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中波段紫外线诱导细胞d n a 损伤及损伤修复 中钙信号的研究 摘要u v b 是中波段紫外线，能够诱导细胞d 】q a 损伤、细胞周期抑制等。 不同剂量的u v b 对细胞造成不同程度的损伤、导致不同的生物效应，这些事件 中都涉及到各种信号通路的激活。钙离子作为细胞胞内第二信使，在传递信息、 调控细胞生理功能上具有重要作用。因此，研究u j 诱导细胞d n a 损伤及损 伤修复过程中钙信号的变化显得尤为重要。 本论文采用比率荧光成像系统检测不同剂量u v b 对细胞胞内钙离子浓度 ( 【c a 2 + 】。) 的影响，同时研究了不同的胞外环境对钙离子浓度变化的影响；采用彗 星实验检测不同剂量u v b 诱导细胞d n a 损伤及损伤修复；最后，利用细胞计 数的方法检测了不同剂量u v b 对细胞增殖速度的影响。 主要内容如下： 1 、建立并优化比率荧光成像系统检测h e p a l - 6 细胞【c a 2 + 】l 的实验方法。实 验结果表明：采用o 1 扯m o 儿的f u r a - 2 a m 避光标记h e p a l 6 细胞2 0 m i n 可得到 理想的荧光图象，采用r m i n = 1 、r m a x = 2 0 2 计算细胞【c a 2 + 】，可得稳定的实验 结果。 2 、采用优化的比率荧光成像系统，分别在即时和延时对不同热量u v b 引 起的细胞【c a 2 + 】i 的变化进行了检测。即时检测结果发现：在o 8 8j m 2 。9 2 4 j m 2 剂量范围内，u v b 诱导【c a 2 + 】浓度升高，且随照射剂量的增加而升高；延时 o 5 h - 4 h 检测发现，当u v b 照射h 印a l 一6 细胞2 s 时， c a 2 十】随孵育时间的延长 表现出先降低后升高的趋势au v b 照射h e p a l 6 细胞6 0 、1 7 0 s 时， c a 2 + 】i 随孵 育时间的延长表现出先降低后升高再降低的趋势。同时检测了不同胞外环境对 u v b 照射引起的细胞【c a 2 + 】i 变化的影响，结果推断细胞胞内钙库可能是胞内钙 离子浓度升高的主要来源。 3 、利用彗星实验研究了不同剂量u v b 诱导细胞d n a 损伤及损伤修复的影 响。结果发现当照射剂量为1 7 6j ，m 2 时，即可检测到最小的d n a 损伤，随着 照射强度的增加，d n a 损伤加剧；但当照射剂量增加到5 2 4j m 2 时，d n a 损伤到达检测的最高限；随着照射时间的进步延长，d n a 损伤没有表现出 增加的趋势。实验结果还表明u v b 诱导的细胞d n a 损伤存在检测的低限，且 t h er e s e a r c ho fc a i c i u m 壅；珏爱籍；囊譬鬻l n 咫蠢篓消羹囊窖舞堇耍圈雹耄薯f 。塞7 骋f 垂警兰争毒翥囊鞋薹蠢蓑夔黍；薹墨囊孽l 囊i 蔓藿羹警喜薯萋! 羔葶j 蠢妻型 爨裂”i 尊兽日；q 耋蓦童蚕! 矗薅譬栋羹壬i 藿孽i 羔：蓬l ；墨蓑l 莲i 兰墨r 一蠹冀望；i ：鹱蓄 窖耋 ；墓i | 每三刀 辫嚣! 邕= 喜i 。圳荔塑侈；i 凄萋霎薹誊亨巍甜利用细胞计数的方法检测了不同剂量u v b 对细胞增殖速度的影响。结 果发现：经小剂量( 0 8 8 j m 2 ) u 、，b 诱导的细胞，其增殖速度没有受到恩著影响； 增大u v b 剂量( 7 4 8j m 2 ) ，细胞增殖速度受到显著影响 。 通过上述实验，我们发现u v b 可以诱导h e p a l 6 细胞的d na 损伤，且损 伤表现出剂量依赖效应，存在检测的低限和商限：细胞经过孵育后，中剂量照射 引起的损伤可以得到一定程度的修复：实验结果还表明u v b 在诱导细胞d n a 发生损伤的同时会影响到胞内钙离子的浓度，且随着照射剂量的增加，胞内钙离 子浓度表现出增加的趋势。同时我们发现u v b 照射会减慢细胞的增殖速度。 关键词：u v b ：钙离子；d n a 损伤；彗星实验；比率荧光成像系 x d n a d 锄a g ei ni r r a d i a t e dc e i j ss h o w si n c r e a s i n gt e n d e n c yw i t he l e v a t i n ge n e 唱yo f u v b t h eu v bo nh e p a l 6f o ro 8 8j m 2a n do nm o u s eh 印a t o c y t ef o r7 。