（生物物理学专业论文）螺旋藻染色体外dna的克隆及结构与功能研究.pdf

；i 二大学博士譬0 泠 蠼旋蔓妻色体hd q a 的卉隆及结构0 ：馥研琵强 夏 摘要 本论文以钝顶螺旋藻藻株s p h 0 1 、s p d 、s p - j 、s p z 、s p - s 、s p - t 、s p 1 0 等为材料， 建立了螺旋藻染色体外d n a ( e x d n a ) 提取与纯化的技术方法；研究了e x d n a 的基本分 子特征：通过s o u t h e r n 杂交分析了各种e x d n a 之间及e x d n a 与螺旋藻染色体d n a 之间 的同源陛；克隆并测定了s p s 两种e x d n a 的部分序列，进而对它们的一级结构和二级结 构，以及开放阅读框( o r f ) 编码蛋白的结构与功能作了生物信息学分析。结果如下： 1 螺旋藻e x d n a 的高效提取与纯化技术方法的建立 采用多种方法从螺旋藻中提取e x d n a ，通过比较与分析，建立了一种高效提取螺旋藻 e x d n a 的方法一c t a b - 蛋白酶k 法。该方法在藻细胞裂解液和第一次d n a 沉淀物的溶解 中均加入适量的蛋白酶k ，再经酚氯仿异戊醇等抽提，可有效去除蛋白质和多糖等杂质， 使e x d n a 的质量和提取率均显著提高。利用所建方法对1 0 多株钝顶螺旋藻所作的e x d n a 提取结果显示：( 1 ) 多数藻株只含有一种e x d n a ，如s p h 0 1 的e x d n a 约为o 7 5k b ，s p - d 、 s p - j 和s 口。z 等的e x d n a 约为1 1k b 1 2k b ；( 2 ) 少数藻株含有两种e x d n a ，如s p - s 含 有1 8k b 和3 6k b 的两种e x d n a ，依次简称为e x d n a - s s 和e x d n a - s - l ；s p t 含有1 9k b 和3 8k b 两种e x d n a ，分别简称为e x d n a - t - s 和c x d n a - t - l 。同时，针对螺旋藻e x d n a 的丰度低，难阱富集与纯化等问题，本文在比较凝胶冻融过滤法、d n a 凝胶回收试剂盒和 碱法等方法的基础上，确立咀凝胶冻融过滤法回收与纯化e x d n a 的效果最好，回收率高于 9 0 。 2 螺旋藻e x d n a 的基本分子特征 对e x d n a 所作的遗传稳定性、分子构型及酶切图谱等研究结果显示：( 1 ) e x d n a 在螺 旋藻生长繁殖过程中保持稳定遗传；( 2 ) 通过碱变性或热变性处理，发现变性的螺旋藻e x d n a 可以迅速复性，经u v 照射后电泳条带呈弥散状而不形成新的d n a 条带；采用1 0 种限制性 内切酶对e x d n a 进行的酶切表明，e x d n a 可以部分地为d r a i 酶切，但未形成酶切带型， 说明螺旋藻e x d n a 可能是一类具有复杂结构的线性d n a 分子；( 3 ) 2 d 琼脂糖凝胶电泳分 析结果表明，s p s 和s p - t 各自所含的两种e x d n a 不是同一种质粒的两种构型，而是两种 各自独立的遗传元件。 3 螺旋藻基因组d n a 的限制。陛酶酶切分析 对提取螺旋藻基因组d n a 的c r a b 二次沉淀法进行了改进，通过提高d n a 沉淀缓冲 螺旋藻染色像，? 【) x j ：免隆及结社与功能母 冤摘要 液巾n a c i 浓度、加入蛋f l 酶k 以充分除去多糖和蛋r 1 质等杂质，优化了高质量螺旋藻基凼 纽d n a 的提取方法，从斯解决了螺旋藻基因组d n a 难以被照制性酶酶切的难题。基因组 d n a 能被a l ul 、b a m h1 、c l al 、d r ai 、e c o ri 、e c o r v 、h i n d l i l 、k p n1 、n o t1 、 n fl 、s m ai 及x h oi 等至少1 2 种限制性内切酶酶切，大多数限制性酶酶切反应的适 宜条件为：酶用量为5u e d n a 、酶切时间为4h 。 4 螺旋藻e x d n a 的同源性分析 以e x d n a 为模板制得的探针，与不同藻株的e x d n a 以及染色体d n a 所作的s o u t h e r n 杂交结果表明：( 1 ) s p i - 0 1 与s p d 的e x d n a ，它们之间没有同源眭，与s p - s 和s p _ t 的 e x d n a 也没有同源性；( 2 ) s p - s 与s p - t 的e x d n a ，它们之间有一定的同源性，而且各藻 株中两种。 , c d n a 之间也具有一定的同源性；( 3 ) s p h 0 1 、s p - d 、s p - s 与s p - t 的e x d n a 除与各自染色体d n a 具有同源性外，还与其它藻株的染色体d n a 具有同源性，表明某些 藻株的染色体d n a 上可能存有几种e x d n a 拷贝。 5 螺旋藻e x d n a 的克隆及结构与功能分析 建立了e x d n a 的克隆方法，并从藻株s p - s 的e x d n a - s s 中克隆到9 3 6b p 和1 0 9 1b p 的2 个片段，依次记为s s l 和s s 2 ，从e x d n a - s - l 中克隆到1 个2 5 8 9 b p 的片段，记为s l l 。 s o u t h e r n 杂交结果显示，s s l 与e x d n a - s - l 没有同源性，但s s 2 与e x d n a - s - l 具有一定的 同源性，说明e x d n a s l 中含有与s s 2 同源的序列：在基因组d n a 上，s s l 和s l l 至少 有1 个拷贝，s s 2 至少有4 个拷贝。n o r t h e r n 杂交分析显示，s s l 和s l l 具有转录活性，而 s s 2 未表现出转录活性，这表明s p s 两种e x d n a 均具有一定的转录活陛。 