（化学工程专业论文）粮食原料生料发酵制乙醇的研究.pdf

中文摘要 乙醇是用途最广和需求量最大的化学品之，也是最有希望的成为未来石油的 替代能源之一。随着农业生产的发展及环保的要求，石油资源的枯竭，再生清洁 能源受到了广泛的重视。其中燃料乙醇成为当今研究的热点。目前燃料乙醇无法 与汽油竞争，主要是价格过高，降低成本是燃料乙醇研究的关键。 传统的乙醇生产工艺中蒸煮和蒸馏工序能耗过大。而利用生料发酵将液化、糖 化和发酵三个工序合为一起，既简化了工艺过程( 省略蒸煮) ，又可以进行高浓度 发酵，可大大降低能耗。 本文利用玉米和稻谷原料进行生料发酵的研究。对影响生料发酵的各种因素进 行了系统的实验，确定了最佳的工艺条件。在稻谷生料发酵实验中，引入植酸酶， 发现植酸酶对乙醇发酵有促进作用。通过对发酵过程的研究，发现生料发酵过程 是边糖化边发酵，还原糖始终处于低水平，这有力得避免了染菌。 对于生料发酵，本文还进行了初步的发酵动力学探讨。通过实验，建立了生料 发酵的动力学模型。计算表明，模型计算值与实验的结果能较好的吻合。 关键词：乙醇生料发酵玉米稻谷发酵动力学 a b s t r a c t e t h a n o li so n eo ft h ec h e m i c a l sh a v i n gt h ew i d e s tu s ea n dh e a v i e s t d e m a n d ，a n dt h a t o f t h em o s th o p e f u l s u b s t i t u t ef o rg a s o l i n e w i t ht h e d e v e l o p m e n to fa g r i c u l t u r ea n dt h ed e m a n do fe n v i r o n m e n tp r o t e c ta n dt h e e x h a u s t i o no f g a s o l i n er e s o u r c e ，t h er e p r o d u c i b l e c l e a nr e s o u r c ei s a t t a c h e d i m p o r t a n c et o t h e r e f o r e ，t h e f u e le t h a n o l i s b e c o m i n g t h e r e s e a r c hf o c u st o d a y h o w e v e r ，d u et ot h eh i g hp r i c e ，f u e le t h a n o lh a sn o c o m p e t i t i o nw i t ht h em i n e r a lf u e la tp r e s e n t ，s or e d u c i n gt h ep r o d u c t i o n c o s ti st h ek e yo ft h ef u e le t h a n o lr e s e a r c h i nt r a d i t i o n a lp r o c e s so ft h ef u e le t h a n o l ，t h ec o o ka n dd i s t i l l a t i o n s t e p s h a v et h e g r e a te n e r g yc o n s u m p t i o n t h ep r o c e s s o fr a wm a t e r i a l f e r m e n t a t i o nt h a tc o m b i n e st h et h r e e s t e p s o f 1 i q u e f a c t i o n ， s a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nc a nn o to n l ys i m p l et h ep r o c e s s ( c u tt h e c o o kp r o c e s s ) b u ta l s of e r m e n ti nh i g hc o n c e n t r a t i o n ，w h i c hg r e a t l yr e d u c e t h ee n e r g yc o n s u m p ti o n t h i s p a p e r s t u d i e so nt h er a wf e r m e n t a t i o n u s i n g t o r na n dp a d d y s y s t e m i c a l l ye x p e r i m e n t s o n m a n y f a c t o r st h a t e f f e c to nt h er a w f e r m e n t a t i o na n dd e t e r m i n et h eb e s tc o n d i t i o n so