和离子对试剂合物 有机溶剂的混合溶氰基，氨基，二醇 难溶或不溶于水、有机混 正相h p l c 合溶液的化合物，异构体 剂基，硅胶 分离以硅胶更好 阴离子交换或 蛋白，多肽，核酸；无机 离子交换色谱缓冲溶液 离子分离应首选离子色 阳离子交换 谱 水相( g f c ) ；纯有 g f c ；二醇基； 大分子化合物，蛋白质或 分子排阻色谱g p c ：聚苯乙烯或 机溶剂( g p c ) 聚台物等 硅胶 亲和色谱缓冲溶液亲和配基生物大分子 类似反相填料但疏 疏水相作用色谱缓冲溶液蛋白质 水性小得多 手性色谱 水有机溶剂各种手性填料光学异构体 c 色谱柱的选择 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。正相色谱系统使用极性填充剂，常 用的填充剂有硅胶等，离子交换填充剂用于离子交换色谱，凝胶或高分子多孔微 球等填充剂用于分子排阻色谱等：手性键合填充剂用于对映异构体的拆分分析。 反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷 键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶( 如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等) 也 有使用。 由于是在建立高效液相色谱方法初段，色谱柱的选择要考虑如柱长，粒度和 柱填料的性质( 如载体的形状，粒径，孔径，表面积，键合基团的表面覆盖度，含 碳量和键合类型等) 以及色谱柱的填充直接通影响待测物的保留行为和分离效果。 不同类型的色谱柱代表了不同的色谱方法，商效液相色谱法选择的色谱柱试验条 件范围一般较广，但具体应用又受到限制，主要是p h 值，柱温和流动相的选择。 孔径在i5 n m ( 1n m = 1 0 a 0 ) p a 下的填料适合于分析分子量小于2 0 0 0 的化合物，分子 1 6 第二章高效液相色谱法测定发酵液中康百汀含量的方法研究 量大于2 0 0 0 的化合物则应选择孑l 径在3 0 n m 以上的填料。以硅胶为载体的一般键 合固定相填充剂适用p h 28 的流动相。极端p h 值的流动相能“溶解”硅胶，使 键合相流失，结果非碱性组分的保留不断减少，碱性组分的保留增加，引起碱性 组分峰变宽。当p h 大于8 时，可使载体硅胶溶解；当p h 小于2 时，与硅胶相连 的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用p h 大于8 的流动相时，应选用 耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并且有高表面覆盖度的键合硅胶，包覆聚 合物填充剂，有机无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用p h 小于2 的流 动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧键能产生空间位阻保护作用的二 异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶，有机一无机杂化填充剂等。 以硅胶为基质的柱和阴离子交换柱超过6 0 。c 后，会增加对流动相中化学物质 的吸附。在高温下用小颗粒柱引起柱床塌陷，降低柱效，改变峰形。另外，某些 色谱柱对流动相有一定要求，并非所有溶剂均能使用，某些溶剂( 如四氢呋喃1 在 某些色谱柱中使用时，一旦达到平衡，不能随意改用其它溶剂。 根据各色谱柱的特点及康百汀的性质拟采用以下所示的色谱柱进行分析测定 比较，选择最佳的高效液相色谱分析用柱。 序号填料类型粒度规格品牌 1l u n ac 85 u m4 6 2 5 0 m m p h e n o m e n e x 2 e c l i p s ec 8 5 u m4 6 2 5 0 m m a g l i e n t 3i n e r t s i lo d s 25 u m4 6 l5 0 r a mi n e r t s i l 4 h y p e r c l o n eo d s 5 u m4 6 2 5 0 m m p h e n o m e n e x 5 h y p e r s i lo d s 2 5 u