（生物物理学专业论文）肌球蛋白ii单分子动力冲程的研究.pdf

原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文 已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得凼墓直太 堂及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 刊移论文作者签名：鲤至堑 日 期：丝f l 左! 三 指导教师签名： 在学期间研究成果使用承诺书 本学1 览论文作者冤全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古火学自权将学位论文的 全部内耜或部分保留并向国冢有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，九许编力有关数据库盏行 检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权q 二 者在学! 缸? ! 白j 取得的研究成果属丁阻豢古人学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成粜须 ， 征得内蒙占入学就读期间导师晌同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古人学方可投稿或公 开发表。 学位语文作者签名：_ ! 雌指导教师签名：牡 日期： 内蒙古火学硕十学位论文 肌球蛋白i i 单分子动力冲程的研究 摘要 在过去的十几年中，新的分子马达正以惊人的速度被发现。一个细胞中可 能包含近百个独特的分子马达。在所有的分子马达中，关于肌球蛋白的研究最 多。由于肌球蛋白和肌动蛋白的作用，粗丝和细丝相对滑动引起肌肉的收缩。 动力冲程是肌球蛋白工作循环过程中的核心概念，被认为是实现化学能转化为 机械能的过程。在传统的动力冲程概念中，动力冲程是一定值，而各种关于动 力冲程的测试值是不同的。针对这一矛盾，本文给出动力冲程一个新的概念， 利用动力冲程新概念对各种实验结果做了解释。 本文分为三部分，第一部分主要介绍肌球蛋白的分子结构、肌球蛋白工作 循环中的机械化学偶联，并对已有的肌球蛋白工作循环模型做了说明和比较。 第二部分主要介绍了肌球蛋白单分子动力学测试实验结果，指出实验结果与理 论的矛盾。第三部分是本文的核心内容，给出了肌球蛋白动力冲程新概念，建 立肌球蛋白工作循环的四态模型。利用化学动力学方法，计算了动力冲程的大 小，结果表明动力冲程的大小不仅依赖于动力冲程过程的反应平衡常数，还与 肌球蛋白杠杆臂及光镊的弹性系数有关。理论结果和实验结果基本相符。 关键词：肌球蛋白，工作循环，动力冲程，单分子实验结果 t h e o i 己e t i c a ls t u d yo nt h ep o w e r s t r o k eo fm y o s i ni i a bs t r a c t p o w e rs t r o k ei st h ec o r ec o n c e p ti nt h em e c h a n o c h e m i c a la c t i n - a c t i v a t e d m y o s i na t p a s ec y c l e i tw a st h o u g h tt h ep r o c e s so ft r a n s f o r m i n gc h e m i c a le n e r g y i n t om e c h a n i c a le n e r g y t h es i z eo fp o w e rs t r o k e s h o u l db eac o n s t a n ti n c o n v e n t i o n a lc o n c e p t s ，b u ti tm e a s u r e di nd i f f e r e n te x p e r i m e n t sh a v en o t h i n gi n c o m m o nw i t ho t h e r t oc o u n t e rt h i sp r o b l e m ，an e wc o n c e p to fp o w e rs t r o k ei s p r o p o s e di n t h i sp a p e r t h ee x p e r i m e n t a ld a t ao fm y o s i na r ee x p l a i n e du s i n gt h i s n e wc o n c e p t t h et e x ti sd i v i d e di n t ot h r e ec h a p t e r s i nc h a p t e ro n e ，t h es t r u c t u r eo fm y o s i n a n dt h em e c h a n o c h e m i c a la c t i