ft h ep r o c e s s i nt h er a w p a d d yf e r m e n t a t i o n ，p h y t a s eh a sb e e nu s e da n di t sa c c e l e r a t i n ge f f e c to n a l c o h o lf e r m e n t a t i o nh a s b e e n d i s c o v e r e d t h r o u g h t h e s t u d y o ft h e f e r m e n t a t i o np r o c e s s ，t h e r a wf e r m e n t a t i o n p r o g r e s s i nw h i c h s a c c h a r i f i c a t i o na n df e r m e n t a t i o nc o n d u c ta tt h es a m et i m ei sd i s c o v e r e d a n di nt h i sp r o g r e s s ，t h ed e o x i d i z e ds u g a ri si nt h el o wl e v e la 1 1t h et i m e ， w h i c hh a st h ea d v a n t a g eo fa v o i d i n gt ob ei n f e c t e db yo t h e rb a c t e r i a k e yw o r d s ：e t h a n o l ：r a wf e r m e n t a t i o n ；c o r n ；p a d d y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研 究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得墨生盘堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解鑫洼盘堂有关保留、使用学位论文的规定。特 授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名导师签名 签字日期：年月日签字日期：年月日 前言 前言 乙醇是用途最广和用量最大的有机溶剂之一，也是最有希望未来成为石油的 替代能源之一。发酵法制燃料乙醇的研究近3 0 年来受到世界广泛的重视。用传 统的发酵法生产燃料乙醇，粮耗高、能耗高、成本高，目前价格还无法与汽油竞 争。造成传统方法成本高的原因主要在蒸煮工序和蒸馏工序，要消耗大量得能源。 如何减少蒸煮的能耗，如何通过增加醪液的酒精含量来降低蒸馏的能耗，是研究 的关键。生料高浓度发酵是解决上述问题的好方法。生料发酵初始的研究，以特 种曲、特殊菌种为前提，应用效果差，难以推广应用。近些年来，随着酶制剂工 业的发展，生料发酵的工业化应用成为可能。本文面向应用进行研究，对影响玉 米和稻谷原料的生料发酵的各个因素进行了实验，取得了较好的结果。 第一章文献综述 第一章文献综述 乙醇( 酒精) 是重要的化工基础原料，广泛用于化学、化工、食品、医药、 染料等众多领域，与人类的生活息息相关。尤其近些年来，石油的日益枯竭，能 源危机曰趋严重，乙醇作为可再生的清洁能源受到各国的重视，燃料乙醇成为研 究的热点。 1 1 燃料乙醇研究的意义 1 1 1 转化粮食 九十年代来，在我国宏观政策的引导下，粮食连续几年获得丰收。但粮食增 产的结果却是粮价下跌，农民丰产不丰收；国家储备压力大，财政负担重，玉米、 早稻、春小麦相继退出国家保护价，挫伤了农民的种粮积极性，对国家的粮食安 全造成了极大的威胁。做好粮食的转化，对于国家的粮食的安全和社会的稳定尤 为重要。而要大规模地进行粮食转化，同时又符合我国农业产业化道路及环保的 要求，生产燃料乙醇，是最佳有效的途径。 1 1 2 缓解能源短缺 能源短缺是本世纪面临的重大课题之一，各国都在为开发新能源，特别是汽 油的替代品而努力。乙醇作为汽车燃料有两种方式：一是配制汽油和无水乙醇的 混合物一汽油醇，通常的添加量为1 0 1 5 。美国、加拿大等西方国家已有 2 0 年的使用历史。尽管乙醇的热值比汽油略低，但由于乙醇分子中含有氧，燃 烧过程的抗爆性能好，当汽油中乙醇的添加量不超过1 5 时，对于车辆的行驶 性能没有明显的影响；一是直接利用乙醇作为燃料，这需要专门设计发动机。我 国也开始了这方面的试点和研究。 2 第一章文献综述 1 1 3 减轻大气污染 乙醇的辛烷值比汽油高许多，既是抗爆剂，又是助燃剂，所以用汽油醇作燃 料不用再添加四乙基铅或m t b e ( 甲基叔丁醚) ，可消除由此而带来的环境污染。 另外乙醇作为燃料可以缓解地球因温室效应加剧带来的气温升高及气候恶化等 严重后果 2 1 。 1 1 4 弥补蛋白饲料资源的不足 我国目前蛋白饲料的缺口较大，对于燃料乙醇副产物酒糟的深度开发，制成 生物蛋白饲料( d d g s ) ，一方面保护了环境，另一方面增加了燃料乙醇的附加 值。 