（化学工艺专业论文）生物柴油专用脂肪酶的研究.pdf

生物柴油专用脂肪酶的研究 摘要 生物柴油是一种可再生、可生物降解、无毒的清洁能源，可以部分替 代石化柴油。酶法合成生物柴油和传统碱法、酸法催化相比，具有反应条 件温和、不产生废水、反应产物容易分离等优点。 本论文首先对催化合成生物柴油的脂肪酶进行了单酶筛选，对三种不 同的脂肪酶催化反应合成生物柴油和前人对生物柴油催化反应的脂肪酶的 研究成果进行了对比。研究表明p b 0 1 l 脂肪酶具有较高的催化特性，在催化 不同的油脂过程中，脂肪酸甲酯的转化率高达9 0 左右。通过单因素实验， 考察p b o l l 脂肪酶催化合成生物柴油的工艺条件如反应温度、酶用量、甲醇 流加次数、有机溶剂用量、底物摩尔比和体系水含量对脂肪酸甲酯( f a m e ) 产率的影响，并对产物进行了气相分析。结果表明，p b 0 1 1 脂肪酶催化大豆 油的适宜反应条件为：反应温度3 5 、酶用量1 0 ( 相对于油的质量分数) 、 甲醇流加次数3 次、有机溶剂用量3 0 i i l l 、体系水含量为o ( 相对于油的质量 分数) 、底物醇油摩尔比为1 5 ：l ，得到的脂肪酸甲酯转化率为9 3 2 1 。 利用晌应面法对p b 0 1 1 脂肪酶催化大豆油合成生物柴油的进行了反应 条件的优化研究。本实验考察了反应酶量、温度、有机溶剂量、底物摩尔 比、流加次数、水含量等因素对大豆油一甲醇酯交换反应的影响。通过6 因 素5 水平c c i 法来考察不同反应条件下对生物柴油的产量的影响，确定了 反应的最佳操作条件以及影响反应的关键因素。研究结果表明，p b 0 1 1 脂肪 酶催化大豆油酯交换合成生物柴油的最佳反应条件如下：酶量1 1 5 ，反应温 度3 7 5 ，流加次数4 次，有机溶剂用量1 9 m l ，水含量为2 5 ，底物摩尔比 为1 ：l ，在该条件下转化率达9 6 8 9 。 根据各种脂肪酶对油脂的选择性，研发得出的p b o l 2 复合脂肪酶催化大 豆油、棕榈油、花生油、菜籽油合成生物柴油的反应条件进行了优化研究。 考察了p b o l 2 复合脂肪酶的反应酶量、温度、有机溶剂、甲醇的抑制作用、 体系含水量和底物摩尔比等参数对酯化过程的影响。试验结果表明，以大 油为底物合成生物柴油，脂肪酸甲酯的转化率达9 7 5 8 ；以棕榈油为底物合 成生物柴油，脂肪酸甲酯转化率最高达9 6 4 0 ；以花生油为底物合成生物 柴油，脂肪酸甲酯转化率最高达9 8 2 0 ；以菜籽油为底物合成生物柴油， 脂肪酸甲酯转化率最高达9 3 5 4 。可见，p b o l 2 复合脂肪酶在催化不同的油 脂过程中，具有较高的脂肪酸甲酯转化率。一定程度上，消除了单酶催化 过程中的原料受限问题，开发出了一种生物柴油专用脂肪酶，为酶法催化 合成生物柴油的产业化奠定了一定的理论基础。 关键词：生物柴油酯交换响应面脂肪酶 t h er e a s e a r c ho fs p e c i a ll i p a s e f o rb i o d i e s e l a b s t r a c t b i o d i e s e l i sar e n 剀咄l e ，b i o d e g r a d a b l e ，n o 劬) 五c 觚dc l e a i l i n g 向e l ，w t l i c hc a l lp a r n yb e s u b s t i t u _ t e df o rc o n v e n t i o n a lf o s s i ld i e s e l c o m p 鲫e d 、) l ，i t l ln l e 恤l d i t i o n a la l k 址锄da c i d c a t a l y s i so nm es ) ，n 廿l e s i so fb i o d i e s e l ，也ee n z y m a t i co n eh a ss 0 m ea d v a n t a g e ss u c h 嬲i n i l d c o n d i t i o n ，n ow a s t e w a t e ra n de a s i l ys e pa m ：t i i 冯t h em a c t a 】n t s i n 吐l i s 怔s i s ，f i r s t l y ，丘l t e r 廿1 el i p a w h i c hi se n z y m a t i cs y n m e s i s0 fb i o d i e s e ia n d c o m p a r i s 0 n so f 觚陷e s t e r i f i c a t i o no fp a h no i lt 0b i o d i e s e lc 削y 乙e db yt h r e ed i 能r c n tl i p a s e s o fe n z y m a t i cs ) ，刀曲e s i so fb i o d i e s e la n dl i p a s ew k c hi se n z ) ，m a t i cs y n _ 吐l e s i so fb i o d i e