（微生物学专业论文）降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆.pdf

独创性声明 本人声明，所里交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔繇皆蚴 日期 晤7 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。口 不保密，本论文属于不保密。 口 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：予 指导教师亲笔签名：， 吖 7 钐 “ 积 伊 期 期 日 日 福建农林大学硕士学位论文 降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 ， 摘要 本研究从福建永泰县温泉的水样、土样及木料样品中分离到6 0 株嗜热细菌。 采用菌体全蛋白s d s p a g e 和1 6 sr d n a 序列分析结合的鉴定方法，将它们归类 为8 种细菌，分属于五个属中的八个种：g e o b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i u s ， g e o b a c n i u sk a u s t o p h j u s 、g e o b a c i l l u st l e r m o c a t e n u a t u s 、g e o b a c i l l u s t h e r m o e o v o r a n s 、a n o x y b a c i l l u sk u a l a w o h k e n s i s 、t h e r m u ss p ，m e i o t h e r m u s s p 、l r a n i c o as p 。嗜热微生物及其嗜热酶在工业和分子生物学等方面有重要 的用途。在能源逐渐枯竭的今天，纤维素酶的研究对利用纤维素这一具有巨大潜 力的可再生资源有着重要的意义。本研究筛选到2 株产胞外纤维素酶嗜热茵 d t - m 7 和t c s 8 ，经鉴定分别为酸热脂环酸芽孢杆菌( a l i c y c l o b a c i l l u s a c i d o c a l d a r i u s ) 和嗜热芽孢杆菌( o e o b a c y l l u ss p ) 。对g e o b a c i l l u ss p 菌 株t c s 8 产胞外纤维素酶的发酵条件进行研究，结果表明：在培养基的初始为 p h 6 5 ，温度为6 0 。c ，装液量2 0 ，接种量2 ，摇床转速为1 2 0 r m i n 的条件下 培养3 6 h 时，产酶量达到最大。 菌株t c s 8 分泌的纤维素酶最适作用温度为6 0 - 7 0 。c ，最适p h 为7 o 。利 用h p l c 法分析纤维素酶降解产物，发现其中主要为葡萄糖，含有少量纤维二糖， 葡萄糖是由b 葡萄糖苷酶将纤维二糖水解的产物，说明菌株t c - s 8 除了分泌内 切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，还分泌b 葡萄糖苷酶，构成复合的纤维素酶体系。 菌株t c - s 8 的b 葡萄糖苷酶g l 基因克隆结果表明，该d n a 片段长1 4 1 5 n t 。 最大开放阅读框编码4 7 0 个氨基酸。该序列与g e o b a c i l l u sk a u s t o p h i l u sh t a 4 2 6 和嗜热脱氮芽孢杆菌n g 8 0 2 ( 6 e o b a c i l l u st h e r m o d e n it r i f i c a n sn g 8 0 2 ) 的 8 葡萄糖苷酶基因序列同源性分别达到9 0 和8 9 。利用系统发育树分析，菌 株t c s 8 的g l 序列、6 e o b a c i l l u sk a u st o p h i l u sh t a 4 2 6 和6 e o b a c i l l u s t h e r m o d e n i t r i f i c a n sn g 8 0 2 的p 葡萄糖苷酶基因序列处于同一分支上。该基 因的克隆，为构建降解纤维素的工程菌奠定基础。 关键词：嗜热菌，耐高温纤维素酶，筛选，克隆 福建农林大学硕士学位论文降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 a b s t r a c t i nt o t a l ，6 0s t r a i n so ft h e r m o p h i l i cb a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o ms a m p l e so ft h r e e h o ts p r i n g si ny o n g t a ic o u n t y , f u z h o uo fc h i n a t of a c i l i t a t et h ei d e n t i f i c a t i o no f t h e r m o p h i l i cs t r a i n s ，s d s - p a g eo fw h o l e - c e l lp