（生物化学与分子生物学专业论文）链霉菌微型转座系统的构建及初步应用.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 屑 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名： 王嘉务 时间：驴占年6 月i t日 学位论文使用授权书 本人完全了解。华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，畸以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文本人同意华中农业大学日以用不同方式在不同媒体上发表，传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者馘豆姊 导师始调善叭 签名日期：d 1 绰占月1 1 日签名日期：1 。6 年6 月c z 日 注：请将本表宣接装订在学位论文的扉页和目录之间 天蓝色链霉菌中微型转座系统的构建及初步戍用 摘要 随着天蓝色链霉菌a 3 ( 2 ) 和阿维链霉菌m a 4 6 8 0 的全基因组序列的发表，链霉 菌的基础研究已进入后基因组时代，大量新基因和功能未知基因的功能有待鉴定。 大规模突变体库的构建是功能基因组研究的一个重要内容，而利用转座子进行插入 突变构建突变体库则是目前广泛应用的方法之一 转座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在链霉菌中应用的大多数转座 子却普遍存在转座效率低下或操作繁琐等缺点。仅有t n 4 5 5 6 及其衍生物和t n 5 衍 生转座子能够被应用于突变体库的构建和突变菌株的筛选。但是它们依然存在各种 缺陷。 针对现有转座子系统的一些缺陷，构建了应用于链霉菌中的携带微型转座子 m i n i t n 4 5 6 0 a 的质粒载体p i l l 2 6 5 。它携带的转座酶基因t n p a 位于转座子m i n i t n 4 5 6 0 a 外部，转座发生后，质粒载体p i l l 2 6 5 由于不具有链霉菌复制子而不能在 宿主菌中存在，失去了转座酶基因的微型转座予理论上将不可能发生二次转座；带 有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点o r i t , 将有利于转座子载体通过 接合转移的方式从大肠杆菌导入到链霉菌中，大大降低了原生质体转化过程中自体 突变的可能；转座子直接进行体内转座，省去用t n 5 体外转座时要构建基因组文库， 再将体外转座突变体库重转入链霉菌，筛选突变菌株的复杂过程。 利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌m 1 4 5 的约1 0 0 0 株转座突变株。 其中不乏表型异常的菌株选取其中的8 株，经s o u t h e r n 杂交验证可知该转座予的 转座基本具有随机性；通过连续的松弛传代培养可知该转座子在宿主d n a 中稳定 存在。此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了一个新的技术手段。 关键词：微型转座子转座诱变天蓝色链霉菌功能基因组 华中农业大学硕七学位论文 a b s t r a c t t h eb a s i cr e s e a r do ns t r e p t o m y c e s t e se n t e r st h ep o s t - g e n o m i c sf f f as i n c et h e p u b l i s h e d o fs t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o ra 3 ( 2 ) a n ds t r e p t o m y c e sa v e r m i t i l i sm a - - 4 6 8 0 g e n o m e f u n c t i o n o fm a n yn o v e lg e n e so ru n k n o w ng e n e si st ob ei d e n t i f i e d c o n s t r u c t i o na n ds c r e e n i n go fm u t a n tl i b r a r yi sa ni m p o r t a n ts t r a t e g yi nf u n c t i o n a l g e n o m i c s a n dt r a n s p o s o ni sau s e f u lt o o lt oc o n s t r u c tm u t a n tl i b r a r i e s t r e n s p o s o ni sav e r yu s e f u lt o o lo fg e n ef u n c t i o na n a l y s i s h o w e v e r , c u r r e n t l y u t i l i z e dt r a n s p o s o u si ns t r e p t o m