（信息与通信工程专业论文）延迟荧光表征植物光合能力方法研究.pdf

摘要 摘要 光合作用是推动地球生物圈内几乎所有生物各种生命活动的源泉，是地球上 最重要的化学反应。光合速率是揭示光合作用运转调节规律的探针，它的测定是 光合作用研究的重要手段之一。延迟荧光( d e l a y e df l u o r e s c e n c e ，d f ) 是植物光 合器官在停止光照后的发光现象，仅发生在活的细胞里面。由于延迟荧光来源于 光合电子传递链，光诱导延迟荧光在发光时间上比荧光慢，而且延迟荧光本身也 是伴随着光合作用产生的，因此较叶绿素荧光更有利于研究光合作用。延迟荧光 本身的特点决定了它在光合能力检测中具有的优势：快速、准确、无损。 本文依据延迟荧光发射和激发特性，以及延迟荧光动态衰减规律，设计并实 现了一套在位且环境条件( c 0 2 浓度、温度、湿度、激发光强、激发时间) 可控的 延迟荧光动态衰减信号检测系统，此系统以延迟荧光探测器即通道型光电倍增管 模块c p d m 为核心，样品暗室与处理机箱合为一体；以d s p ( t m s 3 2 0 f 2 8 1 2 ) 为 处理器，可快速处理数据，并且系统的可控程度高：在样品暗室内集成了光电传 感器；还设计了激发光源强度的调节控制模块。 并用此延迟荧光动态衰减信号检测系统进行了延迟荧光表征植物光合能力的 实验研究，此实验是在最优条件( 温度、湿度和c 0 2 浓度) 下，研究不同激发光 强下植物叶片延迟荧光强度和净光合速率( n e tp h o t o s y n t h e t i cr a t e ，p n ) 的相关性。 测量时先用光合速率测定仪( l i 6 4 0 0 ) 在饱和光强区测量叶片的净光合速率，再 用延迟荧光检测系统在不同的激发光强区测量延迟荧光强度值，然后用o r i g i n 7 5 软件对所测结果进行拟合，得出延迟荧光强度与净光合速率的相关性。 最后，本文对光诱导延迟荧光的应用研究作了简要的展望，延迟荧光作为一 种极其灵敏的生物指标，可在医学、生物科学等领域得到广泛的应用。 关键词：延迟荧光；激发光强；净光合速率；光合能力 a b s t r a c t a b s t r a c t p h o t o s y n t h e s i si st h es o u r c eo fa l lv i t a lm o v e m e mo fa l m o s ta l ll i v i n gt h i n g si nt h e g l o b a lb i o s p h e r e ，i ti st h em o s ti m p o r t a n tc h e m i c a lr e a c t i o n p h o t o s y n t h e t i cr a t ei st h e p r o b eo fr e v e a l i n gt h eo p e r a t i n ga n da c c o m m o d a t i n gr e g u l a t i o no fp h o t o s y n t h e t i c i t s d e t e r m i n a t i o ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tm e t h o d so fp h o t o s y n t h e s i sr e s e a r c h d e l a y e d f l u o r e s c e n c e ( d f ) p h e n o m e n ac a nb ed e s c r i b e da sl i g h te m i s s i o no fp h o t o s y n t h e t i c o r g a n i s m ss h o r t l ya f t e rt h e i ri l l u m i n a t i o na n do n l yo c c u r si nl i v i n gc e l l s d fd e r i v e s f r o mt h ep h o t o s y n t h e t i ce l e c t r o nt r a n s p o r tc h a i n ，l i g h ti n d u c e dd fi ss l o w e rt h a n f l u o r e s c e n c e ，s oi ti sm o r eb e n e f i c i a lt or e s e a r c hp h o t o s y n t h e s i st h a nc h l o r o p h y l l f l u o r e s c e n c e t h ec h a r a c t e r i s t i c so fd fi t s e l fd e t e r m i n e si t sa d v a n t a g ei nt h ed e t e c t i o n o fp h o t o s y n t h e t i cc a p a c i t y ：f a s t 、a c c u r a