对克隆片段s s l 、s s 2 和s l l 的序列及编码蛋白保守结构域所作的生物信息学分析显示： ( 1 ) s s l 和s l l 分别含有1 个和2 个有功能的o r e ，均编码组氨酸激酶，含有p a s 、p a s p a c 、 g a f 等保守结构域和多个功能位点，是双组分信号系统中的感受器和反应调节器，它们在细 胞的光调控、光敏色素调控及渗透调节中起重要作用：( 2 ) s s 2 的3 端有一不完整的o r f ， 其编码的短肽可能对调节螺旋藻细胞的运动性有一定的作用；( 3 ) s s 2 含有多个正向重复 ( d r ) 与反向重复( m ) ，在其5 端形成复杂的发夹( h a i r p i n l o o p ) 结构，这一结构与e x d n a 经碱或热处理后能迅速复性的分子特性相吻合，结合e x d n a 克隆片段的序列特点，推测 e x d n a 可能是一种i s 类似元件。 关键词：钝顶螺旋藻：染色体外d n a ( e x d n a ) ：提耿；纯化；限制性酶切：克隆；结构 与功能 一蔓：二兰三圭三兰t 坠 蠼砬藻染色体、d n a 克隆及结构与功能研冤捅要 a b s t r a c t 1 1 1t h i ss t u d y , a ne f f i c i e n tm e t h o dw a se s t a b f i s h e df o rt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no f e x t r a c h r o m o s o m a ld n a ( e x d n a ) f r o ms p i r u l i n ap l a t e n s i ss t r a i n s ，s u c ha ss p h 0 1 ，s p - d ，s p - s ， s p - te t c a ni n v e s t i g a t i o no nt h ee s s e n t i a lm o l e c u l a rc h a r a c t e r i s t i c so fe x d n a w a s c a r r i e do u t t h e h o m o l o g yo fs e v e r a le x d n a s ，a sw e l la sb e t w e e ne x d n a a n dc h r o m o s o m a ld n ai sa n m y z e db y s o u t h e mb l o t t i n g ；p a r t i a ls e q u e n c e so fe x d n af r o ms p - sw e r ec l o n e d a n dt h ep r i m a r ya n d s e c o n d a r ys t r u c t u r e s ，o p e nr e a d i n gf x a n a e s ( o r f s ) o f t h ec l o n e df r a g m e n t s ，a n df u n c t i o no fp r o t e i n s e n c o d e db yo r f sw e r ea n a l y z e dt h r o u g hb i o i n f o r m a t i c sm e t h o d r e s u l t sg o tf r o mt h es t u d ya l e l i s t e da sf o l l o w i n g ： 1 e s t a b l i s h m e n t o f m e t h o d o l o g y f o r e x d n a e x t r a c t i o n a n d p u r i f i c a t i o n i n s 浙t n a o nc o m p a r i s o nb a s i so fm e t h o d sf o re x t r a c t i o no fe x d n af r o ms p r u l n a ，a ni m p r o v e da n d e f f i c i e n tm e t h o d - - c t a b p r o t e i n a s ekm e t h o dw a se s t a b f i s h e d d u r i n gt h es t e p so fc e l ll y s i sa n d d i s s o l u f i o no fc r u d ed n ae x t r a c t s ，p r o t e i n a s ekw a sa d d e di n t o t h es o l u t i o na n df o l l o w e db y p h e n o l c l a l o r o f o r m i s o a m ! ，la l c o h o le x t r a c t i o n sf o rf i n a ld n ap u r i f i c a t i o n t h r o u g ht h i so p e m f i o i l ， t h ec o n t a m i n a n t so fp r o t e i n sc a r lb er e m o v e de f f i c i e n t l y , a n dt h ee x t r a c t i o ne f f i c i e n c ya n dq u a l i t yo f e x d n a w a si m p r o v e ds i g n i f i c a n t l y t h em e t h o dw a su s e df o re x