（生物化学与分子生物学专业论文）非编码rna片段化方法的建立及验证.pdf

一塑鋈垩王查堂堡主堂垡笙壅 l l u li i ii ti ii l t l t li ii ii y 17 4 7 3 3 4 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口 ，在年解密后适用本版权书。 不保密口。 学位论文作者签名：术嘲 日期：州。年3 月西日 | j 强：避= 。i 指导教师签名：毒- ：一等 量。、+ ；0 薹? 虬。弩o 傅_ 日期：趾务弓月胛 浙江理工大学硕士学位论文 嘶弘理大学 硕士学位论文 非编码r n a 片段化方法的建立及验证 作者姓名杨娟 学科( 专业) 指导老师 生物化学与分子生物学 郭江峰教授 丁先锋副教授 所在学院生命科学学院 提交日期二零零九年十二月 中国杭州 i i i z h e j i a n gs c i t e c hu n i v e r s i t y m a s t e rd i s s e r t a t i o n d e v e l o p m e n to ff r a g m e n t a t i o nm e t h o df o rn o n c o d i n gr n aa n d i t sv e r l t l c a t l o n ，- j u a n y a n g d i r e c t e d 砂 p r o f e s s o rj i a n g f e n gg u o p r o f e s s o rx i a n f e n gd i n g c o l l e g eo fl i f es c i e n c e s ，z h e j i a n gs c i - t e c hu n i v e r s i t y d e c 2 0 0 9 h a n g z h o u ，c h i n a i v 浙江理工大学硕十学位论文 分类号： u dc ： 密级： 非编码r n a 片段化方法的建立及验证 论文答辩日期 銎i 旦：亟二! 了 答辩委员会主席 奎羞差逖 论文评阅人 耋耋塞壑垫 盏离 虱撇 茎鍪垦塾丛 答辩委员会成员 垒盘巡 妻永厚吾、懒搜 镣鸯 曷j 教授 v 浙江理_ t 大学硕士学位论文 课题来源 国家“8 6 3 计划项目资助项目( 2 0 0 7 a a 0 2 2 1 6 5 ) 浙江理下大学硕士学位论文 摘要 非编码r n a ( n o n c o d i n gr n a ，n c r n a ) 是一类缺乏保守性开放阅读框、不编码蛋白 质的一类r n a 的总称。建立高效快速的筛选n c r n a 方法将能更深入的研究n c r n a 。长片 段n c r n a 在自然条件下易形成复杂而稳定的二级结构，该二级结构是影响芯片杂交效率 的主要因素。为降低r n a 二级结构对芯片杂交的影响，需要对r n a 进行片段化处理。利 用适当的片段化方法获得合适长度的核酸片段( 2 0 2 0 0b p ) ，可以避免二级结构产生的负 面影响，提高杂交效率，增加芯片杂交的特异性。 本文以总r n a 为研究对象，在不同温度和时间下利用金属离子( m 9 2 + 、z n + 、n r ) 对总r n a 片段化进行研究，优化片段化方法。结果表明m 9 2 + 片段化总r n a 的大小集中 在2 0 2 0 0n t 。m 9 2 + 在9 5o c 下可以把总r n a 片段化集中在2 0 2 0 0n t ，其片段化总r n a 的 能力与时间有密切关系。在9 5o c 下片段化总r n a 的效果与在8 0o c 下相当。在7 0o c 下， m 9 2 + 片段化总r n a 不完全，5 s 条带清晰可见。m 9 2 + 片段化总r n a 时，时间不宜长于6 0m i n 。 z n2 + 片断化总r n a 的能力与温度有密切关系，在7 0o c ，可以获得2 0 2 0 0n tr n a 片段； 在9 5 。c 高温下获得2 0 一6 0n tr n a 片段。n a - 在相对低温下发挥作用，在3 7 。c 、4 7o c 即 可把总r n a 片段的范围集中在2 0 2 0 0n t 和2 0 6 0n t 的区间。本研究建立的片段化方法具 有经济、快速、高效等特点。 本文还建立了标记片段化后r n a 的方法。片段化试剂可以随机打断r n a 片段，r n a 片段断裂的位点是不确定的，致使片段化r n a 5 和3 端都有可能是磷酸基团。自然条件下， r n a 3 端是羟基，5 端是磷酸基团。r n a 通过羟基和磷酸基团的缩合反应，与接头r n a 连接。片段化r n a 先利用碱性磷酸酶进行去磷酸化处理，获得两端都是羟基的r n a 片段； 去磷酸化r n a 片段利用磷酸激酶进行5 端磷酸化处理，获得5 端是磷酸基团，3 端是羟 基的r n a 片段。经上述方法处理的r n a 片段具有天然r n a 的特征，可以有效的与r n a 接头连接。目的片段与接头长度相差越大，连接效率越低；反之，连接效率越高。为提高 连接效率，本实验通过割胶回收，获得较为均一的r n a 片段，以减少目的片段与接头r n a 大小之间的差距。