9 2 j m 2 1 e a d st od n a d a m a g e r e p a i ro fd n ad 锄a g ei n d u c e dl a r g e re n e r g yu v bs h o w s d e c r e a s i n gt e n d e n c yw i t hi n c r e a s i n gi n c u b a t i o nt i m e 4 t h em e m o dw h i c hc o u n t st h en u m b e ro fc e l l si su s e dt oe x a m i n em ec e l l p r o l i f e r a t i o n i n 玎u e n c e d b y d i 仃e r e mu v be n e r g y r e s u l t si n d i c a t et h a tc e l i p r o l i f e m t i o ni sn o tr e m a r k a b l yi n n u e r l c e db yt l l es m a l l e ru v bi m d i a t i o n ( 0 8 8 j m 2 ) o t h e 九v i s e ，c e up r o l i f e r a t i o ni sr e m a r k a b l yi n f l u e n c e d 、v i mi n c r e a s eo fu v be n e r g y ( 2 6 4 j m 2a n d7 4 8 j ，m 2 ) a n dc e l ld e n s i t yr e d u c e s w ed i s c o v e ru v bc a l li n d u c et h ed n a d a m a g eo fh e p a l 一6 ；誊；i i 芝毫享寸引i x 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解学校有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻 读学位期间论文工作的知识产权单位属于西北大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被 查阅和借阅。学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学 位论文。同时，本人保证，毕业后结合学位论文研究课题再撰写的文 章一律注明作者单位为西北大学。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：兽l 指导教师签名： f 缓徇 细年6 月f 。日国g 年月z 扩臼 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名：m 知6 年6 月，。日 型 c j a j l eh a n s o n ，2 0 0 4 】。c a 2 + 进入胞浆后，引起局部胞浆 c a 2 + 升高，随即与某 些蛋白结合，使其不能自由扩散。这不仅对c a 2 + 起到缓冲作用，而且使c a ”具 有时空分布，增加了钙信号的多样性。 由于细胞质中过高的c a 2 十浓度会导致细胞的物质和能量代谢受阻。伤害甚至 引发细胞死亡，所以，钙信号的及时终止对细胞也是至关重要的。 钙信号的终止方式之一是通过胞浆c a 2 + 的外排实现的。主要是通过钙泵和交 换因子将胞内的钙离子释放到胞外空间【l i p s k a i a l ，2 0 0 4 】。 另外一种终止方式是钙离子通过单向转运入库( 进入线粒体钙库) ，进而降 低胞内钙离子的浓度，进而导致钙信号的终止。此时线粒体基质【c a 2 + 1 则升高 【j a n eh a l l s 0 nc ，2 0 0 4 】。线粒体c a 2 + 的积累使邻近部位内质网c a 2 + 通道关闭，抑 制内质网钙离子的释放【j a n eh a l l s o nc ，2 0 0 4 】，从而使得细胞内钙离子可以维持 在低浓度水平。 钙通道的周期性开放能够引起钙信号周期性的变化，即形成c a 2 + 振荡( c a 2 + o s c a t i o n s ) 。钙振荡的振荡频率表示钙信号的时间特性，即钙离子浓度发生变化 的时间周期【j 锄e sw ，1 9 9 8 】；钙振荡的振幅表示钙离子随着时间的变化幅度【邓友 平，1 9 9 7 1 。对于相同细胞的特定刺激来说，c a 2 + 振荡的频率往往是确定的。已有 实验证据表明钙振荡频率与基因的转录激活相关；钙振荡的振幅特征则也能反应 细胞的特定功能状态【y u y i n gc h a o ，2 0 0 4 】。 1 2 紫外线及其生物学效应 紫外线( u l t r a “o l e t ，u v ) 是波长范围为1 0 4 0 0 m 的光辐射。依据紫外辐 射的穿透能力及作用效应可将其划分为：a 波段( 4 0 0 3 2 0 n m ，u v a ) ；b 波段 ( 3 2 0 2 8 0 n m ，u v b ) ；c 波段( 2 8 0 2 0 0 n m ，u v c ) 以及真空紫外波段( 2 0 0 1 0 n m ) 。由于只有波长大于2 0 0 姗的紫外辐射，才能在空气中传播，所以人们 通常讨论的紫外辐射效应，主要涉及2 0 0 啪至4 0 01 1 1 1 1 范围内的紫外辐射。 紫外线属非电离化辐射，它的一个显著特点是它具有生物效应。