（动物学专业论文）中国对虾性别相关dna片段的克隆研究.pdf

中国对虾性别相恙d n a片段的克隆研究_- 一 一 一 一 舀 医 登 摘 要 本研究采用 d n a减法杂交技术， m r n a 单随机引物差异显示技术及 m r n a双随机引物差异显示技术分离中国对虾性别相关片段。利用 d n a减 法杂交技术，我们分离到了 一个 9 0 0 b p左右的片段， 但 s o u t h e r n杂交分析 证明其不具性别相关性。通过 m r n a 单随机引物差异显示技术，我们初步 分离到了9条差异表达片段， 通过 m r n a双随机引物差异显示技术分离到 2 9条差异表达片段。继而采用这些双引物的组合对中国对虾基因组 d n a进 行了 p c r 扩增检测，发现其中二对引物组合可扩增出具雌性相关性片段。 乙 有 关 这 二 条 片 段 的 进 一 步 验 证 工 作 正 在 进 行 中 厂 关键词:d n a减法杂交、mr n a差异显示、中国对虾、性别相关片段 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究a b s t r a c t ab s t r a c t t h e c l o n i n g o f t h e s e x - r e l a t e d d n a f r a g me n t s o f c h i n e s e s h r i mp p e n a e u s c h i n e n s i s dna subtrac ti ve hybri di zati on. s i ngle pri mer and double p ri mer mrna di ff erenti al di s p lay related d n a f ragments of 9 0 0 bp f r agment had be en t e c hn i q u e s we r e u s e d t o i s o l a t e t h e s e x - c h i n e s e s h r i m p p e naeu s c hi ne ns i s . a clonrd f rom the p roduc ti on of dna s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n, b u t t he r e s u l t s of s ou t h e r n- b l o t t i n g s how ed that the f ragment co uld hybri di ze w i th both m ale an d fem ale genomi c dn a. by the methods of s i ngl e- p ri mer mrna ddrt- pcr a nd d ou b l e - p r i m e r mr na ddrt - p c r, we h a v e i s ol a t e d 9 a n d 2 9 d i f f e r e n t i a l di s p lay f ragments . the relati on of thes e f ragments wi th the s ex was anal yz i ng by the methods of nor t her n- bl otti ng and s ou the rn- bl otti ng. als o s ome s elected double一 p ri mer p ai rs were us ed to amp li f y t h e g e no mi c dna of s h r i mp , a n d t wo p a i r s s h o we d t h e p o s s i b i l i t y f o r the s ex determi nati on of chi nes e s hri mps .k e y wo r d s : p e n a e u s c h i n e n s i s , d n a s u b t r a c t i v e h y b r i d i z a t i o n , m r n a d i f f e r e n t i a l d i s p l a y , s e x - r e l a t e d d n a f r a g m e n t i i 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究前言 前 言 中国对虾为甲壳纲十足目 对虾科对虾属的一种，分布于黄渤海及南海部 分海域。由于其营养价值高，风味鲜美而深受消费者的喜爱，成为我国重要 的经济海产品和出口海产品之一，年产量占了全国海产对虾年总产量的 8 0 %。中国对虾较能耐低温，人工控制条件下可以达到性成熟和产卵，适于工 厂化育苗，因此近年来己在我国沿海地区开展了大规模的养殖，成为了我国 主要的海水养殖品种。随着海洋资源的过度开发以及世界市场对虾需求量的 增加，养殖虾在世界市场中所占份额愈来愈大，到目前为止己经超过了总上 市量的2 8 %，约 7 0 万吨，其中中国对虾占了 1 8 %。