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交联固定化磷脂酶d 催化性能及动力学研究 摘要 磷脂酶d 催化磷脂酰基转移反应是合成高纯度功能性磷脂产品的关键技术。通过固 定化可以实现酶的回收利用，减少酶消耗，降低成本。因此可将磷脂酶d 固定化后应用 于磷脂酰基转移反应中。然而，固定化后由于载体的介入或酶自身空间构象的改变，增 大了反应过程传质阻力的影响。同时，反应过程还存在着水解与转磷脂酰基之间的竞争， 对目标产物的生成速率和收率带来影响。因此，正确地评价固定化磷脂酶d 的转磷脂酰 基反应效果，掌握固定化磷脂酶d 的催化反应规律，优化反应条件，并对其反应动力学 进行研究势在必行。本文对本实验室自主制备的吸附聚集交联固定化磷脂酶d ( 酶活 力：6 3 7 u m g ) 和交联磷脂酶d 聚集体( 酶活力：2 8 6 2 u r a g ) 的催化反应性能进行研 究，以催化磷脂酰胆碱( p c ) 转磷脂酰基生产磷脂酰乙醇胺( p e ) 为评价模型，确定 两种固定化酶转磷脂酰基反应的最优条件，在此基础上，对两种固定化酶的催化反应动 力学进行研究比较。为后续固定化磷脂酶d 的工业化应用提供技术支持和理论指导。 本实验室通过对传统吸附交联固定化方法的改进，引入沉淀剂的作用，提出酶的 吸附一聚集- 交联固定化法( a d s o r b i n g a g 铲e g a t i n g c r o s s l i n k i n gm e t h o d ) 。并采用此方法 制备得到了酶活力高，稳定性好的固定化磷脂酶d ，本文首先对吸附聚集交联固定化 磷脂酶d 的催化性能进行研究，确定出此固定化酶用于转磷脂酰基反应的最佳条件为： 以乙醚为有机相，温度3 0 ，p h = 6 ；同时，对固定化磷脂酶d 的基础动力学因素进行 考察，确定了实现最佳反应速率的底物p c 浓度为l m m ，乙醇胺( e a ) 浓度为5 0 m m ， 固定化酶用量为0 5 9 ，摇床转速为2 0 0 r p m 。在此条件下，固定化酶的最佳反应速率能 够达到8 3 7 i - t m o l m i n m g 。同时，对反应过程的动力学参数进行拟合和模拟，发现，在 最优的反应条件和动力学参数下，此固定化磷脂酶d 催化磷脂酰转移反应中伴随的水解 反应基本可以忽略。这将为固定化磷脂酶d 的应用提供更加广阔的平台。 。另外，对本实验室制备得到的无载体交联磷脂酶d 聚集体的催化性能及动力学进行 研究。得到交联磷脂酶d 聚集体催化磷脂酰基转移反应的最佳反应条件为：温度3 2 c ， p h = 7 ，有机溶剂为乙醚，此条件下得到的基础动力学参数为：底物p c 浓度为l m m ， e a 浓度为5 0 m m ，固定化酶用量为0 2 9 ，摇床转速为1 5 0 r p m 。在此条件下，固定化酶 的最佳反应速率能够达到3 8 4 2 i _ t m o l m i n m g 。同时，对反应过程的动力学参数进行拟合 和模拟，发现，此固定化酶催化转磷脂酰基反应中水解反应的影响也很小，可见，磷脂 酶d 固定化后，明显提高了对底物的选择特异性。 对前两章的实验结果进行比较，固定化酶制备方法及原理不同，其催化反应的动力 学参数也必然发生变化，因此通过对酶促反应动力学模型的理论分析，在初步判定内外 扩散对反应影响的同时，分别测定a a c l 法和c l e a 法固定化磷脂酶d 催化磷脂酰转移反 应过程中，不同双底物浓度下的反应速率，求出动力学模型中的平衡常数，并采用m a t l a b 语言对动力学方程进行模拟，模型能直观地反映酶促动力学反应的过程，为后续扩大应 用提供可靠理论依据。 关键词：磷脂，磷脂酶d ，固定化，磷脂酰转移反应，动力学 c a t a l y z e dp e r f o r m a n c e e v a l u a t i o na n dd y n a m i c sa n a l y s i s o fc r o s sl i n 时n gi m m o b i l i z e d c r o s s -i m m oi i i x e o h o s o h o l l o a s edi n n g d a b s t r a c t t r a n s p h o s p h a t i d y l m i o nr e a c t i o nc a t a l i z e db yp h o s p h o l i p a s ed i st h ek e yt e c h n o l o g yu s e d s u c c e s s f u l l yi np r e p a r i n gh i 曲p u r i t yf u n c t i o n a lp h o s p h o l i p i d s i m m o b i l i z a t i o na sa ne n z y m e m o d i f i c a t i o nm e t h o dw a su s e dt oi m p r o v et h es t a b i l i t yo ff r e ep h o s p h o l i p a s ed ，r