r o t e i n sa n d1 6 sr d n as e q u e n c e s a n a l y s i so ft h e s es t r a i n sw e r ep e r f o r m e dt oi d e n t i f yt h e m t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e r ee x i s t e d8d i f f e r e ns t r a i n sw h i c hf e l li n t oe i g h ts p e c i e so ff i v eg e n e r aa sf o l l o w ， g e o b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s 、 g e o b a c i l l u s k a u s t o p h i l u s 、 g e o b a c i l l u s t h e r m o c a t e n u l a t u s 、g e o b a c i l l u st h e r m o l e o v o r a n s ，a n o x y b a c i l l u sk u a l a w o h k e n s i s ， t h e r m u ss p ，m e i o t h e r m u ss p 、a r a n i c o l as p t h e r m o p h i l e sa n dt h e i re n z y m e sa r e i m p o r t a n tr e s o u r c e si ni n d u s t r ya n db i o t e c h n o l o g y n o w a d a y s ，w i t ht h eg r a d u a le n e r g y s h o r t a g e ，t h es t u d yo fc e l l u l a s eh a sb e e nv e r yi m p o r t a n tt ou l t i l i z ec e u u l o s e _ t b e r e n e w a b l es o u r c ew h i c hh a s l a r g ep o t e n t i a l t w oe x t r a c e l l u l a rc e l l u l a s e p r o d u c e d t h e r m o p h i l i cb a c t e r i a ls t r a i n s ，n a m e da sd t - m 7a n dt c - s 8w e r ei s o l a t e d t h e yw e r e i d e n t i f i e da ss p e c i e so f a l i c y c l o b a c i l l u sa n dg e o b a c i l l u s f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ee x t r a c e l l u l a rc e l l u l a s es e c r e t e db yg e o b a c i l l u s s p t c s 8w e r er e s e a r c h e d t h er e s u l ts h o w st h a t ，i nt h ec o n d i t i o nt h a ti n i t i a lp ho f c u l t u r em e d i u mw a s6 5 ，c u l t u r e - b r o t h q u a n t u mw a sa b o u t2 0 ，i n o c u l u mw a s2 ， s p e e do fs h a k e - c u l t u r ew a s1 2 0r m i na n dc u l t u r et i m ew a s3 6h o u r s ，t h et o t a l c m c a s ea c t i v i t ys e c r e t i e db ys t r a i nt c s 8r e a c h e di t sp e a k t h eo p t i m u mc o n d i t i o nf o r t h ec e l l u l a s es e c r e t e db ys t r a i nt c - s 8w a s6 0 7 0 0 c a n dp h7 0 h p l cw a su s e dt oa n a l y s ew h a tt h ed i g e s tp r o d u c tw a s t h er e s u l ts h o w e d t h a tt h e d i g e s tp r o d u c tw a sm a i n l yg l u c o s ea n df e wc e l l o b i o s e b e c a u s e 1 3 - g l u c o s i d a s eh y d r o l y z ec e l l o b i