（应用化学专业论文）富勒烯水溶性衍生物的制备及其抗氧化性的研究.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 富勒烯水溶性衍生物的制备及其抗氧化性的研究 摘要 由于特殊的分子结构，c 6 0 具有很多令科学界感兴趣的物理化学性质，特别是 c 6 0 的生物活性，如酶抑制活性、抗艾滋病活性、神经保护活性、抗菌活性、d n a 切割活性和光动力治疗应用等等。目前，c 6 0 已经在世界范围内掀起了研究热潮， 并且在c 6 0 水溶性衍生物的生物活性研究领域取得了很多的成果。 本实验首先对c 6 0 进行了化学改性，获得了一系列不同取代物的c 6 0 水溶性衍 生物，详细研究了它们的抗氧化活性，并报道了加成物种类和加成数对c 6 0 水溶性 衍生物抗氧化活性的影响规律。 本实验在非均相碱性条件下制备得到了c 6 0 p 丙氨酸衍生物、c 6 0 肌肽衍生物、 c 6 0 d 氨基葡萄糖衍生物和c 6 0 低聚壳聚糖衍生物，对它们进行了红外光谱、紫外 光谱、核磁共振和元素分析测试表征，并考察了它们的超氧阴离子清除能力、羟 基自由基清除能力、还原能力和金属螯合能力。主要结论如下： 1 随着加成度的增加，c 6 0 p 丙氨酸衍生物的超氧阴离子清除能力、羟基 自由基清除能力、还原能力和金属螯合能力都随之增强。n h 基的供电 效应对c 6 0 p 丙氨酸衍生物的超氧阴离子清除能力、羟基自由基清除能 力、还原能力和金属螯合能力的影响可能大于c = c 的剩余数量等其它 因素的影响。 2 随着加成度的增加，c 6 0 肌肽衍生物的超氧阴离子清除能力、羟基自由 基清除能力、还原能力和金属螯合能力都随之增强。- n h 基的供电效应 对c 6 0 肌肽衍生物的超氧阴离子清除能力、羟基自由基清除能力、还原 能力和金属螯合能力的影响可能大于c = c 的剩余数量等其它因素的影 响。 3 随着加成度的增加，c 6 0 d 氨基葡萄糖衍生物的超氧阴离子清除能力、 羟基自由基清除能力和还原能力随之增强，而金属螯合能力随之减弱。 n h 基的供电效应对c 6 0 d 氨基葡萄糖衍生物的超氧阴离子清除能力、 羟基自由基清除能力和还原能力的影响可能大于c = c 的剩余数量等其 它因素的影响。c 6 0 d 氨基葡萄糖衍生物上c - - - c 的保留数量可能是影响 c 6 0 d 氨基葡萄糖衍生物金属螯合能力主要因素。 上海海洋大学硕士学位论文 4 c 6 0 低聚壳聚糖衍生物在超氧阴离子清除能力、羟基自由基清除能力、 还原能力和金属螯合能力四个抗氧化体系中都表现出良好的抗氧化性。 本文探讨了加成物种类和加成度对c 6 0 水溶性衍生物抗氧化活性的影响规律， 为c 6 0 衍生物抗氧化机理的深入研究和天然抗氧化剂的开发利用提供了相关依据和 思路。 关键词c 6 0 水溶性衍生物，超氧阴离子清除能力，羟基自由基清除能力，还原能 力，金属螯合能力 i i 上海海洋大学硕士学位论文 s y n t h e s i so fw a t e r - s o l u b l ef u l l e r e n ed e r i v a t i v e sa n d t h e i r a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s a b s t r a c t c 6 0 ，w i t hi t su n u s u a lm o l e c u l es t r u c t u r e ，h a sm a n yi n t e r e s t i n gp h y s i c a la n d c h e m i c a lp r o p e r t i e s ，s p e c i a lf o rb i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，s u c ha se n z y m a t i ci n h i b i t i o n , a n t i - h i v a c t i v i t y ，n e u r o p r o t e c t i o n ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ，d n ac l e a v a g e a n d p h o t o d y n a m i ct h e r a p y , e t c c 6 0h a sa t t r a c t e dm o s ta t t e n t i o ni nt h ew o r l d m a n yr e s e a r c h a c h i e v e m e n t sh a v eb e e ng a i n e di nt h ef i e l do ft h eb i o l o g i c a la c t i v i t ys t u d yo fc 6 0a n di t s d e f t v a t i v e s i nt h i sp a p e r ，t h ei m p o r t a