t e 、l o s s l e s s t h i sp a p e rb a s e do nt h ee m i s s i o na n de x c i t a t i o nc h a r a c t e r i s t i co fd f ，a n dt h e d y n a m i cd e c a yr e g u l a t i o no fd f ，d e s i g n sa n di m p l e m e n t sas y s t e mo ft h ed y n a m i c d e c a ys i g n a ld e t e c t i o no fd fi nv i v oa n de n v i r o n m e n t a l ( t h ec o n c e n t r a t i o no fc 0 2 、 t e m p e r a t u r e 、h u m i d i t y 、e x c i t e dl i g h ti n t e n s i t y 、e x c i t e dt i m e ) c o n t r o l ，t h i ss y s t e m sc o r e i st h ed fd e t e c t o rn a m e l yt h em o d u l eo fp a s s a g et y p ep h o t o m u l t i p l i e rt u b e ( c p d m ) ， a n dt h e s y s t e mm e r g e st h ed a r ks a m p l ec h a m b e ra n dp r o c e s s i n gc h a s s i s ；t h ed s p ( t m s 3 2 0 f 2 8 12 ) i st h e p r o c e s s o rf o rt h es y s t e m ，i tc a np r o c e s sd a t ar a p i d l y ，a n d i m p r o v et h ec o n t r o l l a b l ed e g r e eo fs y s t e m ；i ti n t e g r a t e sp h o t o e l e c t r i cs e n s o ri nt h ed a r k s a m p l ec h a m b e r ；i ta l s od e s i g n st h er e g u l a t i o nc o n t r o lm o d u l eo ft h ei n t e n s i t yo f e x c i t a t i o nl i g h ts o u r c e t h i ss y s t e mo ft h ed y n a m i cd e c a yd e t e c t i o no fd fi su s e dt os t u d yd f a t t r i b u t i n g p h o t o s y n t h e t i cc a p a c i t yo fp l a n t s ，a n dt h i se x p e r i m e n ti sr e s e a r c ht h er e l a t i v i t yb e t w e e n d fi n t e n s i t ya n dn e tp h o t o s y n t h e t i cr a t eg n ) i nd i f f e r e n te x c i t e dl i g h ti n t e n s i t yi n o p t i m u mc o n d i t i o n s ( t e m p e r a t u r e 、h u m i d i t ya n dt h ec o n c e n t r a t i o no fc 0 2 ) w h e n m e a s u r i n g ，t h ep h o t o s y n t h e t i cr a t et e s t e r ( l i 一6 4 0 0 ) i su s e dt om e a s u r et h ep no ft h e l e a v e si nt h es a t u r a t e dl i g h ti n t e n s i t yf i r s t l y ，u s i n gt h ed fd e t e c t i o ns y s t e mm e a s u r e st h e d fi n t e n s i t yi nd i f f e r e n tr e g i o no fe x c i t e dl i g h ti n t e n s i t ys u b s e q u e n t l y ，a n dt h e nt h e a b s t r a c t s o f t w a r eo fo r i g i n7 5i su s e dt of i tt h ed a t ao fm e a s u r e m e n