对虾养殖已成为我国当 前海水养殖中生产规模最大、产值最高、出口换汇最多、经济效益最显著的 一个行业。同时对虾养殖业的发展也带动了贝类养殖业、饲料加工业、以及 育苗、冷藏、运输、销售等其它服务行业的蓬勃发展。可以说对虾养殖业已 经成为我国许多地区的重要经济支柱( 李洪宾，1 9 8 6 ;杨竹舫，1 9 8 8 ;) 。 然而，中国的对虾养殖业在经过一段时间的蓬勃发展后，暴露出了许多 急待解决的问题: 首先，目前养殖的种类均为未经系统遗传选育的野生种类， 尚未形成养殖品系;其次，高密度集约化养殖单一生产模式的推行，在短期 内提高了产量，但同时也带来了养殖水体环境恶化所产生的灾难性后果，对 虾流行病在世界范围内的流行，致使养殖产量锐减，至今尚无有效对策，严 重限制了养殖业的进一步发展。根据联合国粮农组织预测，2 0 0 0年世界养 殖虾产量将超过 1 0 0万吨 ( 吴维宁，1 9 9 7 )。中国的对虾养殖业能否抓住机 遇，加快发展，占据领先地位，利用现代生物学技术和现代养殖技术，选育 适于高密度集约化养殖的养殖品种，提高养殖效率，将是一个关键的问题。 这一问题的解决有赖于许多对虾生物学基础研究和对虾养殖实践生产技术的 进展。对于中国对虾这种具有异型性别及具有显著性别差异的甲壳动物来 说，有关其性别决定机制和对虾性别控制问题的研究是中国对虾现代养殖技 术中非常重要的一环，具有重要的理论意义和实际应用价值。 中国对虾及其他甲壳动物性别决定机制:研究现状及问题 在甲壳动物中，性别决定机制和性别分化发育机制在不同的类群之间差 别很大。有些种类受外界环境因子的影响较大，如等足目一些种类中，有的 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究前言 进行单性生殖， 在行孤雌生殖的类群中为多倍体生殖， 其性别多受群体密度、 环境温度及营养状况等因子决定。端足目 钩虾属的迪氏钩虾对光期敏感，夏 季孵化出的个体多为雄性，秋季孵化出的个体多为雌性，它们的性别决定机 制都属于环境性别决定的模式，性别的决定仅仅是在受精后，由外界条件影 响到主导基因的激活，从而决定了选择的方向。但大多数甲壳动物的性别决 定机制和许多其它动物一样，是属于基因型性别决定模式，性别的决定是由 受精时的偶然性而完成的，尽管对于其中的大多数人们还不知道起到决定作 用的 基因是哪些 ( l e g r a n d e t . a l . , 1 9 8 7 ; 康 现江、王所安，1 9 9 8 ) 0 传统的异配性别决定研究方法主要有以下三种 ( l e g r a n d e t . a l ., 1 9 8 7 ) : i 、通过细胞学方法，寻找异型性染色体。在一些高等甲壳动物中，与 性别决定有关的基因集中位于一条染色体上，这条染色体因与性别决定有直 接的关系而被称为性染色体。性染色体进化到较高的阶段，在形态和复制行 为上会和其他与性别决定没有直接联系的那些所谓的常染色体分开，通过细 胞学研究手段可以清楚的看到它们的存在。目前在介形类中2 个种、挠足类 中 1 4个种、端足类 1 个种、等足类中 1 个种、十足类中8个种中发现有异 形性染色体。 其中多数为雄性异配 ( e x y 型)也有少数雌性异配 ( 早 z y p 型) 。 但在大多数甲壳动物中，还没有发现异形性染色体 n i i y a m a , 1 9 5 9 ) o 2 、通过寻找与性别相关的外部形态标记如体色等。但除少数种类之外， 大部分甲 壳动物不具有这种外部标记 ( l e g r a n d e t . a l ., 1 9 8 7 ) e 3 、促雄腺的摘除以测定杂交后代的雌雄比例。促雄腺是甲壳动物所特有的 内分泌腺，可分泌促雄性化激素，诱导性别分化和促进精子及雄性第二性征 的形成。c r o n i n首先报道了软甲纲优游蟹属雄蓝蟹具有促雄腺，而促雄腺 的功能则有 c h a r n i a u x - c o t t o n阐明( 转引自康现江、王所安，1 9 9 8 ) 。软甲 亚纲雌雄异体的种类在幼体性别未分化时均有促雄腺原基。如果性别决定的 机制是由等位基因控制的话，可以简单的推测促雄腺的发育有一对等位基因 m / m控制。如果雄性个体是异型配子，m基因控制促雄腺的发育，促雄腺原 基可以继续发育，并分泌激素控制精巢和第二性征的发育。在遗传雌性个体 中，其性别控制基因为 m / m ，促雄腺原基不发育，生殖原基分化为卵巢，并 分泌激素诱导暂时的和永久的雌性第二性征;若雌性个体是异型配子，则 m 基因抑制促雄腺原基的发育，在雄性个体中则不受抑制。利用手术操作，可 以将促雄腺摘除，观察其对受术性别发育的影响，以推测性别决定的机制。 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究前言 s a g i等人对罗氏沼虾进行了一系列的促雄腺摘除性逆转及交配实验，从得 到的后代的性别比例说明了罗氏沼虾的性别机制为 z ， 型。并且s a g i 等人还 认为在罗氏沼虾性别操控实验中的不同结果说明它的性别决定机制并不是简 单的占 z z / 早z ，型，同时还有修饰基因 ( m i n o g e n e s )在起作用，其性别是 主基因与修饰基因的共同作用决定的( ， s a g i e t . a l , 1 9 8 6 , 1 9 9 0 a , 1 9 9 0 b ) o 但在中国对虾性别决定研究中，上述几种方法基本上很难进行。