经过修饰合成的双链r n a 接头可同时与天然r n a 两端进行连接反应， 处理后的r n a 片段具有天然r n a 特性可与已知序列的r n a 接头连接。连接后r n a 可进 行r t p c r 扩增，在p c r 反应时加入荧光染料c y 5 进行荧光标记。 通过覆瓦式芯片对r i b o s w i t c h 9 研究表明，片段化处理后的r n a 样品芯片杂交的信号 值总体高于全长r n a 杂交信号值。核糖体r n a 片段化处理后的信号值明显高于全长r n a 信号值。证实n c r n a 片段化，可以有效降低二级结构对芯片杂交的影响。本次实验初步 v t t v i i i 一定的技术支持。 浙江理，丁大学硕士学位论文 a b s t r a c t n o n c o d i n gr n a s ( n c r n a s ) a r ef u n c t i o n a lr n a sw i t h o u tc o n s e r v a t i v eo p e nr e a d i n g f l a m e st h a td on o tc o d ep r o t e i n s i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pa l le f f e n c i e n ts c r e e n i n gm e t h o df o r n c r n ar e s e a r c h t h el o n gn c r n a sc o u l df o r ma c o m p l e xs e c o n d a r ys t r u c t u r eu n d e rn a t u r a l c o n d i t i o n s ，w h i c hi st h em a i nf a c t o rt h a ta f f e c t sm i c r o a r r a yh y b r i d i z a t i o ne f f i c i e n c y i no r d e rt o r e d u c et h es e c o n d a r ys t r u c t u r ee f f e c t ，r n ai so f t e nh a v e nt ob ef r a g m e n t e dp r i o rt oh y b r i d i z a t i o n t h ef r a g m e n t a t i o no fr n a ( 2 0 2 0 0n t ) c a l la v o i dt h en e g a t i v ei m p a c to fs e c o n d a r ys t r u c t u r ea n d i n c r e a s et h eh y b r i d i z a t i o ne f f i c i e n c y t h et o t a lr n ao fc e l ll i n ew a su s e dt oo p t i m i z et h er n a f r a g m e n t a t i o nm o t h e db yu s i n g t h r e em e t a li o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm 9 2 + c o u l df r a g m e n tt h et o t a lr n aa tt h es i z eo f 2 0 2 0 0n t ；t h ec a p a c i t yo ff r a g m e n t i n gr n a b yz n z + w a sc l o s e l yr e l a t e dt ot h et e m p e r a t u r e ，a t7 0 o c ，g e n e r a t i n g2 0 2 0 0n tr n af r a g m e n t s ；a t9 5o cg e n e r a t i n g2 0 一6 0n tr n af r a g m e n t s n a + c o u l df r a g m e n tr n aa tar e l a t i v e l yl o w e rt e m p e r a t u r e ，a t3 7o cc o u l dp r o d u c er n a f r a g m e n t sa t s i z e so f2 0 2 0 0n t , a n da t4 7o cc o u l dp r o d u c er n a f r a g m e n t sa ts i z e so f2 0 6 0n t t h i sm e t h o d c a np r o v i d e se n o u g hf r a g m e n t e dr n a q u i c k l yt oh y b r i d i z ew i t l lo n eg e n o m e s c a l em i c r o a r r a y am e t h o df o rf l u o