1 1 5 推动农业产业化和农业生态良性循环 粮食种植、酒精生产、饲料生产、畜禽养殖、沼气生产和蔬菜种植是经典的 生态农业模式。通过燃料乙醇的带动，各个环节有机相连，相互促进，实现“燃 料乙醇生态园”，使相关资源和环境纳入生态良性循环。 1 2 乙醇的工业生产 生产乙醇的方法很多，主要分为发酵法和合成法。发酵法有粮食发酵法、木 材水解法等：合成法中有亚硫酸法、乙烯水合法、乙醛加氢法、c o 和h 2 羰基合 成法等。其中具有工业生产意义是，发酵法和乙烯水合法。 1 2 1 乙烯水合法 乙烯水合法分直接水合法和间接水合法。反应式为： c 2 h4 + h p 些轴c 1 hs o h 间接水合法即乙烯在硫酸介质存在下，与液相水合为乙醇。1 9 3 0 年，首先 由美国联合碳化物公司( u n i o nc a r b i d ec o ) 采用。但由于硫酸对设备严重的腐 蚀，人们开始了直接水合法的研究。美国壳牌( s h e l l ) 化学公司首先发现了磷酸 第一章文献综述 可以作为直接水合法的催化剂，于1 9 4 8 年实现了直接水合法的工业化口1 。 1 2 2 发酵法 发酵法是乙醇生产经典的方法，是利用微生物的代谢，消耗糖类原料来产生 乙醇。 勤劳的我国人民在很早之前，就发明了用粮食来酿酒，这是乙醇发酵的开端。 历史上关于乙醇生产的最早描述者是1 2 世纪的m a p p a ec l a v i c u l ah 1 。但是，真 正的工业化乙醇生产是在1 9 世纪末开始发展起来的。一直到第二次世界大战期 间，发酵法乙醇生产达到了高峰。之后，随着石油工业的发展，由于发酵法成本 较高，无法与乙烯水合法竞争，乙烯水合法逐步成为主要的乙醇生产方法。但近 年来，因为受到环保和能源危机的压力，发酵法又重新被重视。 1 _ 2 _ 2 1 发酵法所用的原料、酶制剂和菌种 采用发酵法生产乙醇可利用的原料主要有淀粉类原料( 玉米、大米、小麦、 薯类等) 、糖质原料( 甘蔗、甜菜等) 、纤维质原料( 秸秆、稻草、木材等) 等。 常用的酶制剂有糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、纤维素酶等。生产酒精的菌种主 要是酵母，其次是细菌。 1 2 2 2 发酵法的代谢途径 发酵过程实质上微生物的代谢过程，微生物的代谢很复杂。酵母在无氧的条 件下通过e m p ( e m b d e n - m e y e r h o f - p a r n a s ) 途径产生乙醇。而细菌是经e d ( e n m e r - d o u d o r f f ) 途径发酵产生乙醇。对于半纤维素水解液的戊糖是经过 h m s ( h e x o s e m o n o p h g s p h a t es h u n t ) 途径，转化为乙醇”1 。目前工业化的生产中 主要还是利用酵母菌发酵制乙醇( 即e m p 途径) 。 e m p 途径如图1 一l 所示，主要分为四个部分： l 、葡萄糖分子活化生成l ，6 一二磷酸果糖； 2 、己糖降解生成3 一磷酸甘油醛； 3 、氧化产能，由3 磷酸甘油醛生成丙酮酸： 4 、无氧条件下，丙酮酸生成乙醇。 4 第一章文献综述 3 磷酸甘油醛+ 2 丙酮酸 1 葡萄糖一l 昏二磷酸果糖 i - j - 2 磷酸二羟丙酮 图1 一l 糖酵解( e m p ) 途径 酵母发酵产生乙醇可表示为： c 6 1 2 0 6 + 2 a d p + 2 h 3 p o j - f f2 c h 3 c h 2 0 h + 2 c d j + 2 a t p 1 3 传统的发酵工艺 1 , 3 。1 工艺流程 2 乙醇 传统由淀粉质原料发酵生成酒精的过程是由原料的预处理、原料的蒸煮、糖 化剂生产、糖化、酒母的制各、发酵和蒸馏等工段组成的。( 如图2 2 所示) 其中原料可以是薯类和谷物等。预处理包括除杂和粉碎，使淀粉的糊化和液化进 行的比较容易和彻底。高温蒸煮通常在4 4 1 3 1 0 5 p a 、1 2 0 1 5 0 下进行，蒸煮 原料3 0 6 0 m i n ，使淀粉从细胞中游离出，并转化溶解状态。原料蒸煮后，在6 0 6 2 c 下加入糖化剂，糖化2 0 3 0 m i n ，使淀粉全部或部分转化为葡萄糖等可发酵 糖。之后，接入酒母在2 7 3 0 c 下进行发酵，发酵过程持续6 0 7 2 h ，并不断有 c 0 。放出。最后通过蒸馏得到发酵醪中的乙醇。 碓i 第一章文献综述 糖化酶酒母 il 原料+ 预处理+ 高温蒸煮+ 糖化+ 发酵 1 3 2 传统工艺存在的问题 图1 2 流程图 c 0 2 发酵醪 i 蒸馏 造成传统工艺生产乙醇成本过高，主要存在以下几方面的问题： ( 1 ) 生产过程中的能耗过大，尤其是蒸煮和酒精回收的过程。高温蒸煮需 要热能约占全部酒精生产能耗的3 0 - 4 0 。 ( 2 ) 发酵醪酒精浓度低，大约8 1 2 ( 体积分数) ，造成蒸馏能耗大 ( 3 ) 乙醇生产效率( 强度) 不高，发酵速度般为o 5 2 5 9 乙醇( 1 h ) “1 。 ( 4 ) 间歇发酵需要大量的发酵罐，而传统的连续发酵也是采用多罐顺流或 循环，发酵周期长，设备投资大，产品成本高。 ( 5 ) 酒精废糟量大、处理困难，环境污染严重。 1 4 乙醇发酵工艺的发展 为了改进上述缺点，不少学者进行了多方面的研究和探索，并针对传统工艺 原料预处理、蒸煮、发酵以及发酵和分离同时进行等的各个环节进行了改进，出 现了许多新的酒精生产工艺。 1 4 1 原料膨化处理 原料的预处理对发酵工艺很重要。起初的玉米原料的酒精发酵工业，是直接 6 第一章文献综述 用整粒蒸煮，能耗很高。之后，被先粉碎后蒸煮所取代，能耗降低很多，是很大 的进步。近来又出现了膨化发酵技术。 膨化发酵技术是采用加热挤压技术使玉米瞬间膨化，这样不仅改变了玉米的 外形，也改变了它们的淀粉和蛋白质的微观结构，为淀粉酶系统的作用创造了条 件。美国已将此技术用于纤维素制酒精的预处理上。孙福来等盯1 对此进行了研 究，得出了最佳的工艺条件，结果表明比低温蒸煮工艺提高出酒率5 左右。 1 4 2 低温蒸煮与生料发酵工艺 蒸煮工序是酒精生成耗能较大的部分，为了降低能耗，出现了低温蒸煮工艺 和本文研究的生料发酵工艺( 后文详述，。 低温蒸煮工艺是为了降低能耗和蒸煮时物质的损失，采用高于淀粉糊化温 度，但不高于1 0 0 进行蒸煮。t 匕较成熟的有德国和美国合作开发的9 0 9 5 。c 液 化( l b w ) 工艺和无锡轻工大开发的8 0 8 5 c 糊化工艺“1 。池振明6 1 设计了一 种，在8 0 下液化3 0 m i n ，在5 5 下糖化3 0 m i n ，发酵7 0 h 的低温蒸煮工艺，也 取得了不错的效果。 1 4 3 发酵 发酵是酒精生产的核心，如何提高发酵效率，是提高整体效益的关键。许多 学者对此进行了研究，提出了新的发酵工艺。 1 4 3 细胞循环发酵 所谓细胞循环就是在蒸馏分离酒精前，把发酵液中的酵母分离并返回发酵罐 循环使用，以提高酵母密度，加快发酵速度。在闻歇发酵中，运用细胞循环技术， 使发酵时间比传统方法大大缩短，在连续发酵中，可在较大的稀释率下保持较高 的细胞密度，实现快速发酵。c y s e w s k i 和w i l k e 8 1 用细胞循环法得到了相当于连 续发酵三倍的细胞浓度和四倍的产物产率。这种方法的不足在于高的细胞循环速 率增加了细胞循环的负担，而且需要优化操作，以求得最经济的细胞循环速率。 l e e 四1 指出，产物产率是随细胞循环速率的增加而增大的，但当乙醇的抑制作用 显著时，产物产率就会下降。常用的分离循环细胞的方法有沉降、离心分离和膜 分离等。 第一章文献综述 1 4 4 固定化细胞发酵 通过吸附、包埋、交联等方法将细胞固定到载体上，不仅细胞的密度大大增 大，而且细胞密度将在一定的范围内，不受进料流速的影响，即使当稀释率高于 微生物的比生长速率时仍能保持高的生产率。细胞固定化后，一方面可以实现高 密度细胞发酵，细胞不易流失，另一方面则由于发酵速率等于或超过了底物的扩 散速率，固定化载体对于酵母的保护或对酒精的吸附，大大减少了底物和产物对 酵母活性的抑制作用，从而使酒精发酵速率大大的增加。钟光祥等”利用海藻 酸钠固定酵母，进彳亍连续酒精发酵，取得较好的结果，并且对实验结果进行拟合， 发现产物抑制或产物一底物联合抑制模型能较符合该过程。白凤武等川1 2 1 对酵 母细胞自絮凝形成的颗粒作为细胞固定化方法进行了研究，在不同的酒精精馏废 液循环比条件下，进行了连续发酵实验，探讨了酒精精馏废液“全回流”的可行 性，为解决酒精发酵行业的废液污染提供了途径。 1 4 5 固态发酵 低含水率( 约5 0 ) 的底物发酵称为固态发酵。我国传统的白酒酿造就属于 固态发酵。固态发酵有许多优点：1 固态底物含水量很少，减少了反应的体积： 2 应用固态底物发酵可以减少原料的预处理费用；3 酒糟易处理符合环保的要求。 r o l zn 3 1 描述了一种甘蔗片发酵和萃取同时进行的反应器。k i r b y 和m a r d o n “4 1 提出用甜菜进行固体发酵生产廉价乙醇。k n a k u m u r a 和s s a t o 【l 卯用淀粉质固 体原料进行乙醇发酵，然后用循环惰性气体将生产的乙醇移出，发酵效率达8 0 以上。杜秉海等印利用造纸厂纤维废渣进行固态酒精发酵，设备简单，易操 作，不仅实现了废物利用而且保护了环境。 1 4 6 耐高温酵母和细菌发酵 高温发酵可利用酵母发酵反应所产生的热量，可省去传统发酵所需要的大量 冷却水。对于提高发酵效率和乙醇的分离都是有利的。m u l h o l l a n d 7 1 用酵母 s c e r v i c a e ( a t c c 4 1 2 6 、4 1 3 2 ) 在4 0 进行了气提发酵研究。j c h r i s t i s o n 等人“8 1 对2 3 种酵母进行了筛选，得到了4 种较为理想的菌种。据他们报道，温度越高， 酵母对酒精越敏感。即耐酒精度越低，但发酵速率却越高。 高温细菌的分解代谢能力强，发酵时间短，生产能力高：氧溶解度降低；发 第一章文献综述 酵液的粘度降低，搅拌所需动力减少；发酵原料液在灭菌后冷至适当的温度所需 移走的能量少。