o s et op r o d u c eg l u c o s ef i n a l l y , s ot h er e s u l ts h o w e d t h a ts t r a i nt c s 8n o to n l ys e c r e t e de n d o g l u c a n a s ea n de x o g l u c a n a s eb u ta l s o1 3 一g l u c o s i d a s e t h e s et y p e so fc e l l u l a s em a k eu po ft h ec o m p o u n ds y s t e mo fc e l l u l a s e t h er e s u l to fc l o n i n g1 3 - g l u c o s i d a s e g e n eg ls h o w e dt h a tt h el e n g t ho f s e q u e n c ei nn u c l e o t i d e sw a s1 4 1 5 n t ，a n dt h em a xo r f e n c o d e d4 7 0a m i n oa c i d t h i s s e q u e n c es h a r e d9 0 s i m i l a r i t yw i t hb - g l u c o s i d a s eg e n eo fg e o b a c i l l u sk a u s t o p h i l u s h t a 4 2 6a n d8 9 s i m i l a r i t y w i t h b - g l u c o s i d a s eg e n e o f g e o b a c i l l u s 2 福建农林大学硕士学位论文 降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 t h e r m o d e n i t r i f i c a n sn g 8 0 2 b a s e do np h , y l o g e n e t i cf l e e s ，b - g l u c o s i d a s eg e n eo f s t r a i nt c - s 8 ib - g l u c o s i d a s e g e n e o fg e o b a c i l l u s k a u s t o p h i l u s h t a 4 2 6 a n d b - g l u c o s i d a s eg e n eo fg e o b a c i l l u st h e r m o d e n i t r i f l c a n sn g 8 0 - 2a l eo nt h es a m e b r a n c h c l o n i n go fb - g l u c o s i d a s eg e n eo fs t r a i nt c - s 8f o u n d e dt h eb a s ef o r c o n s t r u c t i n gt h ee n g i n e e r i n gs t r a i nw i t hh i g h - y i e l dc e l l u l a s e k e y w o r d s ：t h e r m o p h i l i cb a c t e r i a ，t h e r m o s t a b l ec e l l u l a s e ，i s o l a t i o n ，g e n ec l o n i n g 3 福建农林大学硕士学位论文降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 1 前言 1 1 生物质能源 生物质能是指由光合作用而固定在各种有机体中的太阳能，生物质为生物质 能的载体。在各种可再生能源中，生物质是独特的，不仅能贮存太阳能，还是一 种可再生的碳源，可转化成常规的固态、液态和气态燃料。据估计，地球上植物 每年通过光合作用固定的碳达2 x1 0 1 1 t ，含能量达3 x1 0 1 8 k j ，可开发的能源约相 当于全世界每年耗能量的1 0 倍( 朱清时等，2 0 0 2 ) 。我国生物质资源( 包括农林 剩余物、养殖废弃物、农副产品加工废料、人类生活有机垃圾等) 相当丰富，理 论生物质能资源约有5 0 亿t 标准煤，是我国目前总能耗的4 倍左右( 周善元，2 0 0 1 ； 周凤起等，1 9 9 9 ) 。用现代高新技术开发利用生物质能，解决人类面临的经济增 长和环境保护的双重压力，对于建立可持续发展的能源系统，促进社会经济的发 展和生态环境的改善具有重大意义。 1 1 1 发展生物质能源的意义 1 1 1 1利于“三农 问题的解决 “三农 问题是关系我国经济发展和全面建设小康社会的关键性问题，关系 着8 亿农村居民和1 亿农民工的发展需要和切身利益。生物质能源，特别是农作物 秸秆，主要集中在农村地区，无论是用于发电还是生产液体燃料，都是废物利用， 可大幅度提高农业生产的附加值，有效增加农民收入。此外，还可以将荒山、荒坡 承包给农民种植能源林，通过出售能源植物增加收入，同时也增加了能源供应， 使农村地区的生物质能资源优势转换为产业和产品优势，提高农业、植树造林和 生态建设的经济效益，改善农村环境，推动农村城镇化建设。 