对虾染 色体既小又多，很难从中找出异形性染色体 ( 相建海，1 9 8 8 ;戴继勋，1 9 8 9 ; 相建海等，1 9 9 1 ) ;中国对虾在幼体发育早期没有与性别相关的外部形态特 征;大量进行促雄腺摘除、移植实验也很不现实 ( 李富花、相建海，1 9 9 7 ) a 因此现有的研究结果不能明确说明中国对虾有性染色体的存在，但也不能肯 定的否定性染色体的存在。中国对虾自然种群和养殖种群的性比均接近 1 ; 1 ，另外，软甲亚纲，尤其是十足目的许多相近种类，己经发现了异形性染 色体。并且即使没有异形性染色体，性别遗传也不一定就没有性染色体遗传 机制。如等足类的 a r m a d i l l d i u m v u l g a r e至今没有找到异形性染色体，但 是，它的性别严格按-7 z w - a z z 的雌性异配机制遗传，跳钩虾则按1 x x - 3 x r 雄性异配遗传 ( 吴仲庆，1 9 9 0 ;康现江、王所安 1 9 9 8 ) 。中国对虾也可能存 在这种情况。一些实验也表明其性别决定机制应属于遗传决定型的，属等位 基因控制( 杨丛海等，1 9 9 3 ) . 综上所述，有关中国对虾性别决定控制和性别分化的问题尽管有一些涉 及，但远没有得到一个清晰的答案，仍然需要有大量的工作，并需要引进新 的研究方法。 性别控制:对虾养殖生产中的重要意义、技术及面临的问题 对于雌雄异体的动物来讲，两性之间的差异不仅体现在生殖器官，在其他特 征上也能表现出差异，例如个体的大小、外表的装饰及某些行为特征等，表 现出所谓的性别二态现象。对虾属种类中这种性别二态现象为突出。例如中 国对虾，雌体一般比雄体大，生长也快。据统计，在同等养殖条件下的中国 对虾，当雌体平均长度达到 1 8 - 2 3 c m 、体重 6 0 - 8 0克时，雄体只有 1 5 - 2 0 c m , 体重3 0 - 4 0 克，雌虾平均比雄虾重一倍以上。相反，罗氏沼虾在性成熟后， 雄虾个体明显大于雌虾。性别不同，不仅生长速度不同，而且在上市规格、 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究 前言 等级也不同，这会极大的影响养殖经济效益，因此，养殖生产中希望能够进 行单性全雌养殖。这种对经济利益的追求促进了虾类性别控制研究的发展， 也是性别研究的基本动力。性别的控制已经成为了水产养殖业的重要手段之 一，单性群体的应用可以使人类最大限度的利用某些生物的性别差异。通过 对单性的育种和不育技术，可以有效地控制养殖动物的繁殖，改善商品产物 的规格，改良品种，提高渔业产量和经济效益。并且，性别控制也是育种的 重要手段之一。 甲壳动物的性别控制研究起步较晚，许多方法和技术均是借鉴在鱼类中 成熟的方法( 邱高峰， 1 9 9 8 ;楼允东，1 9 8 4 , 1 9 8 6 ) .目前主要集中在以下一 些方面: 1性激素处理法 性激素处理法是鱼类性别控制的有效途径之一，通过在饲料中加入性激 素来达到性逆转的目的 ( 高连勇等，1 9 9 2 ) 。但与鱼类不同，脊椎动物的性 激素并不能使对虾类产生性逆转，只能促进其性腺发育和幼体生长，这点已 由国内外学者们大量的实验所证明 ( 昊仲庆，1 9 9 0 ) . 2促雄腺手术移植或摘除法 促雄腺是甲壳动物所特有的内分泌腺，可分泌促雄性化激素，诱导性别 分化和促进精子及雄性第二性征的形成 ( 邱高峰等，1 9 9 7 ) 。摘除促雄腺后， 可以使得雄性个体雌性化，雌体移植造雄腺后，可使雌体雄化。我国学者也 发现并证明了包括中国对虾在内的多种十足类均具有造雄腺( 李霞、 李嘉泳， 1 9 9 3 ) ，并初步开展了促雄腺的手术操作工作 ( 李富花 相建海，1 9 9 6 ) 0 3人工雌核发育: 雌核发育可以在短期内建立自交系或纯系，一方面可以直接用于单性化 养殖，另一方面还可以用于杂交育种 ( 杨永锉，1 9 9 0 ) 0蔡难儿等 ( 1 9 9 4 ) 采用同研究鱼类人工诱导雌核发育相类似的方法，己经首次诱导出中国对虾 雌核发育个体 ( 3 - 3 . 5 c m幼虾) ，最高诱导率3 7 . 2 9 6 0 4环境因子控制法: 环境因子不但可以改变染色体的倍性，还可以影响某些动物的性别决 定。杨丛海等 ( 1 9 9 3 )用高温处理中国对虾的受精卵，改变了对虾群体的性 别结构，培养至成体后随机抽样的结果证明其雌雄比例为 2 . 4 4 : 1 ,显示可 能对中国对虾的性比产生影响，但其机制乃至有效程度仍需要进一步证实。 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究前言 然而，利用这些方法直接生产大规模养殖用的单性群体是不现实的， 因为雌核发育和环境因子控制法不能保证 1 0 0 % 的单性率，而促雄腺手术移 植或摘除法也只能对少量的个体进行操作，不能大规模的应用于生产。从技 术水平和发展趋势来看，先利用促雄腺手术移植或摘除法产生性别表型逆转 而基因型不变的性反转个体，利用鱼、虾类性反转个体具有正常生殖功能的 特性，使性反转个体和正常性别的个体进行交配来产生用于养殖生产的全单 性的后代，将是一个很有前途的途径。