（应用化学专业论文）新型BODIPY类荧光染料的合成及性能研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 氟化硼络合- ：p t 咯甲川类( b o r o n d i p y r r o m e t h e n e ，简称b o d i p y ) 荧光染料是一 类性能优异的新型荧光染料，具有较高的荧光量子产率和摩尔消光系数，并且表现出很 好的光稳定性；染料分子在一定的条件下容易得到或者失去电子，可以用于设计基于电 子转移原理的荧光探针，还可以经适当修饰应用在荧光标记和d n a 测序中。本论文总结 现有的研究成果，致力于合成高量子产率的、长波长的新系列b o d i p y 荧光染料。 传统的合成路线是以醛为原料，与一分子二联毗咯及另一分子毗咯a 氢缩合再氧 化脱氢，然后与三氟化硼络合得到目标化合物。本论文采取了与传统合成三吡咯b o d i p y 荧光染料不同的合成路线。用过量的毗咯与醛、酰氯或羧酸在强酸性条件下进行缩合， 再进行碱性条件下的氟硼配位，使两步反应在同一个反应器里完成，大大简化了合成二 联吡咯路线所需的工艺。本论文还讨论了利用过量毗咯直接合成b o d i p y 染料的反应条 件，不同取代基对该反应活性的影响，并且对该反应的机理进行了探讨。 对所合成的化合物进行了紫外吸收光谱、荧光发射光谱和荧光量子产率的测定，通 过对光谱的研究探讨了不同的取代基对化合物荧光性质的影响。 测试了p h 值对该系列化合物荧光性能的影响，与其它结构b o d i p y 染料对比，并从 该系列化合物中选出一个p h 探针，该探针对环境p h 有很高的灵敏性，在p h4 0 2 一1 7 0 范围内，荧光增强1 3 倍。在此基础上进一步探索了该系列化合物5 ，6 的阴离子选择性， 将新化合物5 及文献参照染料8 和l o 的氟离子滴定与相应的氢氧根离子滴定光谱对比， 得出b o d i p y 类荧光染料识别阴离子机理，即在强碱性条件下破坏母体氟硼配位结构导 致荧光淬灭。 关键词：氟化硼络合二吡咯甲川；荧光染料；光谱性能；p h 探针；阴离子探针 新型b o d i p y 类荧光染料的合成与性能研究 r e s e a r c ho nt h es y n t h e s i sa n dp r o p e r t yo f n o v e lb o d i p yd y e s a b s t r a c t b o r o n - d i p y r r o m e t h e n e ( b o d i p y ) f l u o r o p h o r e sh a v ea t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o ni nt h e d e s i g no ff l u o r e s c e nl a b e l sa n dh i o m o l e c d es e n s o r s ，b e c a m et h e yp r e s e n tm a n ye x c e l l e n t p h o t o s p e c t r a lp r o p e r t i e s ，s u c ha sh i 曲e x t i n c t i o nc o e f f i c i e n t s ( ) ，h i g hf l u o r e s c e n c eq u a n t u m y i e l d s ( 蚴a n dg o o dp h o t o s t a b i l i t y t h i sk i n do fd y e sa r er e l a f i v d ye a s yt ob eo x i d i z e da n d r e d u c e d ，w h i c hl e a d st ot h eb o d i p yf l u o r o p h o r e s a p p l i c a t i o ni np h o t o s w i t c h e sb a s e do n t h et h e o r yo fe l e c t r o no rc h a r g et r a n s f e r ( c d b a s e do nt h er e c e n td e v e l o p m e n t , t h i st h e s i s w a sf o c m e do np r e p a r i n gn o v e lb o r o n d i p y r r o m e t h e n ed y e sw i t hs t r o n gf l u o r e s c e n c ea n d l o n gw a v e l e n g t h t h et r a d i t i o n a ls y n t h e s i so f t r i - p y r r o l eb o d m yd y e si st h a ta l d e h y d e sw e r et o o ka st h e s t a r t i n gm a t e r i a