（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥pgabh和asprs的表达分析及功能鉴定.pdf

符号说明 j i i ii i ii llf l i ii i i ii i l y 17 8 6 4 7 3 a a r s ：a m i n o a c y l t r n as y n t h e t a s e ，氨酰一t r n a 合成酶 a b a ：a b s c i s i ca c i d ，脱落酸 a m p ：a m p i c i l l i n ，氨苄青霉素 a s p r s - a s p a r t y l t r n as y n t h e t a s e ，天冬氨酰一t r n a 合成酶 b p ：b a s ep a i r ，碱基对 c a m v 3 5 s 3 5 sp r o m o t e ro fc a l i f l o w e rm o s o i cv i r u s ，花椰病毒3 5 s 启动子 c d n a ：c o m p l e m e n t a r yd n a ，互补d n a c t a b ：c e t y l t r i m e t h y l a m m o l l o n i u mb r o m i d e ，十六烷基三乙基溴化铵 d d h 2 0 ：d i s t i l l e d a n td e i o n i z e dw a t e r ，重蒸水 d e p c ：d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸- - 7 , 酯 d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e ，二甲基亚砜 d n a ：d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，脱氧核糖核酸 d n t p - d e o c y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ，脱氧核糖核苷三磷酸 e b ：e t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭 e d t a ：e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 g r ：g l u t a t h i o n er e d u c t a s e ，谷胱甘肽还原酶 g u s ：1 3 - g l u c u r o n i d a s e ，p - 葡糖醛酸酶 h ：h o u r ，小时 k a n ：k a n a m y c i n ，卡那霉素 l b ：l u r i a b e r t a n im e d i u m ，l b 培养基 l e a ：l a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n ，晚期胚胎发生富集蛋白 l i a c ：l i t h i u ma c e t a t e ，乙酸锂 m i n ：m i n u t e ，分钟 m o p s ：3 一( n m o r p h p l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c ，3 - n 吗啉代丙磺酸 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 q r t p c r ：q u a n t i t a t i v er e a l - t i m e ，p c r 实时荧光定量p c r r n a s e a ：r i b o n u c l e a s ea ，核糖核酸酶a r p m ：r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e ，转分钟 r t p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p t a t i v ep c r ，反转录p c r s ：s e c o n d ，秒 s o d ：s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，超氧化物歧化酶 t e ：t r i s h c l ，e d t ab u f f e r ，t r i s c 1 、e d t a 缓冲液 t r i s ：t r i s h y d r y x y m e t h yl a m i n o m e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷 w ：w e e k ，周 x - g l u e 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y l - p - d g l u c u r o n i d e ，5 - 溴一4 - 氯一3 - 吲哚一p d - 葡糖甘酸 目录 中文摘要1 a b s t r a c t 3 l 前言5 1 1 脱落酸研究进展概述5 1 1 1 脱落酸的发现5 1 1 2 植物体中脱落酸的作用5 1 1 2 1 促进果实成熟一5 1 1 2 2 促进气孔关闭6 1 i 2 3 促进种子休眠8 1 1 2 4 提高植物抗干旱能力1 0 1 1 2 5 提高植物的抗低温能力1 1 1 1 2 6 提高植物对盐胁迫的抗性1 2 1 1 2 7 提高植物的抗缺素能力1 3 1 1 3 脱落酸受体研究进展1 4 1 2 氨酰t r n a 合成酶1 6 1 2 1 氨酰t r n a 合成酶的结构及分类1 6 1 2 2 氨酰t r n a 合成酶的功能2 0 1 2 2 1 参与基因表达调控2 0 1 2 2 2 调节r r n a 合成2 1 1 2 2 3r n a 剪切细胞因子2 2 1 2 2 4 抑制细胞凋亡2 2 1 2 3 天冬氨酰t r n a 合成酶的研究进展2 2 1 3 本研究的目的与意义2 2 2 材料与方法2 4 2 1 实验材料2 4 2 1 1 植物材料2 4 2 1 2 菌株与质粒2 4 2 1 3 酶与各种生化试剂2 4 2 1 4 实验用的引物2 4 2 2 实验方法2 6 2 2 1r n a 的提取2 6 2 2 1 1 利用t r i z o l 法提取r n a ：2 6 2 2 1 2 利用通用植物总r n a 提取试剂盒( 离心柱型) 提取r n a ：2 6 2 2 2r n a 中基因组d n a 的去除2 7 2 2 3r n a 反转录2 7 2 2 4 拟南芥基因组d n a 的提取( 小量法) 2 7 2 2 5 拟南芥p g a b h 和a s p r s 序列的扩增2 8 2 2 6 凝胶电泳中d n a 片段的回收：2 8 2 2 7d n a 片段与克隆载体的连接2 9 2 2 8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化2 9 2 2 8 1 大肠杆菌感受态细胞的制备2 9 2 2 8 2 大肠杆菌细胞的转化3 0 2 2 9 克隆载体的酶切鉴定3 0 2 2 1 0 质粒d n a 的提取3 0 2 2 1 0 1 碱法小量质粒d n a 的提取3 0 2 2 10 2 碱法大量质粒d n a 的提取3l 2 2 1 l 表达载体的构建31 2 2 1 2 植物表达载体的转化。3 2 2 2 1 2 1 根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 、g v 3 1 0 1 感受态细胞的制各3 2 2 2 。1 2 2 冻融法转化农杆菌3 2 2 2 1 3 农杆菌的培养3 3 2 2 1 4 农杆菌介导的拟南芥转化3 3 2 2 1 5 农杆菌介导的洋葱表皮细胞转化3 3 2 2 1 6 转基因拟南芥p c r 检测3 4 2 2 1 7p c r 鉴定突变体纯合植株3 5 2 2 1 8q r t p c r 3 5 2 2 1 8 1q r t p c r 引物设计3 5 2 2 18 2q r t p c r 反应条件。3 6 2 2 1 9 转基因拟南芥植株g u s 组织化学染色分析3 6 2 2 2 0 叶绿素含量的测定3 7 3 结果与分析3 8 3 1 尸g 爿b h 的启动子分析3 8 3 2p g a b h 的表达分析3 8 3 3p g a b h 在拟南芥中的功能鉴定4 0 3 3 1p g a b h 缺失突变体p g a b h _ ，及互补突变体植株的获得4 0 3 3 2a b a 抑制p g a b h ，子叶初期生长4 1 3 3 3 子叶生长初期a b a 处理使p g a b h 表达下调4 3 3 3 4p g a b h 影响拟南芥植株发育及开花时间4 3 3 3 5p g a b h 对拟南芥中开花相关基因的调控4 4 3 4a t a s p r s 的组织表达分析4 5 3 5a t a s p r s 在拟南芥中的功能鉴定4 6 3 5 1a t a s p r s 超表达植株的表型4 6 3 5 2a t a s p r s 超表达植株中叶绿素含量测定4 8 3 6a t a s p r s 超表达植株的表达谱分析4 9 4 讨 仑5 2 4 1p g a b h 介导了a b a 调控子叶初期生长过程5 2 4 2p g a b h 调控拟南芥开花时间5 2 4 3a s p r s 在拟南芥中的功能探究5 3 5 结论5 4 6 参考文献5 5 7 附录6 6 8 致 射6 8 9 攻读学位期间发表论文情况6 9 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 拟南芥p g a b h 基因( p o s tg e r m i n a t i o na b a h y p e r s e n s i t i v eg e n e ) 是 一个功能未知的基因。