1 1 1 2利于调整能源结构，保障能源安全 能源安全不仅包括能源供应的安全，也包括由于能源生产与使用所致的生态 环境安全。我国是一个能源生产和消费大国，2 0 0 5 年，全国一次能源消费量已达 ! n 2 2 1 2 亿t 标准煤，约占世界能源消费总量的1 5 ，是世界第二大能源消费国。以 目前的消费速度半日略估算，n 2 0 3 0 年石油资源将只剩下1 8 ，n 2 0 3 7 年将可能全 部耗尽。中国对进口石油的依赖度逐年提升，2 0 0 5 年，中国进口了原油1 2 7 1 0 6 吨，精炼油产品4 0 1 0 6 吨，进f 1 石油的花费大约为5 10 亿美元。中国的能源储量 4 福建农林大学硕士学位论文降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 与未来几十年的发展需求之间已经存在巨大的缺口，从长远发展的角度来看，将 经济发展建立在石油、煤炭等不可再生能源的基础上是不适宜的。我国生物质能 资源丰富，传统的生物质资源为6 5 z , t ，发展能源农业和能源林业还至少可提供 相当于l o 亿t 标准煤的能源资源( 吴创之等，2 0 0 3 ) 。大力开发利用生物质能源， 对于弥补石油和天然气资源短缺、增加能源总量、调整能源结构、缓解能源供应 压力、保障能源安全具有极其重要的作用。 1 1 1 3利于改善生态环境 石油、煤炭和天然气这三种常规能源的使用所带来的环境问题日益严重，表 现为大气污染、臭氧层破坏和温室效应加剧、自然灾害频繁发生发展下去将使 自然界失去供养人类生存的能力。据联合国环境计划署和国家环保总局统计，世 界上污染最严重的2 0 个城市中1 6 个在中国。来自空气污染的总经济损失相当于 2 - 3 的国内生产总值( 环保总局，2 0 0 4 ) 。在没有切实可行办法控制矿物燃料使用 过程中产生的生态环境污染的情况下，减少使用量，开发洁净可替代能源是唯一 的解决办法。我国尚有近l 亿h m 2 宜农、宜林荒山荒地，可用于发展能源农业和 能源林业，是发展洁净可替代能源的重要资源。农业废弃物对环境形成了越来越 大的面源污染压力，通过实施生物质能源利用技术，使生活垃圾和各种农业废弃 物转化成为清洁能源和有机肥，变“废”为“宝( 李建政等，2 0 0 4 ) ，实现可持 续发展。 1 1 2 国内外生物质能开发现状 在生物质能源的研究开发方面，自二十世纪7 0 年代出现“石油危机 后， 许多国家制定和实施了生物能源开发研究计划，如日本的“阳光计划 、印度的 “绿色能源工程”、巴西的酒精能源计划，美国农业部与能源部、环保署协同于 2 0 0 2 年制定了生物质能材料研究开发计划，丹麦、荷兰、德国、法国、加拿大、 芬兰等国也形成了各具特色的生物质能源研究与开发体系，拥有各自的技术优 势。 在能源作物方面，可以大规模用于代替常规能源的生物能将成为未来可再生 能源的主体，尤其是为了生产能源而种植的能源作物。以科学的方法培育高产、 抗逆性强的能源植物是发展生物质能的根本保障。美国、巴西、南非、阿根廷、 印度等国都丌展了培育和利，植甜高粱及其生产燃料乙醇方面的研究与丌发，而且 福建农林大学硕士学位论文降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 取得了成果。我国在甜高粱木薯、菊芋、黄连木、麻疯树和耶路撒冷菜蓟等的开 发上成果显著。 一 生物质发电在发达国家已受到广泛重视。主要工艺分为3 类：生物质锅炉直 接燃烧发电、生物质煤混合燃烧发电和生物质气化发电。目前生物质燃烧发电 已占发达国家可再生能源发电量的7 0 。在美国，生物质发电装机容量已达 10 5 g w 。7 0 为生物质一煤混合燃烧工艺，单机容量10 一- - 3 0 m w ，发电成本3 6 美分( k w h ) ，预计至w j 2 0 15 年装机容量将达16 3 g w 。奥地利成功地推行建立燃 烧木质能源的区域供电计划。目前已有八九十个容量为1 0 0 0 2 0 0 0k w 的区域供 热站，年供热10 x10 9 m j ( 蒋剑春，2 0 0 2 ) 。法国、瑞典、丹麦、芬兰和奥地利是利 用生物质能供热最多的国家，利用中央供热系统通过专用的网络为终端用户提 供热水或热量。意大利发展了1 2 m w 生物质整体煤气化联合循环发电技术( i g c c ) 示范项目发电效率达3 1 7 。瑞典试验加压整体煤气化联合循环发电技术 ( b ig c c ) ( g r e e np a p e r ，2 0 0 0 ) 。我国已开发和推广删级生物质气化发电系统 应用2 0 多套。国家高科技发展计划( 8 6 3 计划) 将建设4 m w 规模生物质( 秸秆) 气化发电的示范工程预计系统发电效率可达到3 0 左右( c o o ke ta l ，2 0 0 0 ) 。 燃料乙醇是国际上近年来最受关注的石油替代燃料之一。巴西2 0 0 2 年产乙醇 1 2 0 0 多万吨，全面覆盖汽车用燃料并大量出口美国。2 0 0 0 年，美国生产6 0 0 多 万吨玉米乙醇，相当于汽油消耗量的1 。据估计，如果美国农林废弃物都利用 起来，可替代美国国内4 0 的汽油( g r o s se ta l ，2 0 0 3 ) 。美国能源部( d o e ) 投资近4 亿美元建设3 所生物质能研究中心，着重于采用纤维素生产乙醇及其他生 物燃料方面的工作，其有望在0 8 年内开始运行。