r e s c e n c e l a b l i n g o ff r a g m e n t e dr n aw a sa l s o d e v e l o p e d r n a f r a g m e n t a t i o nr e g e a n tc a nf r a g m e n tt h er n ar a n d o m l y t h ef r a g m e n t e dr n am a yh a v e p h o s p h a t eg r o u pa te i t h e r5 e n do r3 e n d u n d e rn a t u r a lc o n d i t i o n s ，3 e n do fr n ai st h e h y d r o x y lg r o u pa n d5 e n di st h ep h o s p h a t eg r o u p ，t h ef r a g m e n t a t i o nr n a s h o u l db et r e a t e db y t h ep r o c e s so fd e p h o s p h o r y l a t i o na tf r i s t a n dt h e nt h ef r a g m e n t e dr n as h o u db et r e a t e db yt h e p r o c e s so fp h o s p h o r y l a t i o n t h ep r o c e s s e dr n ac a nb el i g a t e d 、i 廿ld o u b l es t r a n d sr n aa d a p t o r a tt h es a m et i m e i no r d e rt oi m p r o v et h el i g a t i o ne f f i c i e n c y , t h es i z eo ff r a g m e n t e dr n a s h o u l d b ei nan a r r o we x t e n t t h eh o m o g e n e o u sf r a g m e n t e dr n a sc o u l db eo b t a i n e da f t e rr e c o v e r e d f r o mp a g eg e l a f t e rl i g a t i n gt h er n a a d a p t o r , t h ef r a g m e n t e dr n ac o u l db ec a r r i e do u tt o p c r a m p l i c a t i o na n dl a b e l e db yc y 5f l u o r e s c e n td y e s t h et i l i n ga r r a yo fr i b o s w i t c h 9s t u d ys h o w nt h a tt h ep r o c e s s i n gt e c h n i q u eo ff r a g m e n t a t i o n c o u l de n h a n c et h er n am i c r o a r r a ys i g n a l i tw a sn e c e s s a r yt of r a g m e n tn c r n at or e d u c et h e s e c o n d a r ys t r u c t u r ee f f e c t i nt h i se x p e r i m e n t , t h em e t h o do fp r o c e s s i n gn c r n as a m p l ew a s e s t a b l i s h e da n dp r o v i d e dc e r t a i nt e c h n i c a ls u p p o r tf o rn c r n ar e s e a r c h k e yw o r d s ：n c r n a ；f r a g m e n t ；t i l i n ga r r a y ；h y b r i d i z a t i o n 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 a b s t r a c t 目录 第一章文献综述1 1 1n c r n a 及其种类1 1 2n c r n a 的生物学特性2 1 3n c r n a 的作用机制3 1 4n c r n a 的功能3 1 4 1n e r n a 在转录水平的调控3 1 4 2n c r n a 参与r n a 的加工4 1 4 3n c r n a 参与蛋白水平的调控5 1 4 4n e r n a 与生物体的进化6 1 4 5n c r n a 与肿瘤的形成7 1 5n e r n a 的数据库资源8 1 6n c r n a 的研究方法9 1 6 1 用计算机软件预测n c r n a 9 1 6 2 用实验方法发现n c r n a 一10 1 7 生物芯片1 2 1 7 1 生物芯片的产生和发展一1 2 1 7 2 基因芯片的分类及特点。