（康复医学与理疗学专业论文）电针对兔膝骨关节炎软骨细胞mmp13表达的影响.pdf

，1 l l i i ii ii ii ii i i i1 1 1 1 1 1 1 1 1 1ill一一；y 18 8 9 0 3 3电针对兔膝骨关节炎软骨细胞m m p 1 3 表达的影响摘。要目的：骨关节炎( o s t e o a r t h r i t i s ，o a ) 是一种以关节软骨降解、滑膜炎症为特征的退行性关节疾病，尤以膝关节最易受累，其发病率在人群中呈逐年上升趋势。近年来研究表明，滑膜的炎症反应参与了o a 的发生发展过程，基质金属蛋白酶- 1 3 ( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 1 3 ，m m p 一1 3 ) 是公认的在滑膜炎症和软骨损伤过程中发挥重要作用的细胞因子，属于基质金属蛋白酶家族( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ， 心仰s ) 中的胶原酶亚型。临床治疗中针灸治疗疗效确切，施以疏密波等电刺激，能刺激局部肌肉收缩，改善局部血液循环，促进经气运行，有利于渗出液吸收和关节软骨的修复。本实验通过建立兔膝o a 模型，观察治疗前后软骨细胞中m m p 1 3 的表达，探讨电针干预，对o a 软骨修复的影响。方法：( 1 ) 对象和干预措施：3 0 只新西兰大耳兔随机分为正常组、模型组及电针治疗组3 组，每组1 0 只。正常组不造模，模型组和电针治疗组均采用左膝关节伸直位管型石膏固定法，建立o a 模型。6 周后，模型组采用空气栓塞法处死，取左膝内侧髁软骨观察造模后相关指标变化。电针组选取膝周四个穴位：“梁丘 、“足三里 ( 后三里) 、“血海”、“阳陵泉”。行毫针针刺，疏密波刺激，疏波4 h z 、密波2 0 h z 、脉冲宽度0 5 m s ，每日1 次，每次2 0 m i n ，连续治疗1 0 次。同法处死家兔，取股骨内侧髁软骨，观察相关指标变化。( 2 ) 观察指标：肉眼观察正常组、模型组及电针治疗组兔左膝关节大体形态变化；切取左膝关节股骨内侧髁软骨，1 0 中性甲醛溶液固定后，石蜡包埋、切片，作h e 染色和甲苯胺蓝染色光镜观察软骨细胞形态，按m a n k i n s 评分标准对软骨大体形态和光镜观察结果进行评分。免疫组织化学分析：用兔抗m m p 1 3 试剂盒检测左膝关节内侧髁软骨m m p 1 3 的表达变化。( 3 ) 统计学处理：所有数据以均数标准差表示，采用s p s s l 3 o 统计软件对数据进行统计分析，p 0 0 5 表示差异有显著意义。结果：( 1 ) 软骨大体观察：正常组左膝关节无明显关节积液，软骨面外观光滑呈蓝白色，色深明亮，无裂纹。模型组左膝关节大部分出现关节积液，所有软骨表面呈灰黄色，光泽度降低，关节面粗糙，部分部位出现糜烂；电针治疗组部分动物出现关节积液及滑膜增生，软骨改变以粗糙为主，但程度较轻，未见明显糜烂；电针治疗组与模型组按m a n k i n s 评分比较软骨结构，有显著性差异( p 0 0 1 ) 。( 2 ) h e 染色及甲苯胺蓝染色病理学观察：正常组示软骨表面平整，软骨层厚薄均匀；软骨细胞排列整齐，细胞大小一致；甲苯胺蓝染色均匀，无基质失染。模型组示软骨表层出现溃烂缺失，软骨层厚度明显变薄，软骨细胞大量减少，排列紊乱；甲苯胺蓝染色弱，偶有基质失染。电针治疗组软骨表面较规则，裂隙少，软骨细胞排列较整齐，软骨层厚度较模型组厚，软骨细胞数较模型组明显增多；甲苯胺蓝染色弱。按m a n k i n 8 评分正常组与模型组、模型组与电针治疗组间比较，差异均有显著意义( p 0 0 1 ) 。( 3 ) 免疫组化m m p 1 3测定：正常组软骨细胞内无m m p 1 3 表达；模型组的软骨基质、胞浆中均有m m p 1 3 表达，全层可见，尤以表、中层密度最高，成熟软骨细胞中较多，为深棕褐色颗粒；电针治疗组中，软骨表层可见散在的软骨细胞胞浆中存在m m p 1 3 表达，为浅棕褐色颗粒。正常组与模型组、模型组与电针治疗组间比较，差异均有显著意义( p 0 0 5 ) 。结论：电针治疗可减少兔，o a 软骨细胞中m m p 1 3 表达，促使软骨细胞重排，对o a 有积极的治疗作用。关键词：骨关节炎；软骨细胞：电针；基质金属蛋白酶一1 3e f f e ca b s t r a c t ：c h a r a c t e r i z e db ys y n o v i t i sa n dd e g r a d a t i o no fa r t i c u l a rc a r t i l a g e t h ek n e ei st h ep r i n c i p l el a r g ej o i n ta f f e c t e db yo a r e c e n ts t u d i e ss h o wt h a tt h es y n o v i a li n f l a m m a t o r yr e s p o n s ei n v o l v e di nt h ed e v e l o p m e n to fo s t e o a r t h r i t i s m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 一13 ( m m p 一13 ) i sc