n a c t i v a t e dm y o s i na t p a s ec y c l ea r e i n t r o d u c e d s o m ee x p l a i na n dc o m p a r i s o nh a v eb e e nd o n eo nt h ee x i s t e dw o r k i n gm o d e l so f m y o s i n i nc h a p t e rt w o ，s o m ee x p e r i m e n t a l d a t ao fd y n a m i c a lm e a s u r e m e n to n s i n g l em y o s i na r ei n t r o d u c e d t h ec o n t r a d i c t o r i e sb e t w e e ne x p e r i m e n t a ld a t aa n d t h et h e o r ya r ep o i n t e do u t c h a p t e rt h r e ei st h em a i np a r to ft h i sp a p e r an e w l l 内蒙古人学硕i j 学位论义 c o n c e p to fm y o s i np o w e rs t r o k ei sp r o p o s e d b a s e do nt h en e w c o n c e p t so fm y o s i n p o w e rs t r o k e ，af o u r - s t a t em o d e lo f a c t i n a c t i v a t e dm y o s i na t p a s ec y c l eh a sb e e n s e tu p u s i n gt h ec h e m i c a lk i n e t i cm e t h o d ，t h es i z e so fp o w e rs t r o k ew a sc a l c u l a t e d t h et h e o r e t i c a lr e s u l t ss h o w st h a tt h es i z e so fp o w e rs t r o k ed e p e n d sn o to n l yo nt h e e q u i l i b r i u mc o n s t a n to f t h ep o w e rs t r o k eb u ta l s oo nt h es t i f f n e s so ft h el e v e ra r m a n dt h es t i f f n e s so fo p t i c a lt r a p t h e o r e t i c a lr e s u l t si sc o n s i s t e n tw i t he x p e r i m e n t a l r e s u l t s k e y w o r d s ： m y o s i n ，t h ea c t i n a c t i v a t e dm y o s i na t p a s ec y c l e ，t h ep o w e r s t r o k e ，e x p e r i m e n t so ns i n g l em y o s i n i i i 内蒙古大学硕十学位论文 口三罩 日刊k 引言1 第一章肌球蛋白的结构及工作循环2 1 1 肌球蛋白的结构2 1 2 由肌动蛋白激活的肌球蛋白分解a t p 循环4 第二章肌球蛋白的单分子实验1o 2 1f i n e r 和k i t a m u r a 的实验1 0 2 2 肌球蛋白单分子动力学测试的其他实验研究结果1 1 第三章肌球蛋白i i 单分子动力冲程的理论计算1 3 3 1肌球蛋白i i 工作循环的新模型1 4 3 1 1 肌球蛋白i i 动力冲程的新概念1 4 3 1 2 肌球蛋白i i 动力冲程新的三种情形1 5 3 2 肌球蛋白i i 动力冲程统计平均值2 0 3 2 1 肌球蛋白i i 动力冲程统计平均值及四态模型2 0 3 2 2 肌肉收缩的化学反应速率方程及稳态解2 1 3 2 3 肌球蛋白i i 单分子动力冲程理论推导2 2 3 2 4 速率常数选取2 4 3 3 动力冲程的计算与讨论2 6 3 3 1 动力冲的程计算2 6 3 3 2 结果讨论2 6 参考文献3 0 致谢3 3 i v 内蒙古人学硕l ：学位论文 引言 运动是生物有机体的本质活动，生命的所有功能几乎都包含运动。而生物分子马达是 运动在分子水平的本质动因，正是分子马达实现了从化学能到机械能的转导。因此，马达 蛋白成为物理、生命、化学等领域科研工作者所关注的研究对象。在过去的十几年中，新 的分子马达正以惊人的速度被发现，一个细胞中可能包含近百个独特的分子马达。在所有 的分子马达中，对肌球蛋白的研究最多。