1 2 1 7 3 基因芯片的用途一1 2 1 8 研究的目的和意义1 3 第二章总r n a 提取与r n a 片段化的优化1 4 2 1 材料与方法1 4 2 1 1 实验样品14 2 1 2 试剂。1 4 2 2 细胞总r n a 提取l5 2 3 总r n a 的片段化1 5 2 3 1n a + 片段化总r n a 15 2 3 2z n 2 + 片段化总r n a 15 2 3 3m 9 2 + 片段化总r n a 。1 6 2 4 结果与分析。1 7 2 4 1 总r n a 提取结果1 7 2 4 2 总r n a 片段化方法优化18 2 ! ；d 、结：! ：! 第三章片段化r n a 的标记2 4 3 1 材料与方法2 4 3 1 1 材料。2 4 3 1 2 总r n a 样品2 4 3 1 3 试剂与酶2 4 3 1 4m 9 2 + 片段化总r n a 2 4 3 1 5p a g e 胶割胶同收2 4 3 1 6r n a 去磷酸化反应2 5 3 1 7r n a 纯化2 5 3 1 8r n a 的磷酸化反应2 5 3 1 9 双链接头的合成2 6 x 浙江理工大学硕士学位论文 3 1 1 0 小r n a 两端接头的连接反应2 6 3 1 1 1r t ( 逆转录) 2 6 3 1 1 2p c r 扩增2 7 3 1 1 3 荧光p c r 扩增2 8 3 1 1 4 玻片杂交2 9 3 2n c r n a 特异性探针设计2 9 3 3 结果与分析。3l 3 4 ，j 、结3 4 第四章利用基因芯片验证n c r n a 片段化结果3 5 4 1 材料与方法3 5 4 1 1 材料3 5 4 1 2 体外转录r i b o s w i t c h 9 3 5 4 1 3 片段化处理3 7 4 1 4r i b o s w i t c h 纯化一3 7 4 1 5 芯片实验方法。3 7 4 2 数据处理。3 8 4 3 结果与分析3 8 4 4 j 、2 寺4 0 总i 存4 2 参考文献4 3 附录1 重要溶液的配置 附录2u r e a p a g e 的具体步骤 致谢 x i 4 7 5 0 5 1 图1 1 人类基因组中的编码序列与非编码序列比例 f i g 1 1c o d i n ga n dn o n c o d i n gr n a i nh u m a ng e n o m e n c r n a 可以分为两大类：持家n c r n a 和调节n c r n a ( 图1 2 ) 1 4 。持家n c r n a 是细胞 正常功能必不可少的，这部分n c r n a 包括参与初级转录加工的所有种类r n a ；细胞核小分 子r n a ( s n r n a ) 是m r n a 前体剪接体的必要组分；核仁小分子r n a ( s n o r n a ) 参与r r n a 的加工，并指导r r n a 上特异位点的甲基化或假尿嘧啶化，是核仁小体的重要组分；r n a a s e p r n a 在t r n a 前体和r r n a 前体加工中发挥催化作用；指导r n a ( g r n a ) 是指导m r n a 编 辑的小i 斟a 分子，多用来指导在m r n a 转录产物中加入尿嘧啶( u ) 的过程【5 】。参与翻译 ( t r n a ，r r n a ) r n a 和翻译质控的t m r n a ，功能上既是t r n a ，又是m r n a ，翻译时既可 以转运氨基酸，又可当作模板；同样包括端粒酶相关r n a ，该r n a 充当真核染色体端粒复 制的模板；穹窿r n a ( v r n a ) 和参与细胞中分泌性蛋白的s p r r n a 。调控r n a 在生物体 中是短暂表达，这类r n a 包括参加转录调控n c r n a 、参与r n a 力h 工的n c r n a 、参与蛋白质 浙江理丁大学硕士学位论文 调控的n c r n a 。 厂j - 。 编码蛋白质的m r n a非编码蛋白质的转录物 厂上 调节功能的r n a持家r n a 1 2n c r n a 的生物学特性 图1 2 r n a 的分类1 4 l f i g 1 2c l a s s i f i c a t i o no fr n a 酶r n a n c r n a 的长度在2 2n t - 数千n t z 间变化，无论是短片段还是长片段n c r n a ，都具有以下 生物学特性： 1 无开放阅读框 、 短片段n c r n a 不存在开放阅读框，长片段n c r n a ，像n a m a ( n o n c o d i n gr n a a s s o c i a t e d w i t hm a pk i a s ep a t h y w a ya n dg r o w t ha r r e s t ) 、c u d r ( c a n c e ru p r e g u l a t e dd r u gr e s i s t a n t ) 等 也没有明显的开放阅读框，仅在m a l a t 1 ( m e t a s t a s i sa s s o c i a t e di nl u n ga d e n o c a r c i n o m a t r a n s c r i p t - 1 ) 基因上发现- - d 段开放阅读框，但没有实际意义，不能编码蛋白质i t - s 。 