l s ，c o n d e n s e dw i t l lt h ea - ho fap y r r o l ea n da n o t h e r2 ，2 - b i p y r r o l e ，o x i d i z e d b yp - c h l o r a n l l ，t h e nc 0 0 r d i n a t e dw i t hb f 3 i nt h i sp a p e r , a l d e h y d e s ，a c e t y lc h l o r i d e sa n d c a r b o x y l i ca c i d sw e r et a k e na st h es t a r t i n gm a t e r i a i s w h i c hc o n d e n s e dw i l he x c e s s i v ep y r r o l e i ns t r o n ga c i de n v i r o n m e n t , t h e nt h er e s u l t i n gp r o d u c t se o o r d i n a t n dw i t hb f 3 - e t h e m t e t h e t w os t e p sc a l lb ep e r f o r m e di no n e - p o tr e a c t i o n , s ot h ep r o c e s sw a ss i m p l i f i e d t h ea b s o r b a n c es p e c t r u m ，f l u o r e s c e n c es p e c t r u m ，t h ea b s o r p t i o nc o e f f i c i e n t sa n d q u a n t u my i e l dw e r ed e t e c t e d t h er e l a t i o nb e t w e e nt h ep h o t o p h y s i c a lp r o p e r t i e sa n dt h e s l r u e t u r eo f t h ed y e sw e r ei n v e s t i g a t e d a p hp r o b ew a so b t a i n e db a s e do l lt h ef l u o r o p h o r e ，t h ep r o b ee x h i b i t sg o o dp r o p e r t i e sa s ap hf l u o r e s c e n ts e l l s o r 、 ，i t ha1 3 - f o l df l u o r e s c e n c ee n h a n c e m e n ti nt h ep hr a n g eo f4 0 2 1 7 0 t h es e l e c t i v i t yf o ra n i o n so fd y e5a n dd y e6w g l ed e t e c t e da n dc o m p a r e dw i t ht h a to f t h ek n o w nd y e8 t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb o d ys t r u c t u r e so f d y e sw e r ed e s t r o y e di ns t r o n g b a s l ee n v i r o n m e n t k e yw o r d s ：b o d i p y ；f l u o r e s c e n td y e s ；s p e c t r o s c o p i cp r o p e r t i e s ；p hp r o b e ；a n i o np r o b e i l 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也 可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名：至兰垒亟 翩繇彩雄 坚乎月埠日 大连理工大学硕士学位论文 引言 随着生物科学技术的发展，人类对于生命现象的认知越来越深入，而关于生命科学 的研究也不断随之深化和发展。尤其是在微观的生物体系( 例如：细胞内的物质交换， 蛋白质的组成和功能，d n a 等遗传物质的复制等等) 中，当人们不再能够用肉眼直接 的来获取有用的研究结果和现象时，各种精密的生物分析手段便随着科学研究和实际应 用的需要接踵出现了。最直接的方法就是提高显微镜的分辨率，采用高倍的电镜来观测 生物体内的物质流动和变化，但是这种方法仍然太粗略，不能够很好的揭示生物质反应 的靶点和结合方式等更为具体的细节，灵敏度也不够高。还有一些科学家利用电化学的 方法来检测生物体内的化学和物理变化，通过检测生化反应过程中电流的变化来推测反 应进行的方式，例如可以利用纳米金颗粒作为导电介质来对d n a 或者r n a 的配对结合 过程进行检测。