n c eo fr e s e a r c ho nc 6 0w a sd e s c r i b e df r o mc 6 0a p p l i c a t i o n i nv a r i o u sf i e l d sa tf i r s t ，t h e nt h ef u n d a m e n t a ln a t u r ea n db i o l o g i c a la c t i v i t i e so fc 6 0 w e r er e v i e w e d ，a n df i n a ls o m ep r e l i m i n a r ye x p l o r a t i o n so na n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f w a t e r - s o l u b l ec 6 0d e r i v a t i v e st h a tw a sar e s e a r c hf o c u si nt h i sa r e aw e r ec a r r i e do u t s e r i e sw a t e r - s o l u b l ec 6 0d e r i v a t i v e sw e r ep r e p a r e db yc h e m i c a la d d i t i o nr e a c t i o n , t h e i r a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw e r es t u d i e dp a r t i c u l a r l ya n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea d d i t i o n n u m b e ra n dt h e i ra n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw a sr e p o r t e d i - a l a n i n ec 6 0d e r i v a t i v e s ，c a m o s i n ec 6 0d e r i v a t i v e s ，d - g l u c o s a m i n ec 6 0d e r i v a t i v e s a n dc h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d ec 6 0d e r i v a t i v e sw e r es y n t h e s i z e d t h ep r o d u c t sw e r e c h a r a c t e r i z e db yf t - 瓜，u v1 hn m ra n de l e m e n t a la n a l y s i s t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s o fc 6 0d e r i v a t i v e s ，i n c l u d i n gs c a v e n g i n ga b i l i t yo ns u p e r o x i d ea n i o na n dh y d r o x y l r a d i c a l r e d u c i n gp o w e ra n dc h e l a t i n ga b i l i t yw e r es t u d i e d 1 1 1 em a i nr e s u l t sa r es h o w n a sf o l l o w i n g ： 1 w i t hi n c r e a s eo fa d d i t i o nn u m b e r s ，s c a v e n g i n ga b i l i t yo ns u p e r o x i d ea n i o na n d h y d r o x y lr a d i c a l ，r e d u c i n gp o w e ra n dc h e l a t i n ga b i l i t yo fi - a l a n i n ec 6 0d e r i v a t i v e s i n c r e a s e d t h ei n f l u e n c eo f t h ee l e c t r o nd o n a t i n ge f f e c to f 洲o ns c a v e n g i n ga b i l i t yo n s u p e r o x i d ea n i o na n dh y d r o x y lr a d i c a l ，r e d u c i n gp o w e ra n dc h e l a t i n ga b i l i t y o f p - a l a n i n ec 6 0d e r i v a t i v e