另外，氨酰t r n a 合成酶是一类催化特定氨基酸或 其前体与对应t r n a 发生酯化反应而形成氨酰t r n a 的酶。近年来的研究 表明，氨酰t r n a 合成酶还具有基因表达调控、调节氨基酸合成、信号传 导等方面的功能。天冬氨酰t r n a 合成酶( a s p r s ) 属于i i 类氨酰t r n a 合成酶，目前关于a s p r s 在植物体中的新功能的研究尚未有报道。因此 本实验从拟南芥p g a b h 基因的缺失突变体p g a b h 和a t a s p r s 超表达植 株入手，首次对拟南芥中p g a b h 的功能和a t a s p r s 的新功能进行了初步 探讨，为揭示研究两基因的功能和作用机理奠定了良好的基础。 对于p g a b h 的研究结果如下： 1 p l a n t c a r e 分析发现p g a b h 启动子中含有一个与a b a 信号响应 相关的a b r e 1 i k e 元件，还含有与光调控有关的a a a c 元件，g - b o x 元 件和s p l 元件等。通过g u s 染色和q r t - p c r 的方法研究其组织表达模式， 发现p g a b h 主要在拟南芥地上绿色组织，花器官中的柱头和花药中表达。 q r t - p c r 结果还表明p g a b h 在子叶生长初期表达量急剧升高，但a b a 处理抑制其表达。这些结果表明p g a b h 可能参与了a b a 介导的子叶初 期生长和光调控的开花过程。 2 为了研究该基因的功能，我们获得了p g a b h 缺失突变体p g a b h j 。 对突变体进行萌发实验，结果表明a b a 抑制突变体p g a b h j 子叶生长初 期的绿化过程。 3 p g a b h j 在长日照条件下表现出叶片小，开花提前等表型，对开花 相关基因进行了r t - p c r 分析，结果表明p g a b h 缺失突变明显改变了开 花基因c o 和f 丁的表达，说明p g a b h 对开花时间的影响可能是通过调 节c d 和刀的表达来实现的。 对于a t a s p r s 的研究结果如下： 1 通过g u s 染色和q r t - p c r 的方法对a t a s p r s 启动子进行组织表达 分析，发现a m s p r s 主要维管组织，茎尖生长点，侧根中表达。 2 正常生长条件下，a t a s p r s 超表达植株在在幼苗期幼叶黄化并最终 导致植株死亡；抽薹期黄化导致花序轴变短、结实率降低。不同转基 拟南芥p g a b h 和爿印船的表达分析及功能鉴定 因株系出现黄化表型的几率不同，表型的出现率与a t a s p r s 超表达量正 相关。叶绿素含量分析表明超表达a t a s p r s 使转基因株系的叶绿素a 含量 降低，表明a t a s p r s 超表达影响了叶绿素a 的合成或加速了其降解。 3 为了了解a t a s p r s 超表达植株黄化表型出现的原因，我们对 a t a s p r s 转基因植株和野生型植株进行了表达谱分析，结果表明黄化的 a t a s p r s 超表达植株体内有6 1 9 3 个基因的表达发生了显著的变化。这些 基因参与了胁迫响应，生长发育，生物及非生物刺激响应，蛋白质代谢和 基因转录等过程。其中检测到2 3 个叶绿体基因表达相关基因均呈现下降 趋势。这些结果进一步说明a t a s p r s 超表达影响了叶绿素的合成。 关键词：a b a ；天冬氨酰- t r n a 合成酶；未知功能基因；生长发育 2 山东农业大学硕士学位论文 e x p r e s s i o n a la n a l y s i sa n d f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no f p g a b ha n d a s p r s i na r a b i d o p s i s a b s t r a c t t h ea r a b i d o p s i sp g a b h ( p o s tg e r m i n a t i o na b ah y p e r s e n s i t i v eg e n e ) i saf u n c t i o n - u n k n o w ng e n e a m i n o a c y l - t r