e d u c e r e a c t i o nc o s t s ，w h i l em a k i n gi tm o r es u i t a b l ef o rt r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o nr e a c t i o n h o w e v e r , t h er e s i s t a n c eo fm a s st r a n s f e rh a sb e e ni n c r e a s e db e c a u s eo fc a r r i e ra n de n z y m es p a c e c o n f o r m a t i o na f t e ri m m o b i l i z a t i o n t h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n h y d r o l i s i sa n d t r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o nr e a c t i o nw a sf o u n d i nt h ep r o c e s s ，w h i c hi n f l u e n c et h er e a c t i o nv e l o c i t y a n dy i e l d t h e r e f o r e ，i tw a si m p e r a t i v et oe v a l u a t et h ec a t a l y z e dp e r f o r m a n c ea n dr e a c t i o n m e c h a n i s m ，o p t i m i z et h er e a c t i o nc o n d i t i o n s ，a n da n a l y s i st h er e a c t i o nk i n e t i c s i nt h i sp a p e r , t h e c a t a l y t i cp e r f o r m a n c e s o f a d s o r b p t i o n - a g g r e g a t i o n - c r o s s l i n k i n g i m m o b i l i z e d p h o s p h o l i p a s ed ( e n z y m ea c t i v i t y ：6 3 7u m g ) a n dc r o s s - l i n k i n gp h o s p h o l i p a s eda g g r e g a t e s ( e n z y m ea c t i v i t y ：2 8 6 2 u r a g ) w e r es t u d i e d ，w h i c ht a k e t h er e a c t i o no fs y n t h e s i s p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( p e ) a se v a l u a t i o nm o d e l t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ef o u n d c a t a l i z e db yt h e s et w ok i n d so fi m m o b i l i z e dp l d ，a n dt h ek i n e t i cm o d e lw a sb e e ne s t a b l i s h e d t op r o v i d et e c h n i c a la n dt h e o r y s u p p o r tf o rt h ef o l l o w i n gi n d u s t r i a l i z a t i o na p p l i c a t i o n c a t a l y z e db yi m m o b i l i z e d p l d t h r o u g hi m p r o v i n gt h et r a d i t i o n a la d s o r p t i o n - c r o s s l i n k i n gi m m o b i l i z a t i o nm e t h o d , t h ea d s o r b p t i o n - - a g g r e g a t i o n c r o s s - l i n k i n gi m m o b i l i z a t i o nw h i c hb a s e do nt h ee f f e c to f p r e c i p i t a n th a sb e e np r o p o s e dt op r e p a r ei m m o b i l i z e dp h o s p h o l i p a s ed 、舫t hh i