电化学方法较为灵敏，不过对于设备和材料的要求比较苛刻，分析过程 中的影响因素很多，应用还不够成熟。 相对于其他的方法而言，目前应用最为广泛的一种有效生物检测方法就是荧光分析 技术，这种技术是利用带有识别基团的荧光化合物分子作为检测试剂，在与靶标物结合 的前后荧光的强度或者波长的变化来判定靶标的种类和浓度等等相关参数。d n a 自动 测序技术中的一种最重要的方法就是荧光分析法，采用四种不同波长的荧光染料来标记 在脱氧核糖核苷酸( d d n t p ) 的碱基上，在d n a 聚合酶作用下与待测d n a 进行匹配并 且形成许多长短不一的核苷酸链，最后通过电泳来读出d n a 的序列。由于荧光标识方 法的灵敏度、操作的可靠性非常高，因此成为目前d n a 自动测序的主流技术。 由此可见，荧光分析技术在生物分析领域有着不可替代的重要作用，这种分析手段 的关键组成部分之一就是检测信息的传递者荧光染料。荧光染料的特性将直接影响 到检测结果的准确性、灵敏性，因而开发适用于荧光标识的优秀荧光染料将对生物技术 的发展起到巨大的推动作用。 新型b o d l p y 类荧光染料的台成与性能研究 1 文献综述 1 1 概述 二十世纪是生命科学飞速发展的时期，从d n a 双螺旋结构的发现到人类基因组计 划的完成，以及已经启动的后基因组计划一蛋白质工程，人类正从分子水平认识生命， 阐述人的生老病死。生命活动是由体内的各种物质( 如蛋白质，d n a ，糖，各种微量的 金属离子，中性分子等) 来完成的，对生命的研究就是研究这些物质的活动形式，在人 体内起的作用，以及衰变代谢等，这就要求我们能对其进行准确的检测和识别。 传统的生物标识方法包括放射性同位素法和荧光标记法。放射性同位素会对生物体 产生辐射，对环境造成污染，而且放射性同位素都有其自身的半衰期，信号会越来越弱， 所以该方法现在已经渐渐被人们抛弃。而荧光检测法不会对人体产生辐射，且信噪比高， 灵敏度好，是现在研究和应用最多的一种方法。所以对荧光染料的理论研究和应用研究 是近5 0 年人们研究的热点。至今方兴未艾。 1 1 1 荧光产生的理论基础 当紫外或可见光照射到某些物质上时，这些物质就发射出波长和强度各不相同的 光，停止照射光照射时，光线马上或逐渐消失，这就是荧光。 荧光现象早在1 6 世纪就被发现，但对荧光的产生原理和条件直到1 9 世纪中期才清 楚。s t o k e s 在1 8 5 2 年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光后，发现他们的荧光波长比照射 光波长要长，认定是物质吸收光后重新发射出的光，并且波长不同，荧光是发射光被证 实。根据“萤石”能发出这种光，提出了“荧光”这一名称。 荧光产生过程如图1 1 所示【1 ，2 3 】。通常情况下，荧光试剂分子处于基态，吸收光后， 试剂分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两种类型，多 重态用2 s + 1 表示。s 为电子自旋量子数的代数和，其数值为o 或l 。s 为0 时，分子内 轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单线态，大多数有机物分子 的基态是处于单线态。分子吸收光能后，电子跃迁到高能级，电子自旋方向不变，此时 分子处于激发单重态。s o s 1 s 2 ，表示分子的基态和第一，第二，激发单重态，能 量由低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有电子自旋方 向的变化，在激发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此时s = 1 ，表明分子处 于激发态的三重态，用t 表示，t 1 t 2 分别表示三重态的第一第二激发态。分子中的电 子从基态s o 跃迁到激发态s 1 s 2 比较容易发生，进行很快( 约l o 。4 s ) ，而从基态单重态 到激发态三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子( 如s 2 ) 可以与其他同类分子或 大连理工大学硕士学位论文 溶剂分子碰撞通过内转换( 无辐射跃迁) 回到激发态的最低能级s l ，这一过程为1 0 - 1 2 s ， 处于激发态最低能级的分子寿命一般为l 矿- - 1 0 8 s ，它们会放出光子返回基态，这时产 生的光就是荧光。即最低激发态( s i ) 分子回到基态( s o ) 会产生荧光。从s l 到t t 能 量转化是系阃跨越。从t j 回到s o 有两种过程，一个是系问跨越，无能量释放；另一个 是放出光子，即磷光，在1 0 r 4 - - 1 0 s 间完成。 f 荧光，p 磷光，i 体系间跨越，i c 内转换 图1 1 分子荧光的产生过程 f i 昏1 1 t h ep r o c e s so f t i i en u o 圮e n 1 1 2 分子结构与荧光的关系 大量实验事实证明，有机试剂分子的荧光特性如荧光量子产率，紫外吸收光谱，荧 光发射光谱等首先取决于它自身的能量状态，即取决于它自身的分子结构，而外界因素， 如温度，压力，浓度，介质，酸度等对荧光特性的影响是次要的。