罗氏沼虾性反转的研究为我们提供了 一个很好的例子。n a g a m i n e等 ( 1 9 8 0 )和 m a l e c h a等 ( 1 9 9 2 )用移植促雄 腺的方法成功的获得 了性反转 罗氏沼虾性反转雄性个体，s a g i等 ( 1 9 9 0 a , 1 9 9 0 b )用去促雄腺的方法得到性反转雌性个体，这些性反转个体 可以具有正常的性功能，并能同性正常个体交配。用性反转雄性个体和正常 雌性个体交配，可以获得雌性个体比例高的群体，用性反转雌性个体与正常 雄性个体交配能够很容易的获得全雄群体，因而可达到控制性比的目的。 理论上，中国对虾可以通过与罗氏沼虾一样的方法进行全单性群体的 生产。但要建立一套成熟的生产工艺，除必要的促雄腺操作技术之外，可能 还需要满足两个条件，第一个是增加对中国对虾的性别决定机制的了解，第 二个也是较为重要的一个，是建立一种准确区分性表型一致而基因型不同的 个体的方法，也即能够区分性反转个体和正常个体的方法。如果无法区别性 反转个体和正常个体，这种单性化生产技术就无法运用于生产实践。 由此，我们可以认识到，无论是中国对虾性别决定机制研究，还是性别 控制方法研究，都需要一种能够准确检测性别的手段。 分离性别特异 ( 相关)dn a片段:意义及技术路线 如上所述， 无论是中国对虾性别决定机制研究， 还是性别控制方法研究， 都需要一种能够准确检测性别的手段。然而，具体到中国对虾，乃至大部分 甲壳动物、大部分硬骨鱼类，一些传统的性别决定研究方法很难取得进展， 引入新的研究方法势在必行。 分子生物学技术的发展，给研究者提供了许多新的手段，也使研究者能 在新的层次对性别决定机制和性别控制问题进行研究。d n a减法杂交技术和 m r n a差异显示技术分离性别特异 d n a ( c d n a )片段就是 目前能够应用于这一 研究领域的、较好的两种方法。通过这些方法分离得到的片段，可以是一些 在性别决定、性别分化过程中起决定性作用的基因，也可以是在长期进化过 程中累积在染色体上的一些重复序列片段。研究者分离到这些片段后，可以 将它们作为分子标记用于基因作图; 可以在测定序列后， 设计引物， 利用p c r 技术进行性别鉴定;并且可以对具有基因编码功能的片段加以改造，利用转 基因技术生产特定的转基因生物。因此，性别特异 d n a ( c d n a )片段的分离 可推动性别决定理论的研究进程 ，并能直接应用于性别控制工作中某些重要 的环节 。 减法杂交的原理及应用: 减法杂交是 9 0年代初露头角的新技术 ( 朱玉贤1 1 9 9 3 )。它可以在没有 任何探针材料的情况下，由研究突变体的表现型入手，从亲本材料中克隆与 突变体缺失片段相对应的遗传性状，包括许多对高等动植物生长发育影响重 大的基因或基因群。它主要是利用许多缺失突变体与其未缺失同源亲本只有 1 - 2 个 d n a片段的差异，当大量的特殊标记的突变体 d n a与少量未缺失同源 亲本相混合、变性后在适当的温度下复性，待反应体系中的单链 d n a 分子配 对成为双链后，再除去标记的突变体 d n a和与之杂交配对的亲本 d n a 。反复 数次后，反应体系中只剩下突变体核 d n a中所缺失的那一段亲本 d n a由于无 法与任何突变体d n a形成杂合体而保留在溶液中。反应体系之中的d n a 片段 在通过p c r 扩增后可有效地克隆到载体中，以进行一系列的分析或直接作为 探针使用 。 根据性染色体进化的假说，不同的性染色体原本是一对同源染色体，其 序列组成基本一致。在长期的进化过程中.一条同源染色体上的某些基因的 编码序列和功能发生改变，成为与性别决定具有直接关系的基因。当这种变 化积累到一定程度之后，整条染色体的组成、形状发生改变，不再能够和原 来的同源染色体发生同源重组，形成所谓的异形性染色体( b r i a n , 1 9 9 1 ) 。这 条染色体的某些基因相当于其同源染色体上原有基因的突变体，因此可以利 用 d n a减法杂交手段进行性别特异序列的筛选。 l a m e r 与p a l m e r ( 1 9 8 4 ) 采用这一方法成功地组建了一个富含 y 染色体特 异性d n a 片段的小鼠肝细胞d n a 文库。他们把 l w g 经过超声波处理的、平均 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究前言 长度为5 0 0 b p 左右的雌性小鼠d n a与1 0 t g 经过m b o i 酶切的雄鼠d n a 混合后 变性 ( 1 0 0 0c, 3 m i n )再复性 ( 6 5 -6 8 c)到 c o t = 1 3 2 0 。复性后的 d n a通过 轻基磷灰石柱层析， 将回收到的双链d n a 纯化后经酶切后去磷酸化的p b r 3 2 2 质粒载体相连，并按常规方法转入h b 1 0 1 感受态细胞中筛选重组基因。经过 对用杂交相减后 d n a组建的文库进行分析后，发现大约有 2 5 % 的菌落含有 5 0 0 6 p以上的外源 d n a 片段。