d n ae x t r a c t i o nf r o mm o r et h a nt e n s t r a i n so fs p i r u l i n a ，a n dg o o dr e s u l t sw e r eg o t t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：( 1 ) m o s to f p l a t e n s i s s t m i n sc o n t a i no n l yo n ek i n do fe x d n a , f o re x a m p l e ，s p - h 0 1w i t hao 7 5k be x d n a , b u te x d n a s i z eo fs p - d ，s p - ja n ds p - zr a n g e sf r o m1 1k bt o1 2k b ；( 2 ) af e ws t r a i n sc o n t a i nt w ok i n d so f e x d n a , f o re x a m p l e ，s p s ，o n ek i n do fm ee x d n ai s1 8k b ( n a m e de x d n a q - s ) a n dt h eo t h e ri s 3 6k bn a m e de x d n a - s l ) ；s h n i l a r l y , s p - tp o s s e s s e st w ok i n d so fe x d n a sw i t ht h es i z eo f1 9k b a n d 3 8 k b a l lo fe x d n a sa t ew i t hav e r yl o wa b u n d a n c e ，a n da l s ov e r yd i f f i c u l tt oe n r i c ha n dp u r i 母f o r s o l v i n gt h e s ed i f f i c u l t i e s ，a l le f f e c t i v em e t h o df o re n r i c h i n ga n dp u r i f y i n g o fe x d n a f r o mt o t a ld n a w a se s t a b l i s h e d t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h r e em e t h o d s ，f r e e z e - t h a we x t r a c t i o n ，d n ag e le x t r a c t i o n k i ta n da l k a l i n em e t h o d ，c a nb eu s e df o re x d n a p u r i f i c a t i o n , h o w e v e lt h ef r e e z e - t h a we x t r a c t i o n m e t h o di st h eb e s to n e i ti sw i t har e c o v e r ye f f i c i e n c yo v e r9 0 堕望查兰堕! 兰。堡垒望! ! 型坠竺! ! ! 旦竖竺堡塑皇竺壁竺堑! 茎 2 m o l e c u l a r c h a r a c t e r i s f i c s o f e x d n a i n s p i r u l b m t h r o u 曲s t u d i e so nt h eg e n e t i cs t a b i h t y , p r o b a b l em o l e c u l a rc o n f o r m a t i o na n dr e s t r i c t i o ne n z y m e p a t t e r n so ft h ee x d n a ，w ef o u n dt h a t ：( 1 ) e x d n a si ns p i r u l i n aw e r es t a b l ea f t e rm u l t i g e n e r a t i o n c u l t u r e ；( 2 ) e x d n a sw e r ee a s i l yr e n a t u r e da f t e rd e n a t u r a t i o nt r e a t m e n tw i t ha l k a l io rh e a t , h o w e v e r , w h m ae x d n a sw e r ee x p o s e dt ou v , w ed i dn o tf i n dn e we x d n ab a n d si na g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h ee n z y m ed i g e s t i o ne x p e r i m e n to ft h ee x d n ai n d i c a t e dt h a te x d n ac a nb ed i g e s t e db yd r a l i n c o m p l e t e l y , b u tn or e s t r i c t i o np a u e r n sw e r ef o u n d b a s e do nt h e s er e s u l t s ，w es p e c u l a t e dt h a te x d n a m a yb el i n e a rd n aw i t hc o m p l i c a t e ds t r u c t u r e s ；( 3 ) b yu s i