s e lb y f o n n e ri n _ v e s t i g a t o r s f i n d 慨p b 0 l ll i p a s el 刚eu p p e rc a t a l y s et r a i ta n d 恤nt 1 1 r o u g hs m 酉e 觚0 rd e s i 嘶n ge x p 甜m l 斌，廿1 ee 伍酏t so ft e m l 掰豫聆，e n 巧1 ed o s a g e ，a d d i 6 0 n 缸c s ， s o l v e ma m o 眦吨双i b s t r a ：t em o l 盯蒯o ，锄dw 撕锄o 1 to n 玳翮 1 t a g ew e i g h tc o n v e r s i o nt 0 o i lm 砒y le s t e r 袱鹏s t u d i e da i l d 也ec o m p o n e n to f 芦o m l c t 髑a l l a l ) ，z e d t h er e s u l t ss h o w m a l 吐i ef i t t i n gr e a c t i o nc o n d i t i o n sf o r n l ep b 0 1 1l i p a s ec a t a l y s i i 培也es 0 y b e 纽o i la r e3 5 ， lo o fe r 嗡m l ed o s a g e l a t i v et 0o i lq u m i 妫，a d d i t i o nf - 0 r3t i i n e s ，s o l v e n t 锄o u mw 觞 3 0 m la n dw a = 嘧锄o u n t 诫略0 ( r e l 撕v ct oo i lq u a l i 动，1 5 ：lo fs u b s 雠t em o l a rr a t i o n 哈 c 0 n v e r s i o n 豫：t ec a nr e a c h9 3 2 1 n ep r ( d u 以0 no f 唧a t i cb i o d i e l s 也r o u 曲p b o l1l i p a s e 倒m y z e dc h e i n i c a l r e a c t i o n6 o ms o y b e a no i lw 觞o p t i m i z e db y 也er e s p 0 璐s u 血c em e 也0 d ( r s m ) 1 k 佗a c t i o n c o n d i t i o 璐a f l 沁c e d 吐地b i o d i e s e l sp r o d u c t i o n 谳鹏s t i l d i c du s i i l g l ec c r dm 甜l ( ) do fs i 】( f k t o r s 锄df i 、，e l e v e l s ，t l l eo p t i l n a lo p e 髓- t ep a r a m e t e 墙a n dm a i l d ye f f 融f a c t o r sw e r e c 0 i 血n e d 1 kr e s u l t ss h o w e dn l eo p t i i n u mr e a c t i o nc o n d i t i o w e r e ：11 5 o fe n z y n l e d o s a g e ，3 7 5 ，a n da d d i t i o n 矗x4t i m e s ，1 9 m ls 0 l v e n t 锄o u 咄2 5 w a t e r 锄0 咖呜l ：1o f s u b s t 瑚i ：t em o l a r 础o u n c i e rt h o s ec o n d i t i o n s ，也ec o n v e r s i o n 瑚晡oc a nr e a c h9 6 8 9 a c c o r d i n gt 0 l e c t i c 蚵o fl i p a s ef o ro i l s ，t h ep r o d u c t i o no f 朗z ) ，l a t i cb i o d i e s e l sm r o u g h p b o12c o m p o s i t el i p a s ec a t a l y z e dc h e 血c a lr e a c t i o n 舶ms o y b e 缸o i l ，p a ho i l ，p e 觚u to i l 觚dc o l z ao i lw 舔o p t i m i z e dw i mv a r i o uo fp i e c m i a r 也r i e s t h ee 丘e c to fe m ：y m e 锄0 u i l t 钯m p e 豫t u r e ，s o l v e n t ，i n h i b i t i o no fa l c o h o l ，w a t e rc o n t e n ：t ，n 1 0 l a r 觚oo fs l l b s 心a t