sm i g h t b em o r et h a ne f f e c to ft h en u m b e ro fc = ci nc 6 0 2 w i mi n c r e a s eo fa d d i t i o nn u m b e r s ，s c a v e n g i n ga b i l i t yo ns u p e r o x i d ea n i o na n d h y d r o x y lr a d i c a l ，r e d u c i n gp o w e ra n dc h e l a t i n ga b i l i t yo fc a m o s i n ec 6 0d e r i v a t i v e s 1 1 i 上海海洋大学硕士学位论文 i n c r e a s e d t h ei n f l u e n c eo ft h ee l e c t r o nd o n a t i n ge f f e c to f - n ho ns c a v e n g i n ga b i l i t yo n s u p e r o x i d ea n i o na n dh y d r o x y lr a d i c a l ，r e d u c i n gp o w e ra n dc h e l a t i n ga b i l i t y o f c a m o s i n ec 6 0d e r i v a t i v e sm i g h tb em o r et h a ne f f e c to f t h en u m b e ro fc = ci nc 6 0 3 w i mi n c r e a s eo fa d d i t i o nn u m b e r s ，s c a v e n g i n ga b i l i t yo ns u p e r o x i d ea n i o na n d h y d r o x y lr a d i c a la n dr e d u c i n gp o w e ro fd g l u c o s a m i n ec 6 0d e r i v a t i v e si n c r e a s e d b u t c h e l a t i n ga b i l i t yo fd - g l u c o s a m i n ec 6 0d e r i v a t i v e sd e c r e a s e d t h ei n f l u e n c eo ft h e e l e c t r o n d o n a t i n ge f f e c to f - o ns c a v e n g i n ga b i l i t yo ns u p e r o x i d e a n i o na n d h y d r o x y lr a d i c a la n dr e d u c i n gp o w e ro fd g l u c o s a r n i n ec 6 0d e r i v a t i v e sm i g h tb em o r e t h a ne f f e c to ft h en u m b e ro fc = ci nc 6 0 c h e l a t i n ga b i l i t yo fd g l u c o s a m i n ec 6 0 d e r i v a t i v e sm i g h tb em a i n l yr e l a t e dw i t ht h en u m b e ro fc - - - ci nc 6 0 4 c h i t o s a no l i g o s a c c h a r i d ec 6 0d e r i v a t i v e sh a v eg o o da n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s i nt h i sp a p e r , t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ea d d i t i o nn u m b e ra n dt h e i ra n t i o x i d a n t a c t i v i t i e sw a sr e p o r t e d i na d d i t i o n , t h e i rd i f f e r e n tr a d i c a ls c a v e n g i n gm e c h a n i s m sw e r e d i s c u s s e d k e yw o r d sw a t e r - s o l u b l ec 6 0d e r i v a t i v e s ，s u p e r o x i d ea n i o ns c a v e n g i n ga b i l i t y , h y d r o x y lr a d i c a ls c a v e n g i n ga b i l i t y , r e d u c i n gp o w e r , c h e l a t i n ga b i l i t y i v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：系次 日期：爿。