tr e s u l t s ，t h e r e b yo b t a i n i n g t h er e l a t i v i t yb e t w e e nd fi n t e n s i t ya n dp n i nt h ee n d ，t h i sp a p e rm a k e sab r i e fp r o s p e c to nt h ea p p l i c a t i o nr e s e a r c ho fl i g h t i n d u c e dd f ，d fi st a k e na sae x t r e m e l ys e n s i t i v eb i o l o g i c a li n d e x ，i tc a nb ew i d e l y a p p l i e di nm e d i c a ls c i e n c e 、b i o l o g ys c i e n c ea n do t h e rf i e l d s f i n a l l y ，af u l ls u m m a r yo f t h et h e s i si sg i v e n k e yw o r d s ：d e l a y e df l u o r e s c e n c e ；e x c i t e dl i g h ti n t e n s i t y ：n e tp h o t o s y n t h e t i cr a t e ； p h o t o s y n t h e t i cc a p a c i t y 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成硕士学位论文延迟荧光表征植物光合能力方法研究”。除论文中已经注 明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体己经公开发表或 未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：多蟹砖刍 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论 文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式 出版发行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密一( 请在以上方框内打“ ) 一日亲写瓣 日期：7 ：畔吖年移月劢日 延迟荧光表征植物光合能力方法研究 第1 章绪论 1 1 课题的研究目的和意义 延迟荧光是植物光合器官在停止光照后的发光现象【1 】，它与荧光有相同的波形 但比荧光寿命要长，能从n s 持续到几分钟【2 】，仅发生在活的植物细胞里面，是光 合活性色素吸收光能以后的暗适应期间在反应中心p 6 8 0 ( 能被波长为6 8 0 n m 的光 激发的色素，称为p 6 8 0 ) 发生电子复合的结果。从生化的角度来看，生物延迟荧 光实质上是生命系统的化学发光。生理生化过程中形成的激发态中间物质退激时， 一部分能量便以光子的形式释放出来。因此，无论是外界因素还是内在因素对生 理状态和生化过程的影响，都能够从延迟荧光的强度和光谱的变化中反应出来。 探寻延迟荧光与生理状态和生化过程的内在联系，为从微观层次了解生命的奥秘 提供了新的途径和方法。目前，延迟荧光已在生物医学、农业科学、食品工业和 环境科学等研究领域显示出广泛的应用前景【弘5 1 。 由于延迟荧光来源于光合电子传递链，光诱导延迟荧光在发光时间上比荧光 慢，而且延迟荧光本身也是伴随着光合作用而产生，所以较叶绿素荧光更有利于 研究光合作用【6 ，7 】。延迟荧光本身的特点决定了它在光合能力检测中具有快速、准 确、无损等优势。 目前在延迟荧光技术研究中，主要有三种方法：延迟荧光动态衰减、延迟荧 光激发光谱及延迟荧光诱导动力学。而延迟荧光动态衰减是其中最为基础的一项 研究，是其他两种方法的基础，也是本论文中主要研究的延迟荧光技术。但是在 目前，延迟荧光动态衰减检测技术中存在着离体和环境( 温度、湿度及c 0 2 浓度 等) 不可控带来的测量不准确、应用受限、重复性差等缺点。 无数微生物、植物和动物构成了丰富多彩、生机勃勃、变化无穷得地球生物 圈，它的存在、运转和发展- n 也离不开光合作用。从根本上说，唯有光合作用 能够为其中的各种生物提供食物、氧气和能量。既然光合作用如此重要，那么它 的效率即光合作用效率也即光合能力的高低及其变动、调节就是令人关注的重要 问题了。光合作用效率是揭示光合作用运转调节规律的探针，也是植物生产力和 第1 章绪论 作物产量高低的根本决定因素，它的测定是光合作用研究的重要手段之一，在研 究人类面临的粮食、资源和环境等问题上都具有重大意义。因此，确定一种快速、 精确和实用的测定方法是十分重要的。 因此，本文以延迟荧光衰减技术为核心，设计了一套延迟荧光动态衰减检测 设备，并对利用延迟荧光动态衰减技术进行植物光合能力快速检测进行实验研究， 这对于植物光合作用的无损快速检测具有重要的理论意义和使用价值，同时也为 延迟荧光技术在其他领域的应用研究提供了一定的理论和实验基础。 