我国已在黑龙江、吉林、河南和 安徽4 省建设陈化粮生产燃料乙醇工程。我国人口多，耕地资源有限，粮食资源短 缺，因此，从生物质能源的资源与原料选择上，粮食不可能成为我国生物质能源的 主要原料，而农业废弃物( 如秸秆、畜牧业粪便) 、城市污水与垃圾、林业“三剩 物”、能源植物( 如甘蔗) 等应成为我国生物质能源的重点资源。利用数量巨大 的农作物秸秆和林产下脚料( 含木质纤维素) 制取燃料乙醇是解决原料来源和降 低成本的主要途径之一，已经列入我国的“十五”、“十一五”科技发展计划中。 至2 0 0 5 年底，全国燃料乙醇生产能力达到1 0 2 万t ，己在河南等9 个省的车用燃料中 推广使用乙醇汽油( 秦大东等，2 0 0 7 ) 。 6 福建农林大学硕士学位论文降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 ，在技术上，对生物质能源有重要影响的技术纤维素生产乙醇技术的主要 瓶颈是纤维素原材料的预处理以及降解纤维素为葡萄糖的纤维素酶的生产成本 过高。因此，筛选和改造出能同时转化多种单糖或直接发酵纤维素原料为乙醇的 超级微生物和能生产高活性纤维素酶的特种微生物成为世界研究的热点和生物 质能源的关键技术。 利用豆油、花生油、棉籽油、葵花籽油、油菜籽油、棕榈油和蓖麻籽油生产 生物柴油正在形成产业。目前美国总的生物柴油年生产能力为1 0 0 万t 以上；欧 盟2 0 0 1 年已超过1 0 0 万t ；德国2 0 0 0 年已达2 5 万t ，拥有3 0 0 多个生物柴油加油 站；意大利已拥有9 家生物柴油的生产厂。日本、爱尔兰等国用植物油下脚料及 食用回收油作原料生产生物柴油，成本比石化柴油低。美国能源署要求，至u 2 0 1 0 年，美国要将生物柴油产量提高至u 1 2 0 0 万t ；欧盟委员会计划在2 0 2 0 年使生物柴 油的市场占有率达1 2 ( b i o m a s sr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n tt e c h n i c a la d v i s o r y c o m m i t t e e ，2 0 0 2 ) 。我国生物柴油的研究与开发起步较晚但发展较快，目前其研 究内容涉及到油脂植物的分布、选择、培育遗传改良等及其加工工艺和设备。研 究也取得了一定进展。如研究并开发了利用垃圾油或野生油果做原料的生物柴 油等项技术。 9 0 年代以来我国沼气建设一直处于稳步发展的态势。以沼气利用技术为核心 的综合利用技术模式( 如“四位体 模式，“能源环境工程 等) 由于其明显的 经济和社会效益得到快速发展，成为我国生物质能利用的一大特色。近年来畜禽 粪便生产沼气的技术在欧、美等发达国家发展很快，在成套热电沼气工程技术、 不同型号气油联合发电机、大型实用型沼气发酵罐体、储料罐体、预处理和输 配气和输配电系统等方面均已远超过沼气的发源地中国( 孙永明等，2 0 0 6 ) 。 美国俄克拉荷马州畜禽养殖场养7 万多头家畜，每r 利用所产粪便2 0 0 t 生产沼 气，与天然气管道起输送到用户( 李改莲等，2 0 0 4 ) 。德国建立了以沼气发电 并网为基础的环境保护策略，并吸纳了剩余劳动力( g r e e np a p e r ，2 0 0 0 ) 。 我国对开发利用生物质能源极为重视，连续三个国家五年计划都将生物质 能技术列为重点科技攻关项目。我国生物质能高新技术的刀：发尚处于起步阶段， 还有许多问题尚待解决，我国生物质能技术与国外相比还有较大差距，主要表 现在厌氧消化产气率低系统运行和管理自动化水平不高。厌氧消化和综合利用 福建农林大学硕士学位论文 降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 配套的技术和设备还不成熟厌氧消化技术产业化发展缓慢秸秆气化热值低 在稳定运行、焦油清除、气体净化等技术上需要提高，缺乏秸秆直接燃烧供热技 术研究和设备开发，生物质发电技术和装置方面有较大差距。 1 1 3 生物质能的开发利用前景 国际上生物质能利用主要是把其转化为电力、液体燃料、固化成型燃料，在 一定范围内减少和替代矿物燃料的使用，发展目标是发展高效、清洁、低污染、 低成本的生物质气化发电、液化等技术( d e m i r b a s ，2 0 0 1 ) 。未来5 1 0 年是世界 各国大力发展生物质的关键时期，美国的i g c c 可能实现6 0 m w 的目标，2 0 1 0 年 的装机容量将达到6 1 g w ；英国的生物质可满足能源总需求的1 9 ，2 0 3 0 年，生 物质发电技术将完全市场化。 我国的生物质能源消耗的比例一直比较大( 约1 5 ) ，特别是在农村( 约3 0 以上) ，但是生物质利用技术水平较低，开发新型能源的成本较高，限制了技术 设备的推广利用。我国未来生物质利用技术主要在能源作物的开发、沼气技术、 生物质热转化与利用技术、生物质材料的利用上实现突破。2 0 0 5 2 0 2 0 年，为我 国生物质技术的开发和发展阶段，部分技术进入到商业应用，2 0 5 0 年，随着生物 质技术成熟和生物质能源体系的完善，生物质将成为主要的能源，进入到商业化 示范和全面推广阶段。 1 2 降解纤维素微生物及其纤维素酶的研究进展 极端微生物尤其是嗜热微生物蕴涵着生命进化历程的丰富信息，代表着生命 对于环境的极限适应能力，是生物遗传和功能多样性的宝库，也是人类认识生命 本质的重要途径。