o m m o n l yr e c o g n i z e da sav i t a lc y t o k i n e si nt h ed e v e l o p m e n to fs y n o v i a li n f l a m m a t i o na n dc a r t i l a g ed a m a g e ，w h i c hb e l o n g st ot h ef a m i l yo fm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s ( m m p s ) i nt h ec o l l a g e n a s es u b t y p e s c l i n i c a la c u p u n c t y r et r e a t m e n ti sc o n s i d e r e da st h em o s te f f e c t i v em e t h o d w h e ng i v e ne l e c t r i c a ls t i m u l a t i o ns u c ha sd e n s i t yw a v e s ，l o c a lm u s c l e sc o n t r a c tm o r e ，l o c a lb l o o dc i r c u l a t ew e l l ，a tt h es a m et i m e ，t h e yc a na l s op r o m o t eq io p e r a t i o na n dh e l pe x u d a t e sa b s o r p t i o na sw e l la sc a r t i l a g er e p a i r m e n t t h ec u r r e n te x p e r i m e n ta i m st oi n v e s t i g a t et h ei n f l u e n c eo fo ac a r t i l a g er e p a i r m e n tw i t ht h ei n t e r v e n t i o no fe l e c t r o a c u p u n c t u r e ( e a ) a c c o r d i n gt ot h eo b s e r v a t i o no fm m p 一13e x p r e s s i o nb e f o r ea n da f t e rt h et r e a t m e n tb ye s t a b l i s h i n gr a b b i t s k n e e sm o d e l s m e t h o d s ：( 1 ) o b j e c t sa n di n t e r v e n t i o n s ：3 0n e wz e a l a n db i g - e a rr a b b i t sw e r er a n d o m i z e di n t on o r m a lg r o u p ，m o d e lg r o u pa n de ag r o u p ，10i ne a c h t h en o r m a lg r o u pd on o t h i n g ，t h eo t h e r2 0w e r em a d ek n e eo s t e o a r t h r i t i sm o d e l sb yp r o l o n g e df i x a t i o no fl e f t k n e ej o i n ti ne x t e n s i o nw i t ht u b u l a rp l a s t e r s a c r i f i c i n gt h em o d e lg r o u pw i t ha i re m b o l i s m6w e e k sl a t e r a n dc h a n g e so f4h z ，d e n s i t yw a v e2 0h z ，p u l s ew i d t h0 5m s ，e a c ht i m e2 0m i n u t e s ，o n c ead a y ,f o r10c o n s e c u t i v et i m e s t ok i l lt h er a b b i t sa sa b o v e ，o b s e r v i n gc h a n g e si nr e l a t e di n d i c a t o r so ft h em e d i a lf e m o r a lc o n d y l ec a r t i l a g e ( 2 ) o b s e r v a t i o ni n d e x ：t h em a c r o s c o p i co b s e r v a t i o no fn o r m a lg r o u p ，m o d e lg r o u pa n de ag r o u pr a b b i t s l e f tk n e ej o i n t sg e n e r a lm o r p h o l o g yc h a n g eb yn a k e de y e