n as y n t h e t a s ei sa 虹1 1 do fe n z y m e w h i c hc a nc a t a l y z et h ee s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o nb e t w e e ns p e c i f i ca m i n oa c i d so r t h e i r p r e c u r s o r sa n dt h ec o r r e s p o n d i n gt r n a ，t o f o r m a m i n o a c y l t r n a r e c e n ts t u d i e ss h o wt h a tt h ea m i n o a c y l - t r n as y n t h e t a s ea l s oh a sf u n c t i o n so n r e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o n ，r e g u l a t i o no fa m i n oa c i ds y n t h e s i s ，a n ds i g n a l t r a n s d u c t i o n a s p a r t y l t r n as y n t h e t a s e ( a s p r s ) b e l o n g s t oc l a s si i a m i n o a c y l t r n as y n t h e t a s e ，t h e r ea r ef e ws t u d i e so nt h en e wf u n c t i o n so f a s p r si np l a n t s i nt h i ss t u d y , w eu s ep g a b h k n o c k o u tm u t a n tp g a b h - l a n d a t a s p r s - o v e r e x p r e s s i n ga r a b i d o p s i sp l a n t s t o a n a l y z e t h ef u n c t i o n so f p g a b ha n da t a s p r s t h em a i nr e s u l t sa b o u tp g a b ha r ea sf o l l o w s ： 1 p l a n t c a r ea n a l y s i sf o u n dp g a b h p r o m o t e rc o n t a i n sa l la b r e l i k e e l e m e n tw h i c hi sr e l a t e dw i t ha b as i g n a lr e s p o n s ea n da a a cm o t i f ，g - b o x ，s p l m o t i f , w h i c hi sr e l a t e dw i t hl i g h tr e s p o n s e t i s s u ee x p r e s s i o np a t t e r na n a l y s i s s h o w e dp g a b h m a i n l ye x p r e s s e di nt h eg r e e nt i s s u e so fa r a b i d o p s i s t h e e x p r e s s i o no fp g a b h i n c r e a s e ds h a r p l yd u r i n ge a r l yc o t y l e d o ng r o w t h ，a b a t r e a t m e n ti n h i b i t e di t si n c r e a s e t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep g a b hm a yb e i n v o l v e di nt h ea b a m e d i a t e de a r l yc o t y l e d o ng r o w t ha n dl i g h tr e g u l a t i o no f f l o w e r i n gp r o c e s s 2 t os t u d yt h ef u n c t i o no fp g a b h , w eo b t a i n e dp g a b hk n o c k o u t m u t a n t sp g a b h j t h eg e r m i n a t i