年j 月f 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 学位论文作者签名： 日期：爿9 年弓月f 保密 口 在年解密后适用本版权书。 指导教师签名：盈l 、请 日期：2 彳口年多月t 日 日期：纠口年多月日 一 上海海洋大学硕士学位论文 引言 富勒烯( f u l l e r e n e ) 是2 0 世纪8 0 年代发现的一类新型球状分子【1 】，全部由碳原子 组成，是继石墨、金刚石之后，人们发现的第三种碳元素存在的晶体形态。其分 子式为c n ，目前已知n 最大可为5 4 0 ，称之为富勒烯族。在种类繁多的富勒烯家族 中，人们对c 6 0 研究最为深入，因为它是其中稳定性最高的一种。由于c 6 0 的结构特 殊并具有奇特的物理化学性质，c 6 。及其化合物的研究已成为当i j 世界各国科学家 研究的焦点和热点之一。 其实在很久以前科学家在宇宙光谱中就发现过c 6 0 ，直到1 9 8 5 年人们才 用激光的方法合成并分离得到较纯的c 6 0 ( 含c 7 0 ) 。c 6 0 是美国休斯顿赖斯大 学的史沫莱( s m a l l e y , r e ) 等人和英国的克罗脱( k r o t o ，h w ) 于1 9 8 5 年提出烟 火法而正式制得的。他们用大功率激光束轰击石墨使其气化，用lm p a 压强 的氦气产生超声波，使被激光束气化的碳原子通过一个小喷嘴进入真空膨胀， 并迅速冷却形成新的碳原子，从而得到了c 6 0 。c 6 0 的组成及结构已经被质谱、 x 射线分析等实验所证明。此外，还有c 7 0 等许多类似c 6 0 的分子也已被相继 发现。 除c 6 0 外，具有封闭笼状结构的还可能有c 2 8 、c 3 2 、c 5 0 、c 7 0 、c 8 4 c 2 4 0 、 c 5 4 0 等，统称为富勒烯( f u l l e r e n e ) 。在数学上，富勒烯的结构都是以五边形 和六边形面组成的凸多面体。最小的富勒烯是c 2 0 ，有正十二面体的构造。没 有2 2 个顶点的富勒烯，之后都存在c 2 n 的富勒烯，= 1 2 ，1 3 ，1 4 。在之些小 的富勒烯中，都存在着五边形相邻结构。c 。o 是第一个没有相邻的五边形的富 勒烯，下一个是c 7 0 。我国北京大学化学系和物理系研究小组也研制出c 6 0 分 子。目前，人们对c 6 0 分子的结构和反应的认识正在不断深入，它应用于材料 科学、超导体等方面的研究正在进行中。 c 6 0 独特的结构赋予了它特殊的物理、化学性质。如，c 6 0 衍生物可抑制艾滋病 病毒活性。c 6 0 通过光诱导产生单重态氧的效率高达近1 0 0 ，被誉为单重态氧的发 生器【2 1 。c 6 0 有3 0 个双键，可以根据需要接上多种基团，是药物设计的理想基体， 所以人们把它喻为药物设计中的“化学针插3 1 。c 6 0 极易与游离基发生反应，被喻为 l 上海海洋大学硕士学位论文 “吸收游离基的海绵”。c 6 0 的这些特性引起了人们的浓厚兴趣，近年来已有不少研究 小组开始研究c 6 0 及其衍生物的特性，特别是在清除自由基功能方面，并己取得了 一些令人鼓舞的成果。 自由基是带有未成对电子的分子或离子，具有很高的反应活性。生物体内在 自身的新陈代谢中会产生大量的活性氧自由基。正常情况下，体内氧自由基的产 生和清除是平衡的。一旦失衡，就会通过生物分子的脂质过氧化、蛋白质的变性、 酶的失活等过程伤害机体，导致衰老、肿瘤、炎症、癌变等严重疾病。及时清除 体内过剩的氧自由基，就能有效地预防、减轻或消除相关病症。利用抗氧化剂延 缓或降低人体因氧化而受到的危害，是一条十分重要的预防途径。 本文以c 6 0 制备一系n c 6 0 水溶性衍生物，全面考察它们的抗氧化性，并分析加 成基团和加成度对它们的抗氧化性的影响。 c 6 0 及其衍生物具有优异的生理活性，抗氧化作用也日益受到了广泛的关注。 如果在生物环境即水溶液环境中的溶解度得到根本解决，c 6 0 衍生物在生物、医药 领域的应用将更加开阔。随着研究的不断深入，它将可能给人类带来巨大的财富。 2 上海海洋大学硕士学位论文 第一章c 6 0 及其衍生物的生物活性研究进展 lc 6 0 的物理化学性质 1 1 1c c , o 的物理性质 由于c 6 0 晶体结构上的特点，使它呈现出许多特殊的物理性质。c 6 0 是一种黑色 粉末，密度为1 6 5 - 4 - 0 0 5g e m 3 ，熔点大于7 0 0 。它具有偶数个碳原子，对称性好， 结构稳定，易溶于c s 2 、苯、甲苯及烷烃等非极性有机溶剂中。在脂肪烃中，c 6 0 的溶解度随溶剂碳原子数的增加而增大。在不裂解情况下生成热a h f ( c ) = 2 8 0 0k j 。 