s ；c u t a n ds e p r a t et h er a b b i t s l e f tk n e em e d i a lc o n d y l ec a r t i l a g e s ，a f t e rf i x a t i o no f10 n e u t r a lf o r m a l d e h y d es o l u t i o n ，e m b e d d i n g ，s e c t i o n i n gp a r a f f i nh ed y e i n ga n dl i g h tm i c r o s c o p yt o l u i d i n eb l u es t a i n i n gc a r t i l a g ec e l l sf o r m ，s c o r i n gs t a n d a r d sa c c o r d i n gt om a n k i n so fc a r t i l a g eg e n e r a lf o r ma n dl i g h tm i c r o s c o p yr e s u l t s t h es t a t i s t i c a lt r e a t m e n t ：a l ld a t em e a nd i f f e r e n c e s ，a n a l y s i st h er e s u l t sw i t hs p s s13 0p l u so rm i n u ss t a n d a r dd e v i a t i o no fd a t as t a t i s t i c ss o f t w a r e ，氏o 0 5p r e s e n t sd i f f e r e n c e si ss i g n i f i c a n t r e s u l t s ：( 1 ) c a r t i l a g eg e n e r a lo b s e r v a t i o n ：n o r m a lg r o u p ：n oo b v i o u sj o i n te f f u s i o no c c u r s ，c a r t i l a g es u r f a c ei ss m o o t ha n dd e e pb r i g h tb l u i s h - w h i t ew i t h o u ta n yc r a c k s ；m o d e lg r o u p ：j o i n te f f u s i o na p p e a r sm o r e ，a l lt h ec a r t i l a g es u r f a c e sp r e s e n t 鲈a ya n dr o u g h n e s sw i t hr e d u c e dg l o s s i n e s s ，e r o s i o no c c u r si ns o m ep a r tp l a c e s ；e ag r o u p ：p a r ta n i m a l sa p p e a rjo i n te f f u s i o na n ds y n o v i a lh y p e r p l a s i aw i t hn oo b v i o u se r o s i o n ，c a r t i l a g ec h a n g em a j o ri nr o u g h n e s sj u s tt oal e s s e rd e g r e e e a5c a r t i l a g ec e l l sd e c r e a s ed r a m a t i c a l l ya n di nd i s o r d e r , w i t hl i t t l et o l u i d i n eb l u es t a i n i n ga n do c c a s i o n a lm a t r i xd y el o s s ；e ag r o u p ：c a r t i l a g es u r f a c ei sr e g u l a rw i t hl e s sc r a k e s ，c a r t i l a g el a y e ri st h i c k e rt h a nt h em o d e lg r o u p ，c e l l si n c r e a s e da n da l li no r d e r , w e a kt o l u i d i n eb l u es t a i n i n g d i f f e r e n c e sr e p r e s e n t ss i g n i f i c a n tm e a n i n ga c c o r d i n gt om a n k i n ss c o r eb yc o m p a r a t i o no fn o r m a lg r o u pa n dm o d e lg r o u p ，m o d e lg r o u pa n de ag r o u p ( 3 ) i m m u n o h i s t o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o