2 二级结构保守 n c r n a 的保守性主要体现在二级结构上，即保守的是碱基的配对信息而不是单一的碱 基序列。一些n c r n a 甚至在远亲物种也具有高度的保守性，这些n c r n a 在启动子区保守性 较划9 】：h 1 9 r n a 保守的二级结构是其实行功能的关键因素。 3 表达具有时空特异性 l i l l 4 仅在线虫幼虫第一时期特异表达，而l e t 7 仅在线虫幼虫第四时期表达，n c r n a 的 表达还具有组织特异性【协1 2 】。n r o n 基因在胎盘、肌肉、淋巴组织中均有明显表达，而在 心脏、甲状腺、肾上腺中几乎没有表达1 3 1 ；h 1 9r n a 在动物的发育过程中高表达，如在动 物的胎盘、胚胎等组织中均被检测到高表达。 2 浙江理：r 大学硕士学位论文 1 3n c r n a 的作用机制 n c r n a 的作用机制主要有以下五种方式【1 4 1 ，( 1 ) 通过碱基互补配对发挥作用，如 t r n a 、s i r n a 、m i r n a 等；( 2 ) 具有同其他核酸相似的结构，以二级结构形式发挥作用， 如t m r n a 可被认为是t r n a 或m r n a 而起作用；( 3 ) 空间阻隔，如细菌的r n a 聚合酶 将6 sr n a 识别为启动子，影响转录；( 4 ) 核酶的催化作用；( 5 ) 表观遗传修饰作用 ( e p i m o d i f i c a t i o n ) ，主要发生在基因印迹中，通过d n a 甲基化与组蛋白的共价修饰来调 控基因表达。 1 4n c r n a 的功能 r n a 曾被认为仅是d n a 和蛋白质之间的“过渡”，从d n a 获得遗传信息再转化为蛋白 质，起到遗传信息的“桥梁”作用。然而越来越多的研究表明，r n a 尤其是n c r n a 在生命 过程中扮演重要角色。n c r n a 通过三种方式( 鼢队d n a 、r n a r n a 、和r n a 蛋白质相 互作用) 实现对基因的调控。表1 3 y l j 举出近年来发现的n c r n a 的作用和功能【1 6 1 。 表1 3n c r n a 的功能1 1 6 i t a b l e l 3t h ef u n e f i o n so fn c r n a 曼兰垒望巳! 曼 一 至坚望竺! i 旦里 一 一一 e c o l i6 s r n am o d u l a t e sp r o m o t e ru s e h u m f l 17 s k r n a l n h i b i t st r a n s c r i p t i o ne l o n g a t i o nf a c t o rp t e f b h u m a ns r a r n as t e r o i dr e c e p t o rc o a c t i v a t o r h u m a nx i s tr n a r e q u i r e df o rx c h r o m o s o m ei na c t i v a t i o n h u m 赳r la i rr n a r e q u i r e df o ra u t o s o m a lg e n ei m p r i n t i n g h u m a nt e l o m e r a s er n a c o r eo ft e l o m e r a s ea n dt e l o m e r et e m p l a t e h u m a nu 2 s n r n ac o r eo fs p l i c e o s o m e e c o l ir n a s e p c a t a l y t i cc o r eo fr n a s ep c e r e v i s i a eu 18 c ds n o r n ad i r e c t s2 一o r i b o s em e t h y l a t i o no f t a r g e tr n a c e r e v i s i a es n r 8 h a c a s n o 鼢队d i r e c t sp s e u d o 砸d v l a t i o no f t a r g e tr n a z b r u c e ig c y bg r n ad i r e c t st h ei n s e r t i o na n de x c i s i o no fu r i d i n e s 最c o l i0 x vs r n a r e p r e s s e st r a n s l a t i o nb yo c c l u d i n gr i b o s o m eb i n d i n g e c o l id s r as r n aa c t i v a t e st m n s l a t i o nb yp r e v e n t i n gf o r m a