e o n m - e s t e r i f i c a t i o nw e r es t u d i e di i ld e t a i l t h er e s u l ts h o w 也a t ，m ep r o d u c t i o no fe m ：y m a t i c b i o d i e s e l s 舶ms o y b e a no i l ，也ec o n v e r s i o nm t ec a i l 麟h9 7 5 8 ；n l ep r o d u c t i o no f e n 巧m a t i cb i o d i e s e l s 矗o mp a h no i l ，也ec o n 、r e r s i o nr a t ec 强r e a c h9 6 4 0 ；t h ep r o d u c t i o no f e n z y m a t i cb i o d i e s e l s 舶mp e a i l u to i l ，m ec 0 n v e r s i o nm t ec 觚r e a c h9 8 2 0 ；也ep r o d u c t i o no f e r 坷m a t i cb i o d i e s e l s 缸i mc o l z ao i l ，t h ec o n v e r s i o nr a t ec a nr e a c h9 3 5 4 ni so b v i o l l st h a t p b ol2c 0 m p o s 沁l i p 鹤eh a v e 锄u p p e rc o n v e r t i o nr a l ew h e n “c a ：t a l y s e sv 撕o u sa x u i l g e t 0a c e r t a i ne x t e n t “e l i n l i n a 钯m ep r o b l e mo fi i i i l i t e dm a t 耐a l 趾do p e no u tan e w s p e c i f i cl i p a s e f o rb i o d i e s e la n dl a y 恤a c a d e 商cf o u i l d a ：t i o n f o r 也e 砌u s 仃yo fb i o d i e s e l ，w 1 1 i c hi s s ) ，工l 血e s i z e db yt h ec 浏y s e de 妇町俯cm e n l o d k e y w o r d s ：b i o d i e s e l ；乜a n s e s t e r i f i c a t i o n ；聆s 】n s es l 】r f a c e ；l i p 舔e - 符号说明 意义 某脂肪酸甲酯的质量分数 内标的重量 生物柴油样品的重量 样品中某脂肪酸甲酯组分的峰面积百分比 十三酸甲酯的峰面积百分比 样品中某脂肪酸甲酯被测组分的校正因子 十三酸甲酯的重量校正因子 摇床转速 脂肪酸甲酯 气相色谱仪 单位或量纲 m g m g r m i n 。l 口丐 朋 r 、 错孵 4以石石 ， 胁 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和 相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本 论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也 不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个 人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：蚴红 学位论文使用授权说明 2 口口孑年s 只| ab 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 击口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) ：一唧圾绷胛日 生物柴油专用脂肪酶的研究 1 1 引言 第一章绪论 能源短缺和环境污染是目前人类社会所面临的巨大挑战，为了维持各自国家经济 的可持续发展，许多国家政府正大力开发能源的可替代产品，而生物燃料的应用和推广 正是现阶段解决能源替代问题的最佳手段【l j 。 1 9 9 1 年美国大气保护法要求颁布降低柴油燃料中的硫含量及尾气排放量法令同时 欧盟为了履行“京都议定书 中减少c 0 2 排放以减轻地球温室效应的承诺。在这种情形 之下，各国发展了各种可替代能源如生物乙醇、生物柴油等。但是在这些资源中，来源 于动植物油脂的生物柴油证明是一种非常好的燃料替代品【2 】。由于生物柴油是油脂中的 三甘酯和甲醇的酯交换反应的产物，因此生物柴油中含硫量极少，燃烧以后减少了s o x 的排放量；不含有芳香族化合物，p a h 污染也大大降低；且其中的有机碳最初都是通过 光合作用合成的，所以使用生物柴油不会引起大气中的c 0 2 的增加，也就不会产生温室 效应f 3 硼。