g h e ra c t i v i t y a o ds t a b i l i t y t h ec a t a l y z e dp e r f o r m a n c eo fi m m o b i l i z e dp h o s p h o l i p a s ed a a c lw a s e v a l u a t e da n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ef o u n d ：t a k ee t h e ra so r g a n i cs o l v e n t , t e m p e r a t u r ei s 3 0 c ，p ni s6 t h ef o u n d a t i o nd y n a m i c sf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e dt o o i tw a sf o u n d t h a tt h e o p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ep ci s lm m ，t h ec o n c e n t r a t i o no fe ai s5 0 m m ，t h e a m o u n to fi m m o b i l i z a t i o ne n z y m ei so 5 9 ，t h er o t a t i o n a ls p e e di s2 0 0 r p m u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，t h eo p t i m u mr e a c t i o nv e l o c i t yc a na c h i e v e8 3 7p m o l m i n m g i tw a sd i s c o v e r e d i i i t h a tu n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ee f f e c to fh y d r o l i t i cr e a c t i o nm a yb en e g l e c t t h i sw i l lp r o v i d e ab r o a d e rp l a t f o r mf o r t h ea p p l i c a t i o no fi m m o b i l i z e dp h o s p h o l i p a s ed m o r e o v e r , t h ec a t a l y z e dp e r f o r m a n c eo ft h ec r o s s l i n k i n gp h o s p h o l i p a s eda g g r e g a t e s w e r ee v a l u a t e d , t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so ft r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o nr e a c t i o nc a t a l y z e db y i m m o b i l i z e dp l d - c l e aw e r ef o u n d ：t a k ee t h e ra so r g a n i cs o l v e n t , t h er e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s 3 2 。c ，p hi s7 ；t h ef o u n d a t i o nd y n a m i c sf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e dt o o i tw a sf o u n dt h a tt h e o p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ep ci s lm m ，t h ec o n c e n t r a t i o no fe ai s5 0 m m ，t h e a m o u n to fi m m o b i l i z e de n z y m ei so 2 9 ，t h er o t a t i o n a ls p e e di s15 0 r p m u n d e rt h i sc o n d i t i o n ， t h eo p t i m u mr e a c t i o nv e l o c i t yc a na c h i e v e3 8 4 2l a m o l m i n m g i na d d i t i o n ，i tw a sd i s c o v e r e d t h a tu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ee