电离势为2 6 1 ：1 ：0 0 2e v ，电子亲合势为2 6 2 8e v 。其高压相转变可直接形成金刚石， 也可促进金刚石成核的作用，它的这一特点很有可能成为由石墨合成金刚石的有 效催化剂或添加剂。 1 1 2c 6 0 的化学性质 由于c 6 0 分子的球形空间结构存在着离域的大共轭键，可以推断，它应具有芳 香性，能够进行一系列一般稠环芳烃所进行的烷基化，还原生成氢化物等反应。 一般来说，芳烃表现出负电子反应性，易与亲电试剂发生亲电取代反应，但实验 发现c 6 0 却反常地表现出缺电子化合物的化学反应性，它倾向于得到电子，难于与 亲电试剂反应，却易与亲核试剂如n h 3 及金属反应，它的化学行为像缺电子的烯烃 而不是富电子的芳香化合物【3 】。 2c 6 0 水溶性衍生物的制备 由于c 6 0 的碳笼结构使之具有强的亲脂性，使其在水等极性溶剂中的溶解度非 常有限，大大限制了其在生物体系中的研究和应用。为了解决c 6 0 在水中溶解性差 的问题，研究者们采取了多种方法。 1 2 1 引入极性官能基团 江贵长，郑启新等在实验室成功合成了富勒烯赖氨酸衍生物t 4 j 和, g 勒烯甘氨 酸衍生物【5 1 ，孙涛等合成7 c 6 0 1 3 丙氨酸衍生物 6 】，胡桢等合成了c 6 0 精氨酸衍生 物【7 】，孙大勇合成了水溶性富勒醇【8 1 ，都使得c 6 0 的衍生物极易溶于水中。现在水溶 3 上海海洋大学硕士学位论文 性富勒烯衍生物的制备已经得到了十分广泛的应用。 1 2 2 与环糊精等生成水溶性超分子包合产物 环糊精( c d ) 是由d 吡喃型葡萄糖基通过0 【1 ，4 糖苷键构成，通常含有6 、7 、 8 个糖单元，分别称之为q ，p ，丫环糊精。c d 分子的内空腔表面仅存在糖苷氧原子 及覆盖糖苷氧原子的氢原子，所以c d 腔内呈疏水环境，外侧面边框由于羟基的存在 而呈亲水性，这种“内亲油、外亲水”的特殊结构，使c d 作为“主体”可以包合不同“客 体”化合物。富勒烯分子全部或部分地嵌入环糊精空穴内，多数以范德华力、氢键形 成特殊结构的包合物。a ，p ，t - c d 的大孔直径大约分别为0 5 2 、o 6 6 和0 8 4 n m t 9 1 。 由于c 【，p ，丫c d 的孔径与c 6 0 范德华直径( 1 1 1 1 1 1 ) l o 的差别，目前的环糊精c 6 0 包合物 的合成研究多限于使用丫c d ，而p c d 或0 【c d 的c 6 0 包合物则相对较少。 1 2 3 纳米富勒烯颗粒水溶液的制备 最早的纳米富勒烯颗粒制备方法出现在1 9 9 4 年，s c r i v e n s 等【l i 】用1 4 c 对c 6 0 进行 标记，并研究出一种将富勒烯均匀分散在水中的方法，用其来进行富勒烯的细胞 毒性研究。1 9 9 5 年a n 嘶e v s k y 等【l2 】研究出甲苯超声法，这种方法操作简单，而且可 制备得到高浓度( 2 2m m o l l ) 的富勒烯水悬液，能稳定长达1 3 个月。2 0 0 1 年d e g u c h i 等 13 】提出用四氢呋喃溶解富勒烯后与等体积的水混合，然后向溶液中通入氮气， 直至把四氢呋喃全部从水中带走。之后，f i o r i t o 等 1 4 】对方法进行了改进，纳米富勒 烯颗粒水悬液可以稳定至少9 个月。c h e n g 等【l5 报道了纳米富勒烯颗粒水溶液的直 接搅拌法，此种方法的制备过程更接近于自然界中的条件，更能模拟富勒烯在天 然环境中与水相互作用的情况，有利于环境科学领域对自然界中富勒烯天然存在 状态进行研究。 1 3 水溶性c 6 0 及其衍生物的生物活性 1 3 1 对生物酶活性的抑制 最先发现c 6 0 衍生物的生物学效应是它对人艾滋病i 型病毒的蛋白酶( h i p r o t e a s eh p ) 的抑制作用【l6 1 ，这可能是由于c 6 0 衍生物和h i v p 的活性部位之间可 能会产生强烈的疏水相互作用，从而抑制h p 的活性。随后t o n i o l o 等【l 7 】报道一种 c 6 0 的多肽衍生物也能抑带o h b r p 的活性。 除h m 外，c 6 0 衍生物也能抑制其他酶的活性。a n d o 等【1 8 】发现：在光照条件 下，羧酸c 6 0 衍生物对半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶有抑制作用，而对组织蛋白 酶d 、酰基辅酶a 、胆固醇酰基转移酶、双酰甘油酰基转移酶、固醇生物合成酶系 统以及h i v 逆转录酶则几乎没有作用。 4 上海海洋大学硕士学位论文 1 3 2 对d n a 的选择性切割作用 t o k u y a m a 等【l9 】发现一种水溶性羧酸c 6 0 衍生物能够引起d n a 在特定位点发生 断裂，d n a 的断裂效应更具有选择性。b o u t o r i n e 等【2 0 j 人合成了水溶性的寡聚核苷 酸c 6 0 ，然后分别用含该寡聚核苷酸互补序列的双螺旋d n a 、三螺旋d n a 和带发 夹结构的三螺旋d n a 为研究对象，结果发现，断裂只发生在三种d n a 上离c 6 0 较近 的鸟嘌呤上，断裂方向在双螺旋d n a 中同寡聚核苷酸c 6 0 链方向相反，在三螺旋 d n a 结构中则与之平行。 