以” 2 p 标记2 4 个这样的质粒 d n a 作为探针，分 别与雄鼠和雌鼠肝细胞 d n a杂交，发现其中有 3个 ( 1 2 9 6 )不与雌鼠d n a杂 交， 被认为含有 y 染色体片段。 根据这个比例， 作者认为他们得到了大约 3 0 0 0 个由y染色体编码的基因片段。 k u n k e l等 ( 1 9 8 5 )用单轮杂交法克隆到数个不存在于 x染色体部分缺 失病人核 d n a中的序列。他们在反映体系中增加了7 % 的苯酚、7 . 2 5 m o 1 / l 高 氯酸钠。根据 k o h n e 等人 1 9 7 7 )的报道，溶液杂交中加入少量的苯酚，可 以使杂交速率提高数万倍。通过克隆复性后仍具有 m o b 工末端的双链 d n a片 段，得到了 8 1个不同的重组质粒，并从中发现了 4个不与 x染色体部分缺 失的核 d n a杂交的片段。 在异形性染色体不明显的种类中，利用 d n a减法杂交技术也成功的分 离到与性别相关的片段。 大鳞大麻哈鱼雌鱼具有很大的养殖优势。 在生产中， 可通过性反转的假雄鱼( a x x ) 与正常雌鱼( 9- x x ) 杂交，以得到 1 0 0 % 的全雌 子代。 但是， 与大多数硬骨鱼类一样， 大鳞大麻哈鱼不具明显的异形染色体， 由于无法从体表或用细胞学的方法来真雄鱼 ( a x y )和假雄鱼 ( s x x )，就 使得这一单性化技术无法应用( 张兴忠， 1 9 9 0 ) 。 1 9 9 1 年， d e v l i n 等( d e l v i n . 1 9 9 1 )利用 d n a减法杂交技术分离到一个 d n a片段，并通过 s o u t h e r n杂交 证明它只在雄性 d n a中存在，并且从父代向子代遗传。他们还利用得到的片 段序列，设计了一对聚合链式反应引物，可以方便的进行性别检测.现已广 泛应用于商业领域，促进了大鳞大麻哈鱼单性控制技术的发展。 m r n a差异显示技术( d d r t - p c r ) 的原理及应用: 高等生物一般具有 1 0 “ 个不同的基因，在单个细胞或个体中仅有约 的基因得到表达。正是由于基因的差别表达，决定了所有的生命过程。 1 5 % 比较 不同细胞或基因型的基因 ( m r n a )表达， 鉴别这些 m r n a差异的通用方法是借助 为我们 了解生命过程打开了大门。 m r n a的差减杂交技术，然而这种技 术花费大、时间长、重复性和效率都较差。同时 “ 管家基因”的组成性转录 常常会掩盖不同细胞或组织之间的 m r n a表达的差异，因此只有那些中丰度 表达的基因才有可能被筛选出来( 陈中健、 王金发， 1 9 9 8 ; 王学、 徐静 1 9 9 8 ) e 1 9 9 2年由 l i a n g和 p a r d e e 创立的m r n a差异显示技术从一定程度上解 决了这一难题。它利用 p c r技术将差异放大，并通过电泳分离，这样就使差 异变的直观，易于分离。该技术主要基于以下原理: 所有的 m r n a分子 3 端都带有 p o i y ( a ) 尾部，而在 p o l y ( a ) 前面的两个 碱基除 a 外，只有 1 2 种组合 紧邻 p o i y ( a ) 的碱基有三种可能c , g , t ， 第二 个碱基可为 a , g , c , t 。人工合成的 o l i g o - d t引物后面接上组合中的两 个碱基， 用于反转录反应， 可以获得1 / 1 2 的。 d n a 群。 然后用一个5 端1 0 - m e r 随机引物，3 末端用相应反转录引物进行 p c r法扩增每份 。 d n a 。因为这个 5 引物将随机结合在 c d n a上，因此来自不同 。 r n a的扩增产物的大小是不 同的，可以在测序胶上明显分辨出来。在 p c r 反应中加入带放射性同位素标 记的脱氧核糖核昔酸，电泳后对 x 一 光片曝光，或不加同位素，而将 p c r产 物电泳后用银染显示，就可以发现一对细胞群体中有显著差异的d n a 片段。 这些有差异的片段经再扩增后，可用于克隆分析，或用作探针，从 c d n a文 库或基因组文库中筛选出全长的c d n a或基因组克隆。 m r n a差异显示技术结合了差减 c d n a克隆和 p c r技术的优势.成为一 种直观筛选差别表达基因的新方法。从 1 9 9 2年问世到现在的 7年多时间里 己广泛应用于分析基因表达差异，绘制遗传图谱，分离特异性表达基因，临 床诊断疾病等方面( 陈中健、王金发， 1 9 9 8 ) 。人们己用这种方法成功地从 哺乳动物细胞中，分离了与细胞扩增有关的基因 ( l i a n g e t . a l . , 1 9 9 4 )、 癌变相关基因 ( s o t i r o p o u l o u , 1 9 9 7 ) 、及发育过程中不同阶段特异表达的 基因 ( z i m m e r m a n n , 1 9 9 4 ; c o n w a y , 1 9 9 5 ;a d a t i , 1 9 9 5 )。 l i a n g等 ( 1 9 9 2 )最初提出的 m r n a差异显示技术程序后来得到一些发 展，主要在于反转录和 p c r 扩增时所使用引物的变化( l i a n g e t a l , 1 9 9 4 ) 0 目 前己1m 造出只要用 3种 o l i g o - d t引物即 t , 3 a , t , 3 g , t , 3 c就可进行 二 r n a 差异显示分析，大大减少了引物组合，提高了效率。