o ne x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a ta b a i n h i b i t e dt h ee a r l yc o t y l e d o ng r e e n i n gp r o c e s so f p g a b h 一 3 p g a b h 一，s h o w e ds m a l ll e a f , e a r l yf l o w e r i n gp h e n o t y p e si nl o n g d a y c o n d i t i o n s r t - p c rr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e l e t i o no fp g a b ha l t e r e dt h e e x p r e s s i o nl e v e l o fc oa n df t , i n d i c a t i n gt h a tp g a b hm a yr e g u l a t et h e e x p r e s s i o no fc o a n df tt oa f f e c tf l o w e r i n gt i m e t h em a i nr e s u l t sa b o u ta t a s p r sa r ea sf o l l o w s ： 1 t i s s u ee x p r e s s i o np a t t e r na n a l y s i ss h o w e dt h a ta t a s p r se x p r e s s e d m a i n l yi nv a s c u l a rt i s s u e ，a p i c a lp o r t i o na n dl a t e r a lr o o t s 2 a t a s p r s - o v e r e x p r e s s i n ga r a b i d o p s i sp l a n t s s h o w e dp h e n o t y p eo f e t i o l a t i o n ，s h o r ti n f l o r e s c e n c ea x i s ，a b o r t i o na n de v e n t u a l l yd e a du n d e rn o r m a l c o n d i t i o n s t h ep h e n o t y p eo c c u r sm a i n l yd u r i n gt h es e e d l i n gs t a g e ，b o r i n g a n ds i l i q u em a t u r i t y t h ee m e r g e n c er a t eo fe t i o l a t i o n i sr e l a t e dt ot h e e x p r e s s i o nl e v e lo fa m s p r s c h l o r o p h y l lc o n t e n ta n a l y s i s s h o w e dt h a tt h e l e v e lo fc h l o r o p h y l law a sd e c r e a s e di no v e r e x p r e s s i o na t a s p r st r a n s g e n i c p l a n t s ，t h eo v e r e x p r e s s i o no fa t a s p r sa f f e c t e dt h es y n t h e s i so fc h l o r o p h y l l 如 o ra c c e l e r a t ei t sd e g r a d a t i o n 3 t h em i c r o a r r a yd a t ad i s p l a y e dt h a t ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l so f6 913g e n e w e r ec h a n g e e ds h a r p l y t h e s eg e n e sa l ei n v o l v e di ns t r e s sr e s p o n s e ，g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t ，b i o l o g i c a l a n da b i o t i cs t i m u l u sr e s p o n s e ，p r o t e