1 3 3 对细胞生长的影响 c 6 0 及其衍生物对细胞生长有抑制或杀伤作用。t o k u y a m a 等 2 1 】将水溶性的羧酸 c 6 0 衍生物加到体外培养的人子宫颈癌细胞( h e l a ) 中，发现在黑暗中培养3 天时 对细胞生长没有影响，但用6w 荧光灯垂直照射2 次( 2 4 h 一次，每次l h ) 后，对细 胞生长则具有明显的抑制作用，其效果达到细胞毒试剂丝裂霉素的1 。c h i a n g 等 也证明水溶性多羟基c 6 0 能够抑制非正常或疾病细胞的生长。钱凯先等【2 3 】用脂质 体将c 6 0 包埋使之成为水溶性，研究它在光照下对h e l a 细胞生长的影响，发现c 6 0 对h e l a 细胞有显著的光致杀伤效应，生化测定证实膜蛋白硫基含量减少、膜脂过 氧化，同时观察到膜流动性降低、超微结构被破坏。最近，o k u d a 掣2 4 】报道一种水 溶性c 6 0 衍生物能够抑制大肠杆菌的生长，t s u c h i y a 等【2 5 】报道c 6 0 的聚乙烯吡咯烷酮 ( p v p ) 水溶液抑制体外培养的小鼠脑细胞的增殖与分化，受孕小鼠腹腔注射c 6 0 的 p v p 水溶液会严重影响胚胎的形态尤其是头部的发育。 上述研究表明c 6 0 及其衍生物对细胞生长具有抑制或杀伤作用，而另一些研究 则得到不同的结论。t s u c h i y a a - 亭【2 6 】发现c 6 0 的p v p 水溶液能够促进大鼠肢芽细胞的 软骨形成。l i 等发现【2 。7 1 ，在用5 7 0n l t i ，8 0 0m w 激光照射与c 6 0 脂质体融合的h e l a 细胞达1 0m i n 时，加入c 6 0 脂质体的h e l a 细胞密度是空白对照的两倍，显示了c 6 0 对h e l a 细胞生长的促进作用。 1 3 4 抗氧化性 人体在正常情况下自由基的产生和消除是平衡的，但在特殊的情况下体内会 产生大量过剩的自由基，过剩自由基可以使人体的细胞和组织受到损伤。因此， 清除体内多余残留的自由基，对人类的健康和生命起着非常重要的作用。 经实践研究表明，c 6 0 及其衍生物具有良好的清除自由基的作用。孙涛等【2 8 】合 成t c 6 0 邛丙氨酸衍生物，发现其对超氧阴离子自由基0 2 7 有清除能力。孙大勇等【2 9 】 制备了富勒醇并检验了其清除羟基自由基和超氧阴离子的能力，发现富勒醇对两 种自由基都有很好的清除能力，清除能力和茶多酚相仿，而且富勒醇对羟基自由 基的清除能力强于对超氧阴离子。刘绪峰等【3 0 】合成t c 6 0 吡咯烷羧酸衍生物，发现 5 上海海洋大学硕士学位论文 其对超氧阴离子的清除率最高可达到7 0 。石志强等 3 1 1 合成了多受阻酚富勒烯衍 生物，也发现其具有抗氧化性。 6 上海海洋大学硕士学位论文 第二章c 6 0 - p 一丙氨酸衍生物抗氧化性的研究 2 1 概述 b 丙氨酸亦称3 氨基丙酸，无色晶体。熔点1 9 8 ( 分解) ，溶于水，微 溶于乙醇，不溶于乙醚，可由丝胶、明胶、玉米朊等蛋白质水解并精制而成， 也可用化学方法合成，用于合成泛酸，也用于微生物学和生物化学等的研究 上。泛酸具制造抗体功能，在维护头发、皮肤及血液健康方面亦扮演重要角 色，主要功能有制造及更新身体组织，帮助伤口愈合，制造抗体，抵抗传染 病，防止疲劳，帮助抗压，缓和多种抗生素副作用及毒素，舒缓恶心症状。 制备c 6 0 - 1 3 一丙氨酸衍生物，希望它既可以能够将c 6 0 和p 丙氨酸两者良好的生物活 性结合到一起。 2 2 实验部分 2 2 1 试剂和仪器 c 6 0 ( 纯度 9 9 9 ，河南永新试剂公司) 。p 丙氨酸( 上海高信试剂有限公司) 。 h e p e s ( 国药集团化学试剂有限公司) 。f e r r o z i n e ( 美国f l u k a ) 。甲苯、乙醇、氢 氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯化铁、氯化亚铁均为分析纯。 n i c o l e tn e x u s4 7 0 红外光谱仪( 美国n i c o l e t ) 。u v 18 0 0 p c 型紫外分光光度 计( 上海m a p a d a ) 。d m x5 0 0 型核磁共振波谱仪( 德国b r u k e r ) 。m o d l l 0 6 型元 素分析仪( 意大利) 。 2 2 2c 6 0 b 丙氨酸衍生物的合成和表征 分别取4 0 0m gb 丙氨酸和2 0gn a o h 溶于1 2m l 去离子水中，加入8 0 0m l 无 水乙醇，搅拌下缓慢滴加c 6 0 甲苯溶液( 2 5 0 0m g 2 5 0 0m l ) ，室温下搅拌5d ，至 有机层中紫色消失。分液移去无色有机层，将黑色溶液层用蒸馏水稀释，然后再 加入无水乙醇使产物沉淀，继续将产物用水和无水乙醇反复沉淀，在4 0 下经真 空干燥得到黑褐色固体粉末a 。将p - 丙氨酸的用量分别改为2 0 0 0m g 和2 5g ，重复 上述实验，分别得到黑褐色的固体粉末b 和c 。 