t i o no f a ni n h i b i t o r y m r n as t r u c t u r e e c o l it m r n ad i r e c t sa d d i t i o no f t a gt op e p r i d e so ns t a l l e dr i b o s o m e s e c o l i4 5 sr n a i n t e g r a lc o m p o n e n to fs i g n a lr e c o g n i t i o np a r t i c l e 1 4 1n c r n a 在转录水平的调控 哺乳动物x i s t 基因经过转录、剪接产生特异分布于细胞核的多聚腺苷酸化长片段 n c r n a ，x i s tr n a 从转录位点开始顺式扩散到整条x 染色体并介导x 染色体失活，保持雌 3 浙江理工人学硕士学位论文 雄生物x 染色体的剂量平衡。x i s t 与染色质结合，诱导其组蛋白h 3 第9 位赖氨酸的甲基化、 低乙酰化，第4 位赖氨酸的低甲基化和h 4 蛋白的低乙酰化，从而改变染色体的形态，利于 调控因子结合，诱导x 染色失活。抑$ 1 j x i s tr n a 在活性x 染色体上的积累依赖于x 染色体反 义转录的t i s tr n a t r 刀；t i s tr n a 通过碱基互补配对影响x i s t 的活性。在果蝇中通过r o x r a n 诱使雄性x 染色体双倍转录。 基因组印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生修 饰，使带有亲代印记的等位基因具有不同的表达特性，这种修饰常为d n a 甲基化修饰，也 包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。h 1 9 基因是最早发现的一个印迹基因，由r n a 聚合酶 i i 转录产生多腺苷酸化的长n c r n a 。h 1 9 位于人染色体1l p l 5 5 上一组基因簇中，位于h 1 9 基因启动子上游2k b 大小的一段约2k b 区域对与h 1 9 和i g f 2 的印记起着调控作用。 7 s kr n a 是一段长为3 31n t 的保守性s n r n a ，在体内外抑制c d k 9 激酶活性和保护复原 p t e f b 到h 1 启动子上，从而抑制7 s k 和h i v 一1 t a t 的转录，p t z e b 的区域包含7 s k r n a ， 7 s k p t e f b 复合物表现出较低的蛋白激酶活性，抑制细胞的转录【1 8 l 。n r s e r e l 是一种双 链的s m r n a ，在神经细胞的分化过程中扮演着重要角色。该r n a 通过与转录因子 n r s f r e s t 相互作用，限制神经元干细胞向正常细胞转化，从而启动特定基因表达 1 9 1 。 n c r n a 在转录水平上的调控，一般是与转录因子相互作用，从而起到调控作用的：但也有 例外，如大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ，ec o l i ) 6 sr n a 通过与特定的酶相互作用，调节启动 子，进而调控基因表达。 1 4 2n c r n a 参与r n a 的加工 真核生物转录的m r n a 前体需经过加工才能形成成熟的m r n a ，成熟的m r n a 与蛋白 质结合以后才能发挥作用。s n r n a 在m r n a 前体剪接过程中起重要作用，s n r n a 与结合蛋 白s n r n p 形成剪接体，通过碱基互补配对与m r n a 结合，引起m r n a 结构变化，从而完成 对m r n a 的剪接。s n o r n a 在r r n a 的n t 和修饰中是必不可少的，其中u 3 、u 8 、u 1 4 的作 用至关重要1 2 0 1 。s n o r n a 存在于r r n a 前体甲基位点附近序列互补的区段，一般位于一段紧 接在称为d 框( db o x ) 上游5 个碱基的位置处，d 框是甲基化修饰酶识别的信号。r r n a 前 体每个被修饰的位点都有一个对应的不同的s n o r n a 。s n o r n a 除了指令r r n a 的化学修饰 外，还参与p o li i 和p o l1 i 转录的s n r n a 的修饰。含3 个c d 框s n o r n a 指导u 6s n r n a 的2 o 甲基化。g r n a 分子是通过正常的碱基配对途径或通过g u 配对的方式与m r n a 上的互补序 列配对，并在其中插入或删除尿嘧啶【2 l 2 2 1 。 4 浙江理工大学硕士学位论文 r r n a 特有的2 。o 甲基化核苷和假尿嘧啶修饰是s n o r n a 通过在修饰位点附近形成互 补碱基，由反义c d 框s n o r n a 指导r r n a 的2 o 甲基化核苷化；h a c a 框s n o r n a 指导r r n a 假尿甘酸化幽，2 4 1 。