i n m e t a b o l i s ma n dg e n et r a n s c r i p t i o np r o c e s s t h e r ew e r e2 3c h l o r o p l a s tg e n e e x p r e s s i o ns h o wad o w n w a r dt r e n d t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t et h ea t a s p r s o v e r e x p r e s s i o na f f e c t st h es y n t h e s i sa n dd e g r a d a t i o no fc h l o r o p h y l l k e yw o r d s ：a b a ；a s p a r t y l - t r n as y n t h e t a s e ；f u n c t i o n u n k n o w ng e n e ； g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t 4 山东农业大学硕士学位论文 1 前言 1 1 脱落酸研究进展概述 1 1 1 脱落酸的发现 脱落酸( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) ，与生长素、乙烯、赤霉素、细胞分裂 素并列为植物五大类激素。1 9 6 3 年脱落酸首次由a d d c o t to h k u m a 等人从棉 花幼果中提取到，1 9 6 5 年确定了其平面化学结构式，1 9 6 7 年在第六届国际 生长调节物质会上被正式定名。此后在深入研究其植物生理活性及应用前 景方面，各国科学家作出了长期不懈的努力( 谭红等，1 9 9 7 ) 。 1 1 2 植物体中脱落酸的作用 1 1 2 1 促进果实成熟 早在1 9 7 3 年，c o o m b e 等在研究葡萄果实成熟时发现，随着果实的成 熟，其中a b a 含量逐渐升高( c o o m b ebg 等，1 9 7 3 ) ，此后在柑桔等果 实成熟过程中也发现类似现象( g o l d s c h m i d tfe 等，1 9 7 3 ) 。外源a b a 可促进葡萄、草莓等果实提前成熟( c o o m b ebg 等，1 9 7 3 ；k a n oy 等， 1 9 8 1 ) 。多年来的研究表明，a b a 对非乙烯跃变型果实的成熟起关键作 用( k a n oy 等，1 9 8 1 ；c o o m b ebg 等，1 9 9 2 ) 。因此，不少学者推论： 在非跃变型果实成熟的启动中a b a 可能起主导作用。 a b a 对果实成熟的生理效应主要表现在以下3 个方面。一是促进果 实糖分的积累。研究发现，a b a 可抑制筛管的细胞膜a t p 酶活性，降低 膜两侧的质子梯度，从而促进蔗糖的卸出( 沈毓渭等，1 9 9 2 ) ，此外， a b a 可提高转化酶的活性( a c k e r s o nrc 等，1 9 8 5 ) 这些转化酶常被结 合于细胞壁，催化筛管中卸出的蔗糖水解为己糖，然后进入库细胞。a b a 可提高库细胞质膜上h + a t p a e s 活力( h u a n gjz 等，1 9 9 6 ) ，促进质子 蔗糖的同向运输，从而促进蔗糖风同化物进入库细胞。a b a 可提高葡萄 糖异生酶的活性( c o o m b ebg 等，1 9 8 9 ) ，从而促进果肉细胞内有机酸 向糖的转化，改变果肉组织的糖软化，提高果实甜变。第二，促进果实的 软化。外源a b a 可提高果胶酶和纤维素酶的活性( 吴有梅等，1 9 9 2 ) ， 拟南芥p g a b h 和a s p r s 的表达分析及功能鉴定 从而促进柑桔、草莓等果实的软化与成熟。第三，促进果实着色。a b a 可促进柑桔、葡萄等果实的着色( c o o m b ebg 等，1 9 7 3 ；r i c h a r d o ng r 等，1 9 9 5 ) ，其原因是a b a 可提高色素代谢有关的酶，如苯丙氨酸裂解 酶、多酚氧化酶等的活性( m a t s u s h i m aj 等，1 9 8 9 ) 。 1 1 2 2 促进气孔关闭 在干旱条件下，促进气孔关闭以控制水分散失，是脱落酸的一个重要 的生理功能。因水分胁迫，使叶水势下降，增大叶绿体膜对脱落酸的透性， 叶绿体渗出的脱落酸引起气孔关闭。叶肉组织叶绿体中储存的a b a 下降 后，会合成a b a 进行补充。有研究认为，a b a 调节气孔的作用是通过 根冠通讯进行的，即当土壤干旱时，失水的根系产生根源信号a b a 通过 木质部运到地上部调节气孔开度( d a v i e s 等，1 9 9 1 ) 。