紫外线作用 于细胞后，其光子能量被原子或分子吸收，引起分子原子电子能级状态的改变， 进而导致细胞内相关事件出现，如细胞d n a 损伤、基因表达的改变、细胞周期 进程的抑制、细胞凋亡、细胞膜受体的改变及信号转导通路中激酶活性的变化( 如 生长因子受体磷酸化、i k b 的降解，c r e b 的磷酸化等) 等 b e n d e r k ，1 9 9 7 1 。 其中u v c 和u v b 的波长f 好处于d n a 吸收峰附近，可直接引起细胞d n a 损 伤 e h r h 甜j c ，2 0 0 3 】 r i k a k u s 啪o t o ，2 0 0 1 。 对于生物是极端有害的，可以直接引起d n a 损伤 g a r y m h a l l i d a y ，2 0 0 5 ； u v a 则不能直接对细胞d n a 造成损伤，但可通过活性氧引发氧化反应从而协同 或促进u v b 引起的损伤效应。 1 2 1紫外线诱导的细胞d n a 损伤 众多因素可引起细胞d n a 的损伤，如自由基，烷化剂，射线等。紫外辐射 是诱导细胞d n a 损伤的环境因子之一。 d n a 分子中的碱基具有吸收紫外线的能力，是u v 作用于细胞的主要靶分 子。紫外线能够损伤细胞是因为细胞中的生物大分子可以吸收紫外线，如d n a 分子中的共轭键( 如碱基等) 可吸收较短波长的紫外线；磷酸核糖长链或核糖中 的线性重复结构或环状结构和蛋白质中的芳香族氨基酸能够吸收较长波长的u v 射线，进而形成不同的光生产物，引起细胞d n a 损伤，对生物体是极其有害的 c s t i n ca k o c h p a i z ，2 0 0 4 。 1 2 2u v b 诱导细胞d n a 损伤及其修复 紫外线能诱导细胞d n a 损伤，可以产生多种光产物。光产物的类型和紫外 线的波长有一定的关系。u v b 诱导细胞d n a 损伤时形成的光产物有环丁烷嘧啶 二聚体( c p d s ) 和6 4 光产物( 6 4 p p s ) 【d a l l l ej ，2 0 0 5 】，能够引起d n a 结构的变化， 这种结构变化能够被n e r 识别和修复【f r i e d b e 唱，2 0 0 l ：h a l l a w a l t ，2 0 0 1 ； m u l l e n d e r sa i l db e m e b u 昭，2 0 0 l ：md e r r i c o ，2 0 0 3 】。 m a r i j k ev a no o s t e n 和s a n c a r 等人的实验发现u v b 诱导的细胞d n a 损伤在 通过核昔酸切除修复时，可以通过全基因组修复( g g r ) 和转录偶联修复( t c r ) 。 两种通路完成 m a r u k ev a no o s t e n ，2 0 0 0 ；a s a n c a re ta l ，1 9 9 3 】。 全基因组修复( g g r ) 是不依赖于转录的修复机制，可从基因组的非转录 区和转录区的非转录链移走损伤。即可以在基因组的众多位点切除损伤。细胞经 u v b 照射后，g g r 通路被激活，进而快速切除6 4 p p s 。但c p d 不能够通过此 方式修复。 转录偶联修复( t c r ) 则只能从转录链的活性区移除损伤。在切除6 4 p p s 的 同时，c p d 也会被切除。与g g r 修复通路相比，t c r 修复的修复速度较慢，是 6 1 2 4 紫外线诱导的周期阻滞 细胞周期分为g 1 期、s 期、g 2 期和m 期4 个时期，这四个时期是一个动 态的、连续的过程。细胞周期的运行主要由细胞周期蛋白依赖性激酶( c d k ) 家族推动的。 g 1 早期，c d k 4 和c d k 6 与c y c l i nd 结合：c d k 2 则与c y c l i ne 结合负 责g t 期的完成和s 期的起始； s 期和g 2 期，依赖于c d k 2 一c y c l i n a 复合物： m 期，由c d k l c y c l i nb 复合物负责。 细胞为了确保d n a 能够被准确复制( s 期) 和均等的分裂( m 期) ，在细胞 进入s 和m 期前须通过周期检验点( c h e c kd o i n t ) 的检测。 与d n a 损伤相关的检验点主要包括g 1 s ，s 和g 2 ，m 期三个( 图1 ) ： 细胞在g 1 期或者s 期发生d n a 损伤时，会激活蛋白激酶a t m ，a t r ( 属于 磷脂酰肌醇( p 1 3 k ) 激酶家族) ，进而磷酸化c h k l c h l ( 2 c d c 2 5 a ，从而使c d k 2 没有活性，使细胞从g l 期向s 期的转换受到阻止，或者细胞被阻滞在s 期； 另一方面，d n a 损伤可能诱导c y c l i n d 的迅速降解，从而使细胞阻滞在g l s 期。 当细胞在g 2 期发生d n a 损伤时，g 2 期检查点就被激活，细胞被阻滞在 g 2 丹涯期。g 2 朔检查点的关键靶分子是c y c i i nb c d k l 复合物。 