1 2 植物延迟荧光研究综述 1 2 1 生物发光的基本原理 光是自然界最普遍的现象之一。十九世纪末到二十世纪初，光的研究深入到 光的发生、光的物质相互作用的微观机构中，人们这才对发光的原理有了本质的 认识1 6 】。发光的定义是物体在相同温度下，把本身热辐射或多余能量以光的形式辐 射出去，且辐射持续时间远远超过光学光谱波段范围内的辐射周期，这种光辐射 称为发光。 1 2 1 1 激发态的辐射跃迁 众所周知，物质的原子是由电子核和电子层所构成的。不同的原子含有不同 数量的电子、电子层，电子是在不停地运动着的。根据量子理论，运动着的电子 可以处于一系列不连续的能量状态( 即能级) 中，电子遵守定的规则，可以从 一个能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。 一般情况下，电子总是处于能量最低的能级( 即基态) 。在一定条件下，电子可 吸收能量( 如光能、热能、电能、机械能等) 跃迁到较高能级( 即激发态) ，这 个过程称为激发。处于激发态的电子由于有较高的能量而不稳定，它总是要跃迂 回到基态，将多余的能量释放出去，释放多余的能量的方式有：分子内的跃迁和 分子间的相互作用。分子内的跃迁方式可能是辐射跃迁，也可能是非辐射跃迁。 以非辐射跃迁方式跃迁时，能量大多转化为热能，这个过程叫内转换，而以辐射 方式跃迁时，能量转化成相应波长的光，这个过程称为发射，产生的光分为两种： 2 延迟荧光表征植物光合能力方法研究 荧光和磷光，如图1 1 所示。 分子处于基态，两个电子自旋方向相反且耦合得很强。当吸收光子处于激发 态时，虽然能量提高了，但电子自旋方向并未改变，但它们之间的耦合程度减小 了，这时的激发态仍然是单重态，所以叫单重激发态，并相应有第一与第二单重 激发态等等；处于激发态时，如果有外力存在，如电子核原子核轨道的磁矩较大， 就会使一个电子自旋方向反转，从而使两个电子自旋方向相同( 或相平行) ，这 时的分子就是处于三重态l2 | ，这个过程叫做系间转换。 s 2 s l 吸 收 jl j l ，h 亡土斗缸 jl ”“、 jl 0 jl 系间转换 一荧一 1nr 1r 1nr 光 磷 光 r r 1r 1 r 1r 1r1 r 1 r 1r s 0 ：基态 s 1 ：第一单重激发态t ：三重激发态 图1 1 激发态分子的跃迁过程 f i g 1 1t r a n s i t i o np r o c e s so fe x c i t e ds t a t em o l e c u l e t 1 2 1 2 荧光 在光的照射下，物质的电子吸收能量后，可由低能级的电子层( 内层电子) 跳到高能级的电子层。此时，电子由低能态进入高能态。高能态的电子是不稳定 的，它会在极短的时间( 1 0 墙s ) 内，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原 第1 章绪论 来的能态。这时发射出的光的波长比激发光的波长要长，在可见光波长的范围内， 为人眼所能看见的光，这种光称为荧光。 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。由于单重激发态很不稳定，半 。衰期很短，电子直接由单重激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级， 并以光的形式放出它们所吸收的能量，发射持续的时间也很短，这种发射光寿命 较短，即为荧光。1 8 3 8 年，b r e w s t e r 首先描述了这荧光现象，但荧光一词，是 由s t o k e s 在1 8 5 2 年提出的。 荧光是发光体分子中处于激发态的原子核外电子由高能级回到低能级所产生 的辐射，因此是冷光。荧光的颜色多为蓝色、绿色、红色和黄色等。 引起荧光的方式有很多种，如：由光激发所引起的荧光称为“光致荧光”； 由化学反应所引起的荧光称为“化学荧光”；由x 射线或阴极射线引起的荧光分 别称为“x 射线荧光”或“阴极射线荧光”；由激发引起的荧光称为“激发荧光”。 如果化学发光在有生命的生物体中产出，例如：萤火虫( 萤火虫的发光机制是体 内的荧光素、荧光酵素、a t p 及氧的化学反应而发光) 和含磷的真菌，称为“生 物发光”。无论哪一种荧光，其发光机制都是相同的。 荧光的光谱有发射光谱和吸收光谱两种。荧光强度是激发波长和发射波长两 个变量的函数。当激发波长固定时，荧光强度( 纵坐标) 随其发射波长( 横坐标) 改变的图形就是荧光发射光谱，如图1 21 ) 所示。有机化合物的发射光谱的形状 一般不随激发波长的变更而改变。当发射波长固定时，荧光强度( 纵坐标) 随其 激发波长( 横坐标) 改变的图形就是荧光激发光谱，如图1 22 ) 所示。当选用不 同的发射波长时，荧光激发光谱的形状可能会发生改变。荧光光谱是激发态的重 要物理特性之一，可通过荧光光谱得知激发态的有关性质。 4 延迟荧光表征植物光合能力方法研究 荧 光 强 度 发射波长 1 ) 荧光的发射光谱 荧 光 强 度 激发波长 6 0 0 h m 2 ) 荧光的激发光谱 图1 2 荧光的发射光谱和激发光谱示意图 f i g 1 2t h ee m i s s i o ns p e c t r u ma n de x c i t a t i o ns p e c t r u mo ff l u o r e s c e n c e 1 2 1 3 磷光 荧光物质分子去活化回到基态的过程除了发荧光之外，还可能包括热能和磷 光等释放能量的形式。