f f e c to fh y d r o l i t i cr e a c t i o ni sv e r ys m a l l o b v i o u s l y , i m m o b i l i z a t i o np l dc a ne l e v a t ea l t e r n a t i v es p e c i f i c i t yo nt h es u b s t r a t e t oc o m p a r et h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，b e c a u s eo ft h ed i f f e r e n c eo fp r e p a r a t i v em e t h o d a n dr e a c t i o nm e c h a n i s m ，t h ek i n e t i cp a r a m e t e r sc h a n g e d 觞w e l l t h e o r e t i c a la n a l y s i so nt h e e n z y m a t i cr e a c t i o nk i n e t i c sm o d e lw a sm a d ea n d t h ee f f e c to fe x t e r i o ra n di n t e r i o rd i f f u s i o n w a sj u d g e dt o o u n d e rd i f f e r e n ts u b s t r a t e sc o n c e n t r a t i o n , i m m o b i l i z e dp l d ( a a c l s ) a n d i m m o b i l i z e dp l d ( c l e a s ) w e r eu s e df o rt r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o nr e a c t i o nt os y n t h e s i s p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n ef r o mp h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，t h er e a c t i o nr a t ew a sd e t e r m i n e da n dt h e e q u i l i b r i u mc o n s t a n t so f k i n e t i cm o d e lw e r ec a l c u l a t e dt o o s i m u l a t i o no ft h ek i n e t i ce q u a t i o n w a sm a d eu s i n gm a t l a bs o f t w a r e ，i tw a sf o u n e dt h a tt h em o d e lc a nd i r e c t l yr e f l e c tt h ep r o c e s s o fe n z y m a t i cr e a c t i o nd y n a m i c s ，w h i c hp r o v i d ear e l i a b l eb a s i sf o r e x p a n s i o no f i n d u s t r i a l i z a t i o n k e y w o r d s ：p h o s p h o l i p i d s ，p h o s p h o l i p a s ed ，i m m o b i l i z a t i o n ，t r a n s p h o s p h a t i d y l a t i o n , k i n e t i c s i v 勘误声明 致广大读者： 本硕士学位论文交联固定化磷脂酶d 催化性能及动力学研究 中所涉及的吸附一聚集一交联固定化p l d 以及无载体的p l d 交联酶聚 集体两种固定化酶的活力单位，由于书写疏忽，将u 缝误写为u m g ， 文中所涉及固定化酶转磷脂酰基活力单位u r a g 均更正为u g 。同时 论文中涉及的两种固定化p l d 催化磷脂酰基转移反应的反应速率单 位误写为1 t m o l m i n m g ，均更正为g m o l m i n g 。由此带来阅读的不便， 本人表示诚挚的歉意。因论文提交时间紧张，本人粗心，请广大读者 予以谅解! 作者：佣哪 2 0 1 0 6 1 7 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 、 学位论文作者签名： 姻垫指导教师签名：乏趁薹 1 , o l o 年6 月f 7 日知厶年彳月，) 日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本 论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大 学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：勺蛔r 劢f o 年石月 f7 日 西北大学硕士学位论文 第一章绪论 高纯度磷脂作为一种优良的表面活性剂被广泛应用于食品、医药、农业等领域，目 前国内所需高纯度磷脂产品多从国外进口，因此开发出性能优良的磷脂产品迫在眉睫。 