一种名为发酵细胞单胞菌( z y m o m o n a sm o b i l i s ) 的细菌具有很 强的酒精发酵能力 1 9 1 , 该菌种具有糖的吸收速率快，酒精得率高( 1 m o l 葡萄糖 可生成1 9 m o l 酒精) ，酒精生产强度高，发酵温度高等优点。细菌容易进行遗传 工程处理，可望得到耐高温、耐酒精、能利用多种碳源得优良菌株。 1 4 7 耐酒精酵母发酵 提高酵母细胞忍耐酒精能力可以使发酵液中的乙醇浓度增高，从而节省乙醇 蒸馏的能耗。日本学者以s a i c h s a k e 为菌种，培养出的酵母在2 0 。c 下清酒发酵 2 0 小时得到酒精1 9 o ( 体积分数) 1 4 1 a 1 4 4 - 发酵和分离同时进行的生产工艺 由于酒精对酵母的抑制作用，限制了发酵原料液中糖浓度的提高，使得发酵 液中酒精的浓度较低，这样，不但增加了酒精分离过程的设备和操作费用，增加 了能耗，而且使废醪量增加，使处理废醪的投资和操作费用增加。为此，提出了 f 许多发酵和分离同时进行的酒精生产工艺，以消除酒精对酵母的抑制作用。 1 4 4 1 真空发酵 真空发酵是采用抽真空的方法，除去发酵液中的乙醇，使发酵液中乙醇的浓 度保持较低的水平，从而消除了乙醇对酵母的抑制作用。这种方法最早是在1 9 4 8 年提出的。在约5 0 m m h g 的低压下，发酵所产生的乙醇和c 0 2 不断地被抽出， 使得原料液中葡萄糖含量达3 3 4 时也不至于产生乙醇的抑制效应 2 0 1 。但是该 过程还难以实现工业化，由于： 1 发酵过程产生大量的c 0 2 ，维持真空所需的能耗非常高，即使采用适当的 能量回收措施，该过程的能耗比常规发酵高许多； 2 需向发酵罐中鼓纯氧阻满足细胞生长的要求： 3 长期操作会积累一些有毒的副产物，因此需稀释以减少副产物对发酵的影 响，这会造成部分原料的损失。 第一章文献综述 1 4 4 2 萃取发酵 选择适当的萃取剂，使发酵液直接与萃取剂接触，就可以使发酵产生的乙醇 被萃取分离。该过程的优点：( 1 ) 在发酵过程中不断将所产生的乙醇移出，可消 除产物的抑制作用；( 2 ) 能维持高的细胞比生长速率；( 3 ) 萃取发酵相对于常规 的间歇发酵一共沸精馏流程更便于乙醇的回收。 萃取发酵有两种基本形式：( 1 ) 将萃取剂直接引入发酵系统；( 2 ) 将发酵液 引出发酵系统，经离心机离心后，酵母细胞送回发酵罐，离心液于萃取剂混合， 分层后，萃取了乙醇的溶液送去蒸馏，发酵清夜送回发酵罐继续发酵。萃取发酵 可以是间歇的，也可以是与固定化细胞相结合连续操作。据报道，萃取发酵的乙 醇产率可达1 1 2 9 ( 1 h ) 1 2 1 1 发酵液中葡萄糖浓度可达4 0 0 9 1n ”。对萃取剂的要 求是：不溶于水、酒精分配系数大、选择性好、对酵母无毒、容易分离及价格便 宜等。目前，适合工业生产的萃取剂还没有找到。 1 4 4 3 吸附发酵 在发酵液中放入对乙醇有选择性吸附的吸附剂，就可以将发酵产生的乙醇吸 附分离，从而消除酒精的抑制作用。岑沛霖“0 驯等人进行了c 0 2 气提游离细胞、 固定化细胞发酵和活性炭吸附过程的研究。饱和了水和乙醇的c 0 2 通过吸附、 解吸而得到4 0 5 0 的粗酒精。p k w a l s h “1 也迸行了乙醇c 0 2 气提发酵和吸 附的研究。他先用活性炭吸附c 0 2 从发酵液带来的乙醇和水，再解吸到载气中 用植物纤维吸附水蒸气，最后可得到含乙醇9 5 的冷凝液，该过程能耗要低于 蒸馏分离乙醇的方法。除了活性炭吸附外，还有：分子筛选择吸附液相水旺“2 6 1 聚合物吸附液相中的水、植物纤维吸附气相中的水、聚合物吸附气相中的水等。 1 4 4 4 膜分离发酵 选择一种能透过酒精和水的膜，并与渗透蒸发等技术相结合，即可将发酵产 生的酒精分离。目前有以下几种形式： 1 、渗透汽化一细胞循环发酵：即在发酵的同时，发酵液连续通过渗透装置 使产物及时分离出去，而发酵残液和微生物细胞则返回发酵罐内继续发酵。对该 过程的研究表明1 2 7 1 利用聚四氟乙烯作透醇膜可得2 2 5 的酒精，釜内细胞浓 度可达1 6 5 8 。用渗透蒸发吃舢直接将发酵产物乙醇抽提出来，得到的酒精浓 1 0 第一章文献综述 度可达2 0 。而且，产品内不含无机盐、糖分及酵母等物质。 2 、中空纤维膜一细胞固定发酵：将固定化细胞技术应用于发酵，其目的在 于不使细胞流失，可重复使用，保持高的细胞浓度，提高反应速度，同时产物及 时脱离细胞表面，解除产物抑制效应。发酵液从通道流过，酵母和糖留在管内， 而酒精则随溶剂经纤维膜渗出。用中空纤维膜来固定细胞，设备较简单，但 c h e r y a n 眨等认为，这种反应器效率低，在发酵过程中，料液和产物都要进行扩 散，其反应速度受制于扩散速度。另外，还存在细胞退化、泄漏和堵塞等问题。 3 、超滤一细胞循环发酵：该过程是在发酵的同时，将含细胞的发酵液通过 超滤装置，部分发酵液挟带产物透过膜，而细胞则被膜截留，返回发酵罐内继续 发酵。g a r c i a ”推荐了一套超滤系统，操作压力为3 4 5 6 8 9 m p a ，膜通量为 o 0 5 0 0 6 i ( m 2 m i n ) ，产物回收率为7 0 。 