核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述.ppt

第七章核酸的分离纯化及鉴定技术,提取核酸的目的:,1.实验研究,2.用于研制核酸类药物及保健品,?,核酸分离与纯化的设计与原则,主要核酸类药物及用途,主要核酸类药物及用途,DNA：主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA：主要存在于细胞质中，如mRNA，rRNA，tRNA，miRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,细胞内的核酸具有复杂的结构，均与蛋白质结合成核蛋白。分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不同的。,一、材料与方法的选择,核酸存在于各种生物中。临床常见的样品有血液、尿液、唾液、头发、组织及培养细胞等。核酸分离与纯化的方法非常多。如何选择合适的分离与纯化方法是一个首要的问题。因为不同的研究目的对核酸的完整性、产量、纯度和浓度有不同的要求。近年来，试剂盒(Kit)的开发与自动化仪器的使用大大提高了分离与纯化的效率。,根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：保证核酸一级结构的完整性，尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度。,选择原则,核酸制备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解(pH4-10)减少物理因素对核酸的降解,如机械剪切力和高温防止核酸的生物降解。,核酸制备的步骤：,破碎细胞,提取,纯化,二技术路线的设计,破碎细胞微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA，首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,(一)核酸的释放正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞、释放核酸。,DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如：EDTA阴离子表面活性剂：如SDS。该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。RNA酶抑制剂：皂土：带负电荷，能吸附RNase，使其失活。DEPC(焦碳酸二乙酯)：通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。,(二)核酸的分离与纯化,利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异设计有效方案，才能使核酸得以分离。核酸与其它物质的差异包括细胞定位与组织分布上的差异、物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。,1.DNA分离纯化过程破碎细胞+DNA抽提液(EDTA、去污剂、蛋白酶K)65温育20冰浴冷却离心去细胞碎片上清液用水饱和苯酚抽提23次上层液相用氯仿抽至界面无蛋白变性物上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀沉淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥溶于缓冲液加入RNase处理除去RNA苯酚氯仿抽提沉淀干燥,EDTA：破坏细胞膜，螯合Mg2+、Ca2+，使DNase失活；SDS：可破坏细胞膜、抑制核酸酶，还可使核酸从蛋白质上游离下来；蛋白酶K：非特异性蛋白酶，可将蛋白质消化成氨基酸；65：高温下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；冰浴：降低温度使蛋白质及多糖杂质沉淀；,水饱和苯酚：由于蛋白与DNA连结键已断裂，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，DNA溶于水相。苯酚使蛋白质变性，并抑制了DNase的降解作用。氯仿：氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，还能去除植物色素和蔗糖。异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相、下层有机溶剂相维持稳定。无水乙醇沉淀DNA：与核酸不发生任何化学反应；对盐类沉淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥发除去。,2.RNA分离纯化-Trizol一步法,TRIzol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。注意：Trizol是强腐蚀性物质，小心存放于4,所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理，再用蒸馏水冲净。DEPC：焦碳酸二乙酯，是一种强烈但并不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶中His结合使蛋白质变性，抑制RNA酶活性。,利用乙醇的易挥发性洗掉异丙醇,氯仿；溶解一些沉淀中可能的有机物杂质,会极大降低RNA的可溶性,(三)核酸的浓缩,随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会遂渐下降，当不能满足后继研究与应用的需要时，应对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法。优点：核酸沉淀后,可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。,三鉴定与保存,(一)核酸的鉴定分离纯化后的核酸质量如何，是否达到后继实验研究与应用的要求，可以通过相关的方法来鉴定其浓度、纯度及完整性。,1浓度鉴定,(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性，其最大吸收波长在250270nm之间。在波长260nm紫外光下，1OD值得吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA和RNA为40g/ml；寡核苷酸为35g/ml。OD值范围应该在0.10.99之间，否则不符合上述线性关系。,(2)荧光光度法,核酸的荧光染料溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)嵌入碱基平面后，使本身无荧光的核酸在紫外线激发下发出橙红色的荧光，且荧光强度积分与核酸含量呈正比。该法灵敏度可达1-5ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。另外，SYBRGold作为一种新的超灵敏荧光染料，可以从琼脂糖凝胶中检出低于20pg的双链DNA。,(1)紫外分光光度法：紫外分光光度法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260A280比值为1.8，纯RNA的A260A280比值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。,2纯度鉴定,(2)荧光光度法：用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子比RNA大许多，电泳迁移率低。通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果，可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰，亦可鉴定在RNA制品中有无DNA的污染。,凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。基因组DNA的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果有降解的小分子DNA片段，电泳图呈拖尾状。完整总RNA除特征性的三条带外，一般28sRNA的荧光强度约为18sRNA的2倍，否则提示有RNA降解。若在加样槽附近有条带，说明有DNA污染。,3完整性鉴定,(二)核酸的保存,DNA溶于TE缓冲液中在-70C可以储存数年。当TE的pH值为8.0时，可以减少DNA的脱氨反应，pH低于7.0时DNA容易变性。EDTA作为二价金属离子的整合剂，通过螯合Mg2+、Ca2+等二价金属离子可以抑制DNA酶的活性。低温条件有利于减少DNA分子的各种反应，双链DNA因结构上的特点而具有很大的惰性，在4C条件下可保存较长时间。在DNA样品中加入少量氯仿，可以有效避免细菌与核酸的污染。,1DNA的保存,2RNA的保存RNA可溶于0.3molL的醋酸钠溶液或双蒸水中，在-70