对于试剂分子结构跟 荧光特性的关系的规律，人们做了大量的研究，认为试剂的荧光性能与其共轭体系的大 小，共轭大兀键的共平面性及刚性程度，分子母体上取代基的种类及取代基所在位置和 分子的几何结构等因素有关，下面分别给予讨论。 ( 1 ) 分子共轭体系大小对荧光的影响 有机荧光试剂分子都含有发射荧光的基团，习惯称为荧光团。荧光团必须含有共轭 大兀键，而且大兀键达到一定程度才会发出荧光，如( - - c h = c h - - ) n ( n 2 ) 、苯、 萘、对苯二醌、苯并杂环等。芳环类碳氢化合物与直链的烯烃化合物相比，激发能向振 动能的转换更难，因而荧光强度更大。共轭体系越大，靠电子越容易激发，荧光( 或者 磷光) 越容易产生，荧光发射峰向长波方向移动，多数情况下荧光量子产率增加。荧光 强度大的有机化合物绝大多含有芳香环或者芳香杂环，芳香环数越多，共轭体系越大， 荧光越强，但芳香环或者共轭体系增加到一定程度时，只是荧光发射波长红移，荧光量 til叫li上豇 能 e 新型b o d i p y 类荧光染料的合成与性能研究 子产率不但没有增加，反而降低，这一现象涉及共轭大冗键共平面及其刚性的影响，下 面将迸一步讨论。 ( 2 ) 共轭大冗键共平面及其刚性的影响【4 】 分子取得平面结构才能显示出荧光特性。对于具有强荧光的有机化合物和荧光试 剂，仅有大的共轭体系还不够，分子的共轭体系必须具备共平面性并且还要有一定程度 的刚性。如图1 2 所示，联苯由a 键连接，两个苯环由于立体结构效应或者空间位阻不 能共平面，处于最大自由度，量子产率为0 1 8 ，而芴相当于一个c h 2 一，把联苯的两 个苯环固定在一个平面上，不能扭曲或者转动，共平面性大且刚性强，荧光量子产率接 近l 。 o 图1 2 两个荧光化合物的结构 f i g 1 2 t h es t r u c t u r e so f t w of l u o r e s c e n tc o n p o u n d s ( 3 ) 取代基对荧光的影响 有机荧光化合物分子中的取代基对其荧光性能影响显著，在荧光团上引入取代基有 推电子和吸电子取代基两种类型，取代基的影响分为取代基种类和取代基所处位置两 种。 取代基种类的影响。推电子取代基增强荧光，这类取代基有：n h 2 ，n h r ， - n r 2 ，o h 广旬r 。含这类取代基的荧光有机分子，其激发态的产生常常是由取代基 的。或n 的非键电子被激发到矿键上造成的，取代基共轭电子参与有机荧光分子的大 兀键等于扩大共轭体系，使最大吸收和荧光发射红移，荧光强度增强。但是含推电子基 团的荧光分子在极性溶剂中容易形成氢键而质子化，使其带部分正电荷，荧光会显著减 弱，离解出氢后荧光又恢复。吸电子取代基有：c = o ，n 0 2 ，c o o h ，c h o ，一 c o r ，- n = n 一，x ( f ，c l ，b r ，i ) 。他们对荧光强度的影响与推电子基相反，即减 弱荧光，但波长红移。因为这类取代基中的n 电子跃迁到矿键上属于禁阻跃迁，激发态 分子数少，而且s l - t l 的系间跨越占优势，放出光子的激发态分子数大为减少，致使荧 光减弱。硝基吸电子能力最大，对荧光抑制非常严重，几乎所有荧光化合物中引入硝基 都没有荧光，其s l _ t l 系间跨越率达到0 6 。氰基虽然也是强吸电子基团，但是却表现 出推电子效果，它能使荧光增强。磺酸基以及羧酸基含不饱和基团，表现出吸电子性能， 大连理工大学硕士学位论文 减弱荧光，但当它离解出h 质子后带负电，又表现出推电子行为，荧光增强。一般在荧 光染料中引入羧酸或者磺酸基是为了增加水溶性 取代基位置的影响。取代基在试剂分子上的位置及取代基数量对试剂的荧光量子产 率的影响视具体情况而定，只有一个推电子取代基，处于空间位阻最小或者没有位阻时， 可以使荧光增强。当推电子基和吸电子基共存时，推电子基结合在对于吸电子基共振电子 密度减小的原子上，构成荧光性，即存在推拉电子效应，从而使荧光大大增强。 取代基加重效应对荧光的影响。一般说来随着取代基原子量的增加，化合物的量 子产率会降低。如卤素，硫，磷等都存在加重效应【2 】。 芳香环中杂原子的影响。杂原予对荧光的影响比较复杂，有时使荧光增强，有时使 其减弱，主要看杂原子的结构。 1 1 3 外部环境对荧光的影响 温度影响：一般说来，荧光物质随着溶液温度的升高其荧光强度会降低，主要原因 是分子内部能量的转换作用随着温度的升高而加快，同时激发态分子和溶剂分子之间发 生某些可逆的光化学反应，这也是荧光强度下降的原因之一。 溶剂效应：溶剂的极性对荧光化合物的光谱会发生影响，一般说来随着溶剂极性的 增加，化合物的吸收和发射光谱会蓝移，这成为负向溶剂化显色。 p h 对光谱的影响：很多荧光化合物尤其是含有氮、氧或酸根离子的荧光化合物， 对p h 极其敏感，因为染料的质子化和非质予化的两种状态能显著改变荧光分子的电子 云密度，从而极大改变其光谱特性，所以在应用于离子探针时，这一点尤其重要。 1 1 4 描述荧光特性的参数 ( 1 ) 荧光吸收光谱，激发光谱，发射光谱和s t o k e s 位移 吸收光谱就是荧光染料分子吸收光能使电子从基态跃迁到激发态而产生的吸收光 谱。