如果受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，当它所处 单重态的较低振动能级与激发三重态的较高能级重叠时，就会发生系间窜跃，到 达激发三重态，经过振动弛豫达到最低振动能级，然后以辐射形式发射光子跃迁 到基态的任一振动能级上，这时发射的光称为磷光。磷光的产生过程见图1 1 。由 于三重态的半衰期较长，发射持续时间也较长，因此磷光寿命较长，可达几分钟。 磷光也是一种辐射跃迁释放能量的形式，其通常要在低温或刚性介质中才能被观 察到。 磷光一般要比荧光弱得多，这是因为发射磷光的第一三重激发态( t 1 ) 通常 不易从基态( s o ) 直接吸收光子而形成，t 1 态主要是从第一单重激发态( s 1 ) 经系 间窜跃而形成的。由于受荧光及内转换过程的竞争，从s 1 态向t 1 态系间窜跃的量 子产率就大大降低了。另外，与荧光过程不同，磷光发射过程是自旋禁阻( 自旋 发生改变的电子跃迁) 的过程。 第1 章绪论 1 。2 1 4 延迟荧光 s t r e h l e r 和a r n o l d 于1 9 5 1 年在光合磷酸化研究中发现了延迟荧光现象，延迟 荧光就是植物光合器官在停止光照后的发光现象，它与荧光有相同的波形但比荧 光寿命要长，能够从n s 持续到几分钟。 无论是荧光还是延迟荧光，都是由激发态叶绿体分子p 6 8 0 + ( 激发态p 6 8 0 ) 向基态跃迁产生【6 】。直接由激发光激发产生的p 6 8 0 + ，向基态跃迁，发出延迟荧光。 对于延迟荧光的产生有多种理论【7 】：三重态三重态理论、电子空穴理论、电荷重 结合理论、相干理论等，现在普遍接受的理论则是电荷重结合理论。 对延迟荧光光谱的研究结果表明高等植物叶绿体的延迟荧光光谱包括以下特 征：叶绿体延迟荧光光谱和荧光光谱具有几乎相同的波形：主峰为6 8 5 n m ，7 3 0 n m 处为次峰。邢达、王维江等人对高浓度叶绿体的延迟荧光光谱进行了研究，发现 不同于他人的结果【8 ，9 】。对于6 8 5 n m 处的主峰，则认为来自于叶绿体光系统i i ( p s i i ) 作用中心的光化逆反应。并且人们认为高等植物中延迟荧光主要来自于p si i 【1 4 】，但是人们通过对只有光系统i ( p si ) 的光合细菌研究发现，缺少p si i 的生 物仍然有延迟荧光发生，只是与具有p si i 的生物体相比，强度有数量级的差别【。 对7 3 0 n m 处的次峰的产生只是认为因为两光系统具有完全不同的结构，因此不是 由于电荷的回流复合产生【l ，而进一步详细研究未见文献报道。 人们对延迟荧光的研究发现很多因素影响延迟荧光的强度【1 2 】，如激发光波长、 激发光强度、激发时间、样品温度、暗适应时间和延迟时间等。不同波长的激发 光对延迟荧光有不同的激发效率：不同强度的激发光诱导延迟荧光存在一个饱和 激发光强值，在此强度之前，延迟荧光强度随激发光强增加而增加，超过饱和强 度后，继续增加激发强度，延迟荧光强度几乎不变，若再增大激发光强，则会削 弱延迟荧光强度；样品的温度对延迟荧光有比较复杂的影响【1 3 l 。 1 ，2 2 植物延迟荧光产生机理研究现状 到目前为止有关延迟荧光产生的机理主要有四种：三重态三重态理论、电子 空穴理论、电荷重结合理论、相干理论等。 6 延迟荧光表征植物光合能力方法研究 ( 1 ) 电子空穴理论 a r n o l d 和a z z i 在1 9 7 1 年提出电子空穴理论，该理论是将光合单位看成是具 有半导体特征性的物质，并且认为在导带上有一些不同深度的电荷缺陷。在p si i 中的光合单位有两个电荷缺陷，一个是电子陷阱，一个是空穴陷阱，每一个都有 其反应中心。例如，在光合单位中一个光子可导致一个电子和空穴发生，电子陷 入反应中心，而空穴仍自由留在导带上。相反，在另一反应中心，空穴陷入，自 由电子留在导带上。当自由电子与自由空穴重结合时便产生延迟荧光。因为目前 为止还没有发现具有半导体特性的色素系统，所以这个理论未被普遍接受。 ( 2 ) 三重态三重态理论 在叶绿素受激发或者靠z 与q 重结合，其中z 是反应中心的第一电子供体， q 是原初电子受体，p si i 反应中心可借系间交叉产生三重态。这些三重态激子可 以进行无辐射跃迁的衰变，或者两个三重态融合产生一个单重激发态与一个基态， 次单重激发态可以辐射延迟荧光而回到基态。绿色植物中的三重态仅仅在正常的 光化反应已饱和或者有些失活时才能观察到，而在高光强下光化学反应处于正常 的水平，叶绿素a 的荧光就是由于形成三重态而淬灭，因此这种理论也未被普便 接受。 ( 3 ) 电荷重结合理论 a m e s z ，j 和h j v a ng o r k o m 在1 9 7 8 年提出了著名的电荷重结合理论，根 据该理论，对于延迟荧光，p 6 8 0 + 则是由光合作用原初光化学反应过程中产生的电 荷复合产生。现在公认的观点是在放氧组织中的延迟荧光来自于p si if 1 4 】。 