同时也发明了利用双随 机引物对反转录产物进行扩增、利用琼脂糖凝胶进行分离的方法，使一般实 验室也可使用这一技术( s o k o l o v , 1 9 9 4 )。 性别决定也是基因差异表达的结果，同时个体在性别分化以后，也有 一些特异的基因转录活动维持其特异的与性别相关的生理活动。因此，利用 m r n a 差异显示技术也可以分离到一些与这一过程有关的基因。 本工作将利用 d n a减法杂交技术、m r n a差异显示技术筛选出与中国对 虾与性别相关的 d n a片段或 c d n a片段。这一工作的开展，将有助于中国对 虾性别决定机制的研究，也将为性别控制技术的发展应用提供理论和技术的 支持。 材 料 与 方 法 d na减法杂交 实验材料与试剂 动物材料 实验所用中国对虾取自中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验 室水族馆。个体平均体长为8 . 4 c m ，平均体重为 1 5 . 7 g . 酶制剂 蛋白酶k为 s e r v a公司制品，限制性内切酶 s a u 3 a i . b a m h i . e c o r i . h i n d i ii , t a d n a连接酶均为 p r o m e g a公司产品，购自北京天象人生物工程责 任有限公司。d n a 缺刻平移标记试剂盒购自华美生物工程公司。 质粒载体载体和受体菌 质粒载体 p u c 1 8 ( a m r , l a c z )购自上海生工生物工程有限公司，受 体菌株 d h 5 a为本室保存。 放射性同位素制剂 ( a - p ) d c t p ( e 匕 活度 3 0 0 0 c i / m m o l ; l 0 u c i / i 1 )购自北京亚辉生物 工程公司。 其他化学试剂 d n a提取、细菌培养、细菌转化、s o u t h e r n b l o t t i n g用化学试剂均为 a m r e s , b b i . s e r v a等公司u l t r a p u r e试剂及国产分析纯试剂。 实验方法 总d n a提取 按照萨姆布鲁克j等人( 1 9 8 9 ) 的方法略加以改进进行提取: 取 1 g中国 对虾肌肉组织，切碎后放入 1 0 m 1提取缓冲液 ( 5 0 m m o 1 / l t r i s , 1 0 0 m m o 1 / l n a c l , 1 5 0 m m o l / l e d t a , 1 % s d s , 1 5 0 p g蛋白酶 k / m l , p h 8 . 0 ) , 3 7 c 温浴过 夜。加入 5 m o 1 / l n a c l至终浓度 l . 5 m o 1 / l ,盐析除去多余的蛋白质。4 1c 1 0 0 0 0 g离心 1 0分钟，上清液用酚/ 氯仿/ 异戊醉 ( 5 0 : 5 0 : 1 )抽提数次，加 入2 . 5 倍的无水乙醇沉淀。1 2 0 0 0 g 收集d n a 沉淀，并用 7 0 % 乙醇洗涤后，溶 于2 0 0 p 1 t e 缓冲液中 ( 1 0 m m o 1 / l t r i s , l m m o l / l e d t a , p h 8 . 0 )。 - 2 0 保 存。 史旦吐蛆造趾坦艺 d n a t 眼业场渔所材料与方法 总d n a 浓度、纯度检测 紫外分光光度计法测定 d n a浓度:取一定量的总 d n a样品溶液，用 t e 缓冲液稀释至2 0 0 闪，用贝克曼- 7 型紫外分光光度计测定。 d 2 6 。 和 o d 2 8 0 ，根 据吸光值计算d n a 浓度和d n a 纯度。测定前用 2 0 0 p 1 t e 校正零点。 d n a 样品浓度 ( r g / p l )=0d260 x稀释倍数 x 5 0 / 1 0 0 0 d n a 样品纯度依o d z s o / o d m= 1 . 8 - 1 . 9 时，d n a 纯度高，当比值)1 . 9 0时 r n a多，而比值蕊1 . 6 0时蛋白质多来检验d n a 样品的纯度。 减法杂交 根据实验设计，进行雌性对雄性和雄性对雌性两套减法杂交反应。减法 杂交按照 k u n k e l等 ( 1 9 8 5 )的方法进行:2 5 0 r g雌性对虾 d n a用超声波剪 切至大约 5 0 0 - 8 0 0 0 6 p ， 以用来从 l e g用 s a u 3 a t 消化后的雄性对虾 d n a中去 除无性别特异性的d n a 片段， 反之亦然。 将雌性d n a与雄性d n a 混合并在 1 0 0 变性 5分钟，随后冰上骤冷并加大反应体系至 2 . 5 m l ，反应体系中包括了 1 2 % 苯酚 ( 重蒸后用 o . l m o l / l t r i s饱和至 p h 8 . 0 ) , 1 . 2 5 m o l / l高氯酸钠和 1 2 m m o l / l磷酸钠 ( p h 6 . 8 )反应在室温条件下进行并不断震荡，持续一周。 