u v b 照射细胞导致细 胞d n a 发生损伤时，细胞会 激活相应调节机制使细胞周 期停滞，可以停止于g 1 s 、 s 及g 2 期 p e 仃o c e l l it ，2 0 0 0 【m o h 帅m a da t h 越2 0 0 0 】，为 d n a 损伤修复赢得时间、创 造条件。待细胞修复系统修 复损伤后细胞周期才再次 图1 细胞周期四个主要的检验点 开始运转。细胞周期抑制是 细胞对u v b 辐射的主要防御性反应之一。抑癌基因p 5 3 p 2 1 的表达在其中起着关 8 键作用。此外，p 5 3 基因直接参与了d n a 损伤修复过程( “q 1 9 9 8 】。 u v b 诱导形成的c p d 和6 4 p p 不能完全修复时，在细胞中会产q ：不同的效应 【l oh l ，2 0 0 5 。6 4 p p 会激活p 5 3 一p 2 l 基因通路。诱使细胞发生凋亡，从而避免基 因突变的产生。而c p d 主要参与抑制细胞周期【h s i n l u l l gl o ，2 0 0 5 。d e c r a e n ed 的实验发现u v b 照射细胞的应答蛋白p 5 3 会引起细胞周期抑制和d 】q a 修复 d e c m e n ed ，2 0 0 5 】 1 3 钙信号和各种生物学效应的关系 钙离子通过活化胞内各种钙离子依赖性激酶。参与调控胞内各种生理活动。 1 3 1 细胞凋亡中的钙倍号 外晃因子诱导细胞发生凋亡时，细胞内c a 2 + 浓度会显著、持续升高，进而表 现出一系列的生物学效应【o s hd b ，2 0 0 5 ；d e m a u r e xn ，2 0 0 3 ；郭静，2 0 0 5 】。u v 引起细胞凋亡也会导致胞内钙离子浓度的升高，进而调控很多依赖于钙离子的 酶，如与染色质降解有关的核酸内切酶、改变染色质结构作用的多聚a d p 一核糖 聚合酶( p a r p ) 【b e l l l l e t tm r ，1 9 9 5 ；y o n g m e ip u ，2 0 0 2 】，提示钙信号参与细胞凋亡的 起始和执行。 1 3 2 细胞周期中的钙信号 胞内钙离子浓度的增加与细胞周期进程有关，如g 0 期退出、g 1 s 转换和其 他s 期和m 期检验点【b e r r i d g em j ，1 9 9 5 ；k a l l lc r ，2 0 0 3 】等。 m u l l a m n 等人的实验发现钙离子可以激活c a m k l i ，进而直接参与细胞周 期的转换 m u n a r o nl ，2 0 0 0 】。s a l l t e l l a 的实验发现一些钙离子依赖激酶可以活化 d n a 分裂的核因子( c d k 和c y c l i n s ) ，使细胞进入m 期【s a m e l l al ，1 9 9 8 】。 钙依赖的转录因子( e r e b 和n 岸( r ) 则可以参与细胞周期调控。如钙激活 的c i 疆b 可以将细胞维持在静息状态，而钙激活的n f a t 参与诱导的细胞增殖 l i p s k a i al ，2 0 0 4 ；a m o u l dt 2 类的名称后篓啭非誓塑冀引夔| ；藿】。 u v b 能够升高细胞内钙离子浓度，引起细胞的 活力降低导致凋亡的发生，进而调控很多依赖钙离子的酶【d i n g b o u v 引起的细胞d n a 损伤在进行切除修复是依赖钙离子的 “一c h i n g c h a i l g ，1 9 9 9 】。 1 4 研究意义 u v b 属于中波段非电离辐射，具有穿透能力强且单个光子能量较大的特点， 能够直接诱导细胞d n a 发生损伤。 单细胞凝胶电泳做为一种检测细胞d n a 损伤的方法，具有灵敏度高，所需 时间短和花费少等特点，能够精确的检测到细胞中d n a 损伤及损伤后修复。 钙离子是胞内的第二信使。参与调控细胞内的各种生命活动，如细胞生长、 增殖、分化、凋亡等。在不受外界刺激时，细胞严格维持钙离子稳态；当细胞受 到外界刺激时，细胞表面或内质网膜上钙通道打开，使胞浆内游离c a 2 + 突然增加， 使钙离子表现出空间和时间上的变化，形成钙信号，从而影响细胞的生命活动。 比率荧光成像系统具有灵敏度高、选择性强等优点，与双波长荧光指示剂 ( f u r a 一2 a m ) 相结合，可以在单细胞水平对细胞胞内钙离子浓度进行实时定量 检测 g r z e g o r zg 1 9 8 5 ，为研究各种理化因子诱导的胞内钙信号的变化提供了有 效的实验方法。 我们采用u v b 作为损伤诱导因子诱导h e p a l 6 细胞损伤，用单细胞凝胶电 泳系统检测了d n a 损伤及修复情况，用台盼蓝染色法对处理后的细胞生长状况 进行了检测；同时采用比率荧光成像系统即时和延时检测了u v b 对细胞胞内钙 离子浓度变化的影响，并对细胞胞内钙离子变化的来源作了进一步的探讨。 总之，我们探讨了u v b 诱导细胞d n a 损伤及损伤修复过程中钙信号的变 化及其最终的细胞命运，为后续的紫外线致细胞d n a 损伤的信号通路研究奠定 了基础。同时为紫外线引起肿瘤发生的机理的研究提供相关实验依据。 