所以说生物柴油是典型“绿色能源 ，大力发展生物柴油对经济可持续发展， 推进能源替代，减轻环境压力，控制城市大气污染具有重要的战略意义。 1 2 生物柴油概述 生物柴油于1 9 8 8 年诞生，由德国聂尔公司发明，它是以菜籽油为原料，提炼而成的 洁净燃油【1 1 。现在人们认为生物柴油就是长碳链脂肪酸单酰酯类物质，主要是甲醇或者 乙醇等短碳链醇和脂肪酸或者甘油三酯经过酯化或者酯交换来生产，商品化的生物柴油 最主要的成分是脂肪酸甲酯【8 】。生物柴油和石油柴油相比，具有可再生、易生物降解、 无毒、不污染环境等特点。它可以作为一个重要的新能源取代或者部分替代石油柴油【9 】。 1 2 1 生物柴油的性质 生物柴油主要是由c 、h 、o 三种元素组成其主要成分是软脂酸、硬脂酸、油酸、 亚油酸等长链饱和或不饱和脂肪酸同甲醇或乙醇等醇类物质所形成的酯类化合物，见图 1 1 。 生物柴油专用脂肪酶的研究 h 2 f 呱咄1 h 譬o o c r 2 + 3 购h i h 2 c 0 0 c r 3 c a t a l y s t r 1 c 咿r f ；= = = = 苎 r 2 0 r r 3 一c 0 0 r g i 删如a i c o l o i e s l e 陪 + e h 2 c o h g b ，o o i 图1 1 油脂酯化反应生产生物柴油 f i g 1 1b i o d i e lp 川u c e db yt f a e s t e f i c a t i o nr e 枷o n 与常规柴油相比，生物柴油来自于植物，属于可再生资源，因此它具有许多独自的 特性【1o ，1 1 】： ( 1 ) 作为可再生资源，与石油储量有限不同。它的原材料可以通过农业种植得到， 供应量不会枯蝎； ( 2 ) 十六烷值高，抗爆性能、燃烧性能好于石化柴油，燃烧残留物呈微酸性，使 催化剂和发动机机油的使用寿命加长； ( 3 ) 具有良好的低温启动性能； ( 4 ) 所含对环境造成污染的芳香族烷烃大大减少，致癌物质p h a 的排放极低，因 而可减弱对空气毒性和降低患癌率； ( 5 ) 由于生物柴油燃烧时所排放的c 0 2 远低于该植物生长时所吸收的c 0 2 ，所以使 c 0 2 的排放量减少，有利于改善温室效应现象； ( 6 ) 减少了发动机燃烧排放产生的碳烟：由于硫含量低，使得s 0 2 和硫化物的排放 低； ( 7 ) 闪点高，易于运输，储存使用； ( 8 ) 具有较高的运动粘度，在不影响燃油雾化的情况下，更容易在汽缸内壁形成 一层油膜，从而提高运动机件的润滑性降低机件磨损。使喷油泵、发动机缸体和连杆的 磨损率低，使用寿命长； ( 9 ) 生物柴油的含氧量高，使其燃烧时排烟少；但由于生物柴油的粘度高，因而 一般与石化柴油搀和使用。 1 2 2 生物柴油的生产方法 作为合成生物柴油的原料( 植物油和动物脂肪) 通常都是具有特定结构的脂肪酸甘油 酯。由于这些原料的主要成分脂肪酸甘油酯分子长链间的引力大，导致粘度较高，未被 生物柴油专用脂肪酶的研究 直接用作燃料，而一般人工合成生物柴油则能够解决天然油料存在的上述缺陷。生物柴 油的合成方法主要有直接混合法、微乳液法、高温热裂解法和酯交换法。其中酯交换法， 包括酸碱催化、酶催化、超临界催化和超临界介质中的酶催化等【1 2 】。而目前生物柴油主 要是用化学法生产，即用动物和植物油脂和甲醇或乙醇等低碳醇在酸或者碱性催化剂和 高温( 2 3 0 2 5 0 ) 下进行转酯化反应，生成相应的脂肪酸甲酯或乙酯，再经洗涤干燥即 得生物柴油【4 8 ，4 9 1 。 1 2 2 1 直接混合法 柴油机可以用过滤过的油炸过的油作为燃料。混合百分之九十五的用过的食用油和 百分之五的柴油可以作为燃料。用混合或预热的方法来补偿周围环境冷却的温度。这样 没有炼焦和堆积碳的问题。其重点就是过滤，据报道唯一的问题就是润滑油的粘污物( 粘 性会导致不饱和植物油的聚合) 【l 。每4 0 0 0 4 5 0 0 公里就需要被更换一次。 a d r l 粥等在1 9 8 3 年将脱乳的大豆油与2 号柴油分别以1 ：1 和1 ：2 的比例混合，在直接喷 射涡轮发动机上进行6 0 0 h 实验，结果l ：2 的未发现凝胶和变混的现象，并降低了燃料的粘 度，可用于农用机械的替代燃料【1 3 】。现在，各国通常采用5 一3 0 的混合比，其性能与 石油柴油的性能很接近。z i 白e w 晒等人【1 4 】将葵花籽油与柴油以1 ：3 的体积比混合，测得 该混合物在4 0 下的粘度低于4 8 8 1 0 6 m 矶，而a s t m ( 美国材料实验标准) 规定的最高粘 度应低于4 o x l 0 6 m s s ，因此该混合燃料不适合在直喷柴油发动机中长时间使用。而对红 花油与柴油的混合物进行试验则得到了令人满意的结果。但是在长期的使用过程中该混 合物仍会导致润滑油变浑浊。 1 2 2 2 微乳液法 微乳化法是将动植物油与溶剂混合制成微乳液。微乳液是一种透明的热力学稳定的 直径在l 1 5 0 砌胶体分散系，由两种不溶的液体与离子或非离子的两性分子混合形成。 1 9 8 2 年g o e 血g 等用乙醇水溶液与大豆油制成微乳液；z 砑e w s i 等用葵花籽油、甲醇、 丁醇制成乳状液f 1 5 1 6 1 。