y c e sh a v em a n yd i s a d v a n t a g e s s u c ha sl o wt r a n s p o s i t i o n f r e q u e n c y o rc o m p l i c a t e dt ou 辩s o m ec m r e n t l ye m p l o y e df f a n s p o s o n s ( t n 4 5 5 6a n dt n 5 d e r i v a t i v e s ) h a db e e nu s e dt oc o n s t r u c tm u t a n tl i b r a r i e s b u tt h e ya r en o tp e r f e c ta ta 1 1 a i m i n ga ti m p r o v i n gc u r r e n t l yu s e dl l a l i s p o s o n s ，an o v e lt r a n s p o s o np l a s m i d p h l 2 6 5w a sc o n s t r u c t e dc o n t a i n i n gam i n i - t r a u s p o s o nm i n i - t n 4 5 6 0 a t h ep h l 2 6 5h a s s e v e r a la d v a n t a g e s f i r s t , i tat r a n s p o s a s eg e n et n p al o c a t e db e y o n dt h em i n i - t r a n s p o s o n m i n i - t n 4 5 6 0 a i tc o n t a i n sn or e p l i c a t i o no r i o nr e g i o nf o rr e p l i c a t i o ni ns t r e p t o m y c e s i n t h e o r yat r a n s p o s i t i o nm u t a g e n i z e ds t r a i nw i l ln o tb es u b j e c tt oas e c o n dt r a n s p o s i t i o n b e c a u s em p aw i l lb el o s td u r i n gt h ef i r s tt r a n s p o s i t i o np r o c e s s s c e c o n d ，p i l l 2 6 5a l s o c o n t a i n so r i t , t h eo r i g i no f t r a n s f e rf r o mr k 2 ，w h i c hc a l lb eu s e dt oi n t r o d u c ed n af r o m ec o l it os t r e p t o m y c e sb yc o n j u g a t i o n c o n j u g a t i o nw i l lm i n i m i z em u t a t i o nu s u a l l y o c c u r r e di np r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o n f i n a l l y , i n - v i v ot r a n s p o s i t i o nu s i n gp i l l 2 6 5w a s m u c hm o r ec o n c i s e l yo rd i r e c t l y , c o m p a r e dt oi n - v i t r ot n 5t r a n s p o s i t i o ni nw h i c h c o n s t r u c t i o no fac o s m i dg e n o m i cl i b r a r yi sr e q u i r e da n dt h et r a n s p o s i t i o nm u t a g e n i z e d c o s m i dl i b r a r yh a st ob er e i n t r o d u c e di n t os t r e p t o m y c e sa n ds c r c g nf o rm u t a n t s a b o u to n et h o u s a n dt r a n s p o s i t i o nm u t a n t sw e r es c r e e n e du s i n gt h i sm i n i t r a u s p o s o m s o m eo f t h e mw e r ed e v e l o p m e n t a ld e f i c i e n t e i g h ts t r a i n sw e r es e l e c t e df o rs o u t h e r nb l o t a n a