7 上海海洋大学硕七学位论文 霪+ n h 2 c h 2 c h 2 c o o h 骂 c h 2 c h 2 c o o n a 】n 对产物a 、b 和c 进行f t - i r 、u v 、1 hm n r 和元素分析测试表征。红外光谱采 用r , l b r 压, 片法制样，测定波数范围为4 0 0 4 0 0 0c r n 一，分辨率为0 8 锄。紫外光谱， 测定波数范围为2 0 0 - - - 8 0 0n l i l ，分辨率为0 5n l t i 。核磁共振，5 0 0 m h z ，溶剂d 2 0 。 2 2 3 超氧阴离子清除能力的测定【3 2 1 用p h - - 1 0 2 0 的0 5m o l l n a 2 c 0 3 - n a h c 0 3 缓冲溶液配制浓度为1 5 x 1 0 。3m o l l 的鲁米诺溶液，用lx 1 0 3m o l l 的盐酸配制浓度为o 1m o l l 的邻苯三酚储备液， 使用前用去离子水稀释至l x l 0 4 m o l l 。以缓冲液作为溶剂，配制成不同浓度的样 品溶液。用流动注射化学发光分析仪依次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积。 清除率= ( a o a i ) a o 1 0 0 。 式中为空白溶液峰面积；a i 为样品溶液峰面积。 经s o d 、过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基为超氧阴离子0 2 一。 2 2 4 羟基自由基清除能力的测赳3 2 】 用p h = 7 4 0 的o 0 5m o l lk h 2 p 0 4 - n a o h 缓冲溶液分别配制浓度为6 4 x 1 0 4 m o l l 的鲁米诺溶液、0 0 1 2m o v lh 2 0 2 和o 8r a g m e 亚铁氰化钾溶液。以缓冲液 作为溶剂，配制成系列不同浓度的样品溶液。然后用流动注射化学发光分析仪依 次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积。 清除率= ( a o a i ) a o 1 0 0 。 为空白溶液峰面积；a i 为样品溶液峰面积。 经s o d 、过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基羟基自由基o h 。 2 2 5 还原能力的测定 还原能力测试根据文献 3 3 】测定并稍做改进。取2 0m l 不同浓度的样品，加入 p h 为6 6 0 的o 2m o v l 磷酸缓冲液和l 铁氰化钾溶液各2 5m l ，混匀。5 0 水 浴2 0r a i n 后迅速冷却，加入2 5m l1 0 - - 氯乙酸溶液，混匀后在3 0 0 0r m i n 下离 心1 0m i n ，取上清液2 0m l ，加入2 5m l 去离子水和o 5m l0 1 的三氯化铁溶 液，静置十分钟后在7 0 0n l n 处测定吸光度。 2 2 6 金属螯合能力的测定 按文献【3 4 】法稍加修改测定反应产物的金属螯合能力。取一定浓度的样品溶3 5 m l ，加入0 1m l2m m o l l 的氯化亚铁溶液和0 2m l5m m o l l 的f e r r o z i n e 溶液， 混和均匀。混合液室温静置10r a i n ，并于5 6 2n 1 1 1 处测定其吸光度。用下式计算其 上海海洋大学硕士学位论文 金属螯合能力： 螯合能力( ) - 1 - ( a i a j ) a o 1 0 0 式中，表示用水代替样品所测得的吸光度；a i 表示样品所测得的吸光度； a j 表示样品本身的吸光度。 2 3 结果与讨论 2 3 1 结构表征 8 c 量 磊 c 芒 w a v e n u m b e r s ( c m 1 ) f i g 2 。1i n f a r e ds p e c t r u mo fp - a l a n i n ec 6 0d e r i v a t i v e s 图2 - 1c 6 0 1 3 丙氨酸衍生物的红外谱图 c 6 0 - 1 3 丙氨酸衍生物的红外图谱的如图2 1 所示：三种衍生物均有在5 2 6c i l l 。1 处的吸收峰( c 6 0 的特征吸收峰) ，1 0 6 6c n - i 以处的吸收峰( n c 6 0 ) ，1 4 0 0 c m d 处的 吸收峰( c o o 。) ，1 5 6 0c i i l 以处的吸收峰( c n ) ，3 4 1 4c l t i 。1 处的吸收峰( n h ) ，c 6 0 - 1 3 丙氨酸衍生物a 、b 和c 红外表征结果与文献 3 5 】报道的一致，表明合成出的产物 都是c 6 0 b 丙氨酸衍生物。 