n ：m m p 一13i nc a r t i l a g ec e l l sd i d n te x p r e s si nn o r m a lg r o u p w h i l ei nt h em o d e lg r o u p ，m m p 一13e x p r e s s i o na p p e a r si nc a r t i l a g em a t r i xa n dc y t o p l a s m ，o b v i o u si ne v e r yl a y e r s ，e s p e c i a l l yi nt h et a b l ea n dm i d d l eo n e sw i t hap e a kd e n s i t y t h e nf o rc e l ll e v e l ，i ta p p e a r st ob ed e e pb r o w np a r t i c l e ，w h i c hc a nb ef o u n di nm o r em a t u r ec a r t i l a g ec e l l s i nt h ee ag r o u p ，l i g h tb r o w np a r t i c l e sg i v eap o w e re v i d e n c et op r o v em m p 一13e x p r e s s i o ni nt h ed i s p e r s e dc a r t i l a g ec e l lm a t r i x t h en o r m a lg r o u pa n dt h em o d e lg r o u p ，t h em o d e lg r o u pa n de a ，w h e na l lt h ec o m p a r a t i o na r ep u ti n t op r a c t i c e ，d i f f e r e n c e sm a k es i g n i f i c a n tm e a n i n g ( 尸 o 0 5 ) c o n c l u s i o n s ：e at r e a t m e n tc a l lr e d u c em m p - 13e x p r e s s i o ni no ac h o n d r o c y t e so fr a b b i t s ，p r o m o t et h er e a r r a n g e m e n to f6c a r t i l a g ec e l l s ，b eap o s i t i v em e t h o dt ot h et r e a t m e n to fo a k e yw o r d s ：o s t e o a r t h r i t i s ；c a r t i l a g ec e l l s ；e l e c t r o a c u p u n c t u r e ；m m p - 137及关群中疾病一种关节疾病，调查结果表明，目前我国4 0 岁以上人群原发性骨关节炎患病率约为4 6 3 ，其中男性为4 1 6 、女性为5 0 4 ，6 0 岁以上老人中，就有5 5 的人患有此病，在7 0 岁以上的人群中发病率约占8 0 。年龄越大，出现临床症状的比例越高。目前国内外对o a 发病机理研究主要集中于软骨细胞超微结构改变、软骨细胞凋亡、软骨基质生化代谢、细胞凋亡与基质降解的关系等方面。在人体中，膝关节承受重力，并处于身体两个最长的杠杆臂之间，故膝关节最易受累堙1 。当关节负重的力线偏离正常力线时，关节内应力发生改变，关节内软骨受力不均，破坏了软骨细胞及软骨周围基质，特别是含量丰富的i i 型胶原，进而发生退行性变。目前认为，虽然o a 发病机制还不十分清楚，但已有足够证据表明，关节局部的软骨细胞分泌的m m p s 是导致o a 病理改变的重要原因1 。m c 、佃s 能够特异性地裂解胶原分子，所以导致胶原网受到破坏，同时原本被关节软骨细胞外基质包埋的软骨细胞暴露于炎性因子的攻击之下，在力学负荷和炎性因子的作用下，关节软骨抗应力降低，软骨细胞发生凋亡，细胞外基质成分游离出软骨，最终软骨被破坏。其中m m p 1 3 是与o a 关系密切的胶原酶h 1 ，它可直接降解软骨基质中，一t 一，最具特征、含量最多的i i 型胶原，同时其它m i v p s 亚型对i i 型胶原降解过程需通过它发挥作用。m i 、佃1 3 在o a 病变部位的软骨里，其增高程度和软骨组织的破坏程度一致，即破坏程度越严重，酶的表达越高畸1 。因此，理论上h i m p 1 3 的变化能反映软骨基质中i i 型胶原的代谢变化。兔膝关节在伸直位固定时，跨越关节的肌肉、关节囊持续收缩，关节面的压力增加，异常压力状态下粘蛋白、透明质酸的成分减少，导致关节面机械磨损，滑膜与软骨的粘连，同时影响软骨细胞营养摄取及软骨的润滑作用，导致软骨细胞发生退变。本实验采取伸直位管型石膏固定法制作o a 模型，其优点还在于无关节损伤，不存在创伤性滑膜炎干扰，方法简单，创伤小，成功率高，更接近人类o a 的病理过程。一o a 在中医学上属“痹症 范畴，膝关节o a 属于中医学“骨痹 、“膝痹 等范畴，中医认为本病因慢性劳损、受寒、轻微外伤或年老体弱、肝肾亏损、气血不足所致。