l y s i sa n dt h er a n d o m n e s so ft h et r a n s p o s i t i o nw a sc o n f i r m e d t h es t a b l e n e s so ft h e t r a n s p o s o n sw a sa l s oc o n f i r m e db yr e l a x e dc u l t i v a t i o n f o rs e v e r a lg e n e r a t i o n s t h e t r a n s p o s o ns y s t e mc o n s t r u c t e dh e r eh a sp r o v i d e dan o v e la p p r o a c hf o rt h e f u n c t i o n g e n o m i ca n a l y s i so f s t r e p t o m y c e s 2 天蓝色链霉菌中微型转座系统的构建投初步应用 k e yw o r d s ：m i n i t a n s p o s o n ；t r a n s p o s i t i o nm u t a t e ；s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r ； f u n c t i o n a lg e r l o t n e 华中农业大学硕七学位论文 a a c t 3 1 a c t a p f a m p b i d b p c m l c c c d n a c d a c i a p c o s d m s o e d r r a g + c h i p t g i r k b k m m b m m h p d n e o o d o r f 缩略语( a b b r i v i a t i o n s ) a m i n oa c i d a p r a m y c i nr e s i s t a n c eg e n e a c t i n o r h o d i n a p r e m y c i n a m p i c i l l i n b a l d b a s ep a i r c h l o r e m p h e n i c o la c e t y l t r a n s f e r a s e ，s y n o n y mo f o a t e o v a l e n t l yc l o s e dc i r c u l a rd n a c a l c i u m - d e p e n d e n ta n t i b i o t i c c a l f i n t e s t i n a la l k a l i n ep h o s p h a t a s e c o h e s i v ee n d d i m e t h y ls u l f o x i d e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d p e r c e n t a g eo f g + cc o n t e n t h o u r i s o p r o p y i - t h i o g a l a t o p y r a n o s i d e i n v e r t e dr e p e a t k i l o b a s e s ( p a i r s ) k a n a m y c i n m e g a b a s e m i n u t e k a n a m y c i nr e s i s t a n c eg e a e n e o m y c i n o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m 4 氨基酸 阿泊拉霉素抗性基因 放线紫红素 阿泊拉霉素 氨苄青霉素 光秃基因 碱基对 氯霉素酰基转移酶 共价闭合环状d n a 钙依赖抗生素 牛小肠碱性磷酸酶 x 噬菌体包装位点 二甲基砭砜 乙二胺四乙酸 g + c 百分含量 小时 异丙基硫代半乳糖苷 倒转重复序列 千碱基对 卡那霉素 1 0 6 碱基对 分钟 卡那霉素抗性基因 新霉素 光密度值 开放阅读框架 天蓝色链霉菌中微型转座系统的构建及初步府用 o r i g i no f r e p l i c a t i o n o r i g i no f t r a n s f e r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e s i s t a n c e u n d c c y l p r o d i g i o s i n r e p l i c o n s e n s i t i v i t y s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s e c o n d t r i s - a c e t a t e e d t ab u f f e r 1 h s - e d t ab u f f e r n - t r i s ( h y d r o s