杂交反应结束后，用氯仿/ 异戊醇 ( 5 0 : 1 )抽提杂合体混合物，水相中的d n a 经两次沉淀后，用5 0 0 p 1 t e 缓冲液溶解，并用大量t e 缓冲液透析2 4 小时。 透析后的 d n a溶液加入 1 / 1 0体积的 3 m o l / l醋酸钠、2 . 5倍乙醇再次沉淀， 7 0 % 乙醇洗涤，干燥后溶于 1 0 以 t e缓冲液中。紫外分光光度计法测定 d n a 浓度。 d n a 片段的克隆 使用标准 c a c l : 法制备 ( 萨姆布鲁克等，1 9 8 9 )感受态细菌。p u c 1 8质 粒载体d n a 经 b a m h l 酶切，牛小肠碱性磷酸酶去除末端磷酸基团，与减法杂 交反应后的复性 d n a进行连接。连接反应体系为:2 0 0 n g质粒、6 0 0 n g基因 组d n a , 1 x 连接酶缓冲液、2 u t , d n a 连接酶、加入无菌水至2 0 p 1 0 1 5 过 夜，标准程序转化，蓝白斑法挑选重组质粒转化菌落。 重组质粒 d n a的提取 使用碱裂解法 ( 萨姆布鲁克等，1 9 8 9 )提取重组质粒d n a . 重组质粒中插入 d n a片段检测、分离及放射性同位素探针的标记 应用 e c o r i , h i n d i i i 双酶切消化质粒 d n a ，反应体系、反应条件按厂家 要求。 反应结束后， 用 0 . 8 % 琼脂糖凝胶检测， 并用电洗脱法制备切割下的d n a 片段 ( 萨姆布鲁克等，1 9 8 9 )。 取制备好的d n a片段 l u g ，按厂家推荐方法进行探针的缺刻平移标记。 乙醇沉淀纯化标记好的探针。 s o u t h e r n b l o t t i n g 检测 1 0 r g总 d n a用 h i n d i ll 酶完全消化，0 . 8 % 琼脂糖凝胶电泳分离，按印迹 转移的标准程序 ( 萨姆布鲁克等，1 9 8 9 )转移至 h y b o n d 尼龙膜上，8 0 c 烘 干 2 小时，室温真空保存备用。 按标准程序 ( 萨姆布鲁克等，1 9 8 9 )对准备好的转移膜预杂交，以片段 化的鱼精 d n a为封闭物。更换杂交液后，加入标记好的探针， 6 8 杂交过夜。 膜经数次洗涤后，封闭在塑料膜内，加双增感屏对 x 一 光片曝光，- 2 0 0c 8小 时。k o d a k d - 1 9 6 显影液显影，f - 5 定影液定影。 mrna差异显示 实验材料与试荆 动物材料 实验所用中国对虾取 自中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验 室水族馆.个体平均体长为8 . 4 c m ，平均体重为 1 5 . 7 g . 酶制剂 m m l v 反转录酶、无 r n a酶的d n a a s e i 、r n a酶抑制剂 r n a s i n , t , d n a 连 接酶均为 g i b c o b r l公司产品，购自北京天象人生物工程责任有限公司; t a g d n a 聚合酶购自上海生工生物工程有限公司: 限制性内切酶h i n c i i , t 声 n a 连接酶均为p r o m e g a公司产品，购自北京天象人生物工程责任有限公司。 p c r引物 反转录引物 o l i g o - d t a、o l i g o - d t , 3 g , o l i g o - d t , 3 c , 1 0碱基随机引 物购 自上海生工生物工程有限公司。 质粒载体和受体菌 质粒载体 p u c 1 8 ( a m r , l a c z )购自上海生工生物工程有限公司，受 体菌株 d h 5 a为本室保存。 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究材料与方法 放射性同位素制剂 ( a 3 2 p ) d c t p( 比活度 3 0 0 0 c i / m m o l ; i o u c i / p l )购自 北京亚辉生物1 程 公司。 其他化学试剂 总 r n a提取、总 r n a电泳、细菌培养、细菌转化用化学试剂均为 a m r e s , b b 工 、s e r v a 等公司u l t r a p u r e 试剂及国产分析纯试剂。 实验方法 总 r n a的提取 使用中国对虾的眼柄窦腺器官、胸腹神经节、性腺等组织作为材料提 取总 r n a : 所用玻璃器具 2 0 0 烘烤 8 小时，所有试剂溶液 ( t r i s 溶液除外)、 水均用 0 . 1 % d e p c( 焦碳酸二乙酷)处理，所用塑料器具也同法处理，以去 除 r n a s e( 萨姆布鲁克等，1 9 8 9 )。提取方法按照 c h o m c z y n s k i a n d s a c c h i ( 1 9 8 7 )的异硫氛酸肌一苯酚法并略加改进:取 1 0 0 m g左右的实验材 料，加入 6 0 0 g 1 r n a提取变性液 ( 4 m o l / l异硫氰酸肌, 2 5 m m o l / l柠檬酸钠， p h 7 . 0 , 0 . 5 % s a r c o s y l , 1 0 0 m m o l / l 2 - d 一 琉基乙醇)，室温下匀浆，转入一 1 . 5 m l离心管内，冰浴 5分钟，顺序加入 6 0 u 1 2 m o l / l n a a c p h 4 . 