1 9 9 3 年，r a y m e n t 等人利用x 射线衍射给出了分 辨率为0 2 8 n m 的肌球蛋白头部的三维结构；1 9 9 4 年以来，几个科研小组用不同的实验成功 地对单个肌球蛋白分子进行了动力学测试硷喃3 ；s p u d i c h 3 综合分析了关于肌球蛋白的离体运 动分析，分子遗传学及结构生物学三方面的研究成果，给出了肌球蛋白工作循环的机械化 学偶联模型。动力冲程是肌球蛋白工作循环中的重要一步，被认为是化学能转化为机械能 的过程。在s p u d i c h m l 给出的模型中动力冲程发生在肌球蛋白同肌动蛋白丝形成强结合态之 后，动力冲程的大小是一定的。然而，2 0 0 1 年，h o u d u s s e 和s w e e n e y 盯1 在仔细分析肌球蛋 白中肌动蛋白结合域的构象变化后指出只有杠杆臂摆动之后肌球蛋白才能与肌动蛋白形成 强结合态，杠杆臂的摆动发生在弱结合态。此外，不同实验妲圳所测得的肌球蛋白的动力冲 程不一致。因此，动力冲程这一传统概念存在许多疑问。 本文针对肌球蛋白的动力冲程进行研究，从新的角度研究动力冲程的复杂内涵，解释 关于动力冲程的各种测试结果。 内蒙古人学硕上学位论文 第一章肌球蛋白的结构及工作循 生物体的一切活动，从肌肉收缩、细胞内部的运输、遗传物质的复制一直到细胞的分 裂等等，追踪到分子水平，都是源于具有马达功能的蛋白质大分子，即分子马达。已发现 的分子马达种类有数百种，研究最多的有肌球蛋白马达( m y o s i n ) 、驱动蛋白马达( k i n e s i n ) 和动力蛋白马达( d y n e i n ) 这三类，其中研究最深入的是肌球蛋白类，而在各种肌球蛋白 中来源于肌肉的肌球蛋白又最受人们的关注砸川。本章主要介绍肌球蛋白的分子结构及几个 主要肌球蛋白工作循环模型，这是研究肌球蛋白动力冲程的基础。 1 1 肌球蛋白的结构 肌球蛋白是肌肉收缩的关键成分，它的分子结构如图1 1 1 ，它是长约1 4 0 n m 的棒状分 子的二聚体，形状如“y 字，用胰蛋白酶处理后可分解为：兼有a t p 分解酶作用的以及与 肌动蛋白结合作用的重酶解肌球蛋白( h - m e r o m y o s i n ) 和比它轻的并有螺旋结构的轻酶解 肌球蛋白( l - m e r o m y o s i n ) 。在重酶解蛋白的一段形成膨大的部分，即所谓头部，用s 表示。 s 单独分解a t p 的速度很慢，但当s 可以和肌动蛋白( a c t i n ) 结合时，分解速度则可大大 加快。这也正是肌肉内部发生的实际过程。 h e a dn e c kt a i l ，_ - 、，- 一v _ 、 r e g ui a t o r y e s 、s e n t i a i l i g h tc h a i n 1 i g h tc h a i n 图1 1 - i 肌球蛋白分子结构模式图 f i g1 1 - l s c h e m a t i cs t r u c t u r eo f t h em y o s i n 2 内蒙古大学硕r l ：学位论文 1 9 9 3 年，i v a nr a y m e n t 等人利用x 射线衍射给出了分辨率为2 8 a 的肌球蛋白头部( 从 鸡胸肌中提取) 的三维结构，见图1 卜2 。肌球蛋白的头部是高度不对称的，长1 6 5 a ，宽 6 5 a ，厚约4 0 a 。头部包含三个区域：一个2 5 k dn h ，末端a t p 结合域；一个中间5 0 k d 片段和一个2 0 k dc 0 0 h 末端片段；后两个片段参与同肌动蛋白的结合。两条相邻的轻链 ( e s s e n t i a l1 i g h tc h a i na n dr e g u l a t o r yl i g h tc h a i n ) 包缠着重链的一个口螺旋。在 图1 1 - 2 中可以看到一个显著的水平裂缝将重链的中间部分5 0 k d 片段划分为两个域。 图1 1 2 肌球蛋白头部全原子空间填充模型 f i g 1 1 - 2as p a c e - f i l l i n gr e p r e s e n t a t i o no fa l lo ft h ea t o m s i nt h ec u r r e n tm o d e lo f 。 m y o s i ns 3 内蒙古人学硕士学位论文 图1 1 3 肌球蛋白头部三维结构的图解表示 f i g 1 1 - 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h et h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f m y o s i n 图1 1 - 3 中标明了肌球蛋白头部的肌动蛋白结合面及分解a t p 的活性部位。肌球蛋白的二 级结构中a 螺旋占有支配地位，4 8 的氨基酸残基包含其中。一个显著的特征是一个长约 8 5 a 的口螺旋从头的厚部一直延伸到重链的c o o h 末端。这个长螺旋被认为是肌球蛋白工作 中的动力“杠杆 。 