丽测定激发光谱时，把荧光物质试液置于荧光光度计光路中，固定荧光发射波长和 狭缝宽度，扫描，得到荧光激发波长和相应荧光强度的关系曲线，即荧光激发光谱。荧 光发射光谱即荧光光谱的获得的过程，类似于激发光谱。固定激发波长和狭缝宽度，扫 描，得到荧光发射波长和相应荧光强度的关系曲线，即荧光光谱。而s t o k e s 位移指的是 荧光最大发射波长跟最大吸收波长的差值。荧光物质的荧光激发光谱和发射光谱形状相 似且成镜像对称。根据荧光产生的原理不难理解这一现象，激发光谱所反映的是电子跃 迁到第一激发态的情形，而荧光光谱所反映的是电子从激发态的最低能级回到基态的情 形。能量在基态的振动能级上的分布情形和第一激发态中的振动能级上的分布情况相类 新型b o d p y 类荧光染料的合成与性能研究 似，所以激发态光谱中跃迁能量最小的波长与荧光光谱中能够发射能量最大的波长相对 应。 ( 2 ) 荧光强度，荧光量子产率和荧光寿命 荧光强度是指在一定条件下仪器所测得荧光物质发射荧光大小的一种量度，荧光物 质所发射的荧光无固定方向，实际上所测量的是某一方向的荧光，它除与物质本身的荧 光量子产率有关，还与介质、环境、仪器性能等因素有关。物质吸收光越多，处于激发 态的分子数越多，发出的荧光强度就越大。 f = 2 3 巾f 1 0 b c ( 1 1 ) f 为荧光强度；由f 为荧光量子产率；i o 为照射到被测物质上的光强度；为该物质的摩 尔吸光系数：b 为检测池厚度；c 为物质浓度。 荧光量子产率也称为荧光效率，是物质的固有属性，理论上定义为荧光物质吸收光 后所发射的荧光光子数与吸收的激发光光子数之比。在同一浓度下，产率越大，荧光强 度也大。可用下式测定； m s a m p l e = m s t a n d a n dx s a m p l c f s t a n d n r d ( 1 2 ) 式中：由。i e ，巾d 删分别表示待测物质和参比物质的荧光量子产率；f 。i 3 s i o n ，j s t , d 。，d 分别表示待测物质和参比物质的积分荧光强度。 荧光寿命( t ) 可以用下式测定： 1 i lf 0 一h lf t = 一t ，t ( l3 ) f o 和f ；分别代表t = 0 和t = t 时的荧光强度，通过实验测量不同时间的f 。值，确定 i nf 。- - t 关系曲线，其斜率就是荧光寿命。 1 2 荧光染料的介绍 1 2 1 荧光标识对染料的基本要求 目前，许多种类的荧光染料被应用于生物检测领域中，然而不同的荧光染料即便是 应用在同种物质分析过程中他们的表现却有着较大的差异，这说明并不是所有的荧光染 料都适合设计成相应的荧光探针而应用在生物体内活性靶标的检测领域。那么，适合生 物检测领域应用的荧光染料应该具备哪些基本要素昵? 参考现有的文献，分析优秀的分 子探针的结构，一般认为适宜生物应用的荧光染料应该具有以下特征p j ： 大连理工大学硕士学位论文 一、荧光量子产率较高，最好应该大于o 5 。荧光量子产率高将有助于提高检测的 灵敏度，使检测极限维持在较低浓度的水平。荧光量子产率的高低是衡量一个荧光染料 优秀与否的最重要因素之一。 二、染料的最大吸收和发射波长应该较长，最好不要小于5 0 0n n l 。因为生物体内存 在很多的有机共轭小分子，例如嘌呤、嘧啶、各种氨基酸，蛋白质分子等，他们在紫外 区域都有吸收和发射光谱，如果荧光染料的吸收波长在紫外或者较短波长区域，将会降 低荧光探针的灵敏度，并且某些干扰分子的自发荧光会掩盖探针的发射光谱，使检测的 结果容易出现偏差1 6 1 。另外，紫外激发光照射在生物组织内而造成的散射光也对荧光的 检测灵敏度构成了很大障碍1 7 】。 三、荧光染料应该具有较高的稳定性。无论是在光照下、酸碱条件下，还是在较高 温度下，染料的化学性质应该稳定：不会发生严重的光氧化现象，不会在酸碱条件有较 小改变的状况下光谱发生较大的波动，当然也不应该在稍高的温度下导致染料分子迅速 的分解【8 】。 四、染料分子应该具有较好的细胞穿透能力和细胞内的溶解能力【9 】，这样以便能够 设计出在细胞适合应用的荧光探针。染料分子既要有一定的油溶性又要有一定的水溶 性，油溶性是为了便于穿透细胞膜，水溶性是为了有助于在细胞内很好的分散。染料分 子的这两种性质可以通过引入合适的亲水性或者亲油性基团来调节。 五、染料基团对生物体应该没有或者仅有极小的毒害。荧光探针只对特定的靶标发 生作用，而不应该由于自身结构的原因而对细胞内其它活性组织产生破坏作用，这样就 失去了荧光探针的生物应用价值。而作为荧光探针重要组成部分的荧光团当然对细胞的 毒害作用要小，尽量不要干扰细胞的活性。 1 2 2 荧光标识染料的种类及主要特点 从发现了荧光染料到现在，已先后研究出了许多可用于进行荧光标记的染料母体， 下面分别进行简单的介绍。 ( 1 ) 香豆素类荧光染料 图1 3 香豆素的母体结构 f i g 1 3 t h eb a s i cs t r u c t u r eo f c o u m a r i n 新型b o d i p y 类荧光染料的合成与性能研究 香豆素母体本身无荧光，该类染料荧光的有无或强弱与分子中取代基的种类和位置 有一定的关系，如图1 3 所示，而羟基香豆素在紫外灯下大多能显出蓝色荧光，在碱溶 液中荧光大都增强，可以辨认。