n gt w o - d i m e n s i o n a la g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，t h er e l a t i o n s h i p b e t w e e n l a r g ee x d n a a n d s m a l le x d n a o f s p - s o r s p - t w a ss t u d i e d , a n dr e s u l t ss u g g e s t e dt h a ts m a l le x d n aa n dl a r g ee x d n ao fs p - so rs p - ta r et w oi n d e p e n d e n t g e n e t i ce l e m e n t s ，a n dt h a tn o tt w of o r m so f o n ep l a s m i d 3 a n a l y s i s o f r e s t r i e f i o ne n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n o f g e n o m i c d n a f r o m s p i r u l i n a t h em o d i f i c a t i o no ft h ec t a be x t r a c t i o np r o c e d u r e si n c l u d e sa d d i n gp r o t e i n a s ekt ol y s ec e l l s , m g hn a c lc o n c e n t r a t i o n si nt h eb u y e rt or e m o v ep o l y s a c c h a r i d e s a n d a l la d d i t i o n a lp r o t e i n a s ek d i g e s t i o no fc r u d ed n a e x t r a c t st or e m o v ea n ye x c e s sp m t e i n s t h es o - c a l l e dc t a b - p r o t e i n a s ek m e t h o di se f t d e n tt op r e p a r ed i g e s t i b l eg e n o m i cd n a f r o ms p l a t e n s i s t h eg e n o m i cd n ac a nb e d i g e s t e db ym o r et h a n1 2r e s t r i c t i o ne n z y m e s t h ep r o p e rr e a c t i o nc o n d i t i o ni s ：( 1 ) a ne n z y m e c o n c e n t r a t i o no f5u b i gd n a ，a n d ( 2 ) ad i g e s t i o nt i m eo f4h 4 h o m o l o g ya n a l y s i so f e x d n ao f s p i r u l i n a t h ep r o b e s p r e p a r e df r o me x d n a sw e r eu s e dt oh y b r i d i z ew i t hv a r i o u se x d n a sa n d c h r o m o s o m a l d n a t h e c o n c l u s i o n s a r ea s f o l l o w s ：( 1 ) n o t o n l y e x d n a o f s p - h 0 1h a s n o h o m o l o g y w i t he x d n ao fs p - d ，b u ta l s ow i t he x d n ao fs p - so rs p - t ，( 2 ) t h e r ei sp a r t i a lh o m o l o g yb e t w e e n e x d n a so fs p - sa n ds p - t f u r t h e n n o r e ，t h eh o m o l o g ya l s oe x i s t sb e t w e e nl a r g ee x d n aa n ds m a l l e x d n ao fs p - so ts p - t ；( 3 ) b e s i d e st h eh o m o l o g yw i t ht h e i ro w nc h r o m o s o m a ld n a , e x d n a so f s p - h 0 1 ，s p - d ，s p s ，s p - ta l s oh a v ew i d eh o m o l o g yw i t ht oo t h e rc h r o m o s o m a ld n a i ta p p e a r e d t h a ts o m es t r a i n s m a y c o n t a i n c o p i e s o f s e v e r a l k i n d s o f e x d n a i n t h e i r c h r o m o s o m a l g e n o m e 5 c l o n i n g ，s t r u c t u r ea n df u n c t i o na n a l y s i so f s p i r u l i n ae x d n a a m e t h o dt oc l o n ef r a g m e n t so f e x d n a w a sc o n s t m c t e d t w of i a g m e n t s ，n a m e ds s la n ds s 2 ， w h o s es i z e sw e r e9 3 6b pa n d1 0 9 1b p ，w e r ec l o n e df r o me x d n a s so fs t r a i ns p s m o r e o v e r ，a f r a g m e n t ，n a m e ds l l ，w h o s es i z ew a s2 5 8 9b p ，w a sc l o n e df r o me x d n a - s lo fs p - s t h er e s u l t s i v 淅j - 九学诲二 堡坚墨鱼堡! 