参看文献： a m o u l dt v a n k o n n g s l o os ，r e n a r dp “矗c r e ba c t i v a t i o ni n d u c e d b ym i t o c h o nd r i a l d y s f u n c t i o n i san e w s i g n a i i n gp a t h w a y t h a t i m p a i r s c e | l p r 0 1 i f e r a i i o n ，e m b oj ， 2 0 0 2 ，2 i ( 1 2 ) ：5 3 6 3 b e n d e rk ，b l a t t n e rc ，k n e b e la ，p f 口，u v - i n d u c e ds i g n a i 仃a n s d u c t i o n ，j o u m a lo f p h o t o c h e m i s t r ya n dp h o t o b i 0 1 0 9 扎1 9 9 7 ，3 7 ：1 1 7 b e n n e t tm r ，g i h c o nd l ，s c l i w a n zsw p f 讲b i n d i n ga n dp h a g o c y t o s i so fa p o p t o t ；c v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e i i si sm e d i a l e di np a nb ye x p o s u r eo fp h o s p h a t i d y l s e r i n e ，o r er e s ， 1 9 9 5 ，7 7 ( 6 ) ：1 1 3 6 b e r r d g e mj ，b o o t m a nmd ，p e l e rl i p p ，ca l c i u m - ai i f ea n dd e a t hs i n g n a l ，n a t u r e ，1 9 9 8 ， 3 9 5 ( 15 ) ，6 4 5 - 6 4 8 b e r r i d g e m j ，l p p p ，b o o t m a n ，m d ，t h ev e r 蚰t i l i t y 卸du n i v e r s a “t yo fc a l c i u ms i g n a l i n g ， n a t r e vm o lc e b i o l ，2 0 0 0 ，1 ( 1 ) ：1 1 _ 2 1 b e s a r a t i n i aa ，s y n o i dt w ，c h e nh h ，“甜d n al e s i o n si n d u c e db yu v aa n dbr a d i a t i o ni n h u m a nc e l l s ：c o m p a r a t i v ea n a i y s e si nt | l eo v e r a l lg e n o m ea n d nt h ep 5 3t u m o rs u p p r e s s o rg e n e ， p r o cn a t la c a ds c iusa 2 0 0 5 ，1 0 2 ( 2 9 ) ：1 0 0 5 8 - 6 3 c h r i s t i n ea k o c h p a i z ，s a l l ya a m u n d s o n ，m i c h a e | l b i n n e “口 f u n c t i o n a lg e n o m i c s o f u vr a d - a t i o nr e s p o n s e si nh u m 鞠c e l l s ，m u 诅t i o nr e s e a r c h ，2 0 0 4 ，5 4 9 ：6 5 _ 7 8 c j a n eh a n s o n ，m a n l nd b o o t m 卸，hl i e w e l y nr 0 d e r i c k ，c e l ls i g 衄i l i n g ：i p 3r e c e p t o r s c h a n n e lc a i c i u mi n t oc e i ld e a c h ，c u r r e n ib i o l o g y ，2 0 0 4 ，1 4 ( 9 ) ：9 3 3 _ 9 3 5 d a h l ej ，k v a me ，s t o k k et b y s t a n d e le f f e c 拓i nu v 二j n d u c e dg e n o m i ci n s t a b i i i t y ：a n t i o x j d a n t s i n h _ b i td e l a y e dm u t a g e n e s i si n d u c e d b yu l t r a v i o l e t aa n dbr a d i a t i o n ，jc 甜c i n o 岛2 0 0 5 ，9 ：4 1 1 d e c r a e n ed ，s m a e r sk ，m a e sd ，“口，al o wu v bd o s e ，w i t ht h ep o t e n t i a it o t r i g g e ra p r o t e c t i v ep 5 3 - d e p e n d e n tg e n ep m g m m ，i n c r e a s e st h er e s i l j e n c eo fk e r a t i n o c y t e sa g a i n s tf u t u r e u v bi n s u l t s ，j i n v e s td e n t l a t o l ，2 0 0 5 ，1 2 5 ( 5 ) ：1 0 2 6 - 3 1 d e m a u r e xn ，d i s t e l h o r s tc ，a p o p t o s i s t h ec a l c i u mc o n n e c t i o n ，s c i e n c e ，2 0 0 3 ；3 0 0 ：6 5 - 6 7 e h r h 矾j c ，g 。s s e 】e t 鞭c u i e m e rr m ，d 砝u v b i n d u c e dm u t a t i 。n si nh u m a nk e y g a t e k e e p e r g e n e sg o v e m i n gs i g n a i i n gp a t h w a y s a r i dc o n s e q u e n c e sf o rs k i n t u m o u r i g e n e s i s ， p h o t o c h c mp h o t o b i o is c i ，2 0 0 3 ；2 ( 8 ) ：8 2 5 - 8 3 4 g a r ym h a l i i d a y ，i n 门a m m a t i o n ，g e n em u t a t i o na n dp h o t o i m m u n o s u p p r e s s i o ni nr e s p o n s et o u v r - i n d u c e do x i d a t i v ed a m a g ec o n t r i b u t e st 0p h o t o c a r c i n o g e n e s i s ，m u t a t i o nr e s e a r c h ，2 0 0 5 ，5 7l ： 1 0 7 一1 2 0 g r z e g o r zg m a n i nd ，r o g e rytan e wg e n e r a t i o no f c a 2 + i n d i c a t o r sw i i hg r e a t l yi m p r o v e d n u o r e s c e n c ep r o p e r t i e s jb i o lc h e m ，1 9 8 5 ，2 6 0 ( 6 ) ，3 4 4 0 - 3 4 5 0 h s i n l u n gl o ，s a t o s h in a c a j i m a ，l i s am a e fd ，d i 债r e n t i a l b i o l0 9 j ce 彘c t so fc p da n d 6 4 p pu v - i n d u c e dd n ad a m a g eo nl h ei n d u c t i o no f a p o p t o s j sa n dc e l l - c y c l ea 丌s t ，b m cc a n c e r ， 2 0 0 5 5 ：1 3 5 1 1 第二章u v b 对h e p a l 6 细胞【c a 2 + 】i 的影响 钙离子作为细胞内的第二信使，在传递胞内信息、调控细胞生理功能( 例如 生长、增殖、分化等) 等方面具有重要作用【l i p s k a i al ，2 0 0 4 】，所以检测细胞钙 离子浓度变化对于了解细胞的生命过程十分必要。 实验采用比率荧光成像系统结合双波长荧光染料标记的方法来检测细胞内 钙离子浓度的变化。实验选用f u r a 2 a m 作为荧光染料，它是一种用紫外激发的 双波长c a 2 + 指示剂。与其它钙离子检测方法相比，该系统能够有效地减小因为光 漂白效应、指示剂泄漏、胞内指示剂非均匀分布、试剂绝对浓度及仪器绝对灵敏 度等造成的实验误差【g r z e g o r 2g ，1 9 8 5 】，是进行细胞【c a 2 + 】i 实时、定量检测较为 可靠的方法。 u v b 能够引起细胞d n a 损伤 a r i ea v i t l l ( ，1 9 9 8 】，进而激活一种调控机制使 细胞周期停滞，待细胞修复系统将损伤修复后，细胞再次进入周期开始运转；当 损伤不能被有效修复时可引起突变。如果突变使抑癌基因失活或致癌基因活化 【d a i l i e lb y a r o s h ，2 0 0 2 】，就会导致细胞癌变；另外突变可促发细胞的凋亡( 见图 2 1 ) 【j u d i mj a l l s ，2 0 0 5 】。