n i e u l 】舱等用表面活性剂、助表面活性剂、水、炼制柴油和大豆油 为原料，开发了可替代柴油的微乳液体系n 4 1 。 生物柴油专用脂肪酶的研究 1 2 2 3 高温热裂解法 裂解是指在无氧状态下加热后的降解过程。根据反应条件的不同，热解可分为三类： 常规热解、快速热解和闪式热解。 1 9 9 3 年，p i o c h 等人【1 6 】对植物油进行催化裂解生成生物柴油进行了研究。将椰子油 和棕桐油以s i 0 2 2 0 3 为催化剂，在4 5 0 裂解。裂解得到的产物分为气液固三相，其中 液相的成分为生物汽油和生物柴油。分析表明，该生物柴油与普通柴油的性质非常相近。 王一平等【1 7 】对植物油的热裂解作了一些尝试，以生物质为原料热解合成生物柴油的研 究主要集中在以下两方面：( 1 ) 以木材和农作物秸秆为原料的快速热解，所得生物柴油 的氢含量为6 2 ，氧含量为3 7 3 ；( 2 ) 藻类的慢速热解。吴庆余等【1 8 】利用微藻快速热 解合成生物柴油，得到的微藻快速热解油氢含量比木材或农作物秸秆的快速热解油高， 氧含量则较低，平均热值高达2 9m j l ( g ，是木材或农作物秸秆等的1 5 倍，同时也更稳定， 适宜于用作合成生物柴油的原料。 1 2 2 4 酯交换法 酯交换法是指以各种油脂和短链醇为原料，以酸、碱、酶等为催化剂，或者在超临 界条件下不使用催化剂进行酯交换反应合成生物柴油的方法。这里的油脂包括大豆油、 转基因大豆油、蓖麻油、桐子油、黄连木油、工程微藻油、动物脂肪、餐饮业废油脂、 工业废油和食用油废渣等。短链醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。酸性催化剂是硫 酸、磷酸或盐酸，碱性催化剂包括n a o h 、k o h 、各种碳酸盐以及钠和钾的醇盐，酶催化 剂一般是指脂肪酶，常用的超临界流体是甲醇和二氧化碳等。 ( 1 ) 酸催化 酸催化酯交换过程产率高，但反应速率慢，分离难且易产生三废。酸催化是普遍应 用于工业合成生物柴油的方法，在这方面已有很多报道【1 9 2 1 1 。宋庭礼等【1 91 利用高酸值 动植物油为原料，硫酸为催化剂，4 0 8 5 下反应，然后分相、脱色，得到生物柴油。 叶活动等【2 0 】利用废动植物油在硫酸催化作用下合成出生物柴油。林华超【2 1 1 以酸化植物 油、下水道油及回收煎炸油为原料，经酸催化反应得到生物柴油。反应结束后加入阻聚 剂硼酸减压蒸馏，所得到的生物柴油可替代0 4 柴油。f 砌讪m n i l 等人瞄1 研究发现，在 1 1 7 ，丁醇与大豆油物质的量比为3 0 ：l ，l h 2 s 0 4 条件下，脂肪酸丁醋产率达到9 9 需3 h ；而在6 5 ，等量的催化剂和甲醇条件下，脂肪酸甲酷产率达到9 9 需5 0 h 。 生物柴油专用脂肪酶的研究 尽管酸催化转酯反应比碱催化慢得多，但当甘油酷中游离脂肪酸和水含量较高时， 酸催化更合适。砧y 等人【2 3 】报导，当植物油为低级油( 例如硫化橄榄油) 时，在酸性条 件下可使转酯化反应更完全。 ( 2 ) 碱催化 碱催化酯化作用类似于皂化反应，不可逆，得率超过9 0 ，可在室温下进行，不腐 蚀设备。在工业生产中，碱催化法使用较多。 盛梅和郭登峰研究了以n a o h 为催化剂时，植物油与甲醇反应生成生物柴油的过程 中醇油摩尔比、催化剂用量和反应温度等操作条件对反应的影响，其结果表明，常温、 醇油摩尔比为6 ：1 、催化剂用量为原料油脂的1 0 是该反应的最适宜的操作条件【2 4 】。 舢c a n t a 瑚等【2 5 】在用c h 3 0 n a 为催化剂制备生物柴油过程中发现，在6 0 甲醇与油物质的 量比7 5 ：l ，加入质量分数为1 的c h 3 0 n a ，转速6 0 0 r i n i i l ，三种油脂基本转化完全。 碱催化时，反应速率比酸催化快。当油酸中游离脂肪酸和水的含量高时，酸催化比 碱催化效果好嘲。但酸碱催化中所使用的强酸和强碱对设备腐蚀严重，副反应多，后处 理复杂，环境污染严重。因此，人们致力于研制新型酯合成催化剂，如杂多酸、固体超 强酸、相转移催化剂、金属氧化物及无机盐类、生物酶、离子型有机金属化合物【2 刀。 ( 3 ) 酶催化 传统的酸碱催化制备生物柴油存在工艺复杂，醇消耗量大，产物回收难，环境污染 大等缺点。用脂肪酶代替传统酸碱的生物催化剂法具有条件温和、醇用量小、产品易于 收集，基本无污染排放等优点。新的研究表明，脂肪酶是一种生物催化剂，不仅能在油 水界面催化水解长链脂肪酸甘油酯，而且能有效催化酯化和酯交换反应嘲。脂肪酶具 有区域选择性，立体选择性，较高稳定性，抑制水参与的副反应，且酶本身不溶于有机 溶剂易于回收和利用，反应完毕后产物的分离纯化也较容易，尤其是它的立体选择性催 化特性，可完成用化学法难以进行的消旋化合物分离，不对称合成等【2 9 】。脂肪酶是一种 很好的催化剂与脂肪酸甘油酯的酯交换反应的催化剂。酶作为一种生物催化剂，具有较 高的催化效率和经济性，日益受到关注。 