二! 坐堑兰兰生! 皇三堑堂竺壅塑茎 o fs o u t h e m b l o t t i n gs h o w e dt h a lt h e r ei sh o m o l o g yb e t w e e ns s 2a n de x d n a s lb u tn oh o m o l o g y b e t w e e ns s ia n de x d n a s lv i d e l i c e t e x d n a s li sl i k e l yt oc o n t a i nh o m o l o g o u ss e q u e n c e so f s s 2 a n d ，w ea r es u r et h a tt h e r ea r ea tl e a s to n ec o p yo fs s la n ds l la n dm o r et h a n4c o p i e so fs s 2 i nc h r o m o s o m a lg e n o m e n o r t h e r nb l o t t i n go fc l o n e df r a g m e n t si n d i c a t e dt h a ts s la n ds l li s a c t i v e l yt r a n s c r i p t , w h e r e a ss s 2i sn o t a n a l y s i so f d n a s e q u e n c e sa n dc o n s e r v e dd o m a i n so f c l o n e df r a g m e n t sr e v e a l e dt h a t ：( 1 ) s s l h a so n ep o t e n t i a lo p e nr e a d i n g 睡d m e ( o r v 3 ，a n ds l lh a st w o ( o r f la n do r j - 2 ) t h e s eo r f sa l l e n c o d eh i s t i d i n ek i n a s e ，w h i c hc o n t a i ns o m ef u n c t i o n a ls i t e sa n ds e v e r a lc o n s e r v e dd o m a i n s ，s u c ha s p a s ，p a s p a ca n dg a fd o m a i n t h e ya r es e n s o r sa n dr e s p o n s er e g u l a t o r si nt w o c o m p o n e n t s i g n a l i n gs y s t e m s ，w h i c hp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nl i g h t - r e g u l a t e ds i g n a lt r a n s d u c t i o n , p h o t o s e n s o r y p e r c e p t i o na n ds i g n a lt r a n s d u c t i o no f p h o t o c h r o m e s ，a n do s m o t i cr e g u l a t i o n ；( 2 ) t h e r ei sas h o r ta n d i n c o m p l e t e o r f a t 3 - t e r m i n a l o f s s 2 ，w h i c he n c o d e s t h e p o l y p e p t i d e w i t h f u n c t i o n s i nc e l l m o t i l i t y ； ( 3 ) t h es e q u e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a tm a n yd i r e c tr e p e a t sa n di n v e r t e dr e p e a l so c c u ri ns s 2 i n d u c e dc o m p l e xc o n s t r u c t i o no fh a i r p i nl o o p sa t5 - t e r m i n a lo fe x d n a t h i ss t r u c t u r ei sc o n s i s t e n t w i t ht h em o l e c u l a rc h a r a c t e r i s t i c st h a te x d n ac a nr e n a t u r er a p i d l ya f t e rd e n a t u r i n gw i t ha l k a l io r h e a t a c c o r d i n gt ot