1 2 由肌动蛋白激活的肌球蛋白分解a t p 循环 肌球蛋白水解a t p 是如何驱动肌球蛋白与肌动蛋白周期性相互作用过程的呢? 而肌动 蛋白与肌球蛋白周期性结合与分离又是如何促进肌球蛋白水解a t p 的呢? 由图1 1 3 可以看 到，肌球蛋白头部的肌动蛋白结合面与a t p 活性部位位于头部的相反两面【1 2 1 。i v a nr a y m e n t 等人f 1 1 通过分析对比从x 射线衍射得到的肌球蛋白分子的三维结构、电子显微镜下得到的 肌动球蛋白( a c t o m y o s i n ) 及m y o s i n a t p 复合物的电子密度图，描述了肌球蛋白头部的a t p 4 内蒙古人学硕士学位论文 结合位点与肌动蛋白结合面在生化过程中的构象变化关系。给出了由肌动蛋白激活的肌球 蛋白分解a t p 循环过程的机制如图1 2 1 。 a c t i np 鼋串 m n s i e r r t ti n t e r r n e d a t e 图1 2 - 1 由肌动蛋白激活的肌球蛋白水解a t p 的工作循环 f i g 1 2 - 1a c t i n a c t i v a t e dm y o s i na t p a s ec y c l e a 图表示肌动球蛋白( a c t o m y o s i n ) 复合物，肌球蛋白头部中的水平细窄空隙表示将 5 0 k d 片段分为两部分的裂缝，此时裂缝处于合拢状态，a t p 活性口袋处于开放状态。b 图 表示a t p 结合到肌球蛋白引起复合物肌动球蛋白的分离，a t p 活性部位收缩，水平裂缝变 宽。c 图表示肌球蛋白将a t p 水解为a d p 和无机磷酸盐( p i ) ，成为复合物状态 m y o s i n a d p p i ，引起的构象变化使得肌球蛋白的杆状部分( 8 5a 长的o f 螺旋部分) 向上转 动。c 图状态的肌球蛋白释放p i 后同肌动蛋白结合为a c t i n m y o s i n a d p ，成为d 图状态。 裂缝合拢，再次引起肌球蛋白大的构象变化，a t p 活性口袋张开，肌球蛋白杆状部分向下 移动，成为e 图状态，这一过程是肌动球蛋白产生力( p o w e rs t r o k e ) 引起肌肉收缩的过程， e 态复合物a c t i n m y o s i n a d p 释放a d p 回到初态a ，依此循环下去。 1 9 9 4 年，s p u d i c h 6 1 综合分析了关于肌肉的离体运动分析、分子遗传学及结构生物学三 方面的研究结果，提出了由肌动蛋白激活的肌球蛋白水解a t p 循环过程的机械化学偶联如 图1 2 2 。根据这个假说，肌球蛋白同肌动蛋白强结合时存在两个态：动力冲程前态和动力 冲程后态。这过程使得肌动蛋白丝相对肌球蛋白滑动了1 0 n m 。图1 2 2 中步骤l ：a t p 气 塑鍪直叁堂塑主兰垡笙塞 结合到肌球蛋白的球状头部，引起的构像变化使得肌球蛋白与肌动蛋白丝迅速分离。步骤2 ： a t p 迅速水解为a d p 和p i ，肌球蛋白、a d p 和p i 以强结合状态存在，表示为m y o s i n a d p p i 。 m y o s i n a d p p i 同肌动蛋白弱结合，表示为a c t i n m y o s i n a d p p i 。步骤3 是一个慢跃迁过程， 由弱结合态过渡到强结合态，表示为a c t i n * m y o s i n a d p p i 。整个循环时间r ，决定于步骤3 所需时间。步骤3 引起肌球蛋白的构象变化，构象变化触发了步骤4 ，即p i 的释放。p i 的 释放又触发了大的构象变化( 步骤5 ) ，肌球蛋白杆状部分的摆动，使得肌动蛋白丝相对肌 球蛋白滑动。这一大的构象变化之后a d p 得以释放。步骤4 和5 被认为是强结合态时间f 。， r 。大约2 m s 。a d p 的释放使得a t p 又可以迅速结合，以此循环下去。 “f 、? “7 | j j _ j j if j 。? 乍? 、| j 。j 咖j ? o ：i 1j | 。? “k b 蒜j ? j | 肇懒i 。警二啼? 嘞”气；氇警f 弘一? j 7 。? 警j ，o ：。| j _ ：= j j i 二二 。 ：翼| ，：，。0 - ，一。，l | 。t 。i j 够 。 秘? 警蜮 j 麓 图1 2 2 肌球蛋白工作循环中的机械化学偶联 f i g1 2 - 2t h es c h e m a t i cm e c h a n o c h e m i c a la c t i n a c t i v a t e dm y o s i na t p a s ec y c l e 在肌球蛋白头部的两个活性部位还有环1 ( l o o p l ) 和环2 ( l o o p 2 ) ，见图1 2 3 ，由于 柔性，环1 和环2 在前面的晶体结构中没有显示。各种肌球蛋白中都存在环1 和环2 ， 但在长度和序列方面保守型很差。