y m e t h y l ) m e t h y l - 2 - a m i n o - e t h a n e s u l p h o n i ca c i d t h i o s t t e p t o n t r a n s p o s a s eg e n e r e s o l v a s eg e n e t h i o s t r e p t o nr e s i s t a n c eg e n e v i o m y c i nr e s i s t a n c eg e n e w h i t e 5 复制起始位点 转移起始位点 聚合酶链式反应 抗性 十一烷基灵菌红素 复制子 解离位点 敏感性 十二烷基磺酸钠 秒 t d s - 乙酸e d t a 缓冲液 t r i s - e d t a 缓冲液 硫链丝菌素 转座酶基因 拆分酶基因 硫链丝菌素抗性基因 紫霉素抗性基因 白色基因 慨 鏊 硼 胀 r 蹦 坤 协 。 善； i ； ；| | 茎 | 刍 眦 叫咄 舯 咖胁 华中农业大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 链霉菌简介 链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 是一类具有分枝状菌丝体的好氧革兰氏阳性细菌 ( w a k e s m a n a n d h e d r e i ，1 9 4 3 ) ，属于原核生物界放线菌目链霉菌科，是土壤中主要 的微生物类群之一。其g 忙含量高达7 0 7 4 ( w r i g h ta n db i b b ，1 9 9 2 ) ，是迄今为 止自然界中已知g + c 含量最高的生物类群之一( g o o d f e l l o wa n dc r o s s 1 9 8 4 ) 。 链霉菌属于原核生物类群，却不同于普通原核生物主要采用二分裂等无性繁殖 方式进行繁殖。相比而言，链霉菌具有独特的发育分化生活史，其相对简单又较为 完整的细胞分化发育周期包括了萌芽、生长、发育和分化的整个循环首先单个孢 子萌发形成芽管，通过顶端延伸和分枝，逐渐侵入到固体培养基中，形成较细的基 质菌丝，然后，基质菌丝不断向空问延伸，分化出较粗的气生菌丝，气生菌丝通过 不同的形态变化( 如形成螺旋或卷曲) 后，成熟分化形成孢子丝，并通过横割分裂 的方式，产生成串的干粉状灰色孢子链( 如图1 1 所示) 。这种相对简单而生活史较为 完整的原核生物是研究原核生物基因时空表达和分化调节的良好材料( c h a t c t , 1 9 9 3 ) 。 此外，链霉菌基因组还具有遗传不稳定性，自发突变频率至少为0 1 一l ，与 染色体上某些特定区域的高频扩增和缺失密切相关( a l t e n b u c h n e ra n dc u l l u m , 1 9 8 5 ； l e b l o n da n dd e c a r i e s ，1 9 9 4 ) ，对链霉菌的发育过程和抗生素形成、耐药性与酶的形 成等次生代谢过程有一定的影响。外界因素，如紫外线照射、d n a 嵌入诱变剂、修 复抑制剂，甚至简单的冷冻储存和原生质体制备过程都有可能影响链霉菌的遗传稳 定性。 6 天蓝色链霉菌中微型转座系统的构建及初步戍用 图1 1 链霉菌的生活史 f i g1 1t h el i f ec y c l eo f s t r e p t o m y c e s 链霉菌是一类极具商业价值的工业微生物，它可以产生数以千计的天然抗生素 和其它有用的次级代谢产物，自然界中2 3 以上的已知天然抗生素都是由链霉菌产 生的( k i e s e r “a 。2 0 0 0 ) ，它们分别在抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抗寄生虫等方面具 有功效。例如用于抗家畜寄生虫及杀螨虫的阿维菌素，防治水稻纹枯病的井岗霉素， 用于医疗和兽医的红霉素、四环素，用作动物生长促进剂的泰洛星，用于植物保护 的春日霉素、多氧霉素，用做抗癌药物的柔毛霉素，用做免疫抑制剂的f k 5 0 6 和雷 帕霉素等随着人们对新药需求的日益增加，尤其是自h o p w o o d 和m a l p a r t i d a 将 a c t 生物合成基因簇转入曼得尔霉素( m e d e r m y c i n ) 或榴菌素( g r a n a t i e i n ) 的产生菌中， 首次通过抗生素生物合成基因的组合而产生新的“杂合”抗生素后，对链霉菌中杂合 抗生素合成的研究也日益火热起来。除此之外，链霉菌还能产生许多胞外酶，它们 在生产工业用酶和药用蛋白方面同样也具有不可忽视的潜力( b a t z , 1 9 9 0 ；b i n n i ee t 7 华中农业大学硕十学位论文 a ，1 9 9 7 ) 。例如加酶洗涤剂等行业具有重要的应用价值的碱性纤维素酶，在食品工 业中有着广泛的应用前景的转谷氨酰胺酶等等。 1 2 链霉菌的模式菌株天蓝色链霉菌( s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r ) a 3 ( 2 ) 和t 业菌株阿维链霉菌 a v e r m i t i l i s ) m a - 4 6 8 0 简介 由于具有完善的遗传学基础，天蓝色链霉菌a 3 ( 2 ) 成为链霉菌基础生物学和分 子生物学研究的模式菌株( c h a t e re t 以。