s o m a n o u 等研究了不同有机溶剂对酶催化葵花籽油的影响，非极性溶剂条件下转 化率达到8 0 ，而使用极性溶剂条件下转化率降至2 0 以下，在无溶剂条件下，甲醇与 油摩尔比为4 5 ：l ，p s e u d o m o i 粥酶催化效果最好，其转化率超过9 0 。1 怕i n a s 等公开了 一种方法，在m u c o r m i e h e i 等脂肪酶作用下，通过油脂和醇在作为溶剂的己烷中反应， 制备了生物柴油。杜伟等【3 0 】提出了以短链脂肪酸酯作为酰基受体，利用n o w 驰“3 5 酶 生物柴油专用脂肪酶的研究 催化动植物油脂进行酯交换反应，制备生物柴油。 游离的脂肪酶具有催化效率低，使用寿命短等缺点，目前使用较多的是固定化酶催 化酯化法。聂开立等【3 1 】探讨了以大豆油为原料，实验室自制固定化c 锄d i d as p 9 9 1 2 5 脂肪酶为催化剂，合成生物柴油，转化率达到9 2 ，固定化酶使用半衰期可达2 0 0 h 以上。 谭天伟等【3 2 】以菜籽油为原料，使用固定化c a n d i d aa n t a r c t i c a 脂酶作为催化剂，采取甲醇 分批加入法制备生物柴油，酯化率达到9 5 以上，固定化酶的半衰期至少达1 0 0 天。吴 虹等【3 3 】人探讨了无溶剂系统中固定化脂肪酶n o v o z y m 4 3 5 催化餐饮业废油脂来制备生物 柴油。q 趵u r 等p 4 】研究了固定化脂肪酶n o v o z y m 4 3 5 催化棉籽油的实验，在5 0 、酶用量 为油量的3 0 、油醇摩尔比为1 ：4 条件下，反应7 h ，酯化率达到9 1 5 以上。徐圆圆等【3 5 】 以大豆油为原料，固定化脂肪酶l i p o z y m et li m 为催化剂，酶用量为油的6 0 ，醇油摩 尔比4 ：l ，反应温度4 0 ，反应5 h ，得率可达9 2 。m a m o r u 在非水体系中【3 6 1 ，以固定化 假单胞菌脂肪酶为催化剂制取生物柴油。s l l i m a d a 和w a t a n a ：b e 等【3 7 】研究了以废食用油为 原料，采用二阶段固定化酶连续生产生物柴油技术，转化率大于9 0 ，酶可连续使用1 0 0 天。随着生物工程的发展，又开拓了超临界流体中酶催化反应这一新领域。可用于酶催 化反应的超临界流体有二氧化碳、三氟甲烷，烷烃类( 甲烷、乙烯、丙烷) 或无机化合物( 六 氟化硫、一氧化二氮) 等。其中，最常见的是超临界二氧化碳流体中酶催化反应【3 8 4 1 1 。 如沅新等【3 8 】研究了猪胰脂肪酶在超临界二氧化碳中催化仲丁醇和丁酸丁酯的酯交换反 应，反应1 2 h ，转化率可达4 1 4 7 ，明显高于以环己烷为溶剂反应的转化率1 9 6 6 。 a d s c 晰等 4 2 】利用超临界二氧化碳萃取的方法，将三辛酸甘油酯和油酸甲酯的酶催化反 应产物辛酸甲酯从反应体系中萃取出，转化率由原来的约6 0 提高到8 7 3 。超临界二 氧化碳具有无毒、不可燃、化学惰性好、易与反应底物分离和价格便宜等特点，且酶催 化酯交换反应可进行油酯改性，还可获得高附加值的油脂产品及富集具有生物活性的多 不饱和脂肪酸h 3 1 。 目前关于酶法催化合成生物柴油存在的主要问题是：脂肪酶在亲脂性有机溶剂 中存在着聚集作用，从而影响催化效率；反应中使用的短链醇对脂肪酶具有很大的 毒性；副产物甘油对酯交换反应体系有副作用；单一脂肪酶对原料有很大的选择 性，无法适应多种油脂的酯交换。 ( 4 ) 超临界催化 为解决化学法和生物酶法的缺点，国内外研究者正在开发在超临界条件下进行酯交 换反应的超临界流体技术。超临界催化是一种高效简便的方法，即在超临界流体参与 生物柴油专用脂肪酶的研究 下进行酯交换反应。在反应中，超临界流体既可作为反应介质，也可直接参加反应。超 临界反应是一个较新的研究尚不够深入的领域，但它具有众多优异特性，已引起越来越 多的研究者的注意，并已在很多化学领域应用【4 刀。 超临界流体对操作温度及压力变化具有很强的敏感性，从而可通过改变反应中的操 作条件来调节超临界流体的物理特性( 包括密度、温度、粘度、扩散系数、介电常数、 反应速率常数等) ，以进一步影响反应体系在超临界流体中的传质、溶解度及反应动力 学性能，从而改善产率、选择性及反应速率1 2 1 。s a k a s 等【4 5 】进行的试验是在锡浴加热的 管式反应器中，处于超临界状态的甲醇与菜籽油发生酯交换反应，醇油摩尔比为4 2 ：l ， 反应温度3 5 0 4 0 0 ，压力4 5 6 5 m p a ，反应时间2 4 0 s ，菜籽油转化率在9 5 以上。 d e i n i r b a sa y h a n m 】的试验是在高压釜中，处于超临界状态的甲醇与榛子油发生反应，摩 尔比为4 1 ：1 ，反应温度4 5 0 5 2 3 k ，压力4 5 6 5 m p a ，反应时间2 0 0 s ，椰子油转化率达到 9 0 以上。 综上所述，化学转酯化法生产生物柴油脂肪酸甲酯的转化率较高，但化学转酯化法 生物柴油柴油的问题在于工艺复杂，能耗高、易造成环境污染；生物酶法转酯化生产生 物柴油，工艺简单、反应条件温和、醇用量少、副产物少，目前，生物酶法生产生物柴 油脂肪酸甲酯转化率较化学法低，而且找到一种生物催化剂既可以提高生物柴油的转化 率和适应不同的油脂的酯交换又能提高脂肪酶的耐醇抑制作用将是目前生物酶法催化 合成生物柴油过程中所面对的重要问题。 