延迟荧光主要来源于植物p si i 中的光化逆反应【1 4 】。产生机理可简述如下【7 】： 在光照过程中p si i 反应中心产生的氧化还原产物，由于突然停止光照而发生逆转 反应，即处于氧化态的p 6 8 0 + 与还原态的原初电子受体q 所带电荷复合而产生激发 态的p 6 8 0 + ，p 6 8 0 退激发产生延迟荧光及能量。反应可表示如下： z p 6 8 0 q 与z p 6 8 0 + 矿专z p 6 8 0 + q 专z p 6 8 0 q + ( 1 1 ) 式中p 6 8 0 + 与p 6 8 0 分别为反应中心的叶绿素a 处于氧化态与单重激发态。若 第1 章绪论 加羟胺，延迟荧光发光强度会降低，因为羟胺给电子到z ，从而减少正负电荷之一 的数量。与此相似，若在电子传递链上加入电子受体，也会降低延迟荧光，这些 都支持此学说。 ( 4 ) 相干理论 p o p p 等人在1 9 9 2 年提出生物光子的“相干理论 【1 5 】，这一理论认为一部分生 物系统自发发射或光诱导发射的光子起源于生物系统内的一个完全相干的电磁 场，这种由生物体内相干电磁场释放的光子叫做“生物光子”，而且，这种相干 电磁场很可能是活组织内通讯联络的基础，这样建立了生物光子的“相干理论”。 除了上述四种基本的理论之外，一些延迟荧光机理方面的理论研究国内外也 有报道【1 纠9 1 。到目前为止，电荷重结合理论是被普遍接受的。根据此理论，延迟 荧光产生机理为：在光合作用过程中，光能被天线分子吸收将能量传递到光系统 反应中心，反应中心得到光能后产生电荷分离，电子从p si i 传递到p si 。在这个 过程中同时伴随着水的氧化，氧气的释放，氧化型辅酶i i ( n a d p + ) 的还原以及 质子的跨膜运动，最终生成供暗反应所需要的腺苷三磷酸( a t p ) 和还原型辅酶i i ( n a d p h ) 。当忽然断光后，处于电子传递链的电子发生回流到p si i 氧化反应中 心p 6 8 0 + ，重新形成激发态的p 6 8 0 + 退激发而产生延迟荧光。 1 3 植物光合能力检测研究综述 植物光合作用经常受到外界环境条件和内部因素的影响而发生变化，表示光 合作用变化的指标主要有光合速率和光合生产率。光合速率( p h o t o s y n t h e t i cr a t e ) 是指单位时间、单位叶面积吸收c 0 2 的量或放出0 2 的量，常用单位有 肛m o l c 0 2 m - 2 s 1 和p m o l 0 2 d m 2 h ，它是光合作用不受光能供应限制( 即光饱和条 件) 下表明光合效率高低的重要指标，一般测定光合速率的方法都没有把叶片的 呼吸作用考虑在内，所以测定的结果实际是光合作用减去呼吸作用的差数，称为 净光合速率。光合生产率( p h o t o s y n t h e t i cp r o d u c er a t e ) 又称为净同化率，是指植 物在较长时间( 一昼夜或一周) 内单位叶面积所生产的干物质量，常用g m - 2 d 以 表示，由于测定时间较长，存在着夜间的呼吸作用和光合作用产物从叶片向外运 延迟荧光表征植物光合能力方法研究 输等的消耗，测得的光合生产率低于短期测得的光合速率。本文以光合速率作为 表征光合作用强弱的指标。 1 3 1 传统方法 光合作用的整个过程可表示如下形式： c o = + 2 h 2 0 + 4 6 9 k j - - - ( c h 2 0 ) + 0 2 + h 2 0 ( 1 2 ) 由式1 2 可以看出，测定任一反应物的消耗速率或产物的生成速率( 包括物质 的交换和能量的贮藏) 都可以用来计算净光合速率。而净光合速率的最大值即为 光合能力，即光合能力为在各种自然环境因子处于正常而适宜的条件下，具有一 定发育活力的植物所具有的最大净光合速率，因此光合能力和净光合速率的测量 方法基本相同，只是测量条件不同【2 0 】。相应净光合速率的测定大致可分为：1 ) 有 机物的积累速率，主要有半叶法、植物生长分析法；2 ) 叶片放0 2 的速率，主要 有瓦氏呼吸、吉尔森呼吸和化学滴定法、氧电极法；3 ) 叶片吸收c 0 2 的速率，主 要有化学滴定法、p h 法、同位素法和红外线气体分析法【2 l 】。目前普遍使用的方法 为红外线气体分析法，而基于此种方法且国内外通常使用的测量仪器主要有美国 l i c o r 6 0 0 0 、l i c o r 一6 2 0 0 、l i c o r 6 4 0 0 和c l d 公司生产的c i 3 0 1 p s 、c i 5 1 0 ， 英国a d c 的l c a i i 型、型及中国农业大学生产的b a u 光合测试系统等。 1 3 2 红外线气体分析法 因为在本文中测量净光合速率时所用的仪器是l i 一6 4 0 0 ，而l i 6 4 0 0 又是基于 红外气体分析法( i r g a ) 的检测仪器，因此下面简要介绍下红外线气体分析法。 凡振动频率与气体分子的振动频率相同的红外光，在透过气体时均形成共震而被 气体吸收，使透过的红外光能量减少。