1 9 9 3 ) 。天蓝色链霉菌a 3 ( 2 ) 至少可以产生四 种抗生素：放线紫红素( a e t i n o r h n d i n ) ( w r i g h te ta ，1 9 7 6 ) 、十一烷基灵茵红素 ( u n d e e y l p r o d i g i o s i n ) ( r u d de ta l ，1 9 8 0 ) 、次甲基霉素( m e t h y l e n o m y c i n ) ( w d g h te t 口f ， 1 9 7 6 ) 和钙依赖抗生素( c a 2 + - d e p e n d e n ta n t i b i o t i c ，c d a ) ( k e m p t e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。人们最 感兴趣的是放线紫红素，因其与许多在医药和商业上广泛应用的抗生素同属于聚酮 化合物( h o p w o o de t a l ，1 9 9 0 ) 。放线紫红素和十一烷基灵菌红素是两种色素类抗生素， 随着p h 值的改变，放线紫红素呈现蓝色或红色，而十一烷基灵菌红素呈现红色或 黄色。因此可以根据颜色的变化来分析抗生素的合成调控。 模式菌株天蓝色链霉菌a 3 ( 2 ) 的全基因组序列已于2 0 0 2 年4 月公布。根据测序 结果可知，天蓝色链霉菌的线性d n a 长度为8 , 6 6 7 ，5 0 7b p ，g + c 含量为7 2 1 ，预 测编码7 ，8 2 5 个基因。其中调控基因有9 6 5 个，占整个染色体基因组的1 2 3 ；编码 2 0 多个已知和预测的次生代谢物( 包括抗生素) 合成酶的基因簇，大约占基因组的 5 ( b e n t l e ye ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 阿维链霉菌是阿维菌素( a v e r m e c t i n ) 的产生菌，因其重要的生理活性和复杂的 化学结构，引起人们极大的兴趣。阿维菌素是一种新型抗生素类，具有结构新颖、 农畜两用的特点。随着人们生活水平的提高以及对绿色食品的呼唤，生物农药在当 前农药市场中倍受青睐，而阿维菌素是当前生物农药市场中最受欢迎和具激烈竞争 性的新产品。阿维菌素为阿维链霉菌一种典型的次级代谢产物，生物合成复杂，从 前人们通过对阿维菌素合成突变株的研究了解了其大概的合成途径。 天蓝色链霉菌中微型转座系统的构建及初步庸用 图1 2 天蓝色链霉菌a 3 0 ) 的遗传图谱和物理图谱( r e d e n b a c h e ta ，1 9 9 6 ) f i g1 2t h ep h y s i c a lm a pa n dg e n e t i cm a po f s t r e p t o m y c e sc o e l i c o l o r a 3 ( 2 ) = ( r e d e n b a c he ta ，1 9 9 6 ) m a - 4 6 8 0 菌株的全基因组序列测定已经完成( i k e d a e t a l ，2 0 0 3 ) 。其线性d n a 长度为9 ，0 2 5 ，6 0 8 b p ，g + c 含量为7 0 7 ，预测有7 ，5 7 4 个开放读码框( o r f ) ， 其中的3 5 组成7 2 1 个平行相关的家族。有3 0 个基因簇与次级代谢产物的生物合成 有关，占整个线性基因组的6 6 。它的内部有6 5 m b 的区域在碱基的组成与排列上 与天蓝色链霉菌a 3 ( 2 ) 菌株具有很高的相似性，且这段区域包含了所有已知重要 的基因。 基因组的测序只是链霉菌基因组研究的第一步，下一步的工作是要研究在不断 变化的内部和环境因素的作用下，不同基因的行为。弄清这些基因的具体功能及其 相互间作用和调控的机理才是最终的目标。 天蓝色链霉菌a 3 ( 2 ) 及阿维链霉菌m a - 4 6 8 0 基因组测序工作的完成是科学研究 9 华中农业大学硕十学位论文 发展史中的一个里程碑。从此人们可以更加系统地进行生物体的代谢和发育生物学 研究，同时也为链霉菌在生物医药和其它领域更广泛的应用奠定了坚实的基础。 1 3 功能基因组的研究策略 基因组( g e n o m e ) 是指生物染色体的全套基因。随着模式生物基因组计划和人类 基因组计划( h g p ) 的提出和实施，1 9 8 6 年t h o m a sr o d e r i e k 提出了“g e n o m i c s 这个 词，用以描绘基因组作图、测序和基因组分析等研究内容。随着基因组计划的深入 开展，其研究的内容从基因组的作图和测序向基因功能的研究转变和扩展。为反映 这一转变，基因组分析被分成“结构基因组学( s t r u c t u r a lg e n o m i c s ) ”和“功能基因组学 ( f u n c t i o n a lg e n o m i c s ) ”两个阶段。前者代表基因组分析的最初阶段，其基本的目标是 构建生物高分辨率的遗传图谱、物理图谱、表达图谱和序列图谱。