p r a d e r - w i l l i 综合症是一种先天性基因缺失病，k i s h o r e 2 5 1 等利用r t p c r 检测发现，相较于正常人，p r a d e r w i l l i 综合症患者缺失h b i i 5 2r n a ，h b i i 一5 2 是一种脑特 异的反义c d 框s n o r n a ，可以对p r e m r n a 的5 羟基色胺受体进行选择性剪切。p r a d e r w i l l i 患者含有不同与5 一h t 2 c r 的m r n a 亚型。r n a s e pr n a 对t r n a 前体5 端进行剪切加工，同 时核酶在r n a 自我裂解、自我剪接、肽键的形成以及染色体d a n 终端合成等过程中起着重 要作用。 1 4 3n c r n a 参与蛋白水平的调控 一些n c r n a 可直接与蛋白质结合，改变其生物学结构，从而直接影响其生物学活性。 在大肠杆菌中发现的t m r n a ，它包含一个模拟的t r n a 区和另外一个编码氨基酸序列区； 类t r n a 区可被丙氨酸t r n a 合成酶识别，并被氨基化。该区与延伸因子结合，进入核糖体 的a 位点，释放出错误的m r n a ，翻译重新开始一反式从t m r n a 内部的m r n a 片段开始，通 过在非正常的蛋白质增加一个附加的短肽标签，使其被蛋白酶所识别与降解。t m r n a 是存 在于细菌的一类稳定的n c r n a ，是t r n a 和m r n a 的组合体，t m r n a 的二级结构具有以下 特点：5 和3 末端的t r n a 样区域，有结合茎、t 臂和d 环，但无反密码颈环结构；m r n a 区 含有一段编码信号肽的开放阅读框，终止密码子位于发夹结构的后面；两个区域之间有4 个假结状结构p k l 一p k 4 【2 6 1 ( 图1 4 ) 。p r a s a n t h 等口7 1 研究发现，果蝇中的h s r - o d r n a 在h n r n p 的合成和构建中起到结构性和功能性的作用，同时还调控h n r n p 的转运。 浙江理工人学硕士学位论文 图1 4t m r n a 二级结构i 勰i f i g 1 4s e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft m r n a 1 4 4n c r n a 与生物体的进化 真核生物的基因都是断裂基因，基因间包含大量的非编码基因内含子，而原核生物基 因结构是连续的，不含内含子和外显子。比较同源基因的进化过程，发现内含子的异化大 于外显子，因此内含子在生物进化过程中起着非常重要的作用。但随着r n a 研究的深入， 生物复杂性方面大量差异不仅仅和内含子有关，同时与n c r n a 有着密切关系。ec o l i 中 n c r n a 基因的数量达2 0 0 个或更多，但不会超过全部基因数量的0 5 和转录产物的0 2 。 在高等生物中，大部分转录产物是n c r n a 。由于n c r n a 缺少开放阅读框，这使得n c r n a 可 以减少点突变的影响，在一定程度上承受进化压力，促进进化现象的发生。 当转录物产物数量超过一定阈值时，细胞内的内在监控系统就会发挥作用。利用特定 的酶降解与外基因同源的所有m r n a 降解，或者形成d s r n a 。d s r n a 产生r n a 指导的d n a 甲基化，导致转录水平基因的沉默。在进化过程中，生物体在对外基因转录产物降解的时 候，可能会对这些转录产物其进行一定的修饰，当这种修饰达到一定的程度，外基因就丧 失其模板的功能，而变成沉默基因，变成细胞内中基因组的内元。沉默的外基因增加受体 生物在选择上的优势，如增加基因重组的几率，大大增大生物体应对突变能力【2 9 1 。宋江华 1 3 0 1 等研究推测b c m f ll 与芸薹属植物物种间进化有关；h a m b e n g 等1 3 1 】利用组合n o 慨分 析，证实4 1 种短的非编码m i r n a 对脊椎动物进化提供一定的证据，这些m i r n a 仅在八日鳗 中发现，而在其他海鞘类动物中未发现，说明这些m i r n a 促进了生物体的进化；l e t - 7 家族 6 浙江理工大学硕士学位论文 在两侧对称动物中很保守，在非两侧动物中却未被发现，暗示l e t - 7 基因在低等后生动物向 高等两侧对称动物进化过程中发挥重要的作用；l e t - 7 最基本的功能就是通过抑制细胞而促 进细胞分化，形成组织、器官、成年动物的特定细胞表型。l e t 7 的出现有利于生物向更高 层次进化f 3 2 1 。m i r - 1 是另一个极为保守的短片段n c r n a ，在肌肉组织中特异表达，m i r - 1 的 出现是使肌肉发育的调节变的更为复杂，促进各物种形成特有的肌n f 3 3 1 。 1 4 5n c r n a 与肿瘤的形成 n c r n a 在生命过程中发挥重要作用，最近研究表明，n c r n a 参与肿瘤的发生。c a l i n t 3 4 1 等通过对1 8 6 个m i r n a 绘图和随机定位相比较，5 2 5 的而风位于基因脆性部位，而这些位 点与肿瘤形成有关。通过n o r t h e r n 印迹研究表明，一些m i r s 在肿瘤中低表达。m i r - 1 5 a 、 m i r - 1 6