香豆素荧光染料s t o k e s 位移大，光照稳定性较好，而且 分子体积比较小，对细胞的穿透能力比较强。香豆素染料性能上的不足表现在吸收发射 波长过短，多数都是蓝色的荧光( o 5 ) ，a 位是一个反应活性最大的位点，可以与含羰基的化合物反应，引入活性基团， 如图1 4 所示。因为该染料完全为平面结构，所以芘分子在溶剂中有很强的积聚效应， 导致一个长波长的荧光发射在4 7 0a m 附近出现，这个性质常常被用来设计成芘基激缔 合物荧光探针【1 “，另外芘的平面性也使得该染料比较适合作为d n a 的嵌入型探针。芘 的优点是极其稳定，长时间接受光照或酸碱都不会引起结构的变化，但是缺点也是非常 明显的，最大吸收波长过短( 5 0 0n m ) ，量子产率高，光稳定性较好；但是由于染料中羟基 和氨基的存在，使得该类染料对p h 值非常敏感，在应用于离予或者生物分子探针时， 对工作环境酸碱性有特定的要求 1 3 】i ( 4 ) 菁染料 图1 7 菁染料的母体结构 f i g 1 7t h e b o d ys 仃1 l 咖o f c y a n i n e d y e 菁染料是非常重要的近红外荧光标记染料，其母体结构如图1 7 所示，它们的最大 吸收和发射波长一般都超过了6 0 0n i l l ，可以通过调节中间共轭碳链的长短在极广的范围 内调节其光谱性质；有很高的摩尔消光系数，并且可以方便的引入水溶性基团( 例如： 羧基，磺酸基) 。此类染料的缺点是光稳定性差，多甲川结构容易在光照下氧化断裂， 新型b o d i p y 类荧光染料的合成与性能研究 导致染料分解，另外多甲川的结构也导致了染料容易聚积嘲，影响了染料在应用方面的 推广。 总结以上所描述的几类荧光染料，我们可以发现，这些染料都存在着各种缺陷，在 应用到生物识别领域还有很多的局限性。改进这些染料的性能是其中的一个解决的方 案，但是这些染料的基本结构也注定了对于染料分子小规模的修饰只能部分的改善他们 的应用性能，不能够从根本上克服染料的弱点。因此，设计新型的性能优异的荧光染料 就成为目前荧光染料发展和应用的迫切需要，氟化硼络合二吡咯甲川 ( b o r o n - d i p y r r o l e m e t h e n e ) 类荧光染料就是新兴的一类优秀的荧光染料，具有其他染料 无法比拟的优越性，下面我们将详细的介绍该类荧光染料的特点及最新研究动向。 1 3 氟化硼络合- - t t 咯甲川类荧光染料的优点及分子结构的拓展研究 1 3 1 氟化硼络合_ - n i t 咯甲川类荧光染料的基本结构和性能简介 氟化硼络合- - p i t 咯甲川( b o r o n - d i p y r r o l e m e t h e n e ，简称b o d i p y ) 类荧光染料是近 二十几年才发展起来，并受到广泛重视的一种较新的荧光化合物。染料的母体结构如图 1 8 所示，其核心是左右两个吡咯环、中间一个硼氮六元杂环，三个环呈非常好的共轭 平面结构，与硼原子相连的两个氟原予位于b o d i p y 核心平面的两侧。 b o d i p y 类荧光染料具有非常优异的光物理性甜5 1 4 , ”】，表现在以下几个方面： 第一、具有较高的摩尔消光系数，通常 8 0 ，0 0 0 锄4 r 1 ，有利于提高染料的光 敏性能，便于应用在生物分析领域。 第二、具有很高的荧光量子产率，普遍能够达到0 6 以上，许多该类染料的量子产 率接近l ，而且在水中仍然保持高量子产率的特性，不会被水分子将荧光淬灭。相比之 下，许多其他类的荧光染料在有机溶剂中量子产率可能很高，但是在水中却仅表现出微 弱的荧光。 图1 8b o d i p y 化合物的母体结构 f i g 1 8 t h eb o d ys t r u c t u r eo f t h eb o d i p yd y e s 大连理工大学硕士学位论文 第三、b o d i p y 染料的光谱性质非常稳定，不易受到溶剂极性和p h 值的影响。这 个性质对于设计能在不同溶剂中工作的分子探针非常重要，必须要保证染料光物理性能 的不变性才能方便的应用在测试领域。b o d i p y 染料分子对于p h 不敏感，这个性能使 染料适合应用在d n a 测序和d n a 标记领域，因为此类探针分子的分离纯化过程中都 会遇到酸解离的步骤，需要保证染料分子不被破坏。 第四、b o d i p y 染料的荧光光谱峰宽较窄，这样使得染料在应用到分析领域的时候 检测灵敏度非常高。待测的样品可能只有微量存在的前提下，荧光探针分子就能够用显 著的荧光变化指示出样品的存在。 第五、b o d i p y 染料具有较高的光稳定性，不会因为荧光分析过程中受激发光的照 射而导致染料结构的迅速光降解，从而保证了光谱信号的变化仅源于受检测的样品。 第六、b o d i p y 染料分子结构中不含离子电荷。这样避免了因为电荷的存在导致染 料分子与溶液中其它离子闻静电相互作用的可能，减少了干扰源。 因此，氟化硼络合- - , e 咯甲川类荧光染料光物理性能优越，非常适合应用在各种生 物质荧光分析领域，而近些年围绕着b o d i ly 染料分子结构创新和开发一直成为有机化 学工作者的兴趣热点。 