应用磷脂酶d 对磷脂进行酶法改性具有反应条件温和、催化效率高、分离工艺简单等优 点，越来越受到社会的广泛关注，其缺点是酶不能回收利用，成本代价高【1 1 。因此实验 室采用固定化技术对磷脂酶d 进行修饰，提高磷脂酶d 的催化性能及稳定性，增加酶的 回复利用批次以期降低酶消耗。而磷脂酶d 催化磷脂酰基转移反应通常在油水界面进 行，反应机理复杂，过程还伴随着水解反应与转磷脂酰反应的竞争【2 】。磷脂酶d 经固定 化后以固体催化剂的形式存在于水有机溶媒双相反应体系中，这种液液固反应体系必 然会对传质产生影响。而固定化酶由于制备方法及作用机理不同，其催化磷脂酰基转移 反应的性能也会存在差异。本文采用实验室制备的两种交联固定化磷脂酶d ：吸附聚集 交联固定化磷脂酶d ( a a c l s ) 和交联磷脂酶d 聚集体( c l e a s ) ，分别在水有机溶剂 双相反应体系下催化磷脂酰胆碱( p c ) 与受体醇乙醇胺( e a ) 进行磷脂酰基转移反应 合成磷脂酰乙醇胺( p e ) 。并以合成磷脂酰乙醇胺( p e ) 为模型体系，研究两种固定 化酶的催化性能及相关动力学基础因素对反应的影响。从动力学参数的角度分析两种酶 的异同，并对模型进行适当简化，建立相关动力学方程，用于探明固定化磷脂酶d 的催 化反应规律。 1 1 磷脂 1 1 1 磷脂简介 磷脂( p h o s p h a t i d e ) 是一类广泛存在于鸡蛋蛋黄和大豆中的脂质化合物，由甘油骨 架、极性头部、以及两条脂肪酸链构成【3 】。这种两性分子结构使其成为农业、化妆品、 食品等工业中的重要添加成分。在8 0 年代兴起的靶向给药技术( d r u gd e l i v e r ys y s t e m s ， d d s ) 中，高纯度磷脂作为一种优良的脂质体被应用于实验研究中【4 】；在化妆品工业领 域，磷脂以其天然无污染的特点，被广泛地作为一种性能优越的表面活性添加剂应用于 生产中；同时，近年来针对磷脂在改善大脑记忆方面的生物活性的研究越来越多，这也 进一步提出了对高纯度磷脂产品的需求。但是由于在天然磷脂中，只有磷脂酰胆碱( p c ) 的提取工艺较为简单，方便工业化扩大生产，而其他高纯度的单一磷脂的提取工艺相对 第一章绪论 复杂，因此单一稀有磷脂的成本也相应昂贵，因此通常采用酶法改性的方式对粗磷脂进 行改性，来合成含有不同极性末端的新的功能性磷脂或单一磷脂。 1 1 2 磷脂结构和功能 通常所说的磷脂是多种磷脂的混合物，是根据不同磷脂极性末端的功能性基团进行 命名的。主要包括磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s ，p c ，俗称卵磷脂) 、磷脂酰乙醇胺 ( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n ，p e ，俗称脑磷脂) 、磷脂酰丝氨酸( p h o s p h a t i d y l s e r i n e ，p s ，俗 称丝氨酸磷脂) 、磷脂酰甘油( p h o s p h a t i d y i g l y c e r o l ，p g ) 、磷酸( p h o s p h a t i d i e a c i d ，p a ) 、 磷脂酰肌醇( p h o s p h a t i d y r l i n o s i t o l ，p i ，俗称肌醇磷脂) 等，结构见图1 1 。 + - c m - c m - n ( c h g =磷脂酰胆碱( p c ) 4 - - m - c i - a - n i - i ， 磷脂酰乙醇胺口e ) n i l , + c i i a - c h - c o o 。 磷脂酰丝氨酸口s ) 一a 王2 c h o 王王- c 王l o h 磷脂酰甘油( p g ) - h 磷脂酸 a ) 磷脂酰肌醇( p i ) hu 且 图1 1 磷脂的结构 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo fd i f f e r e n tp h o s p h a t i d e 1 1 3 目前国内外磷脂供求现状 根据美国化学文摘统计，列出相关磷脂的专题文献报道，见表1 1 。从表中可以看 出：磷脂研究于7 0 年代末至8 0 年代初这一阶段最为活跃，而磷脂应用及其相关反应方 面研究的比重也在逐年递增。磷脂产品作为优良的表面活性剂被广泛应用于医药化工、 食品添加剂等领域。目前国际市场主要包括美国、日本、西欧等国家对高纯度磷脂产品 的年需求量约为5 0 0 0 0 吨左右，而实际生产能力仅为3 0 0 0 0 吨，产生的5 0 供需缺口成 为磷脂产品生产行业的头等难题【5 1 。 2 x d 撮 o o o o i 乒o 0 o吕- 弘m o。