其作用效应是由于 a b a 在保卫细胞原生质膜外的自由空间起作用，关键是a b a 降低了a t p 。 质子泵的活力，切断了h + 和k + 的交换通道，使水分外渗膨压降低，气孔 关闭( m a c r o b b i e 等，1 9 9 8 ) 。旦水势恢复正常，叶绿体停止释放a b a ， a b a 合成速率即显著下降。 已有实验表明，a b a 可以刺激细胞质中c a 2 + 浓度升高。g r a b o v 等利用 钙的荧光指示齐i j f a r a 2 发现a b a 能诱导鸭跖草下表皮细胞的胞质中游离 c d + 浓度迅速升高，这种升高现象比气孔关闭现象更早( g r a b o va 等， 1 9 9 8 ) 。但是在缺钙的条件下，a b a 几乎不抑制气孔的开放，这表明在保 卫细胞内存在依赖c d + 信号的转导途径。但也有报道认为a b a 引起气孔 关闭并没有 c a 2 + 】c y t 增加的现象，说明存在着不依赖c a 2 + 的a b a 信号通 路( a l l a na c 等，1 9 9 4 ) 。 a b a 处理可以导致保卫细胞原生质体中4 ，5 二磷酸磷脂酰肌醇( p i p 2 ) 水平迅速降低和l ，4 ，5 三磷酸肌醇( i p 3 ) 的升高。在甜菜q h l p 3 既使c a 2 + 由液泡释放出去，增加胞质中c a 2 + 的浓度，又使质膜内向k + 通道关闭，减 少胞质中k + 的浓度，从而诱导气孔关闭( l e c k i ecp 等，1 9 9 8 ) 。另外有实 验证实蚕豆保卫细胞质膜上存在g 蛋白，利用g 蛋白激活剂可促进i p 3 水 平升高( g t e n o tk 等，1 9 9 1 ) ，表明g 蛋白活化磷脂酶c ，提高了i p 3 的水 平，因此g 蛋白可能处于a b a 诱导气孔关闭的信号转导途径的上游 6 山东农业大学硕十学位论文 ( a s s m a n ns m 等，1 9 9 3 ) 。 保卫细胞中还存在不依赖c a 2 + 而依赖h + 的a b a 作用途径，p h 梯度可 调节叶片中a b a 的分配和浓度，从而调节气孔的开度，因此旷也可能是 保卫细胞中的一个信使物质( h a r t u a gw 等，1 9 9 8 ) 。k w a k 等发现蛋白磷酸 酶l ( p p l ) 和p p 2 a 的抑制剂以及a b a 促进c a 2 + 通道的开放，表明a b a 信号 感应以及接收离子通道信号的功能是通过与质膜相偶联的蛋白激酶和蛋 白磷酸酶而实现的( 图3 ) ( k w a kjh 等，2 0 0 2 ) 。此外还有报道认为磷脂酶a 2 可以激活保卫细胞质膜k + 通道，并据此推测与磷脂酶a 2 相关的耦联系统 也参与保卫细胞a b a 信号转导( l e ey 等，1 9 9 4 ) 。另外利用膜片钳技术 发现蛋白磷酸化与脱磷酸化也参与气孔的信号转导( p e iz m 等，1 9 9 8 ) 。 因此，保卫细胞中a b a 的信号途径大致是：a b a 与质膜上受体结合， 激活g 蛋白，g 蛋白再活化磷脂酶c 而导致i p 3 释放。i p 3 一方面促使c a 2 + 从胞内钙库液泡释放进入胞质，另一方面促进胞外c a 2 + 通过阳离子通道 进入胞质，引起胞质c a 2 + 浓度升高。c a 2 + ( 或h 十) 激活外向k + 通道和阴 离子通道，关闭内向k + 通道，调节阴阳离子流动，降低细胞膨压，最终诱 导气孔关闭或抑制气孔开放( 图1 ) 。 图l 保卫细胞中a b a 应答相应信号调控模式图 f i g 1as c h e m a t i cv i e wo fs i g n a l sc o n t r o l l i n ga b ar e s p o n s e si ng u a r dc e l l s a b a 信号通路调节因子不断被鉴定出，脱落酸信号通路这一错综复 杂的“网络”正逐渐明确，促进脱落酸作用机制的研究。这一通路不是“孤 7 拟南芥p g a b h 和a s p r s 的表达分析及功能鉴定 立”的， 而是与胁迫反应以及其他植物激素信号途径紧密相连( z h uj 等， 2 0 0 2 ：f e d o r f f nv 等，2 0 0 2 ) ) 。s o n g 等提出a b a 诱导植株气孔关闭的信 号转导通路动力学模型，中断膜去极化、阴离子流出、肌动蛋白细胞骨 架重组、细胞质p h 增加、磷脂酸信号途径、激活质膜k + 通道等过程都引 起a b a 应答效应的减弱。整个a b a 诱导植株气孔关闭信号转导通路是 十分复杂的，任何一个小的外界刺激都会引起a b a 应答效应发生变化 ( s o n gl 等，2 0 0 6 ) 。 1 1 2 3 促进种子休眠 a b a 是维持许多植物种子正常发育的必要因素，是保证发育过程中 种子干物质和储藏蛋白质积累的重要植物激素。种子发育的全过程包括种 胚发育和种子成熟两个阶段。