4 、膜蒸馏一乙醇发酵：膜蒸馏是利用疏水性多孑l 膜两侧温度的不同而产生 的蒸汽压差作为驱动力，使蒸汽通过多孔膜来实现溶液的分离。h u d r i o t 等人b 及r l c a l b o 等人b 2 1 都有将膜蒸馏成功地用于乙醇发酵地报道。h u d r i o t 等人 报道，酵母细胞在无膜蒸馏下培养2 2 小时，葡萄糖转化率、乙醇的浓度、细胞 浓度和乙醇产率分别为6 0 、2 4 4 9 l 、2 - 3 9 1 和o 9 9 9 ( 1 h ) 。而在有膜蒸馏的情 况下连续培养1 8 小时，葡萄糖的转化率、乙醇浓度、细胞浓度和乙醇产率相应 为1 0 0 、3 2 o 胡、7 3 9 l 、1 8 5 9 ( 1 h ) 。可见，乙醇的产率提高了8 7 。但该系 统长期操作存在膜污染和渗透量下降的问题。 1 4 4 5 气提发酵 p k w a l s h 等人玎为了消除发酵液中溶解的底物和酵母细胞的悬浮对吸附剂 的影响，提出了以c 0 2 作为载气进行循环，将发酵液中的乙醇以蒸汽的形式抽 提出来，然后吸附蒸汽中的乙醇的操作方式。由于发酵产生的乙醇都被c 0 2 循 环带走，发酵液中产物可以保持较低的水平，减少甚至消除了乙醇对酵母细胞的 抑制，使细胞活性增强，提高了乙醇发酵产率：另一方面，细胞活性增强又促进 细胞密度增加，提高了乙酵体积产率，细胞活性和密度的增加又能促进底物的充 分利用。 h w a i s h e nl i u 和h a i e n - w e nh s u ”4 1 在理论上对乙醇气提过程进行了较为详 细的研究。他们对g h o s e t y a g i 的比生长速率模型和l u e d e k i n g p i r e t 的产物产率 模型进行了改进，建立了气提发酵的数学模型，提出了气提因子( 为综合载气量、 发酵温度、反应器体积、发酵液性质等因素的常数) 的概念。 第一章文献综述 上述的研究大部分还处于实验室或中试阶段，离工业应用还有距离。 1 5 生料发酵 ， 传统的淀粉质原料发酵工艺中，高温蒸煮是必经的工序，但能耗过大。之后， 高温蒸煮被液化法( 8 5 1 0 5 液化) 取代，称为低温蒸煮。近年来兴起生料发 酵技术，将液化、糖化和发酵三个工序合为一个工序，不仅大大降低了能耗，而 且不经蒸煮的淀粉液粘度低，可以进行浓醪发酵，提高了发酵罐的生产能力，受 到广泛的重视。 所谓生料发酵实际就是微生物利用生淀粉直接进行生长、繁殖、代谢的过程， 是一门既古老又年轻的技术。我国古代劳动人民早就将“生料发酵”这一技术应 用于生产，如酿制豆瓣、豆酱、制大曲酿酒等，但生产效率低。近些年来，世界 能源危机的爆发，以乙醇作为替代能源被重视，有学者为降低酒精发酵的成本而 开展了生料发酵的研究1 3 5 1 。 1 5 1 生料发酵工艺的基础h 1 高压蒸煮的目的是使淀粉彻底的糊化、液化，并破坏植物细胞，使蒸煮物料 成为均一的糊化醪，有利于进一步的糖化和微生物的作用。另外高压蒸煮可以对 原料进行彻底的灭菌。但随着科学技术的进步，生料发酵工艺替代高压蒸煮工艺 成为可能。原因如下： 1 、目前，酒精厂己全部采用了原料粉碎，原料的吸水膨胀，糊化、液化的 情况与整粒有很大的不同。以前针对整粒的高压蒸煮理论阐述，已不适合。 2 、起初酒精生产的糖化剂是大麦芽，它所具有的纤维酶系统和果胶酶系统 都很弱。目前采用的糖化酶大部分是属于黑曲糖化酶系统，它除了有高活性的淀 粉酶系统外，还具有相当活力的纤维酶和果胶系统。这为生料发酵工艺准备了良 好的基础。 3 、黑曲淀粉酶系统是耐酸型，最适p h 在4 5 左右，这就使得可以在实行生 料发酵工艺时，采用调节p h 的方法来防止杂菌污染。 4 、酶制剂工业的发展，已有淀粉酶、纤维酶、果胶酶等酶制剂成品商品化， 为生料发酵工艺实施提供了物质条件。 5 、高压蒸煮虽然能使淀粉彻底糊化，以利于糖化酶的作用，但它同时也造 成了原料中可发酵性物质的损失。利用新技术创造的条件，合理的安排无蒸煮发 第一章文献综述 酵工艺，可以使因无蒸煮造成的淀粉糊化不彻底的损失降低到因高压蒸煮造成的 物质损失之下。这样生料发酵工艺就有了工业化的可能。 1 5 2 生料发酵研究现状与方向 初期生料发酵研究是以特制的曲为前提的，由于酶水平较低，难以实现工业 化。随着酶制剂工业的发展，糖化酶糖化生淀粉的能力增强，以及酶种类的丰富， 使得用市售酶制剂代替特制曲成为可能。1 9 9 1 年，日本的木田建次等以碎米为 原料，用糖化酶生产烧酒取得成功 3 5 1 0 在我国，池振明昭6 1 利用国产糖化酶，以 玉米粉为原料，发酵9 6 小时，得到1 8 0 ( 体积分数) 的乙醇。薛正莲”7 1 利 用复合酶发酵，醪液的酒精度达到1 2 8 ，淀粉的利用率达9 2 1 。这些表明了， 生料发酵工业应用的良好前景。 生料发酵研究应筛选降解生淀粉能力强的菌种，或结合遗传和基因工程的发 展制出适合生料发酵的工程菌。另外，在现有的条件下，面向工业的应用进行研 究，详细探讨影响生料发酵的各种因素并寻找最佳的发酵条件。本文就是进行后 一部分的工作。 