( ：)pr 西北大学硕士学位论文 表1 1 美国化学文摘关于磷脂研究的统计报告 t a b 1 - 1t h es t a t i s t i c a lr e p o r ta b o u tp h o s p h a f i d 鹤o fa m e r i c a nc h e m i c a la b s t r a c t s 研究 r 生物学 特性 应用 分析 制取伴随反应总计 年纷 1 9 7 2 1 9 7 67 0 5 1 6 5 4 7 3 5 1 2 1 0 2 4 9 0 0 多篇 1 9 7 7 1 9 8 15 3 2 2 3 1 1 2 5 1 3 2 8 0 5 6 6 8 0 0 0 多篇 1 9 8 2 - 1 9 8 6 3 2 8 1 3 5 1 4 3 4 7 2 0 6 o 4 1 3 7 1 9 0 0 多篇 在国内市场上，大豆和蛋黄是目前商业卵磷脂最主要的两个来源。从表1 2 可以看 出，虽然蛋黄中的卵磷脂含量比大豆要高，但要在工业上成功地从蛋黄中提取高纯度的 卵磷脂，仍具有较大难度，因此现在国内市售的卵磷脂产品多数是以大豆为原料的。而 我国虽然拥有丰富的大豆磷脂资源，但与国外生产研发技术相比，磷脂产品的开发仍处 于起步阶段。生产过程中存在产品含量低、资源浪费严重、生产规模小、检测手段落后、 高纯度功能性磷脂产品欠缺等问题，使其在精细化工医药领域的应用方面仍受到一定程 度的局限。因此生产出高纯度的单一功能性磷脂产品成为目前研究的热点，开发出适合 我国国情的高纯度磷脂产品制备工艺，并使其达到工业化生产的标准，这一研究将具有 重要的社会价值和经济价值【6 j 。 表1 - 2 大豆磷脂和蛋黄磷脂的组成 t a b 1 - 2t h ec o m p o s i t i o no fs o y b e a np h o s p h o l i p i d sa n de g g y o l kp h o s p h o f i p i d 成分 p cp ep sp gp ap i 类别 大豆磷脂 4 6 1 1 7 3 6 5 2 2 9 4 1 8 5 蛋黄磷脂7 3 o 1 6 8 1 0 2 本文着重研究的磷脂产品磷酯酰乙醇胺( p e ，俗称脑磷脂) ，在粗品大豆磷脂中其 含量仅次于磷脂酰胆碱( p c ，俗称卵磷脂) ，并在近年来以其独特的生理作用而备受关 注。为了制备高纯度的功能性磷脂产品p e ，可采用磷脂酶d 对磷脂酰胆碱进行酶法改 性。该方法具有较高的催化反应速率，和传统的化学改性方法相比，其反应条件温和( 一 般为常温、常压) 、选择性高、设备简单、生产安全、副反应少、反应速率快，因此在 生物催化领域越来越受到人们的广泛关注。 第一章绪论 1 2 磷脂酶d 1 2 1 磷脂酶d 的概述 磷脂酶d ( 简称p l d ) 存在于哺乳动物、植物、细菌、微生物中，具有广泛的底物 特异性，可催化主要作用底物磷脂酰胆碱发生水解反应或通过磷脂酰基转移反应改变磷 脂的极性头部来合成新型磷脂产品。其中水解产物磷脂酸( p a ) 及其副产物二酰甘油是 细胞信号传导酶的激活剂，参与调节细胞脂质代谢、信号转导等。同时p l d 在细胞增 殖和分化过程中通过激活蛋白激酶c 起到一定的调节作用。影响p l d 的催化活性的因 素很多，有温度、p h 、无机盐类、双相反应中有机溶剂种类以及酶与底物的聚合形式等 l 。根据研究表明，不同来源的p l d 其最适反应温度及p h 值范围均不同，而由于磷脂 酶d 属于水溶性酶，其在水有机溶媒双相反应体系中必然会在两相界面与有机相发生 接触，因此不同极性的有机溶剂也会对酶产生一定的影响，严重时可导致酶分子结构的 改变，甚至使酶失活。酶与底物结合形式不同也会影响酶活性的发挥，经研究表明，当 底物浓度过大，反应即产生底物抑制现象，此时酶与底物在反应之初便形成死端复合物， 使酶丧失催化活性，影响反应速率【8 】。因此，采用p l d 催化磷脂酰基转移反应合成新型 磷脂产品的过程中，研究并选择最优的反应工艺条件，有助于了解p l d 的催化作用机 制，同时可以指导后续工业化生产的扩大。 1 2 2 磷脂酶d 的活性部位结构及其催化机理 磷脂酶d 可催化两种反应：水解磷脂酰胆碱( p c ) ，一种p l d 的主要作用底物，生 成磷脂酸( p a ) 和胆碱( c h o ) ，即水解反应 9 1 ，除水解作用外，在特定条件下，p l d 还能催化磷脂酰基转移反应，使各种含羟基的极性头部基团结合到磷脂的碱基上，形成 新型磷脂产品。利用这一特性可对粗品大豆磷脂进行酶法改性，来制备高纯度的单一磷 脂和稀有磷脂【1 0 1 ，来填补市场上对高纯度磷脂产品的需求空缺。 由于磷脂酶d 是水溶性酶，而反应底物磷脂及其产物只溶解于有机溶剂中，因此以 磷脂酶d 催化的磷脂酰基转移反应均在水有机溶媒双相反应体系中进行，在该双液相反 应体系中，磷脂底物溶于有机相，酶、受体羟基化合物、副产物胆碱均存在于水相【l l 】。 同时通过实验发现磷脂酶d 仅作用于处在脂( 油) 水界面的磷脂分子，因此，任何能增 加两相界面的条件及有利于磷脂酶d 吸附在两相界面上的因素都能加快磷脂酶d 的催化 反应速率，提高酶的催化活力。 