从针灸治疗膝o a 的临床报道可见，针灸治疗该病的疗效确切、且选取穴位多在膝关节及以下部位。针灸疗法因可疏通经络气血，使营卫调和而风、寒、湿、热等邪无可依附，“通则不痛 ，具有蠲痹止痛之功，故使痹痛得解。电针阳3 治疗可刺激肌肉收缩，产生泵的作用而改善局部血液循环，促进经气运行，而有利于关节渗出液的吸收和软骨的修复。通过疏密波电刺激，可能促进蛋白多糖合成增加，增强局部血液循环，促进炎性因子瞳7 1 吸收，促使软骨修复。本实验采用以毫针针刺后，疏密波电刺激作用于兔左膝关节进行治疗，疏波4 h z 、密波2 0 h z 、脉冲宽度0 5 m s ，每日1 次，每次2 0 m i n ，连续治疗1 0次。对正常对照组、模型组及电针治疗组分别观察左膝关节软骨，h e 染色和甲苯胺蓝染色观察左股骨内侧髁软骨m m p 1 3 表达变化，并进行统计学处理，机理。2 0 - 2 5 k g ，6 月龄，由泸c x k 川 2 0 0 8 1 7 。在泸州医学院动物实验中心饲养，采取一笼一兔，普通饲养，可自由活动，保证实验动物生活环境的清洁，常规适应环境1 周后开始实验。实验场地在泸州医学院病理实验室。2 主要实验试剂1 0 中性甲醛，5 硝酸脱钙液，二甲苯，1 0 0 、9 5 、8 5 、7 0 酒精，多聚赖氨酸，伊红，苏木素，甲苯胺蓝，p a s 缓冲液( 泸州医学院病理教研室提供) 。m m p 1 3 免疫组化试剂盒( 北京博奥森生物技术有限公司)3 主要实验仪器实验动物台，石膏，绷带，5 0 m l 注射器，手术刀，组织剪，组织钳( 泸州医学院病理教研室提供)华佗牌电子针灸仪( 苏州医疗用品厂有限公司，s d z i i 型) 。b m j b 病理组织包埋机( 常州市中微电子仪器有限公司)l e i c ar m2 2 3 5 切片机( 德国莱卡公司)t k 一2 1 8 型恒温摊片烤片机( 湖北泰维医疗科技有限责任公司)o l p u sc h 2 0 光学显微镜( 日本o l y m p u s 公司)l e i c ad m 4 0 0 0 b 荧光显微分析系统( 德国莱卡公司)-：，4 实验方法。4 t 建立模型管型石膏伸直位制动法建立o a 模型。将兔固定于实验固定台上，左后肢处于伸直位，石膏绷带温水浸透后在左后肢腹股沟以下1 5 a m 至踝关节下3 c m ( 趾端) ，约1 5 c m ，用石膏绷带包裹，管型固定于伸直位，松紧适中，待石膏绷带干燥后放入笼中喂养。4 1 1动物分组3 0 只动物随机分为三组：正常组：1 0 只，正常饲养，未行任何处理。模型组：1 0 只，在6 w 取兔左膝关节，肉眼外观软骨大体形态改变，h e染色及甲苯胺蓝染色观察软骨细胞，免疫组化观察m 卜佃1 3 表达。电针组：1 0 只，造模6 w 后行电针治疗1 0 d ，取左膝关节肉眼观察软骨大体形态改变，h e 染色及甲苯胺蓝染色观察软骨细胞，免疫组化观察m m p 1 3 表达情况。各组兔都处于相同环境中喂养。4 1 2 动物分组目的正常组不造模，其目的是与模型组造模后在软骨大体形态、软骨细胞h e染色、甲苯胺蓝染色及软骨m m p 1 3 表达等多方面进行比较，观察以确定模型造模是否成功。模型组与电针组比较，以观察治疗前后相关指标( 同上) 的变化，分析治疗效果及其可能性机制。4 2 干预措施在动物模型左膝关节伸直位管型石膏固定造模6 w 后，电针组穴位定位参照动物针灸学，选取膝周四个固定穴位：“梁丘 、“足三里 ( 后三里) 、。_一$“血海 、“阳陵泉 。以3 0 号一寸毫针针刺后，针柄连接于s d z - i i 型治- r，：疗仪上，疏密波刺激，疏波4 h z 、密波2 0 h z 、脉冲宽度0 5 m s ，每日1 次，每次2 0 m i n ，连续治疗1 0 次。模型组及正常组不予任何处理。4 3 标本制备4 3 1 标本取材及大体形态观察评定以空气栓塞法处死各组兔，取左股骨内侧切口打开膝关节显露膝关节腔行大体观察，主要观察股骨内髁关节面瞳6 3 的病理改变，观察关节软骨光滑度、色泽、表面是否有糜烂及溃疡、是否有纤维性增生及边缘是否有骨赘形成等。4 3 2 标本制作以锐利刀片切取股骨内侧髁0 5 c mx0 5 a mx0 5 c m 关节软骨标本，。将其置于1 0 中性甲醛溶液内固定4 8 h ，流水冲洗2 3 h ，5 硝酸脱钙液脱钙3 8 - 4 8 h ，直至大头针能轻松穿透标本后，再流水冲洗2 3 h ，1 0 中性甲醛溶液内固定，石蜡包埋标本，垂直软骨表面连续切片，厚度5 u m 。4 3 2 1软骨h e 染色( 1 ) 切片在二甲苯中脱蜡5 m i n ，2 次；( 2 ) 移入1 0 0 、9 5 、8 5 、7 0 酒精，各级5 m i n ，最后经蒸馏水流水冲洗2 m i n ，转入苏木精染液染色5 m i n ；( 3 ) 水洗玻片上多余染液，l 盐酸酒精( 7 0 酒精配制) 分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数1 0 s ；( 4 ) 流水冲洗5 m i n 后在碳酸锂饱和液中蓝化2 m i n ，即细胞核呈蓝色，蒸馏水冲洗2 m i n ：( 5 ) 0 5 伊红染液染色2 m i n ；，- 。一( 6 ) 依次经7 0 、8 5 酒精脱水各3 0 s ，9 5 、1 0 0 酒精脱水各5 m i n ：( 7 ) 二甲苯透明( 二次) ，共约1 0 m i n ；( 8 ) 封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。