0 , 6 0 0 4 1 酸性苯酚 ( 重蒸苯酚用 d e p c处理过的水饱和)，1 2 0 司 氯仿，剧烈振荡 2 0 秒，冰浴 2分钟，4 c 1 2 0 0 0 g离心 2 0分钟:取上清，加入等体积异丙醇， 混匀后，- 2 0 沉淀3 0分钟;4 0c 1 2 0 0 0 g离心2 0 分钟，去上清:沉淀加入 6 0 o v i r n a提取变性液，使之重新悬浮、溶解，顺序加入 6 0 刃 2 m o l / l n a a c p h 4 . 0 , 6 0 0 1x 1 酸性苯酚， 1 2 0 1 x 1 氯仿， 剧烈振荡2 0 秒， 冰浴2 分钟， 4 c 1 2 0 0 0 g 离心 2 0分钟;取上清，加入等体积异丙醇，混匀后，- 2 0 沉淀 3 0分钟;4 1 2 0 0 0 g离心 2 0分钟，去上清;7 5 % 乙醇悬浮清洗，真空抽干 1 0分钟， 溶于1 5 0 口d e p c 处理的重蒸水中，- 7 0 保存。 总 r n a浓度、纯度检测 紫外分光光度计法测定r n a 浓度:取一定量的总r n a 样品溶液， 用d e p c 处理的重蒸水稀释至2 0 0 以，贝克曼- 7 型紫外分光光度计测定o d , , 。 和o d 2 a 0 根据吸光值计算 r n a浓度和 r n a纯度。测定前用 2 0 0 衅 d e p c处理的重蒸水 校正零点。 r n a 样品 浓度 ( w g 扣d = o d , , , x稀释倍数 x 4 0 / 1 0 0 0 r n a 样品纯度依o d 2 s u / o d a e 0 = 2 . 0 检验r n a 样品的纯度。 中国对虾性别相关d n a片段的克隆 研究材料与方法 总r n a 完整度的检测 用 0 . 8 % 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总r n a 完整度: 8 % 甲醛变性琼脂糖凝胶的制备 称取0 . 8 g 琼脂糖， 加入5 m l 2 0 x r n a 硼酸缓冲液( 2 4 . 了 3 g 硼砂， 3 8 . 1 4 g 硼酸，8 m l 0 . 5 m o l / l e d t a p h 8 . 0 ，加 d e p c处理的重蒸水至 1 l ，此时缓 冲液 p h值约为 7 . 4 6 )和 8 7 m l d e p c处理的重蒸水，微波炉加热溶解， 放置于 6 0 水浴中;待胶液温度平衡至 6 0 时，加入 8 m l甲醛，混匀， 倒胶于胶槽内。 r n a 加样样品的准备 l o p 1 r n a 溶液 ( 约 l o g g ) 加入 l p l 过滤过的澳化乙锭溶液 ( l m g / m l ) , 再加入2 倍体积的r n a 加样缓冲液( 1 9 7 p l 甲 酸胺， 6 4 p l 甲醛， 3 9 p 1 2 0 x r n a 硼酸缓冲液) ，混匀.6 5 水浴处理 5 分钟后，冰浴 5 分钟，加样。 电泳 应用 1 x r n a硼酸缓冲液为电泳缓冲液，电泳条件为 l 0 0 m a恒流。 电泳结束后，用流水冲洗 5 分钟，紫外灯下观察，照相记录。 无 r n a s e的d n a s e i 处理总r n a 1 0 - 1 0 0 p g 总r n a 加入1 0 u 无r n a s e 的d n a s e i ， 反应体系包括1 0 m m o l / l t r i s - h c 1 , p h 8 . 3 , 5 0 m m o l / l k c 1 , 1 . 5 m m o l / l m g c 1 2 . i o u r n a酶抑制 齐 1 r n a s i n , 3 7 0c 3 0分钟。反应结束后，加入等体积酸性苯酚一氯仿 ( 3 : 1 )溶液，振荡混合后，冰浴 1 0分钟，4 1c 1 2 0 0 0 g离心 2 0分钟;取水 相，加入 n a a c至终浓度为 0 . 3 m o l / l ，并加入 3倍体积的无水乙醇，- 2 0 放置 3 0分钟以沉淀 r n a ; 4 1c 1 2 0 0 0 g离心 2 0分钟，去上清;7 0 % 乙 醇悬浮清洗，真空抽干 1 0分钟，溶于 1 0 0 时 d e p c 处理的重蒸水中，取 部分用于浓度及完整度检测，其余于一 7 0 保存。 r n a反转录 反转录按照b a u e r 等人 ( 1 9 9 3 )的方法，2 0 以 反应体系中包括 5 x r t b u f f e r 4 . 0 p 1 d n t p ( 2 5 0 u m o l / l ) 1 . 6 u 1 o l i g o - d t , 3 n * ( 1 0 u m o l / l )2 . 0 u 1 总 r n a( 0 . 1 g g / u l )2 . 0 p 1 d e p c 处理的重蒸水9 . 4 v 1 总体积 1 9 r l 中国对虾性别相关d n a片段的克隆研究材料与方法 * n为 a ,g 、 6 5 c变性 5 分钟 ， c三种中任意一种 然后冷却至3 7 c，保温 1 0 分钟， 稍事离心，加入 1 口 m m l v 录酶 逆转录酶 ( 2 0 0 u / 户)，3 7 保温 1