种胚发育起始于受精卵的细胞分裂，直至种 胚各部分基本建成的心形胚期。在种胚发育后期，多种贮藏物质开始积累， 种胚因细胞膨大而逐渐充满整个胚囊。种子成熟阶段受脱落酸信号诱导， 细胞分裂停止，贮藏物质进一步积累，获得脱水耐性，种胚进入休眠状态。 w a n g 等的研究结果表明，a b a 诱导种胚细胞内依赖周期蛋白的激酶抑制 物( c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s ei n h i b i t o r ，简称i c k l ) 的表达，使细胞周期停滞 于g 1 期不能进入s 期( w a n gh 等，1 9 9 8 ) 。l i u 等报道，番茄a b a 缺陷 型突变体成熟种子由于缺乏a b a ，使胚细胞不能受阻于g l 期，直接通过 s 期后停滞于g 2 期，因此比野生型种子具有更高比例的g 2 期细胞( 4 c d n a ) ，这些例证表明内源a b a 是使胚细胞停滞于g l 期所必需的信号 分子( l i uy 等，1 9 9 4 ) 。 a b a 在所有的种子中都有积累，或通过韧皮部由母体运输而来，或由 种子本身合成。通过野生型和a b a 缺陷突变体相互杂交的遗传分析表明， 大多数a b a 是在种子成熟期合成的( 洪克前等，2 0 0 4 ) 。k a r s s e n 等发现拟南 芥种胚在成熟过程中出现两个a b a 峰第一次a b a 积累发生在种皮中，通 过韧皮部由母体运输而来( k a r s s e n c 等，1 9 8 3 ) ，发生在在传粉后约l o 天。 第一次a b a 积累非常重要。在这期间f u s 3 和l e c 基因表达，防止胚胎细 胞分裂后期种子提前成熟。f u s 3 和l e c 基因调节种胚的生长与停滞，这 些基因的突变导致种胚和胚乳细胞分裂不停止，种胚持续生长，r a z 等报 山东农业大学硕士学位论文 道在细3 和尼c 突变体种子发育过程中，a b a 含量比野生型低3 倍，这使其 种子表现很高的胎萌性( r a z v 等，2 0 0 1 ；n a m b a r a e 等，2 0 0 0 ) 。接着 在胚和胚乳中有低水平的积累，第二次a b a 累积高峰累积量约为第一次 的1 3 ，这次积累依赖于胚自身的a b a 合成。而第二次a b a 积累对于种子 进入休h 民期至关重要。种子成熟后期a b a 含量下降很快，干种子中a b a 很少，a b a 合成基因的所有转录物都能在胚和发育的种子中检测到 ( m c c a r t ydr 等，1 9 9 5 ；f i n k e l s t e i n r r 等2 0 0 2 ) 。比较向日葵( l ep 等， 1 9 9 2 ) 、大麦( w a n gm 等，1 9 9 5 ) 、白花烟草( g r a p p i np 等，2 0 0 0 ) 的 休眠和无休眠种子内源激素的差异，可知种子休眠的维持还与吸胀过程中 a b a 的重新合成有关。k a w a k a m in 等发现3 个无休眠性的小麦突变体，其 a b a 含量正常，但其种胚失去对a b a 的敏感性( k a w a k a m in 等，1 9 9 7 ) ， 此p l l e c l 突变也严重降低了a b a 的敏感性( p a r c yf 等，1 9 9 7 ) 。 种子成熟阶段贮存物质的积累、晚期胚胎发生富集蛋白( l a t e e m b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n ，l e a ) 基因的表达均受到a b a 及转录因子 的协同调控，这些基因的启动子序列中均含有发育阶段特异的、组织特异 的a b a 应答元件( b u s kpk 等，1 9 9 8 ) 。通过酵母单杂交技术鉴定了许多与 这些启动子相互作用的d n a 结合因子。然而至今，仅对以下6 个转录因子 进行了遗传分析和功能鉴定( f i n k e l s t e i nrr 等，2 0 0 2 ) ：a b l 3 p 1 ，a b l 4 ， a b1 5 ，l e c l ，l e c 2 和f u s 3 ，它们均为a b a 诱导的或种子特异表达的基 因产物，其中a b l 3 v p l 在种子脱水耐性获得、种子休眠形成等过程中起 着关键的调控作用( h a t t o rit 等，1 9 9 4 ；s h i o t ah 等，1 9 9 8 ；l u e r s s e nh 等，1 9 9 8 ) 。a b l 3 v p l 分别为来自拟南芥和玉米的直系同源基因，其它 的直系同源基因还包括水稻o s v p l ( h a t t o rit 等，1 9 9 4 ) 、小麦t a v p l ( b a i l e ypc 等，1 9 9 7 ) 、燕麦a