开展嗜热微生物的研究，对于揭示生物圈起源的奥秘，阐明生 物多样性形成的机制，认识生命的极限及其与环境的相互作用的规律等，都具有 极为重要的科学意义。同时，因工业生产的许多环节需要在高温条件下进行，嗜 热微生物特殊的生理功能和遗传功能激起了工业界对其应用潜力的兴趣，尤其是 嗜热微生物在极端环境下产生的效能卓越的极端酶( n i e h a u s ，1 9 9 9 ；s c h i r a l d i d e r o s a ，2 0 0 2 ) ，如热稳定d n a 聚合酶、蛋白酶、纤维素酶、q 一淀粉酶、葡萄糖异 构酶等都具有巨大的生物工程及商业应用潜力。嗜热微生物研究的成果，将大大 促进微生物在能源丌发、环境保护、人类健康和生物技术等领域的利用。自美国 福建农林大学硕士学位论文降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 人b r o c k 等1 9 6 9 年首先从美国黄石国家公园分离出第一个严格意义的高温菌一 一水生栖热菌( t h e r m u sa q u a a c u s ) 至今，人们已发现并分离了超过7 0 多个属，1 4 0 多种的嗜热菌( 郭春雷等，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 利用纤维素的微生物 纤维素是地球上最丰富的可再生资源，是植物细胞壁的主要成分，由1 3 - 1 ，4 葡萄糖苷链连接葡萄糖苷形成的线形聚合体，不溶于水，可被纤维素酶水解成葡 萄糖( c o u g h l a n ，1 9 9 0 ) 。 细菌的许多属和真核生物中很多真菌都能消化纤维素，在超古菌强烈炽热球 菌( p y r o c o c c u sf u r i o s u s ) 中也发现了有关纤维素降解的酶。真细菌中的好氧 放线菌目( a c t i n o m y c e t a l e s ) 和厌氧的梭菌目( c o s t r i d i a l e s ) 中众多成员具 有分解纤维素能力。真菌中能利用纤维素的成员更多，从原始的壶菌 ( c h y t r i d o m y c e t e s ) 到高等的担子菌( b a s i d i o m y c e t e s ) 都可以利用纤维素， 目前应用于工业的纤维素酶类大多是由真菌产生的，其中以1 9 5 6 年发现的木霉属 ( t r i c h o d e r m a ) 真菌最为突出。丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群，其在 降解纤维素时，菌丝穿过次生壁进入胞腔，由内向外降解纤维素；而细菌则是粘 附在纤维上，从纤维的表面向内生长，在接触点处的纤维素被降解，纤维表面呈 锯齿状蚀痕( 孟雷等，2 0 0 2 ) 。 分解纤维素的细菌可以分为以下几组：( 1 ) 发酵厌氧菌，主要是革兰氏阳 性菌，梭菌属( c o s t r i d i u m ) 、热纤梭菌( c o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m ) ，牛 黄瘤胃球菌属( r u m i n o c o c c u s ) 、热解纤维素菌属( c a l d i c e l l u l o s e r u p t o r ) ，也 有少数革兰氏阴性菌。此类多数在系统发生上跟梭状芽孢杆菌结合( c o s t r y d i u m a s s e m b l a g e ) 有关，但也有少数例外，如丝状杆菌( f i b r o b a c t e r ) ；( 2 ) 好氧 革兰氏阳性细菌，纤维单胞菌属( c e l l u l o m o n a s ) 、粪碱纤维单胞菌( c e l l u l o m o n a s f i m i ) 、纤维弧菌属( c e l l v i b r i o ) 、发酵单胞菌属( z y m o n o n a s ) 、混合纤维 弧菌( c e l l v i b r i m i x t u s ) 、嗜热裂孢菌属( f h e r m o b i f i d a ) ；( 3 ) 好氧滑行细 菌，噬胞菌属( c y t o p h a g a ) 、生孢噬纤维菌( s p o r o c y t o p h a g a ) 。 1 2 2 产纤维素酶微生物选育 从生产应用角度看，各菌株有各自的优点和缺点，因此，各国学者仍在进一 步选育优良性能的菌株，特别是极端环境下( 如高温、广适p h ) 高活性纤维素 福建农林大学硕士学位论文降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 分解菌。如r a i n e y 等( r a i n e ye ta l ，1 9 9 4 ) 从温泉中筛选得到热解糖纤维菌 ( 国j 甜c e l l m o s i r u p t o rs a c c h a r o y t i c u s ) ；t a y a 等( t a y ae ta l ，1 9 8 8 ) 分离到的嗜热厌氧解纤杆菌t h e r m o a n a e r o b a c t e rc e l l u l o l y t i c u s n a l o ，以及国 内韩如砀等( 韩如呖等，2 0 0 2 ) 分离到的e v a l 和胡国全等( 胡国全等，2 0 0 4 ) 分离到 的邦系列菌。 