( 9 ) h e 染色光镜观察：观察软骨表面是否规则、有无裂隙，细胞数量、分布、排列是否规则。参考m a n k i n “s7 1 评分标准进行评分。4 3 2 2 软骨甲苯胺蓝染色( 1 ) 切片在二甲苯中脱蜡5 m i n ，2 次：( 2 ) 移入1 0 0 、9 5 、8 5 、7 0 酒精，各级5 m i n ，最后经蒸馏水流水冲洗2 m i n ，转入甲苯胺蓝染液染色5 m i n ；( 3 ) 水洗玻片上多余染液，1 盐酸酒精( 7 0 酒精配制) 分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数1 0 s ；( 4 ) 流水冲洗5 m i n 后，二甲苯透明( 二次) ，共约1 0 m i n ；( 5 ) 封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。( 6 ) 甲苯胺蓝染色观察：基质染色有无失染。4 3 2 3 软骨免疫组化i v i m p 1 3 测定( 1 ) 将待检软骨标本用中性缓冲甲醛液固定4 8 h ，脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋：( 2 ) 连续切片5l - tm ，贴片于多聚赖氨酸防脱处理过的载玻片上，切片脱蜡，3 h ：0 ：室温1 0 m i n 灭活内源性过氧化物酶；( 3 ) 冲洗后p b s 浸泡5 m i n 复合消化液修复抗原活性；( 4 ) 正常血清封闭，滴加1 ：1 0 0 稀释抗兔m l v l p 1 3 抗体，4 c 孵育过夜；( 5 ) p b s 冲洗3 次，5 m i n 次，滴加生物素标记的二抗，3 7 。c 孵育2 0 m i n ；。( 6 ) p b s 冲洗5 m i n ，3 次，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，3 7 。c 孵育2 0 m i n ；( 7 ) p b s 冲洗5 m i n ，3 次，二甲基联苯胺( d a b ) 室温下显色至满意，自来水终止显色反应；( 8 ) 苏木素复染细胞2 0 s ，洗去多余染液，酒精梯度脱水后封片，显微镜下观察。( 9 ) 免疫组化结果观察：参照p e l l e r i e r 随3 的方法在软骨切片中随机选取3 个高倍镜视野( 2 0 0 倍) ，计算每个视野里的阳性细胞数和细胞总数，显微镜下胞浆或胞膜有褐色颗粒为阳性细胞。用细胞分数即阳性细胞数占细胞总数的百分比来表示m m p 一1 3 表达量。每张切片的细胞计数分别由两个独立的观察者进行，其评分误差率控制在5 以内，取二者均值为最后得分。5 统计学分析所有数据以均数标准差表示，采用s p s s l 3 o 统计软件对数据进行统计分析，对兔软骨结构、软骨细胞结果采用单因素的方差分析进行两两比较，p 0 0 5 表示差异有显著意义。结果+-1模型建立，通过兔膝关节伸直位石膏固定制动6 周，可以较好的模拟o a 病理形态学变化。2 关节面观察2 1 大体观察按m a n k i n s 软骨结构评分原则( 具体见表1 ) ：o 分：关节面光整，色泽如常；1 分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；2 分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨浅层；3 分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨中层；4 分：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；5 分：软骨剥脱，软骨下骨质暴露。正常对照组共1 0 只兔，在空气栓塞法处死后，观察左膝关节大体形态，未见明显关节积液，软骨面外观光滑，透明，呈兰白色，色深明亮，无缺损及新生物，无水肿充血表现，评分均为0 分。表明参加实验的新西兰兔未造模时膝关节形态正常。模型组1 0 只兔造模6 w 后处死进行大体形态观察，左膝关节大部分出现关节积液，软骨表面色泽暗，呈灰黄色，光泽度降低，表面略有不平，较粗糙，有不规则压迹，糜烂与溃疡，4 只兔评分为5 分，5 p , 兔评分为4 分，1 只为3 分；电针治疗组1 0 只兔治疗后观察，1 只兔有关节积液，软骨表面有少许溃疡，评分4 分，8 只兔有少量关节积液，软骨表面不光滑，软骨欠透明，光泽较正常对照组稍差，评分2 3 分，1 只兔无关节积液，软骨表面欠光滑，光泽较正常对照组差。软骨大体形态评分：模型组1 0 只兔造模6 w 后与电针治疗组1 0 只兔治疗1 0 d 后参与评定，两组比较有显著性差异( p 0 0 5 ) 。( 详见表2 及图表1 ) 。，2 2 光镜观察结果2 2 1h e 染色结果正常对照组1 0 只兔左膝关节内侧髁1 0 中性甲醛固定，5 硝酸脱钙，石蜡包埋切片后，进行h e 染色观察，显示软骨层较厚，软骨着色均匀，软骨细胞排列整齐，细胞饱满。m a n k i n s 软骨细胞评分均为o 分。表明正常对照组软骨层细胞形态和分布正常。