后者代表基因组 分析的最新阶段，其研究内容是在利用结构基因组学丰富的信息资源的基础上、应 用大通量的实验分析方法并结合统计和计算机分析来研究基因的表达、调控与功能， 基因间、基因与蛋白质之间和蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之问的相互作用以及 生物的生长、发育等规律( h i e t e r e l a ，1 9 9 7 ) 。 随着基因组测序工作和遗传图谱的不断完成和序列信息的积累，大量新基因和 功能未知基因的功能有待鉴定。因此，发现新基因和认识基因的功能成为功能基因组 学研究最为紧迫的任务。大规模突变体库的构建是功能基因组研究的一个重要内容， 这是因为突变体和相应的突变基因间有着直接的因果关系，为确定功能基因的功能 提供最具有说服力的证据( s c h r e i b e re l a 。1 9 9 5 ) 。 产生突变体的方法有物理和化学诱变、同源重组( h o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ) 、 基因沉默( g e n es i l e n c e ) 以及插入突变( i n s e r t i o n a lm u t a g e n e s i s ) ，这些方法都可以用来 构建突变体库，但每种方法都有各自的优缺点。对于功能基因组学研究来说，在基 因鉴定方面，插入突变与化学或物理诱变剂等产生的突变相比具有很多优点。插入 突变利用已知的插入序列作为标记，不必事先确定基因表达和基因产物，即可对未 知基因进行研究。因此，在功能基因组学研究中插入突变已成为进行基因鉴定及功 能研究的首选方法( o t ae l a ，2 0 0 3 ) 。 利用插入突变进行功能基因组学研究时主要采用t d n a 、转座子及质粒介导 的插入突变等方法构建突变库。与t d n a 插入技术相比，使用转座子进行插入突变 1 0 天蓝色链霉菌中微型转座系统的构建及初步戍用 更具有优势。首先转座予产生的插入通常是完整的单一因子，很容易进行分子分析。 其次，许多转座子在转移酶存在的情况下，可从插入基因切离，使表型回复到野生 型或产生具有弱表型的等位基因，因此可确定该突变是否由插入突变引起。另外， 质粒介导的插入突变主要应用于微生物功能基因组学的研究中，其原理是利用不能 在宿主中自主复制的自杀性质粒，在宿主全基因组范围内进行随机插入突变构建突 变库 功能基因组的研究还处于发展的初期，虽然许多高效率、大通量的基因功能平 行分析技术不断提出和发展，但许多技术手段及其配套应用还不太熟。因此，功能 基因组研究的技术体系的建立、优化、改进和创新成为功能基因组学目前研究的主 要内容之一。 1 4 转座子 1 4 1 转座子的发现及类型 5 0 年代初期，m e c l i n t o c k 通过对玉米遗传现象的细微研究，首先发现了基因组 内的转座现象及转座子，随后在短短十几年中，人们在细菌和各类真核生物中也发 现了转座因子与转座现象，例如，1 9 6 3 年泰勒发现噬菌体m u 能随机地插入细菌染 色体基因组内；1 9 6 6 年，贝克威斯等在大肠杆菌中发现了可整合在染色体上也可游 离于染色体外的f 因子( 性因子) ；6 0 年代末，科学家仍在大肠杆菌中发现存在所 谓的插入序列( i s ) ；后又在沙门氏菌中发现基因的流动性( 转座子) 和抗药性基因 等。科学家们在随后的研究中，从多种原核生物和真核生物中分离出转座因子，并 进行d n a 水平的研究，对它们的组成，转座机制，在基因交流和进化的意义有了 初步的认识。 转座子是基因组中可以移动的不连续的d n a 片段，可以被一些未知的信号激 活，在染色体d n a 上从一个基因座跳到另一个基因座当它插入到一个功能基因 时，可以起到一种开关作用而影响基因的表达，引起暂时性的突变，也有一些转座 子由于丧失从染色体上隔离出来的能力而变成永久性突变( o k a m o t o e t a l ，1 9 8 3 ) 。 转座子的特征是它们并不利用独立元件( 如噬菌体或质粒d n a ) ，而只是从基因组的 一个位点直接移动到另一个位点，与大多数基因组重构的其它程序不同，转座子不 华中农业大学硕士学位论文 依赖序列供体和接体位点自j 的任何联系。转座子非常严格地自我转座到同一基因组 的新位点，有时增加一些序列，因此它们可作为基因组问序列转移的内部载体，是 基因组内突变的主要来源。转座子的转移过程叫转座( u a l i ! s p o s i t i o n ) 。 原核生物中已发现的转座子分为两类：插入序列( i n s e r t i o ns e q u e n c e , 1 8 ) 和复合转 座子( c o m p o s i t et r a n s p o s o n ) 。i s 元件以倒转重复( i n v e r t e dr e p e 矾i r ) 序列结尾，两个 重复序列高度同源以至于很难辨别；复合转座子两侧有具有转座功能的i s 元件 “臂”，中心区还携带有抗药性标记( d r u gm a r k e r ) ，因此得名。这类转座予以t n 加一 个数字表示。其中复合转座子在微生物的功能基因基因组学研究中应用的最为广泛。 