要使纤维素酶能够用于工业生产，首先要降低纤维素酶的成本，因此选育高 酶活的纤维素分解菌株就成了关键之一。由于直接从自然界筛选得到的原始菌株 的产酶活性不高或者酶组分不全等原因，产酶菌株通常需要遗传改造。过去以常 规理化诱变为主，近2 0 年来，基因重组技术、基因定位突变技术和细胞融合技 术已被应用于产纤维素酶菌株的构建并取得可喜进展。 1 2 2 1 常规理化诱变 常规理化诱变虽然存在偶然性大，不定向及工作量等不足，但在产纤维素酶 微生物的遗传改造上仍不失为一种有效手段。现在使用的许多高酶活菌株多是由 此方法获得的。如美国陆军n a t i c k 实验室通过一系列射线和t n g 诱变里氏木霉 q m 6 a 菌，得到高活性的q m 9 4 1 4 ( 刘家建，1 9 9 5 ) 。邱雁临等( 邱雁临等，2 0 0 4 ) 用紫外线、亚硝基胍处理绿色木霉n o ，得到高酶活的菌株1 1 0 。 1 2 2 2 基因重组技术 纤维素酶基因工程始于二十世纪七十年代，近年来发展迅速。纤维素酶系中 的一些基因已在2 0 多种细菌和真菌中克隆并在大肠杆菌( ec o l i ) 、酵母等受 体菌中得到表达。这些工作为了解纤维素酶基因的遗传背景，构建高活性菌株奠 定了良好的基础。纤维素酶基因的重组工作主要集中在细菌纤维素酶上，已有 4 0 多种细菌纤维素酶基因被克隆。纤维素酶基因克隆受体菌目前主要是大肠杆 菌( ec o l i ) ，虽然ec o l i 作为受体菌有其公认的有点，但是由于该菌很少分 泌蛋白质，因此现在许多学着把受体菌的工作转移到了枯草芽孢杆菌 ( 及s u b t i l i s ) 、酿酒酵母( 爱c e r e v i s i a e ) 、乳糖发酵短杆菌( b r e v i b a c t e - r i u m l a c t o f e r m e n t u r n ) 等。近年来真菌纤维素酶基因克隆的工作报道不断增加，最早 的报告始于1 9 8 3 年s h o m e a k e r 和t e e r i ，他们分别在不同的实验室进行了里氏 木霉zr e e s i 外切纤维二糖水解酶i 基因的克隆。他们先制备发转录d n a 探针， 以入噬菌体构建木酶的基因文库，在用鉴别杂交进行筛选，然后用m r n a 杂交选 1 0 福建农林大学硕士学位论文 降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 择和d n a 序列分析鉴定c b h i 基因。其不同之处只是所选择的菌株有所不同，结 果有所差别，但都分别取得了进展，使得纤维素酶基因克隆的工作从细菌扩展到 真菌，从内切酶基因扩展到外切酶基因( 刘家建，1 9 9 5 ) 。运用基因重组技术， 人们已得到具体有生产价值的基因工程菌。 1 2 2 3 基因定位突变技术 基因定位突变技术工作起步较晚，主要集中在八十年代中后期。为了有效地 完成基因定位突变，必须了解纤维素酶蛋白质三维结构的活性部位，以便有效地 在基因水平上改变活性部位氨基酸残基的密码子，进而改变纤维素酶的活性。目 前已提出了3 种主要应用于确定纤维素酶活性的方法，即与标记试剂的亲合性 能、特定的化学修饰、以及分析纤维素酶与抑制剂及底物结合后的三维构象。其 中后者比较困难，主要由于很难得到纤维素酶的晶体，因而无法通过x 一衍射分 析其三维构象。最早对里氏木霉zr e e s ie x o i 基因的定位突变研究始于1 9 8 7 年c h e n 的工作。目前该技术已被系统地应用于许多纤维素酶的改造中，并已有 提高纤维素酶热稳定性的多篇成功报道( 吴显容等，1 9 9 4 ) 。 1 2 2 4 细胞融合技术 通过细胞工程提高纤维素酶活性的工作始自日本h t a y a m a 等学者。他们利 用原生质体融合技术研究里氏木霉zr e e s i 的遗传，所选择的两个亲本菌株为 q m 9 4 1 4 等，其融合率为0 9 - 一4 xl o _ 4 ，得到的融合子其稳定的羧甲基纤维素酶 ( c m c a s e ) 活性比亲本高l 倍，后来工作进一步扩大到不同种木霉之间的融合。 国内在纤维素微生物原生质的制备、再生以及融合也都进行了探索( 刘春芬等， 2 0 0 4 ) 。 1 2 3 纤维素酶组分 微生物所产生的纤维素酶系是一个多组分酶系，通常将纤维素分为( 1 ) 内 切葡聚糖酶( e n d o - 1 ，4 一b d - g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ) ，来自真菌的称为e g ， 来自细菌的称c e n ；( 2 ) 外切葡聚糖酶( e x o 一1 ，4 一b d - g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 9 1 ) ， 来自真菌的称c b h ，来自细菌的称c e x ；( 3 ) 0 一葡萄糖苷酶( b - g l u c o s i d a s e ， e c 3 2 1 2 1 ) 。一般来说，内切葡聚糖酶作用于纤维素分子内部的非结晶区或 羧甲基纤维素，随机水解b - 1 ，4 一糖苷键，将长链纤维分子截断，产生大量小分 子纤维素。