模型组h e 染色后观察，软骨明显变薄，可见裂隙，部分深达软骨下骨，基质染色明显变浅，细胞簇集，有较薄的钙化层，局部有破坏，软骨细胞局部排列紊乱，多个软骨细胞聚集一起，细胞核浓缩，3 只兔软骨细胞评分2 分，7 只为3 分。电针治疗组染色显示软骨层较模型组增厚，表面光滑，偶见小的裂隙形成，着色尚均匀，软骨细胞排列整齐，细胞饱满，偶见多个软骨细胞聚集一起，细胞核浓缩，评分2 只为2 分，其余8 只1 分。软骨细胞评分：模型组与电针治疗组进行比较，两组间有显著性差异( p o 0 5 ) ( 详见表3 及图2 11 ) 。表1m a n k i n ，s 评分标准+2 2 2甲苯胺蓝染色结果正常对照组染色均匀，9 只无基质失染，评分为0 分，1 只有轻度减轻；评分为1 分，表明胶原和蛋白多糖的含量基本正常。模型组软骨层失染，以表层、中层尤为明显，7 只为3 分，3 只为2 分。电针治疗组染色轻度减退，8只为1 分，2 只为2 分。( 见图1 2 - 1 4 )2 2 3 免疫组化染色结果在光学显微镜下，m m p 1 3 表达阳性结果主要表现为软骨细胞内棕褐色颗粒。在正常对照组m m p 一1 3 无表达；模型组呈强阳性表达，软骨基质、胞浆中均有m m p 1 3 表达，全层可见，尤以表、中层密度最高，成熟软骨细胞中较多，为深棕褐色颗粒。电针治疗组软骨组织中m m p 一1 3 较模型组表达降低，主要是软骨组织的表、中层减少，为浅棕褐色颗粒( 见图1 5 - 1 7 ) 。形态计量学研究：对每张软骨切片随机取3 个高倍镜视野( 2 0 0 倍) ，其中3 个位于软骨表层和中上层，另2 个位于软骨中下层和下层，标本应注意选取邻近退变缺损部位，但具有完整4 层软骨结构的区域进行观测。计算每个视野里的阳性细胞数和细胞总数。m m p 1 3 表达量用细胞分数即阳性细胞数占细胞总数的百分比来表示，其最大值为1 0 0 。统计结果显示：模型组m m p 1 3表达阳性细胞分数和正常对照组比较有显著性差异( p o 0 1 ) ，与电针治疗组比较差异也有显著性( p o 0 5 ) 。( 见表4 ) 。表2 各组m a n k i n s 软骨结构评分结果比较( ，x s )注：与正常组对比：+ p o 0 1 ；与模型组对比：p o 0 5表3 各组m a n k i n s 软骨细胞评分结果比较( ，x s )注：与正常组对比：尸 o 0 l ；与模型组对比：氏o 0 5图1图2图3 正常组( h e 染色x1 0 0 )图4 正常组( 腿染色2 0 0 )图5 正常组( 旺染色x4 0 0 )图6 模型组( h e 染色x1 0 0 )图7 模型组( h e 染色x2 0 0 )图8 模型组( h e 染色x4 0 0 )2 1图9 电针组( 脏染色x1 0 0 )露誊”尹q v 4 - ”一、v、：、，：、：! 图1 0 电针组( h e 染色x2 0 0 )_ _，vt、缸-；足三里是治疗下肢痿痹的要穴，此穴位是“足阳明胃经”的主要穴位之一，具有调理脾胃、补中益气、通经活络、疏风化湿、扶正祛邪之功能。阳陵泉为筋会穴，膝为筋之府，故阳陵泉善治膝病；针刺足三里和阳陵泉可疏通膝部外侧气血。梁丘为足阳明胃经之腧穴，针刺有促进气血运行之效，具有舒筋活络的作用，与足三里配伍有温经通络的作用。诸穴合用，则舒筋活血、除湿止痛，为治疗膝痹之常用腧穴。针灸疗法因可疏通经络气血，使营卫调和而风、寒、湿、热等邪无可依附，“通则不痛”，具有蠲痹止痛之功，故使痹痛得解。故选“梁丘 、“足三里 ( 后三里) 、“血海 、“阳陵泉四穴位治疗膝o a 。3o a 的治疗方法。- 目前对于o a 的治疗方法很多，包括手术治疗、关节腔灌洗、药物治疗、物理治疗、针灸治疗等多种方法。治疗以症状治疗为主，治疗的目标是消除关节疼痛，改善关节功能。手术治疗分为两类：一类是保留关节面，以减轻疼痛、提高关节功能、延缓膝o a 的发展为目的，包括截骨术、关节清理术；另一类是祛除关节面，主要针对膝o a 晚期患者，采用人工关节置换术。虽然手术治疗，尤其是人工关节置换术能改善患者关节的功能，但手术或多或少有并发症或危险性，且费用较高，故只适合于某些患者。临床所应用的非手术疗法都不是针对关节边缘的骨赘，也不可能清除骨赘。实际上，多数情况下，骨赘并不直接引起疼痛等症状，只有在关节负重较大和稳定性差的情况下，骨赘不断刺激关节面及关节周围组织，导致关节腔内慢性渗出，关节周围炎症，从而引起关节肿胀、疼痛等症状。因此采取恰当措施，阻止慢性渗出及促使渗出液吸收就可对本病起到较好的防治作用。药物治疗可选择非甾体类抗炎药( n s a i d s ) ，主要通过抑制环氧化酶( c o x ) 活性，从而阻止参与炎症的主要介质前列腺素的产生，起到止痛、抗炎、解热作用。但长期的治疗往往会引起消化系统等副作用，如消化性溃疡、肠胃出血、肝肾功能障碍等。这些副作用又易发于中老年人，严重者还可能危及生命。从针灸治疗膝o a 的临床报道乜2 2 3 1 可见，电针治疗o a 不良反应少，患者耐受性好，疗效确切、方法简便、易行。电针是在针刺腧穴“得气后，在针上通以接近人体生物电的微量电流以防治疾病的一种疗法。其优点是在针刺腧穴的基础上，加以脉冲电的治疗作用，针与电两种刺激相结合，提高临床疗效。电针治疗能使肌肉一收一舒，起到泵的作用，从而改善周围组织的微循环，促进经气运行，有利于渗出液的吸收，消除炎性介质，促进关节面软骨的修复；抑制伤害性信息的传导，还能缓解肌痉挛；可刺激脑垂体释放内源性鸦片样物质，5 一羟色胺、乙酰胆碱等神经介质而达到镇痛作用。