1 3 国内外生物柴油的产业发展现状 目前，国际有十几个国家地区生产销售生物柴油。生产国有美国、欧洲成员国、阿 根廷、马来西亚、南联盟、印度、日本等【姗。 1 3 1 欧盟生物柴油的产业发展现状 鉴于植物生产过程吸收的c 0 2 远大于生物柴油燃烧排放的c 0 2 ，欧盟为了履行“京 都议定书中减少c 0 2 排放以减轻地球温室效应的承诺，同时也为了减少空气环境污染、 增加就业机会、保障其能源的可靠供应，从而大力推动生物柴油的发展【5 l 】。 欧盟已建立生物柴油工厂，规模最大的生物柴油工厂在意大利，生产能力达2 5 万吨 年。1 9 8 2 年，德国和奥地利首次在柴油机引擎中使用菜籽油甲酯。1 9 8 5 年奥地利建立了 广西大学硕士学位论文 生物柴油专用脂肪酶的研究 以常温、常压新工艺生产菜籽油甲酯的中试装置，并从1 9 9 0 年起以菜籽油为原料工业化 生产生物柴油。生物柴油在拖拉机中广泛试用、得到了一致的好评，成为生物柴油成功 走向市场的里程碑【5 2 1 。1 9 9 6 年德国和法国建立了生物柴油的工业化生产装置，并在 v o l k s w 毽e n 、a u d i 等小轿车中使用生物柴油作为发动机燃料；同年欧洲成立了以生产生 物柴油为主的生物柴油委员会，这表明了又一个新兴工业形成【5 2 】。1 9 9 1 年奥地利标准局 首次发布了生物柴油的标准，欧盟其他一些国家，如法国、意大利、捷克、和德国等也 相继建立了生物柴油标准【5 引。 1 3 2 美国生物柴油的产业发展现状 美国是最早研究生物柴油的国家。生物柴油在美国的商业应用始于2 0 世纪9 0 年代 初，联邦政府、国会以及有关州政府通过政令和法案，支持生物柴油的生产和消费，并 采取补贴等措施，使生物柴油产业迅速发展起来【5 4 1 。目前，美国已经有多家生物柴油生 产厂和供应商，生产原料主要以大豆油为主，年生产生物柴油3 0 万吨以上，并且生物柴 油的税率为零。美国在生产大豆生物柴油的同时，也积极探索其它途径生产生物柴油， 美国可再生资源国家实验室通过现代生物技术制成“工程微藻 。实验室条件下可以使 其脂质含量达到4 0 巧o ，预计每英亩“工程微藻”可年产6 4 0 0 l 1 6 0 0 0 l 生物柴油， 为生物柴油的生产开辟了一条新途径f 5 4 j 。 1 3 3 印度生物柴油的产业发展现状 印度的能源供需形势十分严峻。印度国内石油产量约为3 7 兆吨，而需求近1 2 0 兆吨 【5 5 1 。为了解决燃料危机，促进生物燃料的发展，印度政府建立了一个以d n 蒂瓦里主席 为首的生物燃料发展委员会。该委员会在2 0 0 3 年4 月向国家计划委员会提出了一个报告。 该报告提出了生物柴油目标：第一阶段，在2 0 0 3 2 0 0 7 年间，建立麻风树和水黄皮树种 植基地；第二阶段，在2 0 0 7 年 2 0 1 2 年，实现大规模种植麻风树，并把种植范围扩大到 全国，从而能够生产出足够多的植物油生产生物柴油【5 5 1 。麻风树项目对于印度而言具有 非同一般的意义，2 0 0 3 年8 月1 4 号，印度总理在独立日纪念会上称：“如果我们能启动 从植物中生产生物柴油的麻风树计划，那么就可能为3 6 0 0 万人提供就业，3 3 0 0 公顷贫瘠 干旱的土地就可以开垦油田。目前拥有1 2 亿人口的印度其中有4 亿劳动力，其中3 6 0 0 万人失业【l 】。同时印度又是一个快速发展中的国家，对石油的需求非常大。城市交通拥 生物豢油专用脂肪酶的研究 挤，空气污染十分严重。麻风树项目如果能如期实现，无疑是给印度的经济发展带来新 的希望。 1 3 4 巴西和日本生物柴油的产业发展现状 巴西是最早掌握生物柴油技术的国家，是c e 砸大学的e x p e d bp 黜教授于1 9 8 0 年研究成功的，但因生产成本过高，没有进行大规模生产。今年7 月2 日，巴西政府颁布 法令，重新启动生物柴油计划，以蓖麻籽为原料，第一个生物柴油冶炼厂预计在2 0 0 5 年 1 月投产，日产柴油5 6 0 0 公升。巴西科技部制订的目标是，到2 0 0 5 年生物柴油的掺和比 为5 ，至2 0 2 0 年达到2 0 【5 6 1 。日本1 9 9 5 年开始研究生物柴油，由于植物油资源贫乏，日 本主要以煎炸油为原料生产生物柴油，1 9 9 9 年建成了2 5 9 l d 生产生物柴油的工业化实验 装置，目前日本生物柴油年生产能力达4 0 万吨【5 4 1 。 1 3 5 中国生物柴油的产业发展现状 我国研究生物柴油始于上个世纪8 0 年代，由上海内燃机研究所和贵州山地农机所 联合承担课题，并对生物柴油的研究、开发做了大量基础试验探索。中国农业工程研究 设计院、辽宁省能源研究所、中国科技大学、河南科学陆军化学所等单位也都对生物柴 油作了不同程度的研究。近几年，北京化工大学、江苏石油化工学院、中国农业科学院、 华东理工大学、辽河化工厂、长春通达轻工技术研究所等科研院所也加入了生物柴油的 研究行列。已研制成功利用菜籽油、大豆油、米糠油、工业猪油、牛油及野生植物小桐 籽油等为原料的生物柴油生产工艺。