磷脂酶d 催化的磷脂酰基转移反应均为双底物的酶促反应，反应符合乒乓机理【1 2 1 。 4 西北大学硕士学位论文 对于这个机制，酶( e ) 必须首先与在第一个底物磷脂酰胆碱( p c ) 结合，然后释放第 一个产物胆碱( c h o ) 并形成一种新的酶产物( e p ) 。然后第二个底物乙醇胺( e a ) 再 与酶产物( e p ) 结合，形成复合物( e p - x o h ) ，复合物分解成游离酶( e ) 和第二个 产物磷脂酰乙醇胺( p e ) 。乒乓机理见图l ，2 。 粥产x 勿脚一嚣r x 专e r 二i “ r p x - o h “，1 ，一 u p c ，、e hh e 艾 陆t i n g | t c p队o 1 妇、弓妄e - p - h o h 竺e - p a 生 e 图1 - 2p l d 催化的乒乓反应机理图 f i g 1 - 2p l d r e a c t i o n sb a s e do i lp i n g - p o n gm e c h a n i s m 酶促反应动力学的研究有助于阐明酶的结构与功能的关系，也可为酶作用机理的研 究提供可靠数据；有助于优化磷脂产品的反应工艺条件，提高酶的催化活力表现率。同 时文章采用两种不同的固定化酶催化磷脂酰基转移反应，通过研究酶促反应动力学相关 参数的变化，有助于加深对固定化酶作用机理的认识，帮助判断载体对固定化酶催化作 用的影响，并通过建立动力学模型，有效控制和指导反应的进行。 1 2 3 磷脂酶d 在应用中存在的问题 目前，对游离磷脂酶d 的催化工艺研究较多，但在具体使用游离酶催化反应的过程 中发现直接利用其进行工业化生产遇到了一些严峻的问题，主要包括以下几方面。 1 ) 一批反应后，磷脂酶d 难于从双相反应体系中分离出来，而据了解发酵产p l d i 艺 复杂，周期较长，造价昂贵，如果不能对酶进行回收利用，必然造成反应成本的增 大，同时该反应体系也难以实现过程的连续化。 2 ) 酶在有机相中不溶解，反应过程中容易聚集成团，大大降低了酶的利用率，同时游 离酶很不稳定，容易变性和失活。 3 ) p l d 催化磷脂酰基转移反应作用的底物磷脂不溶于水，因而必须加入合适的有机溶 剂或乳化剂强化酶分子与底物的接触比表面积。这必然会引起产品的二次污染，增 加产品分离处理的难度。 第一章绪论 由于游离酶在催化反应中存在上述缺点，因此对于工业化生产，游离酶还不能作为 一种理想的催化剂，因此需要对酶进行适当的修饰加工比如对其进行固定化操作，以期 改善其操作性能，降低反应成本，同时使其更加适于工业化扩大生产的需要。 1 3 固定化酶 1 3 1 固定化酶的概述 固定化酶技术，就是将酶结合在载体上，或将其限制在有限空间内，使其在保持相 应催化活性的同时，方便回收利用的一类技术。它能以固相状态作用于底物进行催化反 应。固定化酶的发展历史距今有9 0 多年，早在1 9 1 6 年，n e l s o n 和g r i f f i n 首次发现结合在 载体氧化铝上的蔗糖酶仍具有催化活性，这一研究揭开了固定化酶的发展序幕。后来又 研发了很多新型的固定化方法，包括包埋法，溶胶凝胶法及新兴的无载体固定化方法， 比如后面要研究的交联酶聚集体技术( c l e a ) 已成为大规模生物转化研究领域关注的 热点【1 3 1 。而固定化酶的研发初衷就是为了寻求一种可以方便回收并重复利用的新型固体 催化剂，进而满足工业化生产的需求。1 9 6 3 年日本田边制药公司首次利用自行研发的固 定化酶拆分外消旋氨基酸衍生物生产l 氨基酸，这一工业化应用先例，不断激发工程人 员的研发兴趣。固定化酶与游离酶相比，具有如下优点。 1 ) 固定化酶在催化反应后很容易从反应体系中取出，方便回收反复利用，且产物不受 酶液污染容易精制，因此便于工业化的扩大生产； 2 ) 固定化酶相对于游离酶具有更高的选择性、专一性和稳定性，能够满足生产过程中 人们对产品性能的诸多要求。 3 ) 固定化酶具有一定机械强度，可以装填在反应器中重复使用，便于实现连续化生产。 4 ) 酶的使用效率提高，成本降低的同时节约能源，保护环境。 1 3 2 传统固定化方法介绍 传统的固定化方法可分为：吸附法、共价结合法、交联法、包埋法。 1 ) 吸附法 传统吸附法包括物理吸附法和离子吸附法两种。 物理吸附法是将酶以物理吸附固定于非水溶性载体上。常用的载体有活性炭、高岭 石、铝氧粉、硅胶、氧化钛、硅藻土、陶瓷等。 离子吸附法是将酶以离子静电引力结合到含有离子交换基团的载体上的。此法在工 6 西北大学硕士学位论文 业上应用较广泛，常用的交换剂为多糖类、离子交换树脂等。 吸附法相对于其他固定化方法来说，其优点是工艺操作简便、反应条件温和，因此 酶蛋白的活性中心不易受到破坏，能较好的保持有活性的高级结构，同时载体可以再生 利用。缺点是酶与载体相互作用力较弱，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往容 易从载体上脱落下来，重新溶解到缓冲液体系中【1 4 1 。 2 ) 包埋法 这种方法是将酶包埋在凝胶的微小空间内。酶被限制在该空间内不能自由通透，而 底物和反应产物由于分子量小皆能自由的进出空间。常用的有凝胶包埋法、纤维包埋法 和微胶囊法。该方法具有反应条件温和，适用性广等优点。 