h ed e t e r m h a e ds e q u e n c e so fe x d n a , w ep r e s u m et h a te x i ) n am i g h tb ea n i n s e r t i o n s e q u e n c e0 s ) 一l i k ed e m e n t k e yw o r d s ：s p i r u l i n ap l a t e n s & ；e x w a c h r o m o s o m a ld n a ( e x d n a ) ；e x t r a c t i o n ；p u r i f i c a t i o n ； r e s t r i c t i o nd i g e s t i o n ；c l o n e ；s t r u c t u r ea n df u n c t i o n 螺旋藻染皇俸外d n a 的克隆及车传弓功能研冗略：吾表 缩略词( a b b r e v i a t i o n ) 缩1 j英文中文 a aa m i n oa c i d 氮基酸 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 b pb a s e p a i r 碱基对 b s a b o v i n es e l 一d ma l b u m i n 牛血浩白蛋白 c d s c o d i n gs e q u e n c e编码序列 c ic u r i e 居里 c i a p a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( c a l f i n t e s t i n e )础眭磷嘲 c r a b c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e十六烷基三甲基溴化铵 d d a y 天 d a t p d e o x y a d e n o s i n et f i p h o s p h a t e脱氧腺苷三磷酸 d c y p d e o x y c y t i d i n eu l p h o s p h a t e 脱氧胞苷三磷酸 d e p c d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d脱氧核糖核酸 d n t p 2 - d e o x y n q j o n u d e o s i d e - 5 t r i p h o s p h a t e 脱氧核糖核苷三磷酸 2 d t w o - d i m e n s i o n a l 双向 e b e h i d i u mbromide溴化乙锭 e d t a e t h y l e n ed i a m i n e t e l r a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 e x d n ae x l r a c h r o m o s o m a ldna染色体外dna h h o u r 小时 i p t g i s o p r o p y l t h i o - b - d - g a l a c l o s i d e 异丙基硫 0 b - d 半乳糖苷 k bkilobase千碱基对 k d ak i l od a l t o n 千道尔顿 l bl l l r i ab e r m n im e d i u m l b 培养基 m b m e g a b a s e 百万碱基对 r a i n minute分钟 m o p s 3 - 6 q m o r p h o l i n o ) p m p a n e s u l f o n i ca c i d 3 一( n _ 吗啉代) 丙磺酸 m w m o l e c u l a r w e i g h t分子量 n tn u c l e o t i d e 核苷酸 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 o r f o p e nr e a d i n g m a m e开放阅读框 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r n ar i b o n u c l e i ca cid核糖核酸 r p m r e v o l u t i o np e rm i n u l e 每分钟转速 s s e c o n d 秒 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 螺旋募尝色像? 一d n a 的克隆及铝构与功能研究略语表 s d s p a g e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s t b e t r i s - h c l ，b r o i ca c i d ，e d t a b u f f e r t e1 s ，c le d t a b u 脏f t e m e d n ，n ，n ，n 一t c t v a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t n s t r i s o a y d r o x y m e t h y l ) - a m i n om e m a n e u vu l t r a v i o l e t x g a l5 - b r o m 0 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l - b d - g a l a c t o s i d e 氨基酸简写符号 单字母符号 三字母符号 a l a a 曙 a s h a s p a s h a s p c v s g l i l g 1 u g i n ，g l u g l v h 讧 i l e i 上u l v s m e t p h e p r o s e t t h r t r p t 叮 一募塞一一。