第二章实验材料与方法 第二章实验材料与方法 2 1 实验材料和分析设备 2 1 1 原料 玉米，产于天津，经测定淀粉含量6 4 6 0 ，水分1 2 5 0 ： 稻谷，早釉稻产于江苏省，经测定淀粉含量6 0 0 8 ，水分9 5 3 。 木薯干，产于泰国，经测定淀粉含量7 0 1 0 ，水分1 2 0 4 。 2 1 2 酵母及酶制剂 活性干酵母：酒用耐高温型，产地湖北 耐高温甜淀粉酶( 液化酶) ：固体，活力2 0 0 0 0 u g 糖化酶：固体，活力5 0 0 0 0 u g 酸性蛋白酶：固体，活力3 0 0 0 0 u g 纤维索酶：固体，活力8 0 0 0 u g 果胶酶：固体，活力3 0 0 0 0 u g 植酸酶：固体，活力5 0 0 u g 2 1 3 主要分析设备 u g v - - 7 5 4 分光光度计( 上海第三分析仪器厂) 、h p - - 4 8 9 0 d 气相色谱( 惠 普公司) 、p h s - - 2 5 b 型数字酸度计( 上海大普仪器设备公司) 。 2 。2 实验方法 2 2 1 酒精发酵试验 称取定量经过筛原料粉，加入适量的复合酶及干酵母，按比例与4 0 。c 自来水 第= 章实验材料与方法 均匀混合于5 0 0 m l 三角瓶中，塞上棉塞，放入恒温培养箱内，3 0 下进行发酵。 间歇振荡，定时称量，记录c 0 2 失重，来估计发酵状况。因为在理想的条件下， 生成1 t o o l 酒精就有l m o i 的c 0 2 放出。 2 3 分析方法 2 3 1 乙醇浓度的测定 取l o o m l 成熟发酵液于蒸馏瓶中，加1 0 0 m l 自来水。然后蒸馏出l o o m l 溶液。 利用气相色谱( 或酒精比重计) 测定此溶液的乙醇浓度。 2 3 2 还原糖的测定 还原糖的测定，可以采用l a n e - e y n o n 法和高锰酸钾法。近来，d n s 法由于 简单、快速被广泛应用。 2 3 2 1d n s 法3 8 1 测定还原糖的原理 在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇( 1 ，2 一烯二醇) ，易被各种氧化剂如铁 氰化物，3 ，5 一二硝基水杨酸( d n s ) 等氧化为糖酸。还原糖和碱性二硝基水杨 酸试剂一起共热，产生种棕红色的氨基化合物，其反应原理如下所示。在一定 的浓度范围内，棕红色物质的颜色深度与还原糖的量成正比，由此可确定还原糖 的浓度。 二 三寻业二飞三| ；安二、 c o 二o h 兰+ 似瑚+ a 。一 i 一：一 i 一： l ：。 第二章实验材料与方法 2 3 2 2 测定方法 1 、制作葡萄糖的标准曲线：制备九个管，溶液为0 5 m l ，葡萄糖的浓度为 o u g m l 8 0 0 u g m l ；向九支试管分别加入d n s 试剂o 5 m l ，充分混合：将九支试 管放入沸水浴中加热5 m i n ；放入盛有冷水的烧杯中冷却；向各管中分别加入4 m l 蒸馏水，充分混合；以空白管做对照，在5 4 0 n m 波长下，分别测定各管的o d 值；以每管在5 4 0 r i m 下的吸收值作为纵坐标，每管所含的葡萄糖微克数为横坐 标作图，得到一条直线。( 见附录) 2 、用滤纸过滤发酵醪，用移液管吸取清夜，定容到合适的容量瓶中。之后 吸取o 5 m l ，如上面的方法。以空白管做对照，测定5 4 0 n m 波长下的o d 值，与 标准曲线对比，得到还原糖的浓度。再换算出发酵醪的还原糖的浓度。 2 3 3 总糖的测定 总糖的测定需要两步，先水解后定糖。 l 、水解t 3 9 1 取发酵醪1 0 9 ，加入1 ：4 硫酸溶液1 0 m l ，混合后，置于电炉 上加热。至沸腾后5 分钟转化完毕。冷却后，用2 0 n a o h 溶液中和，过滤。吸 取滤液，定容到合适的容量瓶。 2 、定糖：方法同还原糖的测定。 2 3 4 总酸的测定 用滤纸过滤发酵醪，得到清夜。用移液管吸取i m l 至三角瓶，并加入2 0 m l 蒸馏水及酚酞指示剂2 滴，用o 1 n 的n a o h 溶液滴定。 1 6 第二章实验材科与方法 2 3 5 挥发酸的测定唧1 图2 1 水蒸汽蒸馏示意图 吸取5 0 m l 试样，放入2 0 0 m l 蒸馏烧杯中，进行水蒸汽蒸馏( 如图2 1 所示) 。 开始蒸馏时，水蒸汽发生器和试样蒸馏瓶可同时加热，当蒸馏瓶内试样即将沸腾 时，试样蒸馏瓶可停止加热，让水蒸汽通入蒸馏瓶进行蒸馏，约保持每1o 分钟 馏出2 0 m l 的速度收集约2 0 0 m l 馏出液，取出盛馏出液的锥形瓶，加入酚酞，用 0 ，1 n 的n a o h 溶液滴定。 ， 2 3 6p h 值的测定 醪液过滤后，用p h s - - 2 5 b 型数字酸度计测定。 2 3 7 原料的水分测定 经粉碎的原料全部通过4 0 目孔筛，用烘干至恒重的称量瓶精确称取粉碎后 的试样2 5 9 ，在1 0 5 c 烘3 4 小时( 以达到恒重为准) ，取出置于干燥器内， 冷却3 0 分钟后，再称重。 第二章实验材料与方法 2 3 8 原料的淀粉测定 原料淀粉的测定和总糖一样，也是两步水解和定糖。 1 、水解i r 3 9 1 精确称取粉碎后的试样1 2 9 ，放入2 5 0 m l 三角瓶内，加入2 盐酸溶液1 0 0 m l ，瓶口装上冷凝管，置于沸水浴中水解3 小时。