结构研究表明环同肌动蛋白的氨尾部负电荷作用，它 决定a c t i n m y o s i n a d p p i 向a c t i n * m y o s i n a d p p i 的转换，由此决定循环周期t 。环1 决定a c t i n m y o s i n * a d p - * a c t i n * m y o s i n + a d p 的转化速度，亦即影响肌球蛋白同肌动蛋 白强结合时间f 。由于肌球蛋白只有在同肌动蛋白丝强结合时才对肌肉收缩产生作用， 6 内蒙古大学硕i j 学位论文 因此常把，称为执z q g _ ( d u t yr a t i o ) 。对骨骼肌肌球蛋白分子，动力冲程d 1 0 n m ， 2 m s ， 5 0 m s 。一个肌球蛋白分子工作时，肌动蛋白丝相对于肌球蛋白滑动速度为 d t o = 0 2 4 # m j 一。常把肌球蛋白头部的杠杆部分称为杠杆臂。图1 2 3 所示杠杆臂的摆 动得到实验的证实1 3 , 1 4 1 。分子马达将化学能转化为机械能的过程是： a t p 水解的化学能一马达分子的构象能一机械能。 a c t i n - b i n d i n gs 随e 一1 0n ms t r o k e 图1 2 3 肌球蛋白头部活性部位环的作用 f i g 1 2 3t h ec r i t i c a lr o l e sf o rt w oa p p a r e n t l yn o n c o n s e r v e ds u r f a c el o o p so n t h em o t o rd o m a i no fm y o s i n 肌球蛋白与肌动蛋白间存在强结合态和弱结合态。关于肌球蛋白杠杆臂的摆动发生在 强结合态还是弱结合态，h o u d u s s e 和s w e e n e y i7 】将肌球蛋白杠杆臂摆动前的态称为过渡态 ( t r a n s i t i o ns t a t e ) ，摆动后的态称为近僵直态( n e a rr i g o rs t a t e ) 。肌球蛋白处于过渡态和近僵 直态时其肌动蛋白结合域的构象是不同的。2 0 0 1 年，h o u d u s s e 等人仔细分析了肌动蛋白的 肌球蛋白结合域的构象，认为只有处于近僵直态的肌球蛋白才有可能与肌动蛋白形成强结 合态。这也就是说杠杆臂的摆动发生在弱结合态针对这问题，罗辽复先生和郭维生老师 总结之前的传统模型f 6 a 5 】，结合实验结果，于2 0 0 3 年给出了肌球蛋白的一个新机械化学偶 联循环模型1 6 1 。 如图1 2 4 ，图中步骤1 ，a t p 结合到肌球蛋白的球状头部，引起肌球蛋白的肌动蛋白 7 内蒙古人学硕一l ：学位论文 的结合部位的构象变化【1 5 】，使得肌球蛋白同肌动蛋白迅速分离。a t p 被水解为a d p 和p i ， a d p 和p i 同肌球蛋白处于结合态，表示为m y o s i n a d p p i 。水解过程引起肌球蛋白头部的 构象变化，a t p 水解的化学能转化为肌球蛋白的构象能。此时肌球蛋白头部的杆状部分( 也 称为杠杆臂) 所处的状态称为过渡态【7 1 ( t r a n s i t i o ns t a t e ) 。步骤2 ，m y o s i n a d p p i 和肌动蛋 白形成弱结合态，表示为a c t i n m y o s i n a d p p i 。步骤3 为p i 的释放，表示为a c t i n m y o s i n a d p 。 p i 的释放触发了肌球蛋白头部的杆状部分发生约6 0 0 角【l7 j 的摆动。图中a 点表示肌球蛋白 与肌动蛋白的结合位点，b 点表示肌球蛋白杠杆臂末端。由于肌肉负载的阻碍作用，弱结 合态时杠杆臂的摆动没有引起杠杆末端b 相对结合位点a 的滑动，而是肌球蛋白绕结合位 点a 有一转动。杠杆臂摆动的同时肌球蛋白的肌动蛋白结合部位的构象也发生相应的变化， 变化后的构象适宜与肌动蛋白形成强结合态【_ 7 1 。步骤4 ，从弱结合态过渡至0 强结合态，表示 为a c t i n * m y o s i n a d p 。此时杠杆臂所处的状态成为近僵直态【刀( n e a rr i g o rs t a t e ) 。b 点相对 a 点移动& 1 0 n m 。这一步可以看作动力冲程( p o w e rs t r o k e ) 。动力冲程发生在强结合态的 形成过程。肌动球蛋白的构象能转化为机械能。步骤5 ，强结合态形成以后，a d p 得以释 放。此时肌球蛋白与肌动蛋白仍处于强结合态，表示为a c t i n * m y o s i n 。a d p 的释放使得a t p 又可以迅速结合，以此循环下去。 p i a c t i n ( 朱- ib p i ， 1 e v e ra 珊 a d p r l 图1 2 - 4 肌球蛋白工作循环中的机械化学偶联 f i g1 2 - 4t h es c h e m a t i cm e c h a n o c h e m i c a l a c t i n a c t i v a t e dm y o s i na t p a s e c y c l e 新模型较传统模型的改进之处是认为动力冲程这一过程是发生在只释放之后，肌球蛋白 8 内蒙古大字坝七字位论义 与肌动蛋白从弱结合态向强结合态过渡的过程中。