由异原子组成的具有偶极矩的气体分子如 c 0 2 、c o 、h 2 0 、s 0 2 、c i - 1 4 、n h 4 、n o 等，在波长2 5 2 5 1 t m 的红外线光区都有 特异的吸收带，其中c 0 2 在中段红外区的吸收带有4 处，且以4 2 6 斗m 的吸收带最 强，而且不与h 2 0 相互干扰。被吸收的红外光能量多少与被测气体对红外光的吸 收系数( k ) 、气体的密度( c ) 和气层的厚度( l ) 有关，并服从比尔一兰伯特 定律：e = e o e 一砌。 第1 章绪论 该方法优点：1 ) 灵敏度高，可测1 0 9 m o l m l 、o 5 1 t m o l m l 甚至o 1 9 m o l m l ( 即v p m ) 的c 0 2 ；2 ) 不破坏试材；3 ) 易实现自动化、智能化。由于红外线气 体分析法输出的是电信号( 电流或电压) ，可以输入记录仪进行自动、连续记录， 也可与专用或通用微机相配合，实现c 0 2 及有关环境因子的自动监测、记录、数 据储存、计算甚至某些环境条件的控制，现已成为测定光合速率的最主要方法。 该方法的主要缺点：1 ) 在测量过程中受外界环境因素的制约比较严重。外界 条件的瞬间改变都会给测量结果带来很大的差异。因此，测量一组有效的数据往 往要花费很长的时间。2 ) 由于测量持续的时间比较长，而外界的环境状态在变， 因此，测得的数据不能够准确地反映被测植株在当时所处生理条件下的光合能力。 3 ) 由于在测量过程中植物叶片的呼吸作用和蒸腾作用，使得叶室内的环境条件 ( c 0 2 浓度、湿度等) 和外界条件不一致，而测量仪器本身不能对该差异造成的测 量结果进行很好的补偿。4 ) 基于该种方法的仪器主要来自于进口，如：l i c o r 公 司的l i 一6 4 0 0 、美国c i d 公司的c i 5 1 0 等，价格比较昂贵( 达n - 十几万元甚至 几十万元人民币) ，不利于在农业生产中的普及使用。 1 4 主要内容 光合作用是地球上最重要的化学反应，光合速率的测量在生物学、农业等领 域中起着重要的作用。根据电荷重结合理论，植物光诱导延迟荧光来源于光合电 子传递链的逆向反应，是p si i 电荷分离效率的内在的敏感探针，对代谢变化的敏 感性加之延迟荧光测量的简易、快速，使得延迟荧光成为一种潜在的诊断活体植 物光合能力的有用方法。 本论文将以延迟荧光衰减技术为核心，对利用延迟荧光动态衰减技术进行植 物光合能力快速检测进行了实验研究，并设计了一套延迟荧光动态衰减检测设备， 这对于植物光合作用的无损快速检测具有重要的理论意义和实用价值，同时也为 延迟荧光检测法在其他领域的应用研究提供了一定的理论和实验基础。本文主要 研究内容如下： ( 1 ) 延迟荧光动态衰减检测原理及系统设计 延迟荧光表征植物光合能力方法研究 针对目前延迟荧光动态衰减检测技术中存在的离体和环境( 温度、湿度和c 0 2 浓度) 不可控带来的测量不准确、应用受限、重复性差等缺点，设计了一套在位 和环境条件可控的植物叶片延迟荧光动态衰减信号检测系统。该系统可对植物叶 片延迟荧光动态衰减信号进行在位采集，根据延迟荧光动态衰减特性，在激发光 停止数微秒时间内，对延迟荧光信号进行采集，利用从采集到的信号中减去本底 信号的处理方法，得到延迟荧光动态衰减曲线，计算曲线下的面积，得到相应的 延迟荧光强度。该系统可对激发光时间、激发光强、样品暗室内c 0 2 浓度、湿度、 温度等影响延迟荧光强度的外界环境进行控制和监测。 ( 2 ) 不同激发光强下延迟荧光强度与光合能力的相关性研究 以四种植物叶片为样品，用自行设计的延迟荧光动态衰减信号检测系统测量 不同激发光强下样品的延迟荧光强度。并以通用光合能力测试仪器即美国l i c o r 公司的l i 一6 4 0 0 测量数据做参照，进行了对比实验，分析不同激发光强下延迟荧 光强度与植物光合能力的相关性。 第2 章延迟荧光检测技术及原理 第2 章延迟荧光检测技术及原理 2 1 延迟荧光检测技术 目前在延迟荧光技术研究中，主要有三种方法：延迟荧光动态衰减、延迟荧 光激发光谱、延迟荧光诱导动力学。 1 9 9 0 年g u n a s e k a r a n 利用延迟荧光动态衰减的方法研究了蔬菜和水果新鲜度 的检测 1 2 1 。b i s w a l 在2 0 0 1 年利用延迟荧光强度来研究光合电子传递链中从q a 到 q b 的传递【2 2 1 。2 0 0 5 年m a r i n am o n t i 等人利用延迟荧光衰减动力学及强度的方法， 研究一种控制条件下的海生单细胞生物的生长期和迟滞期细胞浓度和碳含量【2 3 】， 认为延迟荧光强度的方法是一种区分藻类不同时期生物量估计的非常有效的方 法。在国内，华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室从1 9 9 5 年开始致力于 这一领域的研究，取得了一些研究成果【8 2 4 之5 】，比较有代表性的是2 0 0 5 年王成龙、 邢达等利用延迟荧光动态衰减研究人工酸雨和二氧化硫的环境胁迫检测【2 6 1 ，2 0 0 6 年王成龙、邢达等人利用光谱学手段来研究离体菠菜叶绿体延迟荧光7 3 0 n m 的来 源【16 】；2 0 0 6 年张玲瑞、邢达等人利用延迟荧光来研究实时监测光合代谢调控传感 器【27 1 。