1 3 2 氟化硼络合二吡略甲川类染料典型的合成路线： 根据染料核心部分进行缩合反应时原料的不同，有三条比较典型的合成路线。 第一条合成路线，如图1 9 所示： + 9 一瓴谤 b f 3 o f e t ) 图1 9 吡咯甲醛与吡咯缩合生成b o d i p l 的反应路线 f i g 1 9 t h es y n t h e t i cm u t e so f b o d i p yc o n c 朋仃a t e dp y r r o la l d e h y d ew i t hp y r r o l e 最初采用不同取代基的吡咯甲醛与旺位没有取代基的吡咯或吡咯衍生物在酸性条件 下缩合，然后氧化脱去一分子氢，形成吡咯甲烯，在碱性条件下与三氟化硼络合，形成 b o d i p y 类荧光染料【1 6 】。 新型b o d 口y 类荧光染料的合成与性能研究 richo+2 c h 2 c 1 2 。 b f 3 o ( e t h ill： n ( c h e c h 3 bc h e c h d d q c h 2 c h 图1 1 0 醛与不同取代的吡咯缩合生成b o d i p y 的反应路线 f i g 1 1 0 t h es y n t h e t i cr o u t e so f b o d i p y n o 即n a l e da l d e h y d ew i t l lp y r r o l 嚣 如图1 1 0 所示，现在这条路线衍化为由各种醛与位没有取代基的不同吡咯在酸性 ( 三氟乙酸) 条件下缩合，然后加入d d q 氧化脱氢，最后与三氟化硼在三乙胺存在的碱 性条件下络合形成b o d i p y 荧光染料。其中r l - p - 4 可为不同取代基，并且可利用两种不 同取代的毗咯合成不对称的b o d i p y 。 第二条合成路线，如图1 1 l 所示： r i c o c i + 2 b f 3 o ( m ) 2 一 r 3 n ( c h 2 c h 3 ) 3c h 2 c h 图1 1 1 酰氯与吡咯缩合生成b o d i p l f 的反应路线 f 皓1 1l t h es y n d i cr o u t co f b o d m yc o n m r 砒c da c y lc h l o d d ew i t hp y r r o l e s 用酰氯和不同取代的毗咯为原料进行缩合，然后在碱性( - - l 胺) 条件下与三氟化硼 络合，形成氟硼荧染料。用酰氯比用醛反应迅速，且因为反应过程当中无需加入氧化剂 进行氧化脱氢，使后处理比较简单，收率相对较剐埘。r l - r 4 为不同取代基，并也可以 合成不对称的b o d i p y 。 大连理工大学硕士学位论文 第三条合成路线，如图i 1 2 所示： + 魂。一 b b o ( e t ) 2 n ( c h 2 c h 3 ) 3 图1 1 2 氦杂b o d i p y 的合成路线 f i g 1 1 2 t h es y n t h e t i cr o u t eo f a z a - b o d i p y 由a 位亚硝化的吡咯与a 位没有取代的吡咯为原料进行缩合，再与三氟化硼乙醚络 合，形成氮杂b o d i p y 类荧光染料，其中a r l a t 4 为芳基。这种染料的特点是：可利用 不同芳基取代的毗咯生成对称及不对称产物，并控制终产物产生单线态氧的能力，其波 长一般在6 0 0 r i m 以上，加上较低细胞毒性，是一类可用于光治疗理想的光敏剂1 1 6 1 8 - 2 0 。 1 3 3 氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料的结构发展 1 9 6 8 年，a ，t r c i b s 和f h k r e u z e r 首次合成了烷基取代的氟化硼络舍二吡咯甲川i 类荧光染料【2 “，方法是用2 吡咯甲醛或其衍生物与另一分子的吡咯发生缩合反应，然后 氧化脱氢，最後与氟化硼络合而成。然而，在其后的十几年里，与氟化硼络合二毗咯甲 川类染料研究相关的报道十分稀少，可能是因为该染料周边的取代基团都是没有任何反 应活性的烷基，而想要引入活性基团比较困难的原因，许多入认为这种染料没有什么应 用价值。所以，b o d i p y 染料几乎被人遗忘了。 直到1 9 8 5 年，w o r r i e sh j 和k o e k j h 等人合成了带有磺酸基团的b o d i p y 染料 1 2 2 1 ，使染料具有了很好的水溶性，这是染料结构性能上的一个重要突破，说明b o d i p y 染料结构的可改造性还很大，可以引入合适的可反应基团。该文献中采用简单的氟化硼 络合二毗咯甲川染料与氯磺酸反应，在2 位引入磺酸基，如图1 1 3 所示，并且合成了 磺酸钠盐形式的水溶性染料。这个研究工作首次尝试并且成功的向b o d i p y 染料母体引 入了活性基团，为染料广泛应用于生物分析领域打开了一道希望的大门，使人们认识到 了b o d i p y 染料潜在的应用价值。 