电针膝眼穴可促进膝关节局部的血液循环，放松局部肌肉，减轻滑膜的炎症，减轻或消除疼痛。电针对股四头肌有明显的刺激收缩作用，且不易产生机体适应，类似于电肌体操训练。可有效恢复股四头肌的功能，从而达到纠正膝关节的力学平衡的目的。本研究采用疏密波，是疏波、密波自动交替出现的一种波形，能克服单一波形易产生适应的缺点，动力作用较大。治疗时兴奋效应占优势，能促进代谢，促进气血循环，改善组织营养，消除炎性水肿。可用来减轻患者疼痛，、改善关节活动度。针刺可疏通膝部气血，可刺激膝关节周围局部肌肉收缩，改善局部血液循环，有利于渗出液吸收。在通过疏密电刺激，可能具有增强软骨再生能力，促进胶原及蛋白多糖合成增加，减轻软骨基讨论1祖国医学对o a 的认识o a 是一种退行性病变，系关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，是临床最常见的慢性骨关节炎。以膝关节( k o a ) 最易受累。临床表现为疼痛、关节僵直畸形和关节功能受限，是导致中老年人病残的主要疾病之_ 。内经瞳1 日：“病在阳日风，病在阴日痹。故痹也，风寒湿杂至，其经络之阴，合而为痹。痹者闭也，三气杂至，雍闭经络，血气不行，故名为痹。”痹之形成，多由正虚于内，阳虚于外，营卫虚于经络，风借寒之肃杀之力，寒借风之疏泄之能，湿得风寒之助，参揉其中，得以侵犯机体。初犯经络，继人筋骨，波及血脉，流注关节。经气不畅，络血不行，阳气不达，则邪气肆虐，而生疼痛。痹证之病变部位在筋骨关节，筋骨有赖于肝肾中精血的充养，又赖于督肾中阳气之温煦，肾虚则先天之本不同，百病滋生。肾中元阳乃人身诸阳之本，风寒湿痹多表现为疼痛、酸楚、重着，得阳气之振奋时能化解。肾中元阴为人身诸阴之本，风湿热痹多化热伤阴，得阴精滋润、濡养始能缓解。故本病与肝肾亏虚，筋骨失养，风寒湿邪侵袭，痰瘀凝滞等因素有关，属本虚标实之证。素问脉要精微论日：“膝者筋之府，屈伸不能，行则偻附，筋将惫矣。骨者髓之府，不能久立，行则振掉，骨将惫矣”。灵枢云：“经脉者，所以行血气而营阴阳，濡筋骨，利关节者也。，“血和则经脉流行，营复阴阳，筋骨劲强，关节清利矣”。素问痹论云：“风寒湿一。_ l _ _ _ _ 。三气杂至，合而为痹也痹在骨则重，在脉血凝而不流，在筋则屈不伸，在于肉而不仁，在于皮则寒。 灵枢九针日：“五劳所伤，久立伤骨，久行伤筋，久坐伤肉 。膝关节骨关节炎不论外伤还是劳损，其发病与肝、脾、肾亏虚，风、寒、湿及瘀血于局部有关，最终都导致局部血瘀气滞，经络痹阻不通而发病。诸病源候论日：“肝主筋而藏血，肾主骨而生髓，虚劳血损耗损故伤筋骨。 肝肾同居下焦，乙癸同源，肾气虚则肝气亦虚，肝虚则无以养筋以束骨利机关肝主筋，膝者筋之府，肝气虚则膝痛，且以夜间为着又肾为寒水之经，寒湿之邪与之同气相感，深袭入骨，痹阻经络使气血不行，关节闭塞，筋骨失养，渐至筋挛，关节变形，不得屈伸；甚至出现筋缩肉卷，肘膝不得伸，尻以代踵，脊以代头的症状。其主要病机是“虚与阻”，虚主要是肝肾虚、血虚；阻主要是血瘀气滞，寒凝等，为本虚标实之证。可见本病常因人体肝肾亏虚，气血不足，感受风寒湿邪，致筋脉痹阻，气血不畅，日久而发病。正虚为本，邪实为标。治疗宜补益肝。肾、活血化瘀、行气止痛、通经活络为主。2 治疗膝0 a 的穴位选择选取穴位多在膝关节周围部位，如取犊鼻穴、血海、足三里、阳陵泉、梁丘等穴。犊鼻穴，又名外膝眼穴，属足阳明胃经穴位，出自灵枢本输：“刺犊鼻者，屈不能伸。主治膝痛，下肢麻痹，屈伸不利，该穴具有通经活络，疏风散寒，理气消肿止痛的作用。血海穴，“血”，这里指脾血，“海 ，指脾经所生之血在此聚集，气血物质充斥的范围巨大如海，故名。其为活血之要穴，有化血为气，运化脾血之功能，为人体足太阴脾经上的重要穴道之一。与阳陵泉配伍有舒筋活络、利关节的作用，主治膝关节痛。质损害的作用，同时增强局部血液循环，促进炎性因子吸收，减少其对蛋白聚糖的水解，减轻滑膜炎症，促进软骨细胞重排与再生，使软骨修复，+防止和延缓病变发展。实验研究发现，通过电针特定穴膝眼、阳陵泉、足三里、梁丘和足太阴脾经血海穴，电针组治疗前后有明显差异：电针治疗能降低膝骨性关节炎细胞因子i l - 1 、i l - 6 和t n f a 的含量，有防卫免疫、抗病镇痛的作用。电针足阳明经合穴足三里和梁丘能补益气血，疏经活络，鼓动气血祛邪外出，达到标本兼治。电针阳陵泉和血海穴，能舒筋活络，滑利关节，主润宗筋，通络止痛。目前，临床上通过合理取穴和正确的针刺方法治疗膝骨性关节炎，可取得较好的疗效。，j40 a 动物模型骨关节炎的发生机制复杂，一般认为是多因素联合作用所致。o a 动物模型制备分为通过人工筛选或基因改造方式获得的自发性o a 动物模型，及通过手术或非手术方式获得诱导性动物模型。其中关节应力改变是其重要原因。关节制动n 妇通过扰乱细胞功能，影响所谓“软骨泵”的软骨营养机制，使软骨细胞营养减少；滑膜向软骨浸润及与软骨粘连，影响软骨细胞营养摄取及软骨的润滑作用；跨越关节的肌肉、关节囊持续收缩，使关节面的压力增加，同时异常压力状态下黏蛋白、透明质酸的成分减少，导致关节面的机械磨损，而引起关节退行性变。在诱发模型中n 引，造成膝关节应力改变及关节不稳，所诱发的o a 模型是目前常用的。此操作本身并不直接作用于关节内，因而不带来误差，适合于o a 病理机制研究和各种方法防治效果的比较研究。关节内干预模型，手术操作较复杂，创伤大，出血及创伤性滑膜炎易影响