细胞增殖与凋亡是维持细胞数量平衡与机体正常功能的 保证。钙离子作为胞内信使 y u 一n gc h a o ，2 0 0 4 】，参与调节了细胞的增殖和凋亡 【b e r r i d g e ，m j ，l9 9 8 】。 图2 1u v b 对细胞的影响 本实验中，我们首先建立并优化了比率荧光成像系统检测h e p a l 6 细胞 【c a 2 + l 的实验方法；之后，采用此方法检测了u v b 照射h e p a l 6 细胞引起的 c a 2 + 】。 的变化，并对其钙信号形成的原因进行了初步探讨。为进一步研究【c a “】与d n a 损伤、及其生物学效应的关系奠定基础。 2 1 比率荧光成像检测系统测量【c a 2 + 】i 的原理【g r z e g o r zg ，1 9 8 5 ；郭 4 四曰 2 3 材料与方法 2 3 1 h e p a l 6 细胞的培养 h e p a l 6 细胞是小鼠肝癌细胞，来源于上海生命科学院细胞与生化研究所。 将细胞接种于9 0 d m e m ( g i b c o 公司) + 1 0 新生牛血清( 四季青公司产 品) + l l g l n ( a m r e s c o 公司) 和双抗( 青、链霉素，1 0 0 u “m l ) 的完全培 养基中，在5 c 0 2 、饱和水蒸气的培养箱中培养。取对数生长的h 印a 1 6 细胞 进行实验。 2 3 2u 照射装置 本实验室自行研制，顶部安装紫外消毒灯( 8 w 石英紫外线杀菌灯，发射主谱 线为3 1 2 n r n ，属u v b 波段，天津市紫晶特种光源有限公司) 。 紫外灯 光源控制门 载物台 载物台间距1 0 c m 圈2 3u v b 照射装置 2 3 3 实验用试剂及配制 h a n k s 贮存液( 1 0 储存液) ：n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 00 6 9 ，k h 2 p 0 40 ，6 9 ， m g s 0 4 7 h 2 02 o g ，n a c l8 0 o g ，葡萄糖1 0 0 9 ，三蒸水9 0 0 m l ，c a c l 2 6 h 2 014 9 三蒸水1 0 0 m l ，用5 n a h c 0 3 调p h 为7 ，2 7 4 ，配制1 0 储存液，过滤除菌后 1 0 m l 分装。用时稀释1 0 倍，加入b s a ( 牛血清白蛋白，a m r e s c o 公司产品) ， 使其终浓度为0 1 。 6 扣 一 m d h a i l k 5 液( 1 0 储存液) ：n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 01 2 9 ，k h 2 p 0 4o 6 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0 2 o g ，n a c l8 0 o g 葡萄糖1 0 o g ，三蒸水l o o o m l 。用时稀释l o 倍并过滤除菌， 加入终浓度为o 1 b s a ( 牛血清白蛋白，a m r e s c o 公司产品) 。 f u r a 一2 a m ( 1 m g ) ：s 堙m a 公司产品。f u r a 一2 a m 用d m s 0 ( 二甲基亚砜， s i g m a ) 溶解后避光分装( 1 p g ，“l ) ，临用时根据标记浓度用d m s o 稀释。 e g l i a ( a m e r s c o 公司产品) ：采用l m 的n a o h 配制成0 2m o l l 的工作液 ( p h 8 o ) 。 t r i t o nx 一1 0 0 ( s i g m a 公司产品) ：使用终浓度为0 2 。 v 打s e n e ：n a c l8 9 ，k c lo 2 5 9 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 6 9 ，k h 2 p 0 4o 2 5 9 ， e d l a2 n a0 2g ，溶于l l 的蒸馏水中。高压灭菌。 胰蛋白酶( 天津t b d 产品) ：o 1 ，1 0 0 m l 的v e r s e n e 溶解0 1 9 的胰蛋白 酶，用5 n a h c 0 3 调p h 7 4 7 6 ，过滤除菌。 其它试剂均为分析纯。 2 3 4 实验流程 ( 1 ) 细胞接种：取对数生长的细胞，台盘蓝计数，调整细胞密度至 l 1 0 5 c e l l s m l ，接种于放有盖玻片的六孔板中，置培养箱中培养1 2 h 。 ( 2 ) u v b 照射处理；采用不同强度的u v b 照射处理细胞。 ( 3 ) 荧光标记，采集图像。 ( 4 ) 胞内钙离子浓度的计算。 2 3 5 实验分组及u v 处理 2 3 5 1 实验参数的筛选 首先选择了不同的标记浓度和标记时间，进行细胞胞内钙离子浓度检测，观 察荧光图象和比率图像，筛选最佳标记浓度和标记时间。 在此基础上我们选择用不同密度的细胞接种，培养1 2 h 后进行胞内钙离子浓 度的检测，观察细胞密度对实验结果的影响。 