在传统的六态模型中，假定杠杆臂的摆 动发生在强结合态a c t i n * m y o s i n a d p 形成之后并将之视为动力冲程。而新模型中，假定了 弱结合态a c t i n m y o s i n a d p 转变为强结合态a c t i n * m y o s i n a d p 过程中发生动力冲程。这和 文献1 7 的分析结果一致，即杠杆臂的摆动发生在弱结合态a c t i n m y o s i n a d p 。如果把弱结合 态和强结合态的能量差别看作是结合能的差别，那么结合能可以看成两部分，一是构象态 的能量，二是在给定构象下电子态的能量【1 8 】，而在弱结合态到强结合态的过渡中主要是构 象态的变化。由于弱结合态的构象能较高，而强结合态构象能较低，动力冲程是实现构象 能转化为机械能的过程，应该对应弱结合态向强结合态的转化，因此从能量转化的观点上 看，该模型更为合理【1 9 之2 1 。 9 内蒙古大学硕1 ：学位论文 第二章肌球蛋白i i 的单分子实验 本章主要介绍对肌球蛋白单分子动力学测试结果，将实验测得的动力冲程同理论结果 进行比较，目的是思考已有的关于肌球蛋白动力冲程的概念是否合理。 2 1fin e t 和kit a m u r a 的实验 在肌球蛋白的单分子动力学实验中，对动力冲程做了研究。1 9 9 4 年，f i n e r 等人1 2 设计了如图2 1 1 的实验，盖玻片上放一个二氧化硅小珠，小珠上载有肌球蛋白分子。肌动 蛋白的两端接两个直径约1 聊的乳胶珠。用光学镊子操纵乳胶珠，使得肌动蛋白丝同肌球 蛋白相互作用。f i n e r 的实验结果是：一个分子产生的最大力为3 - 4 p n ，消耗一个a t p 只有 一个动力冲程，动力冲程为l l n m 。 图2 1 1f i n e r 等人的肌球蛋白单分子动力学测试简图 f i g 2 1 1s c h e m a t i cd r a w i n go f t h ee x p e r i m e n tm a d eb yf i n e r e ta l 1 9 9 9 年，k i t a m u r a 等人做了如图2 1 2 的实验，将一个细玻璃针装到三维压电扫描器 l o 内蒙古人学硕士学位论文 上，玻璃针顶端接一长5 7i z m 、尖端曲率半径约1 5 m n 的z n o 晶体扫描探针。晶体探针顶 端粘接链霉抗生素，链霉素可以和肌球蛋白的调控轻链的生物素酰化点结合，由此可操纵 有一个头部( 另一个头部被截去) 的肌球蛋白同肌动蛋白丝的作用。实验结果为：肌球蛋 白消耗一个a t p 可以沿肌动蛋白丝移动1 5 步，也就是说可以有多个动力冲程。每步长度 ( 动力冲程) 5 5 r i m 。 l a s e ti n n l a s e ro l l s i n g l e - m o l e c u l ei m a g i n g 图2 1 2k i t a m u r a 等人的肌动球蛋白单分子动力学测试简图 f i g 2 1 - 2s c h e m a t i cd r a w i n go ft h ee x p e r i m e n tm a d eb yk i t a m u r ae ta l 2 2 肌球蛋白单分子动力学测试的其他实验研究结果 m o l l o y 3 】做了类似f i n e r 的实验，所不同的是使只有一个头部的肌球蛋白与肌动蛋白丝 相互作用，发现消耗一个a t p ，产生一个动力冲程，动力冲程的大小为4 n m ，产生的力为 1 7 p n 。s l e e p 2 1 】等人假设动力冲程之后伴随着无机磷酸盐p i 和a d p 的释放，其动力冲程比 人们普遍公认的l o n m 小，发现肌球蛋白杠杆臂移动的平均距离为真实的动力冲程的一半， 并且依赖于动力冲程过程的平衡速率常数及动力冲程前态的分离速率常数。k a g a w a 【2 4 】认为 骨骼肌肌球蛋白运动步长即动力冲程不是固定的，研究了一个肌球蛋白分子沿肌动蛋白丝 运动时驱动系统中涨落对动力冲程的影响。t y s k a 2 5 】等人对肌球蛋白一个动力冲程的测试结 内蒙古大学砂! 一i ：学位论文 果为1 2 n m 。p i a z z e s ig 等人用x 射线衍射实验对m y o s i ni i 的动力冲程的测试结果是分子马 达自身产生6 p u 的力使其进行一个动力冲程，动力冲程大小为6 n m 。而文献【猢7 1 通过光镊 实验研究了肌球蛋白i i 单分子的动力冲程约为5 - 6 n m 。 在各种关于肌球蛋白动力冲程实验中，所测得的动力冲程值是不一致，但从实验结果 分析，动力冲程应当是存在的，应该重新审视已有的关于动力冲程的概念，给出有别于传 统肌球蛋白动力冲程新概念，并能对动力冲程的实验结果做出合理解释，这是文章所要做 的尝试和意义所在。 