之后，取出冷 却用2 0 的n a o h 溶液中和，然后过滤至5 0 0 m l 容量瓶中，用水充分洗涤残渣 后定容。 2 、定糖：方法同还原糖的测定，计算时乘淀粉的换算系数0 9 。 第三章玉米原料生料发酵的研究 第三章玉米原料生料发酵的研究 玉米是我国北方主要的粮食作物之一，分为两大类：黄色玉米和白色玉米。 就淀粉含量而言，黄色玉米淀粉含量较高，通常在6 0 以上。玉米中的含氮化 合物几乎全是真蛋白质，营养丰富，有利酵母生长。另外，玉米的含有5 7 的脂肪，主要集中于胚芽中。其中不饱和脂肪酸约占7 2 ，饱和脂肪酸约占2 8 。在酒精生产中，事先除去胚芽，这样既能得到了玉米油，又有利酒精发酵。 美国大规模燃料乙醇的开发就是以玉米为原料。玉米作为酒精原料有许多优 点：在谷物中亩产较高，可达8 0 0 k g ，种植面积也较广：含有较高的淀粉量，而 且蛋白质和脂肪的含量也较高，可以进行酒精、饲料、油料生产的综合加工：玉 米的淀粉颗粒小，平均只有1 5um ，适于生料发酵。 虽然玉米生料发酵早就有成功的报道，但在工业应用上却没受到足够的重 视。由于以往的研究，偏重于特殊菌种的筛选，和使用特种曲，因而不利于成果 的推广。而且，玉米生料发酵对生产过程的影响因素，研究的不够充分。本文利 用干酵母和商品化的酶制剂，对玉米生料发酵进行了详细的研究，为工业应用创 造了条件。实验所用玉米原料的组成如下表3 1 所示： 表3 1 玉米原料分析 本章对玉米生料酶组合、加水比、粒度、接种量、p h 等影响因素进行了实 验研究。 3 1 酶组合的影响 酶是一种由活细胞产生的生物催化剂，与化学反应中的催化剂不同，它可以 在常温常压下，进行催化反应。目前已经广泛用于制糖、酿造、食品、洗涤剂、 纺织、皮革等工业中。 起初的酒精生产，是利用酵母菌自身的酶系统和大麦芽等谷芽为糖化剂。生 产效率很低。随着人们认识的提高、酶制剂及活性干酵母生产，极大的促进了酒 精工业的发展。糖化酶和活性干酵母在酒精发酵过程中的使用被认为是酒精行业 1 9 第三章玉米原料生料发酵的研究 的“比翼双飞”。 对于生料发酵来讲，由于酵母菌自身没有淀粉酶系统，不能直接利用淀粉； 原料又不经过蒸煮，淀粉没液化，单一的糖化酶难以很好的作用，酵母也难以进 行酒精发酵。解决问题的方法，有三种：1 、导入有淀粉酶系的基因到酵母中， 得到适合生料发酵的工程菌；2 、研制可以糖化生淀粉的糖化剂；3 、利用复合酶 的作用，提高糖化生淀粉的能力。生物技术的迅猛发展，前两种方法也不难实现。 对于目前来讲，应用后一种方法就能较好的解决问题。在文献的报道嵋6 3 7 1 和前 期实验的基础上，本文选择糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、纤维素酶为基本酶组 合。玉米粉碎过6 0 目筛，取6 0 9 ，加水比2 ：1 ，添加干酵母o 5 9 ，以酒精得率 为评价参数，选用l 9 ( 3 4 ) 正交表( 表3 2 ) ，进行正交实验。 表3 2 正交试验水平因子表 从表3 3 的实验的结果得到，最佳的酶组合配方为糖化酶2 5 0 u g ，液化酶 5 u g ，纤维素酶o u g ，酸性蛋白酶l o u g 。纤维素酶的最佳添加量为0 ，可能是 由于玉米粉中纤维素含量低，纤维素酶不能产生应有的效果。又从纤维素酶极差 r 可看到，其值最大，纤维素酶是否对其他酶的作用有干扰，还需要深入的研究。 从糖化酶的k 值变化趋势图( 图3 - - o a ) 可看出，随着酶量的增加，有利于酒精 得率的提高，而从2 0 0 u g 到2 5 0 u g 提高的幅度很小，且此时淀粉的利用率可达 9 0 以上，没有必要再增加用量。因而2 5 0 t j g 基本是最大用量。液化酶呈现的 趋势( 图3 - - o b ) 相反，在实验条件下，液化酶酶活很低，添加量过大，可能对 其他酶的作用产生负影响，需要开发适合生料发酵的液化酶。酸性蛋白酶呈现先 增后降的变化( 图3 一o d ) ，1 0 u g 是最佳的添加量。过高的添加量酒精得率反而 降低，可能由于蛋白质被降解，营养丰富，造成菌体的大量合成，消耗了葡萄糖。 2 0 第三章玉米原料生料发酵的研究 极差r o 0 0 9 70 0 1 8 60 0 2 7 7 o 0 2 2 4 较好水平a 3b i c ld 2 d 图3 0 因素指标图 2 1 第三章玉米原料生料发酵的研究 3 2 加水比的影响 加水比是影响发酵重要因素之一，合适的加水比是获得最佳的工艺条件的前 提。传统的酒精工业采取液态发酵，加水比通常在3 0 以上。 1 | 田| 水 d u 1 8 图3 1 玉米发酵在不同加水比下c 0 2 的失重曲线 1 51 8 22 53 加水比 图3 2 玉米发酵在不同加水比下的醪液中酒精含量 6 4 2 0 8 6 4 2 o 籁求聪棼v x 姗舡蜒垛 第三章玉米原料生料发酵的研究 卜 、啦 蜒 照 o 1 5l - 822 53 加水比 图3 - - 3 玉米发酵在不同加水比下酒精得率 图3 1 是在不同加水比下c 0 2