一一一 a l a o m e m l g i n i l l e a s p a r a g i n e a s p a t t i ca c i d a s p a r a g i n e a s p a r t i c a c i d c y s t e i n e ( 3 1 u t a m i n e g 血t 猢l i ca c i d g l u t a m i n e ，g l u l a m i c a c i d g l y c i n e h i s t i d i n e l s o l e u c i n e k e u c m e l y s i n e m e t h i o n i n e p h e n y l a a n i n e p r o l it i e s e r i n e 骶o n i n e t r y p t o p h a n t y r o s i n e v a l i n e 卜一烷基酸酸一聚阳烯酰胺凝腔也泳 硐s ! h c l ，硼酸，e d t a 缓冲液 t e 缓冲液 n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 紫外线 5 一溴4 氯o 吲哚b d 半乳糖苷 中文 丙氨酸 精氨酸 天冬酰胺 天冬氨酸 天冬酰胺或天冬氨酸 半胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 谷氢酰胺或谷氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸( 蛋氨酸) 苯丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 缬氨酸 a r n d b c q e z g h ，l k m f p s t y v ? 。i ，。：i 博士亨。论飞螺旋蘼袭隹! 、哥d n a 的克隆及结构与功能研冗致 i 别 致谢 本论文是在导师徐步进教授悉心指导下完成的，沦文的形成凝结着导师的心瓶。三年多 来，导师总能在关键的时候给我指明前进的道路，而在导师不多的言语之中，总能给我6 口进 的动力。跟随导师共同工作的时间虽然短暂，但导师高尚的品德、宽广的胸怀、渊博的学识、 严谨的治学态度，给我留下了终生难忘的印象。我对导师的感谢无法用语言表达，只想衷心 地说一声：谢谢! 我要特别感谢汪志平博士，论文选题、实验设计和实施的很多研究思路都是在他的具体 指导和无私帮助下完成的。在论文撰写过程中，他提出了很多宝贵的意见并帮助审阅了论文 初稿。在此，谨向他表示最诚挚的谢意! 特别感谢杨灵勇硕士。在论文完成过程中，是他与我f 1 夜_ 起完成了螺旋藻染色体外d n a 的克隆、测序与杂交验证等许多工作。感谢中国科学院水生生物研究所徐旭东研究员在实验 技术与资料方面给予的热情帮助。生物信息学研究所樊龙江教授在序列分析方面给予了指 导、中国科学院植物研究所赵颖博士、农业与生物技术学院于志浩博士、王华新博士、朱宏 波博士、徐凯博士、生命科学学院陈士超博士等在实验技术与分析方面给予了热晴帮助和指 点。在此一并致以感谢! 感谢本所陈子元院士、孙锦荷教授、夏英武教授、华跃进教授、舒庆尧教授、崔海瑞教 授、郭江峰教授、史建君教授、叶庆富教授、张永熙副教授、柴立红老师以及其他老师对我 的指导和关心。 感谢本所吴志平博士、徐强硕士、盛多红博士、刘庆龙博士、周祥胜博士、刘丽丽博士、 田兵博士、高冠军博士、许镇坚博士、张春潮硕士、应南娇博士、黄丽芬博士、开美灵硕士、 汪海燕博士、吴媛媛博士、孔祥礼硕士等学友在学习与工作方面给予的大力支持。 还要特别感谢本实验室李晋楠博士、马美萍硕士、刘艳辉硕士、邹凤莲硕士、杨灵勇硕 士、陈晓燕硕士对我的大力帮助与支持。 感谢我的家人长期以来对我的鼓励与支持! 特别感谢我的夫人陈萍女士，是她承担起了 照顾父母和孩子的重任。 最后，谨向参加本论文评阅、答辩的各位专家致以最真诚的感谢! 曹学成 2 0 0 5 年6 月于杭州 带：、学孽士兰吨：仑五蝗旋藻染刍体外d n a 的克隆及结构与功能研充又献综述 1螺旋藻分子遗传学研究进展 i 1 螺旋藻染色体d n a 的研究进展 螺旋藻( 勋i r u l i n a ) 系蓝藻门( ( 2 y a n o p h y t a ) 、颤藻目( o s c i l l a t o r i a l e s ) 、颤藻科 ( o s e i l l a t o r i a c e a e ) 的一个属，是最早出现的光合生物之一，在地球上已有3 5 亿年的生 存历史( c i f e r r i ，1 9 8 l ，1 9 8 3 ：胡鸿钧，1 9 9 7 ) 。目前已发现这个属在世界上有钝顶螺旋藻 ( 印i r u l i n a p l a t e n s i s ) 、极大螺旋藻( 跏i r u l i n am a x i m a ) 、巨型螺旋藻( s p i r u l i n am a j a r ) 、 盐泽螺旋藻( 印i r u l i n as u b s a b a ) 和椭圆螺旋藻( s p i r u i i n a f u s i f o r m i s ) 等3 8 个种，其中 多数为淡水和咸水种类，仅有4 种分布于海洋中( 胡鸿钧，1 9 9 7 ；彭白露等，1 9 9 3 ；吴 丌国，1 9 9 8 ) 。当前国内外研究得较深入，并已应用于大规模生产的主要为钝顶螺旋藻 和极大螺旋藻两个种( 胡鸿钧，1 9 9 7 ；吴开国，1 9 9 8 ：李定梅，1 9 9 5 ) 。 螺旋藻是蛋白质、矿物质、维生素b 1 2 、1 3 胡萝h 素、基本脂肪酸如y 一亚麻酸等 的丰富来源，是最具经济价值的微藻之。螺旋藻能利用光能将c o z 转化为有机物，且 光能利用率高达1 8 2 4 ，是目前光能