内蒙古人学硕j ：学位论文 第三章肌球蛋白i i 单分子动力冲程的概念和理论计算 自从上世纪6 0 年代人们先后从肌肉细胞和原生生物细胞中提取出m y o s i n l i 以来，对 其结构和运动机制作了大量的研究。m y o s i n l i 的晶体结构表明，消耗一个a t p 分子，在不 加负载情况下的动力冲程为1 0 1 2 n m ，这个值得到x 射线衍射实验的证明12 of i n e r 口1 等人 光钳实验结果是，一个肌球蛋白分子头部产生的力约为3 - 4 p n ，消耗一个a t p 分子，只有一个 动力冲程，动力冲程是1 1 n m 。m o l l o y 3 等人作了类似的试验，所不同的是实验中使用的一 个头部肌球蛋白，实验结果是消耗一个a t p 分子产生的力为1 7 p n ，也只有一个动力冲程， 约为4 n m 。k i t u m u r a h 3 等人的实验结果表明，肌球蛋白消耗一个a t p 可以沿肌动蛋白丝移动 1 5 步，既有多个动力冲程，每个步长( 动力冲程) 为5 3 n m 。文献乜假设动力冲程之后伴 随着无机磷酸盐p i 和a d p 的释放，结果表明，其动力冲程比人们普遍公认的1 0 n m 小。由 此可见，对同一研究对象给出了不同的理论和实验结果，如何从理论上解决这些问题是摆 在我们面前的课题。从前两章的介绍可以看出，在已有的动力冲程模型中，关于肌球蛋白 动力冲程的概念和单分子实验结果存在矛盾。在传统的动力冲程概念中，动力冲程是一定 值，而各种关于动力冲程的测试值是不同的。针对这一矛盾，本章给出动力冲程一个新的 概念，以m y o s i n i i 为研究背景，建立m y o s i n i i 工作循环的四态模型，并假设无机磷酸盐p i 的释放伴随着动力冲程过程，a d p 的释放在动力冲程之后，通过选取适当的速率常数，发现 动力冲程的大小不仅与动力冲程过程的反应平衡常数有关，也与肌球蛋白杠杆臂及光镊的 弹性系数有关。 3 1 肌球蛋白工作循环的新模型 3 1 1 肌球蛋白动力冲程的新概念 在罗辽复先生和郭维生老师所提出的肌球蛋白工作循环模型【1 6 】中，还存在缺陷，如果 处于弱结合态的肌球蛋白不受外力，则动力冲程为零，这是难以理解的。据此，郭维生老 师等人【2 8 】给出一个改进的肌球蛋白工作循环模型，如图3 1 1 所示。 p i t h i n ) f i l a m e n t 一| 6 l p i l e v e ra r m d p d p p i 图3 1 1 肌球蛋白作循环模型 f i g3 1 - 1 t h es c h e m a t i c m y o s i nw o k ec y c l e 图中步骤1 ，a t p 结合到肌球蛋白的球状头部，引起肌球蛋白的肌动蛋白结合部位的构 象变化，使得肌球蛋白同肌动蛋白迅速分离。a t p 被水解为a d p 和p i ，a d p 和p i 同肌球 1 4 叩邛 内蒙古人学帧上学位论义 蛋白处于结合态，表示为m y o s i n a d p p i 。水解过程引起肌球蛋白头部的构象变化，a t p 水 解的化学能转化为肌球蛋白的构象能。此时肌球蛋白头部的杆状部分( 也称为杠杆臂) 所 处的状态为过渡态( t r a n s i t i o ns t a t e ) 。步骤2 ，此时的肌球蛋白和肌动蛋白形成弱结合态， 表示为a c t i n m y o s i n a d p p i 。步骤3 为p i 的释放，表示为a c t i n m y o s i n a d p 。肌球蛋白头 部的杆状部分仍处僵直态，肌球蛋白的肌动蛋白结合部位的构象发生相应的变化，变化后 的构象适宜与肌动蛋白形成强结合态。步骤4 ，从弱结合态过渡到强结合态，表示为 a c t i n * m y o s i n a d p ，肌球蛋白发生构象变化，变化后的构象适宜与肌动蛋白形成强结合态， 杠杆臂发生约6 0 。角的摆动，此时杠杆臂所处的状态为近僵直态( n e a r i g o r s t a t e ) 。b 点相 对a 点移动6 。这一步可以看作动力冲程( p o w e rs t r o k e ) 。动力冲程发生在强结合态的形成 过程。肌动球蛋白的构象能转化为机械能。步骤5 ，强结合态形成以后，a d p 得以释放， 此时肌球蛋白与肌动蛋白仍处于强结合态，表示为a c t i n * m y o s i n 。a d p 的释放使得a t p 又 可以迅速结合，以此循环下去。 此模型同罗辽复先生和郭维生老师所提出的肌球蛋白工作循环模型有两点不同，其一 是步骤3 中，肌球蛋白与肌动蛋白处于弱结合态时，杠杆臂一直处于僵直态，杠杆臂没有摆 动。其二是杠杆臂的摆动发生在从弱结合态到强结合态的形成过程中。 3 1 2 肌球蛋白i i 动力冲程的三种情形 依据图3 1 1 所给出的模型，结合f i n e r 、m o l l o y 、k i t a m u r a 等的单分子实验，当肌球 蛋白与肌动蛋白丝处于弱结合态时，会出现如下的三种情况： ( 一) 如图3 1 2 ，图中的弹簧表示肌球蛋白单分子实验中【1 4 , 2 1 1 肌球蛋白结合位点偏离 平衡位置时所受到的弹性回复力的作用，虚线位置表示平衡位置。