度f 蒜? 德罗嘲；o o m 裟l ， 猫：激 赫 罢 5 此5 此 2 _ 3 5 2u v b 诱导的h e p a l - 6 细胞 c a 2 + l 变化的即时检测 从六孑l 板中取出生长有h e p a l 6 细胞的盖玻片，置于含有2 m lh a i l k s ( 龠 o ，1 b s a ) 的培养皿( 中= 3 5 m m ，o 咖1 9 e 公司产品) 中，采用u v b 照射箱进行紫 外线照射处理，然后进行细胞胞内钙离子浓度的检测。照射强度为4 4 “w c m 2 ( 环 地牌紫外辐照计测量，北京师范大学光电仪器厂产品) 。 实验分为对照组和照射组，实验组的细胞用u v b 分别照射2 s 、1 0 s 、3 5 s ，6 0 s 、 1 3 0 s 、1 7 0 s 、2 1 0 s ，共7 组，对照组细胞不进行紫外线照射处理，处理后进行细 胞内钙离子浓度的计算。 2 3 5 3 u v b 诱导的h e p a l 6 细胞 c a 2 + 。的延时检测 按照2 t 3 5 2 中的方法收集细胞，然后用4 4 “w c m 2u v b 分别照射2 s 、6 0 s 、 1 7 0 s ，照射后的细胞再次移入原培养基中， 3 7 、5 c 0 2 饱和湿度的培养箱中 分别培养不同时间( o 、o 5 、1 、1 5 、2 、4 h ) ，然后进行胞内钙离子浓度的检测。 实验分为对照组和实验组。实验组共2 4 组，对照组细胞不进行紫外线照射处 理。 2 ，3 5 4 不同胞外环境对u v b 所诱导的h e p a l 6 细胞 c a 2 + 的影响 从六孔板中取出生长有h e p a l 一6 细胞的盖玻片，置于含有2 m lh a i l l ( s ( 含 o 1 b s a ) 或d h a i l k s ( 含0 1 b s a ) 的培养皿中( 巾= 3 5 m m ，o r 趴g e 产品) ，进 行u v b 照射。 实验分为对照组和照射组，实验组的细胞分别用h a n k s ( 含o 1 b s a ) 和 d h a l l k s ( 含0 ，1 b s a ) 重悬后，用4 4 “w ，c m 2u v b 分别照射2 s 、6 0 s 、1 7 0 s ， 共6 组，然后进行细胞胞内钙离子浓度的检测。 2 3 6 数据处理 采用i m a g e m a s t e r 软件对荧光图象进行数据采集与处理。实验组所得数据与 对照组进行统计学处理，处理结果进行t 检验。 2 4 比率荧光成像系统实验条件的筛选结果 2 4 1 f u r a 2 a m 标记条件筛选 ab c 图2 4f u n 。2 ，a m 标记h e p b l _ 6 细胞的荧光图像 ( 图2 4 是采削f u r a - 2 a m 标记h e p a l 6 细胞后的荧光图像。其中a 图和b 图分别 是在3 4 0 n m 和3 8 0 n m 紫外光激发所产生的荧光图像，c 图是a 、b 两图的比率荧光图像。) 我们首先筛选了f u r a 2 a m 的标记h 印a 1 6 细胞时所需要的标记条件( 荧光探 针标记时间及浓度) 。结果见图2 ，4 。首先采用0 0 5 州的浓度标记细胞( 分别标记 1 5 、2 0 、2 5 m i n ) ，观察发现标记时间为1 5 、2 0 m i n 时，背景荧光强度较低，但细 胞图像的荧光强度过低，比率图像中不能见到清晰的细胞图像；标记时间为2 5 m i n 时，细胞图像较清晰。将探针浓度增加至0 1 m 时进行标记( 标记时间1 5 、2 0 、 2 5 m i n ) 后发现，当标记时间为1 5 m i n 时，也不能观察到清晰的细胞图像，而标 记时间延长到2 5 m i n 时，观察到很强的背景荧光，标记时间为2 0 m i n 时，背景荧 光强度较低，细胞图像十分清晰。但标记时间过久容易出现f u m 2 荧光染料的房 室化现象，导致标记失败。综合以上结果我们选择0 1 岫o l ，l 浓度标记2 0 m i n 作为 后续实验的标记条件。 2 4 2 细胞接种密度的筛选结果 采用上述的实验结果( o 1 岫o l lf u r a - 2 a m 避光标记h e p a l 6 细胞2 0 m i n ) 对不同的细胞接种密度( 0 5 1 0 5 c e l l s l 、1 1 0 5 c e l i s l 、2 1 0 5 c e l l s l 、l 1 0 6 c e l l s l 、 6 1 0 5 c e l l s l 、2 1 0 6 c e l l s l x 第三章u v b 诱导细胞d n a 损伤及损伤修 复研究 u v b 可直接引起细胞d n a 损伤。当u v b 的光子被d n a 吸收后，产生c p d ( c y c l o b u t a n ep y “m i d i n ed i m e r s ) 和6 4 p p ( 6 4p h o t o p m d u c t s ) ，引起d 咐a 结构的变 化，这种结构变化能够被核苷酸切除修复( n e r ) 识别和修复 r i k a k