1 4 1 转座子转座机理 无论哪种转座元件，其两端都具有正向或反向的i s 元件，i s 元件有其结构特 征：其末端是倒转重复序列，邻近末端的旁侧存在宿主d n a 的短正向重复序列。 在d n a 序列中，这种组织类型被认为是转座子的一大特征( 如图1 3 ) 。 宿主d n a宿主d n a e = 二二= = = 二二= = = = 蛋t g c a 二= = = 二= = = = 二= = 匹= = = = = = = = = = = = r a c g 瓦二= = = = = = = = 二= 二= 靶位点 靶点重复转座子 靶点重复 = = = a t g c a l 2 3 4 5 6 7 8 明一9 8 7 6 5 4 3 2 ”g c a 二= = c = = lt a c g t l 2 3 4 5 6 7 8 明艮) 8 7 6 5 4 3 2 f f a c g 兀= = = = 宿主d n a 反向重复反向重复宿主d n a 图：1 3 转座子所具有的末端倒转重复能够在靶位点的两翼产生正向重复，图中，靶 位点重复5 b p 转座子末端的倒转重复为9 b p ，数字l - 9 表示碱基序列 天蓝色链霉菌中微型转座系统的构建及初步心用 f i 9 1 3i ro ft r a n s p s o nc o u l df o r md i r e c tr e p e a ta tt h et w ow i n g so ft h et a r g e ts i t e s i nt h es c h e m e , t a r g e ts i t eh a v e5 b pr e p e a t , t h ee n do ft a n s o p o s o ah a v e9 b pi n v e r t r e p e a t 1 - 9a r eb a s es e q u e n c e s 不同转座元件的转座频率不同。一般为每代1 0 - 3 1 0 。4 次元件。单个位点的 插入频率与自发突变率一致，约为1 0 巧1 0 - 7 代。 一个转座子插入到一个新的位点包括靶d n a 的交错断裂，将转座子连接到突 出的单链末端和填补缺口。交错末端的产生和填补解释了靶d n a 在插入位点的正 向重复的产生；两条链的两个缺口间的交错决定了正向重复的长度。交错末端的使 用对于所有方式的转座来说都是普遍的。但是我们通过转座子移动的机制可以将转 座分为三种类型。 复制型转座( r e p l i c a t i v e 仃a n s p o s o n ) ：在相互作用时，转座子被复制，因此转 座实体是原转座子的一个拷贝。一个拷贝保留在原位点，而另一个则插入到新的位 点。因此转座伴随着转座子拷贝数的增加。复制型转座涉及到两种类型酶的活性： 一是转座酶，它在原转座子的末端起作用。另一种为拆分酶( r e s o l v a s e ) ，它对复制 拷贝起作用。与t n a 有关的一组转座子只能通过复制性转座移动。 非复制型转座( n o n r e p l i c a t i v et r a n s p o s o n ) ：转座因子做物理性运动，直接从 一个位点到另一个位点，并且是保守的。这种发生可通过两种机制产生：一种是利 用供体与靶d n a 的连接，与复制型转座的一些步骤相同。这种转座过程中涉及到 转座子从供体d n a 的释放，该机制需要一个转座酶。 保守型转座( c o n s e r v a t i v et r a n s p o s o n ) 描述了另一种非复制型转座，在这种情 况下，通过一系列事件，转座元件从供体位点上切除然后插到靶位点上。在这一过 程中，碱基是保守的。 1 5 链霉菌中的转座子 可转座因子是细菌遗传分析和分子操作十分有用的工具。链霉菌是一类重要的 革兰氏阳性菌，近年来，已发现了几种链霉菌的可转座因子最早发现的链霉菌可 转座因子是天蓝色链霉菌( s c o e l i c o l o r ) a 3 ( 2 ) 中1 1 6 k b 的插入片断i s l l o ( c h a t e r e t a ，1 9 8 5 ) ，后来在白色链霉菌( s a l b u s ) 中发现t i s l l 2 ( r o d i c i o e t a ，1 9 9 1 ) ，在带 kfl，ftf 华中农业大学硕士学位论文 棒链霉菌( s c l a v u l i g e r u $ ) 中发现t i s l l 6 ( l e s k i w e t 口f ，1 9 9 0 ) ，在变铅青链霉菌( s 1 i v i d a n s ) 6 6 中发现了t n 4 8 1 l ( c h e ne t a l ，1 9 9 2 ) 等，然而，它们都没有充分发展成为有 用的遗传工具。1 9 8 7 年c h u n g 偶然从新霉素产生菌弗氏链霉菌( s f r a d i a e ) 中发现了 转座子t n 4 5 5 6 ( c h u n g ，1 9 8 7 ) ，1 9 8 9 年s o l e n b e r g 等人从变铅青链霉菌中发现了插入 序歹l j i s 4 9 3 ( s o l e n b e r ge ta 。1 9 8 9 ) ，并对其进行了改造，由此而发展了链霉菌的转座系 统。