3 ) 共价法 共价法是利用酶蛋白分子上的n i t 2 基、s h 基、c o o h 基、o h 基、n h = c ( n h ) n h 一 基、咪唑基等反应活性高的未结合基团与载体表面上的反应基团之间形成化学共价键连 接，以固定酶的方法。其常用载体包括天然高分子、合成高聚物和无机支持物。该方法 由于酶与载体间连接牢固，不易脱落，具有良好的稳定性和回复利用性等优点，已成为 酶工程领域研究的热点。但是与传统的吸附法相比，共价法由于反应条件较为苛刻，固 定化操作程序复杂，容易引起酶蛋白高级结构变化，损坏部分酶的活性中心，因此比酶 活力低，酶活力回收率也相应较低。因此常常将其与交联法联用，以期改善这种不足。 4 ) 交联法 交联法是一种通过酶与具有两个或两个以上官能基团的试剂反应，使酶固定化的方 法。本法不需要载体，过程中除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。 最常用的交联试剂是戊二醛。交联法由于酶蛋白长时间与交联剂接触，对其活性产生了 一定影响，导致固定化酶的酶活力回收率较低，经研究采用降低交联剂浓度和缩短反应 时间将有效改善固定化酶的比活力。此法很少单独使用，一般作为辅助手段，与吸附法 结合，以期达到更好的固定化效果。 表1 3 列出了不同固定化方法的优缺点，以便后续操作中根据不同实验的需求来选 择合适的固定化方法或者进行多种方法的有效结合以便生产出酶活高、蛋白负载率高的 新型固定化酶。而基于沉淀剂作用下酶分子相互聚集、溶解度降低、且载体吸附量可望 增加的原理，文章第二章以沉淀聚集作用强化酶的吸附交联固定化，提出酶的吸附聚 集一交联固定化法( a d s o r b i n g a g g r e g a t i n g c r o s s - l i n k i n gm e t h o d ) 。 7 第一章绪论 表1 - 3 传统固定化方法的比较 t a b 1 - 3c o m p a r i s o no ft h et r a d i t i o n a li m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s 1 - 3 3 无载体固定化技术 近年来，无载体固定化技术以其酶结合容量大、催化反应活性高( 一般为传统有载 体固定化酶催化活力的1 0 1 0 0 0 倍) 、受扩散限制影响小、稳定性高等优点，成为固定 化酶研究领域的热点。目前常见的易于操作的无载体固定化技术为交联酶晶体c l e c ( c r o s s l i n k e de n z y m ec r y s t a l s ) 和交联酶聚集体c l e a ( c r o s s l i n k e de n z y m e a g g r e g a t e ) 。c l e c 是先对酶进行纯化结晶，形成酶晶体，再对其进行交联的过程。c l e a 是采用物理方法使酶分子聚集、再经交联剂( 一般为戊二醛) 交联而成，荷兰的d e l f t 大学于2 0 0 0 年首次采用该方法，用沉淀剂沉淀酶蛋白，再利用戊二醛交联制备出稳定性 较高的无载体固定化酶。其中c l e c 由于需对粗酶进行纯化结晶，因此操作过程相对复 杂，而c l e a 的制备工艺简单、不需纯化酶、成本低、酶活回收率和催化活性古【1 5 】，因 此这种技术被广泛应用于蛋白质纯化及固定化酶制备领域。 1 3 4 影响固定化酶动力学的因素 固定化操作对酶活性影响显著，常因酶的种类、反应体系、特别是固定化方法以及 载体类别不同而使固定化酶的性能发生不同程度的变化【1 6 1 。概括起来大体有如下三种因 素。 1 1 空间效应 酶蛋白分子的三维空间结构决定了酶的活性位点及变构部位的性质。在固定化过程 中，由于酶和载体的相互作用，从而引起了酶的活性中心或调节中心的构象发生了扭曲 8 西北大学硕士学位论文 变形，改变了酶活性的三维结构，减弱了酶与底物的结合能力，这种现象称为构象效应， 通常多出现于吸附法和共价偶联法。同时由于载体的介入，可产生位阻效应。因为载体 的存在使酶分子的活性基团不易与底物相接触，从而对酶的活性部位造成了空间障碍， 使酶的活性下降。这种效应在以吸附法或共价偶联法将酶固定于纤维素类的载体上时， 可通过在酶与载体间加“臂”加以改善。 2 ) 分配效应 当固定化酶投入到反应体系的主体溶液中时，反应体系从单相变成多相体系。通常 把固定化酶颗粒附近的环境称为微环境，而把主体溶液体系称为宏观环境。由于固定化 载体的亲水性、疏水性及静电作用引起固定化酶载体内部底物、产物以及其他效应物在 微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反 应速度的效应称为分配效应。分配效应一般采用液固界面内外侧的底物浓度之比，即分 配系数来定量表示。 3 ) 扩散效应 固定化酶对底物进行催化反应时，必须发生物质传递，过程包括两部分：第一，底 物必须从主体溶液传递到固定化酶内部的催化活性中心处；第二，催化产物又必须从酶 的催化活性中心传递到主体溶液中。该扩散过程的速率可能会对反应速率产生限制作 用，特别是当底物在液体中的扩散速率相对缓慢，而固定化酶的催化活性又很高时，这 种扩散限制效应就