但上述仅限于初步研究，未能形成生物柴油的工业 化生产【5 曰。 同时，我国长期能源形势十分严峻，且随着我国工业化的加快，能源需求却越来越 大。目前每年年耗能量达到标煤1 3 亿吨，而且每年以近2 0 增长。另一方面由于我国传 统石化能源在5 0 年后期，因储量减少而将大幅减产，面临枯竭，近年来大量依靠进口。 当前，国际形势和主要石油产地中东局势使得我国石油供应面临严重挑战和重大安全威 胁，如果现在不超前加快发展替代能源，届时很可能发生能源危机，波及我国经济和社 会安全与稳定。生物柴油在我国发展潜力巨大，将对保障我国石油安全、保护生态环境、 促进农业和制造业发展、提高农民收入和促进农业结构调整产生积极而重要的作用。当 前，我国仅有少数几家民营企业涉及生物柴油的研究开发和产业化，并形成了年产1 0 万 生物柴油专用脂肪酶的研究 吨的生产规模，如海南正和生物能源公司、四川古杉油脂化工公司、福建卓越新能源发 展公司。但由于我国生物柴油发展起步晚，技术力量薄弱，产品缺乏统一标准，竞争力 不强，更缺乏政府的扶持和鼓励。我国生物柴油发展虽面临机遇，但挑战巨大。因此， 如何像美国、德国那样，制订适合我国国情的生物柴油发展战略和相应政策措施，扶持 我国的生物柴油产业，直接关系到我国生物柴油的跨越式发展和国家的能源安全，特别 是石油安全【5 8 】。 为了促进我国生物柴油产业的发展，我国加紧对生物柴油标准的制定，于2 0 0 7 年5 月l 号，由国家标准化委员会发布的b l o o 生物柴油国家标准将正式实施【5 7 1 。这是我国生 物柴油的第一个国家标准，虽然只是推荐使用而非强制，但作为生物柴油产业正规化的 第一个标准，意味着这种替代能源将在官方认可下正式登场【5 7 1 。我国目前还正在组织制 定b 5 和b 1 0 生物柴油的国家标准，这是具体指导成品油零售系统的标准，以及将于明年 年底发布5 7 1 。 1 3 6 其他国家生物柴油的产业发展 韩国目前有年生产能力2 0 万吨的生物柴油生产厂；泰国发展生物柴油计划已于2 0 0 1 年7 月发布，并实施税收减免政策，第一套生物柴油生产装置已经投入使用；冈比亚已 在2 0 0 3 年上半年投产建设第一套以花生油为原料生产生物柴油装置，并获得政府支持； 保加利亚、加拿大、澳大利亚等国近年来也开始推广使用生物柴油【跏。 1 4 脂肪酶简介 脂肪酶是脂肪酶( e c3 1 1 3 ) 是一类可以催化甘油三酯合成和分解的酶的总称，是 一类特殊的酯键水解酶，脂肪酶作为生物催化剂可催化有不同底物出发的水解和合成反 应。它能催化天然油脂( 甘油三酯) 水解，产生脂肪酸和甘油，在水解过程中存在中间 产物甘油单酯和甘油二酯。用于催化合成生物柴油的脂肪酶主要是真菌类脂肪酶，这些 酶生产较为方便，和动物脂肪酶相比具有更高的活性。酯化反应中，所需酶制剂的筛选 指标主要是酶活力，酶的专一性( 位置专一性、底物专一性等) 刚。脂肪酶活性有水解 活性及酯化活性之分，不同的反应条件下，表现的活性是不同的。如水作溶剂时主要催 化脂类水解为相应的酸和醇，而在非水相( 有机相、超临界流体，无溶剂体系、微水体 系等) 中，水解反应明显不发生，然而却能催化醇、酸的酯化反应，这在水相中是热力 生物柴油专用脂肪酶的研究 学不利的反应【6 1 1 。 1 4 1 脂肪酶的分类 1 4 1 1 脂肪酶按专一性分类 从催化特性看，脂肪酶按催化特异性可以分为5 类，有底物选择性的脂肪酶；有位 置选择性的脂肪酶；无选择性的脂肪酶；有脂肪酸选择性的脂肪酶；有立体选择性的脂 肪酶【5 9 1 。 ( 1 ) 底物选择性的脂肪酶 底物专一性是指某种脂肪酶对特定甘油酯的偏好。如在消化过程中，甘油三酯的 水解是不完全的，产物甘油二酯可以迸一步水解成甘油单酯，但甘酯再水解的速度极慢， 因此甘油三酯是大多数动物脂肪酶的最适底物，而甘油单酯则是一种很弱的底物【6 2 】。 ( 2 ) 位置选择性的脂肪酶 位置专一性是指对底物甘油三酯中s n 1 ( 或3 ) 和s n 2 位酯键的识别和水解的反应 性。如：胰脂肪酶、黑曲霉和根霉的脂肪酶仅催化l ( 或3 ) 位酯键水解，而对2 位酯键 无作用，且先水解不饱和脂肪酸【6 3 1 。 ( 3 ) 无选择性的脂肪酶 一些脂肪酶对甘油三酯的酯键位置和脂肪酸不表现出差别，但是此脂肪酶极少，目 前只有发现少数的几种，如苹果青霉脂肪酶等【6 3 】。 ( 4 ) 脂肪酸选择性的脂肪酶 是指脂肪酶对不同碳链长度和饱和度的脂肪酸表现出特殊反应性。不同来源的脂肪 酶水解甘油三酯的脂肪酸专一性有很大的差别。例如圆弧青霉( p e i l i c i l l i u mc y c l o p i 啪) 脂肪酶对短链( c 8 以下) 脂肪酸，黑曲霉( 赴；p e 玛i l l u s l l i g e ) 和根霉( i m z o p u s ) 对中 等长链( c 8 c 1 2 ) 脂肪酸表现出强烈特异性【7 刀；a c h r o m o b a t e r i 眦l i l ) 0 l 如c 眦对饱和脂 肪酸表现出特异性【7 9 】，而来源于s t 印h y l o c o c c u s 觞r e u s 2 2