目前，较为系统研究的链霉菌可转座因子有天蓝色链霉菌a 3 ( 2 ) 中的i s l l 7 ( l y d i a t ee t a l ，1 9 8 6 ) 、t n 4 5 5 6 及其衍生物、i s 4 9 3 及其衍生物。 1 5 1 转座子t n 4 5 5 6 及其衍生物 转座子t n 4 5 5 6 最先由c h u n g 于1 9 8 7 年首先在新霉素产生菌弗氏链霉菌( & f r a d i a e ) 中发现，并由s i e m i e n i a k 等人于1 9 9 0 完成其测序工作。t n 4 5 5 6 全长6 6 2 5 b p ， g 吒含量达6 8 。t n 4 5 5 6 由末端3 8 b p 的反向重复序列( i r ) 、分子量约9 7 k d 的 转座酶( m p a ) 、分子量约1 6 k d 的拆分酶( t n p r ) 和一个保守的共整合拆分位点( r e s ) 组成( f r e e m a ne ta 。1 9 7 8 ) 。1 n 4 5 5 6 类似于t n 3 ，与其有很高的同源性，其中反向 重复序列的同源性高达7 0 ，3 8 b p 中有2 6 b p 相同；转座酶的同源性达6 1 ；拆分 酶的同源性也达到了4 5 ，共含有9 个开放阅读框架。 t n 4 5 5 6 6 6 2 5 b p t n 4 5 6 0 8 6 2 5 b p 图1 4 ：转座子t n 4 5 5 6 和t n 4 5 6 0 示意图 i r 为末端倒转重复，w 为内部拆分位点，t n p a 为转座酶基因，t n p r 为拆分酶基因，哪为紫 霉素抗性基因。 f i 9 1 4d e l i n e a t i o no f t r a n s o p o s o n t n 4 5 5 6a n d t n 4 5 6 0 i r , i n v e r t e dt e r m i n a lr e p e a t s ；，w ，i n t e r n a lr e s o l u t i o nm p a ，t r a n s p o s a s eg e n e ；m p r , t e s o l v e s eg e n e ；v p h , v i o m y c mr e s i s t a n c eg e n e 1 4 天蓝色链霉菌中微型转座系统的构建及初步戍用 t n 4 5 5 6 不含有已知的对抗生素及重金属的抗性标记，而数种t n 4 5 5 6 的衍生物 具有卡那霉素( n e o ) 和紫霉素( v 肋) 抗性，并且具荧光素酶( 1 u x ) 和儿茶酚2 ，3 双加氧酶( x y i e ) 指示基因。其中t n 4 5 6 0 就是在t n 4 5 5 6 转座非必需区中插入紫霉 素抗性基因( 砌) ，组成复合体t n 4 5 5 6 ：v p h ( 即t n 4 5 6 0 或t n 4 5 6 3 ) ，并导入温敏 质粒p m t 6 6 0 ，得到了重组质粒p u c l l 6 9 ( 如图1 4 所示) 。p u c l l 6 9 在2 8 。c 能自主复 锘o ( v i o r l l l i o ，在3 4 ( 2 以上不能自主复制，在高温和选择压力下，t n 4 5 6 0 则可发生 转座，整合到宿主染色体上( 0 8 1 1 l i 0 5 ) 。 引入荧光素酶基因时t n 4 5 5 6 进行了改造，构建t n 5 3 5 1 和t n 5 3 5 3 ( s o h a s k e ye t a 1 1 9 9 2 ) 。t n 5 3 5 1 和t n 5 3 5 3 能随机转座到链霉菌的染色体上，且t n 5 3 5 3 含有新 霉素抗性基因( n e o ) ，故比其它t n 4 5 5 6 衍生物更加实用。因为新霉素更易获得，且在 大肠杆菌和链霉菌中均能作为抗性选择。另外，荧光素酶基因的引入使少量的光都 可被精确地测量，测量方法简单可行 1 5 2 转座子t n 4 5 5 6 及其衍生物的应用 e n g e l 等用转座子t n 4 5 6 0 处理尼可霉素产生菌唐德链霉菌，以1 1 0d 的转座 频率获得了6 株营养缺陷型突变株和3 株尼可霉素阻断突变株( e n g e le ta ，1 9 9 1 ； + e n g e le t a 1 9 9 3 ) ，转座子在这些突变株中均是随机插入到不同的基因上。i k e d a 等 ( i k e d a e t a l ，1 9 9 3 ) 用t n 4 5 6 0 诱变阿维菌素和寡霉素的产生菌阿维链霉菌，并以1 0 d“ 的转座频率获得8 株营养缺陷型、l o 株阿维菌素阻断突变株和5 株寡霉素阻断突变株， 不同的突变株转座子插入到染色体上的位置不同。野生型的阿维菌素产生菌不仅产 生阿维菌素，也产生有毒的寡霉素。获得的5 株寡霉素阻断突变株均产生阿维菌素， 利用这种菌株产生的阿维菌素进行精制时可省掉除去寡霉素的操作。另外，邓子新 等用t n 4 5 6 0 诱变吸水链霉菌，得到了5 1 0 2 2 i 抗生素的生物合成阻断突变株( 邓子新 等，1 9 9 4 ) ；中国科学院微生物所谭华荣实验室也用t n 4 5 6 0 诱变圈卷