9 o u c 日 口 - o a 2 o 1 5 1 0 0 5 0 0 上海海洋大学硕士学位论文 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 07 0 08 0 0 w a v e n u m b e r s ( n m ) f i g 2 - 2u v - s p e c t r o g r a mo fc 6 0 ，1 3 - a l a n i n ea n d 3 - a l a n i a ec 6 0d e r i v a t i v e s 图2 - 2c 6 0 、肛丙氨酸和c 6 0 - 1 3 - 丙氨酸衍生物的紫外谱图 1n i 舢 f i g 2 31 hn m r o f1 3 a l a n i n ec 6 0d e r i v a t i v e s 图2 - 3c 6 0 - 1 3 一丙氨酸衍生物的1 hn m r 图谱 t h 哪呐 叫e r - 晰 日ml u l 糟- _ n k _ t a 一- l _ - ，u l _4 11)i囊 l h_ 一 一 删m e m f mm 冒 -j 啊- 一 a n a - l * 一 i f 时一一 im t i i - m - _ _ _ 一i ”。_ _ 一 a埘 ni i - - u，l 9 1 1 1 _ t 簟柚t 嗽 盯啊 r_ u 托t _ - 嵋l 一 - l 曩一m h 曩盘舶 玎l l m l l 一- ， j 一 hi r a - 且 _ d ，k _i 哪柙 瞄- i i 抽 上海海洋大学硕七学位论文 c 6 0 、1 3 - 丙氨酸和c 6 0 - p 一丙氨酸衍生物的紫外图谱如图2 2 所示：p 丙氨酸和 c 6 0 - 1 3 丙氨酸衍生物在2 1 0 r i m 处附近都有吸收峰，c 6 0 在2 9 6r i m - 1 处和3 5 3a m 1 处 有吸收峰，说明c 6 0 - 1 3 丙氨酸衍生物保留了p 丙氨酸的吸收峰，但在c 6 0 原有吸收 峰处发生了改变。 c 6 0 - 1 3 - 丙氨酸衍生物的1 h n m r 图谱( d 2 0 ，5 0 0 h z ) 如图2 3 所示：在1 1p p m ，2 3 p p m ，3 4p p m 处的吸收峰是c 6 0 h 的吸收峰。 元素分析结果显示，c 6 0 - 1 3 丙氨酸衍生物a 、b 和c 的与c 6 0 上连接的p 丙氨 酸的平均数目分别是2 ，4 ，8 ( 计算值分别为1 8 8 ，4 0 4 ，8 0 0 ) 。 2 3 2 超氧阴离子清除能力 超氧阴离子0 2 。是一种毒性很大的活性氧，可通过很多生物体内反应或光化学 反应产生【3 6 】，抗氧化剂通过氧化或还原反应抑制自由基的产生或直接清除自由基。 c 6 0 b 丙氨酸衍生物a 、b 、c 和p 丙氨酸的超氧阴离子清除能力如图2 4 所示： 随着浓度的增加，c 6 0 1 3 丙氨酸衍生物a 、b 和c 的清除率随之增加，超氧阴离子 清除能力逐渐增强。在这个检测体系中，p 丙氨酸在这个浓度范围内几乎没有超氧 阴离子清除能力。c 6 0 1 3 一丙氨酸衍生物a 、b 和c 的半抑制浓度分别是1 6 m m o l m l 、 0 8 7m m o l m l 和o 3 0m m o l m l 。 三种c 6 0 p 丙氨酸衍生物对超氧阴离子的清除能力有一定的差别，表现为 c b a ，而这种差别的出现与加成基供电活性、空间位阻、c 6 0 - 1 3 丙氨酸衍生物母 体c 6 0 上保留的c = c 双键的数目等因素密切相关。富勒烯的化学研究表明，c 6 0 与自 由基的反应以c = c 双键的加成为主【3 7 l ，而1 3 丙氨酸本身并不具备清除超氧阴离子的 能力。c 6 0 具有缺电子烯烃性质，它容易与胺( 伯胺、仲胺) 发生多加成反应形成 胺加成产物。c 6 0 胺化反应的加成度主要为5 8 ，加成一般为6 6 键上的1 ，2 - 力口成， 是由于空间位阻的关系也可能生成1 ，4 - 力日产物。发生加成后，加成基团将分布于 c 6 0 球体上，而且p 丙氨酸与c 6 0 以- n i - - i 基相连，而- n h 基是一个强的供电子基团， 它的供电效应可能会使具有不饱和烯烃性质的c 。o 上7 c 键的电荷密度增大，从而更利 于超氧阴离子的进攻，与此同时，由于p 丙氨酸的加成，使得c 6 0 分子中兀键数目减 少、空间位阻加大及形成囊泡状聚集体结构，这些因素将对c 6 0 - 1 3 丙氨酸衍生物的 超氧阴离子清除能力产生不利影响。故c 6 0 一1 3 丙氨酸衍生物清除超氧阴离子的性能 是加成基团供电效应、空间位阻和c 6 0 1 3 丙氨酸衍生物母体c 6 0 上保留的c = c 双键的 数目等因素共同作用的结果【3 引。 三种c 6 0 b 丙氨酸衍生物的超氧阴离子清除能力的大小顺序为c b a ，说明 在这个体系中，可能n h 基的供电效应对c 6 0 - 1 3 丙氨酸衍生物的超氧阴离子清除能 力的影响大于c = c 的剩余数量等因素的影响，即随着加成度的增加，c 6 0 1 3 丙氨酸 上海海洋大学硕士学位论文 衍生物的n h 基团增多，c 6 0 b 丙氨酸衍生物的超氧阴离子清除能力增强。 1 0 0 7 5 5 0 2 5 0：加 一至 | 扩一卜1 3 a l a n i n ec 邡d e r i v a