国内的其他单位近年来也有相关的研究成果，如2 0 0 6 年重庆大学李震东等 人利用延迟荧光动态衰减技术对植物叶片延迟荧光机理进行了研究【2 8 】。 延迟荧光激发光谱是某一波长延迟荧光强度随激发波长的变化，而延迟荧光 强度是由衰减动力学曲线下积分来表征。y a c o b i 等人在1 9 9 8 年利用延迟荧光激发 光谱和延迟荧光强度的方法，研究了光合活性色素的浓度和淡水中浮游植物的成 分例；2 0 0 3 年保加利亚索非亚大学的g o l t s e v 等人同时利用延迟荧光与荧光两种 方法对光合器官性能进行研究【3 0 】；2 0 0 5 年张新萍等利用延迟荧光光谱研究了华鱼 腥藻的特性【3 2 j 。 延迟荧光诱导动力学是在饱和脉冲光的激发后，经过一定延迟时间，在暗适 应时问内的衰减动力学曲线。中科院上海植生所从8 0 年代开始在该方向进行研究， 近几年依然有这方面的研究成果，主要是利用延迟荧光诱导动力学研究光合磷酸 化和质子梯度势。2 0 0 3 年苏吉虎和沈允钢利用延迟荧光诱导动力学研究了大豆叶 延迟荧光表征植物光合能力方法研究 片状态转换过程中跨膜质子动力势的变化【3 2 】；2 0 0 3 年，蔡霞等人利用延迟荧光诱 导动力学研究p si i 核心天线c p 4 7 热稳定性【3 3 】；2 0 0 5 年，刘贤德和沈允钢利用延 迟荧光研究了红光和远红光处理引起的杜氏盐藻跨类囊体膜质子动力势变化【3 4 1 。 国外在该方向也有报道【3 5 矧，比较有代表性的有：2 0 0 4 年莫斯科国立大学的 b a d r e t d i n o v 等人利用延迟荧光方法研究温度对光合电子传递链的影响【5 】；2 0 0 5 年德 国f r e i e 大学m a r k u s 等人利用延迟荧光诱导动力学研究p si i 膜颗粒的能量传递【4 】。 延迟荧光动态衰减是一次激发后的衰减规律，它是其中最为基础的一项研究， 是其他两种方法的基础，也是本论文中主要研究的延迟荧光技术，因此下面介绍 一下延迟荧光动态衰减技术检测方法的国内外现状。 ( 1 ) 国内检测技术现状 华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室从1 9 9 5 年开始致力于延迟荧光 动态衰减检测技术的研究，在国内外处于领先地位，主要的检测方法有两种：一 是将植物叶片摘下，放入暗室中，利用6 2 8 n m 激光激发植物叶片，通过c c d ( i c c d ) 对延迟荧光信号进行采集，最后在p c 机上获得延迟荧光动态衰减曲线【2 3 艺6 1 。二是 将植物叶片捣碎，从中提取叶绿体，放入荧光光谱仪中，对延迟荧光光谱进行测 量【1 6 】。在国内其他单位，对延迟荧光动态衰减的检测方法与华南师范大学激光生 命科学教育部重点实验室基本相同，如重庆大学李震东等人是将植物叶片洗净后 匀浆，加水制成悬液，然后置于样品池中，利用单光子探测器检测延迟荧光动态 衰减，在p c 机中获得延迟荧光动态衰减曲线【2 7 1 。 ( 2 ) 国外检测技术现状 比较有代表性的是1 9 9 0 年g u n a s e k a r a n 利用延迟荧光动态衰减的检测来研究蔬 菜和水果的新鲜度，检测方法是将蔬菜或者水果摘下后放入暗室的样品槽中，利 用激发光照射样品，通过光电倍增管采集延迟荧光衰减信号，利用延迟荧光总强 度来表示样品的新鲜程度【1 2 】。b i s w a l 在2 0 0 1 年利用延迟荧光强度来研究光合电子传 递链中从q a 到q b 的传递，延迟荧光动态衰减的检测方法是从菠菜中提取p si i 膜颗 粒，以一定的叶绿体浓度存储在零下8 0 。c 包含有n a c l ，c a c l 2 ，m g c l 2 ，p h 值为6 2 的缓冲溶液中，而后放入荧光计( 氙灯激发，光电倍增管接受) 中，荧光计与p c 第2 章延迟荧光检测技术及原理 相连，延迟荧光动态衰减在p c 中显示出来【3 7 】。2 0 0 5 年m a r k u sg r a b o l l e 和h o l g e rd a u 在研究p si i 中电子传递效率的实验也是如此做法【4 1 。 目前国内外延迟荧光动态衰减检测技术中存在两个主意缺点：一、离体检测 的不准确和应用受限。一般有两种测量方法：一是将叶片取下，放入样品室中进 行测量；二是将叶片取下，而后提取叶绿体，对叶绿体的延迟荧光进行测量。然 而这两种方法中均存在着离体的问题，这种离体测量，必然会影响测量结果的准 确性，不能准确地反应植物叶片在正常生理条件下的延迟荧光动态衰减；同时离 体的样品随着时间的推移会逐渐的变质甚至死亡，对样品进行继续的对比测量研 究，必定会存在着一定的误差，比如名贵观赏植物或者稀有品种，如用这种离体 的方法，必然会导致很大的损失，测量结果从某种程度上讲也便失去了意义。二、 外界环境因素( 温度、湿度和c 0 2 浓度) 的变化导致的测量不准确。传统延迟荧光 测量中，一般是将样品( 植物叶片或者叶绿体) 放入样品室中，直接激发后测量 延迟荧光，而不进行环境( 温度、湿度和c 0 2 浓度) 的设置，或只控制温度，而不 控制湿度和c 0 2 浓度，而随着延迟荧光研究的逐渐深入，研究结果表明这些外界环 境因素( 温度、湿度和c 0 2 浓度) 与延迟荧光动态衰减的衰