本图表示肌球蛋白同肌 动蛋白丝处于弱结合态时杠杆臂末端没有偏离平衡位置，左右两端弹簧没有发生相对伸缩， 则此时肌球蛋白杠杆臂受到弹簧的回复力作用为零。步骤4 后，结合部位发生构象变化， 即球蛋白与肌动蛋白丝由弱结合态变成强结合态，发生一个动力冲程过程后，b 点相对于a 点的相对滑移距离为动力冲程的值。此时实验所测得的动力冲程应当与传统理论值相符。 但由于肌动蛋白丝上肌球蛋白的结合位点是不连续的，因此，从发生概率来看，在实验中 出现这种结合位点正好在平衡位置的情况的概率为零。 内蒙古大学硕十学位论文 平衡中心 ! a ； a e t i nf i l a m e n t 图3 1 2 结合位点处于平衡位置 f i g 3 1 - 2b i n d i n gs i t ea tt h em e a np o s i t i o n ( 二) 如图3 1 3 a ，当肌球蛋白与肌动蛋白丝处于弱结合态时，结合位点向左偏离平 衡中心乇，肌球蛋白杠杆臂受到一个向左的力，左端弹簧压缩，右端伸长。肌球蛋白杠杆臂 末端b 受到向右的弹性回复力，肌球蛋白绕着结合位点a 发生一个逆时针旋转，见图3 1 3 b ， 杠杆臂末端b 相对结合位点a 产生位移h 。在肌球蛋白与肌动蛋白丝形成强结合态过程中， 杠杆臂摆动，b 点相对于a 点滑动的位移即为动力冲程x 。可以看到动力冲程大小由于位 移h 而大于动力冲程理论值，实验所测得的肌球蛋白产生的力也相应的大一些。 叫粤。k 图3 1 3 a 结合位点处于平衡位置左侧 f i g 3 1 - 3 ab i n d i n gs i t ea tt h el e f to f m e a np o s i t i o n 1 6 内蒙古人学硕j ：学位论文 冷 ： j人火 、 - 、。 i 人； ，vvb ： 一h 。 图3 1 3 b 弹性力作用后的肌球蛋白 f i g 3 1 - 3 bm y o s i ne f f e c t e db ye l a s t i cf o r c e 由于肌球蛋白在形成弱结合态以后，肌球蛋白处于僵直状态，如图3 1 3 c 所示，肌球 蛋白杠杆臂末端b 因受到弹性力f ，的作用，头部的结合位点位于平衡位置的左侧。而绕结 合位点a 逆时针旋转，角度为0 ，此时b 端相对于结合位点a 有一个相对滑动h ，当肌球 蛋白发生构象变化后，杠杆臂发生的角度偏转约为6 0 。，杠杆臂的长度为定值9 n m 。动力冲 程x 的大小关系应为： x = 1 0s i n l 9 + 9 s i n 6 0 。 ( a ) 内蒙古大学顾十学位论文 lk j 图3 1 3 ce 作用下的肌球蛋白工动力冲程 f i g3 2 1p o w e rs t r o k eo f m y o s i nw o r kc y c l ea c t i v a t e de + ( - - - ) 如图3 1 4 a ，当肌球蛋白与肌动蛋白丝处于弱结合态时，结合位点向右偏离平 衡中心，o ，肌球蛋白杠杆臂受到一个向右的力，右端弹簧压缩，左端伸长，肌球蛋白杠杆 臂末端b 受到向左的弹性回复力，绕着结合位点a 发生一个顺时针转动，见图3 1 4 b ，杠 1 8 图3 1 - 4 a 结合位点处于平衡位置右侧 f i g 3 1 4 a b i n d i n gs i t ea tt h ed g h to fm e a np o s i t i o n 图3 1 _ 4 b 弹性力作用后的肌球蛋白 f i g 3 1 - 4 bm y o s i ne f f e c t e db ye l a s t i cf o r c e 1 9 合态过程中， 所测得的肌球 内蒙古大学硕i ：学位论文 t - g ， 图 合位点位于平衡位置右侧，如图3 1 4 c 所 蛋白的动力冲程 f i g 3 i 一4 cp o w e rs t r o k em y o s i nw o r kc y c l ea c t i v a t e db yf 2 3 2 肌球蛋白i i 动力冲程的统计平均值 3 2 1 肌球蛋白i i 动力冲程的统计平均值及四态模型 据图3 1 1 肌球蛋白工作循环模型【2 8 1 和对3 1 2 节肌球蛋白动力冲程的理解，无论是在 肌纤维内还是单分子实验中所测，肌球蛋白动力冲程应当是一个统计平均值，由( 1 ) 式给 扣= 甓撇 j ( x ) 是肌球蛋白工作循环的几率流和循环过程中每一步的速率常数有关。文献啪1 给出 了图3 1 1 所示循环的j ( x ) 表达式，但表达式中的速率常数无法全部从文献中查到。为了能 得n - - 个与实验结果相比较的理论值，我们将肌球蛋白i i 工作循环新模型2 8 】简化为的四态 内蒙古大学硕一i ：学位论文 模型。 k 4 ( x ) k ，t x )j 1 2 ( j )码k 4 ( x ) p i k _ 殳2 ) a m 。p 品a 嗡一4 ( j )b ( 工) ( x ) 五3 ( 砷k 图3 2 1 肌动蛋白激活肌球蛋白水解a t p 循环的四态模型