新型b o d i p y 类荧光染料的合成与性能研究 图1 1 3 含有磺酸基的b o d i p y 染料 f i g 1 ，1 3 t h eb o d i p yd y e sw i t hs u l f o n i cg r o u p 从1 9 8 8 年开始，b o d i p y 染料迎来了大发展的阶段，h a u g l a n dr p 和k a n gh c 等人的专利文献描述了近5 0 种具有新颖结构氟化硼络合二吡咯q j ) l l 染料的合成1 2 ”，并 给出了相应的光谱数据。他们为b o d i p y 染料的发展做出了巨大的贡献，起了至关重要 的推动作用。在专利中，b o d i p y 染料母体结构上被引入了羧烷基等可反应基团，大大 提高了氟硼荧染料的应用价值。更令人关注的是，在染科母体的r 3 位置引入了苯乙烯 基团，结构如图1 1 4 左侧所示；另外还在r l 、r 3 位置上引入了两个苯基，如图1 1 4 右侧所示。这样合成了两种荧光发射波长超过6 0 0n r f l 的长波长荧光染料，为b o d i p y 染料结构的扩展并向合成长波长荧光染料方向迈开了第一步。 图1 1 4 最早的两种长波长b o d i p y 染料结构 f i g 1 1 4 t h et w oe a r l i e s tl o n gw a v e l e n g t hb o d i p yd y e s 1 9 9 3 年，k a n gh c 再接再厉，又有一份新的专利问世聊】，在这篇专利中重点阐述 了长波长b o d i p y 染料的合成方法。其中包括：3 、5 位上五元杂环取代的b o d i p y 染 料，结构如图1 1 5 左侧所示；苯乙烯基，萘乙烯基取代的b o d i p y 染料，结构如图1 1 5 右侧所示；苯丁二烯基取代的染料等等6 0 余种染料结构。取代的位置主要集中在3 位 和5 位上，其最大发射波长一般都大于5 7 0n m ，量子产率也都比较高。但是该专利文 献中报道的染料局限性也非常大，首先体现在分子结构方面，3 位和5 位中只能是有一 个位置用于引入增加波长的芳香族取代基，而另外一个取代位置用于引入末端含有羧基 大连理工大学硕士学位论文 的烷基，这样做方便了染料的应用，但是导致染料的波长红移不够大，多数染料波长还 是小于6 0 0n n l 。另外一个重要的不足体现在染料的合成方面，所有的染料均通过醛基吡 咯与不同的芳香族取代吡咯缩合而成，然而吡咯衍生物的合成往往极其困难，条件苛刻， 尤其是合成多取代基的吡咯衍生物是非常不易，因此这份专利中的合成方法较繁琐、不 易操作。 x - 0 s ，n i l 图1 1 5 含有五元杂环取代基的b o d i p y 染料( 左图) 和蒙乙烯取代的b o d i p y 染料( 右图) f i g 1 1 5 t h eb o d i p yd y e sw i t hp e n t a b a s i cc i r c l e s ( 1 e f t ) a n dn a p h t h y lg t h e n y lg r o u p s ( r i g h t ) 1 9 9 5 年，h a u g l a n dr p 和k a n gh c 为了合成更长波长的b o d i p y 染料采用邻苯 二羰基化合物为原料，与羟胺反应，生成了异吲哚二甲川化合物，然后与三氟化硼络合， 形成了大共轭体系的b o d i p y 荧光染料【2 5 】，如图1 1 6 所示。这类荧光染料的最大发射 波长甚至超过了7 0 0n l n ，成为典型的近红外荧光染料。尽管合成此类染料达到了促使光 谱大范围红移的效果，但是这个系列的化合物目前还无法引入可连接的基团，芳香环的 周边仍然无法进行修饰，这使他们的应用受到了很大限制，至今还没有此类化合物应用 于生物检测领域。此外，由于染料的结构包含较多的共轭芳香结构，导致染料分子的溶 解性很差，溶于一般的有机溶剂都比较困难，应用到生物标记领域更加困难，难于穿透 细胞膜进入到细胞组织内部，脂溶性很差，这个缺陷不利于该类染料在生化领域的推广 应用，因此需要对这种染料进行大规模的结构改进以适应实际应用的要求。 国1 ，1 6 由异碍i 哚合成的b o d i p y 染料 f i g 1 1 6t h e b o d i p y d y e s s y n t h y s i z e d b y i s o i n d o l e 新型b o d i p y 类荧光染料的合成与性能研究 s h e nz 等人采用了一种传统的方法来合成了类似于图1 1 6 中的染料结构 2 6 , 2 1 ，他 们首先用苯甲醛与相应的吡咯衍生物缩合进而合成了图1 1 7 中左边的结构a ，然后研究 人员发现通过2 2 0 0 c 的高温加热可以将结构a 转换成更稳定的结构b 。 图1 1 7 由芳醛与异吲哚合成的b o d i p y 染料 f i g 1 1 7 t h eb o d i p yd y e ss y n t h y s i z e db ya r o m a t i ca l d e h y d ea n di s o i n d o l e 他们这种合成方法最大的好处是可以采用不同取代基的苯甲醛在r 的位置上方便 的引入可反应基团，为染料的应用铺平了道路。s h e n z 等人已经利用该染料合成了一系 列的离子探针，用于检测碱金属离子的存在。不足的是所报