外切葡聚糖酶，作用于纤维素线状分子术端，水解0 1 ，4 一糖苷键， 福建农林大学硕士学位论文降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 每次从纤维素链的非还原端切下_ 个纤维二糖分子，可以水解微晶纤维素。而1 3 一葡萄糖苷酶水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，三种酶协同作用，完 成对纤维素的降解。蛋白质的进一步分级研究表明上述三大类酶又分别由一些亚 组分组成。b e l d m a n 等( b e l d m a ne ta l ，1 9 8 7 ) 发现商品化绿霉纤维素酶中发现了 6 种内切葡聚糖酶、3 种外切葡聚糖酶和一个1 3 一葡萄糖苷酶。 1 2 4 纤维素酶降解机制 关于纤维素酶降解机制，较公认的有以下3 种：( 1 ) 改进的c ，_ c 。假说，认为 首先由c 。酶作用于纤维素酶的结晶区，引起纤维素膨胀，形成变形纤维素，再由 内切酶和1 3 一葡萄糖苷酶联合作用产生二糖和葡萄糖。( 2 ) 顺序作用假说，认为 首先由内切酶随机作用于纤维素的葡萄糖苷键，打开缺口，然后由外切酶在新生 链末端切下一个纤维二糖，再由6 一葡萄糖苷酶将它水解成葡萄糖。( 3 ) 竞争吸 收模型，从上述降解模型中可以看出，不同的纤维素酶组分之间存在一个协同效 应的问题，因而不同酶组分比例直接影响酶的降解效果。有研究表明在嗜热裂孢 放线菌zf u s c a 的粗酶液中加入纯的zr e e s i 纤维二糖水解酶i ，会使其滤纸酶活 是两者分别作用时的两倍( 刘家建等，1 9 9 5 ) 。 目前已经报道了纤维素酶的四种协同机制：( 1 ) 内切一外切协同，存在于内 切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶之间；( 2 ) 外切一外切协同，存在于从还原端和非还 原端切割的外切葡聚糖酶之间；( 3 ) 外切葡聚糖酶和b 一葡萄糖苷酶的协同；( 4 ) 分子内催化结构域和c b d 结构域的协同( d i ne ta l ，1 9 9 4 ；t e 嘶，1 9 9 7 ) 。 1 2 5 纤维素酶的分子结构与功能 纤维素酶分子普遍具有类似的结构，均由催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n s ， c d ) 、纤维素结合结构域( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n s ，c b d ) 和连接桥( 1 i n k e r ) 三部分组成。( 1 ) 催化结构域：呈球形，主要体现酶的催化活性及对特定水溶 性底物的特异性。内切酶的活性位点位于一个开放的裂口( c l e f t ) 中，它可结 合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链。外切酶的活性位点位于一个长环状管 道中，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。( 2 ) 纤维素结合结构 域：c b d 在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过连接桥与催化结构域相 连。t o m m e 等( 1 9 9 5 ) 根据c b d 分子大小及氨基酸的相似性将已知的c b d 分为l o 个 家族，大部分c b d 位于家族i 、i i 、i i i 。人们推测，c b d 可能通过芳香坏与葡萄糖 福建农林大学硕士学位论文 降解纤维素嗜热菌的筛选及其功能基因克隆 环的堆积力吸附到纤维素上，i 扫c b d _ p _ 其余的氢键形成残基与相邻的葡萄糖链从 纤维素表面脱离开，以利于催化区的水解作用。但有一些纤维素酶并没有c b d ， 如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体( c e l l u s o m e ) 吸附纤维素的。( 3 ) 连接桥：连接桥主要作用是保持c d 和c b d 之间的距离，也可能有助于不同酶分子 之间形成较稳定的聚集体。细菌纤维素酶的连接桥富含脯氨酸、苏氨酸，而真菌 纤维素酶的连接桥富含甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸。细菌纤维素酶的c b d 与c d 夹角 为1 3 5 。，而真菌为1 8 0 。细菌纤维素酶有两个酶切位点可将c b d 与连接桥分别 切去，而真菌纤维素酶一般只有一个酶切位点可将c b d 与连接桥一起切去。 1 2 6 嗜热纤维素降解菌的研究进展 1 2 6 1 嗜热厌氧纤维素降解茵 近年嗜热厌氧纤维素降解菌研究异军突起，高温下水解纤维素比常温更有优 势，嗜热厌氧细菌在生长速度和纤维素代谢速度上比常温菌株快，同时它所产生 的纤维素酶的稳定性也有很大提高。 自然界中存在的纤维素是高分子聚合物，在常温下溶解性低，不易酶解。嗜 热厌氧纤维素降解菌其酶系多与嗜热好氧纤维素降解菌酶系不同，以多酶复合物 或称纤维小体( c e l l u s o m e ) 的形式存在，这种四级结构有利于对纤维素的迅速 降解，许多嗜热厌氧纤维素降解菌还具有直接转化纤维素产乙醇的能力。z e i k u s ( z e i k u sc ta